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    公开号:WO1991006663A1
    申请号:PCT/JP1989/001118
    申请日:1989-10-30
    公开日:1991-05-16
    发明作者:Tsunetake Sugimori；Yoji Tsukada；Yasuhiro Ohta
    申请人:Marukin Shoyu Co., Ltd.；
    IPC主号:C12P19-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書
    [0002] ガングリオシ ド GM1の製造法
    [0003] 技 術 分 野
    [0004] 本発明は、 ガングリオン ド GM1の製造法に関する。
    [0005] 従 来 技 術
    [0006] ガングリオン ドは、 シアル酸を含有するスフ イ ンゴ糖 脂質群の総称であり、 高等動物の脳特に神経系に存在す ることが知られている。 ガングリオシ ド類は、 生体内に おいて、 神経機能や細胞の相互識別、 分化、 増殖、 ガン 化、 老化等に関与し、 また細胞社会学的視点から、 コ レ ラ トキシン、 ボッリ ヌス毒素等の細胞毒素、 甲状腺ホル モン等のペプチ ドホルモン、 イ ンタ一フヱロン等の受容 体機能にあずかり、 更に細胞表面の陰性電荷に寄与して いるものと考えられる。 実際、 ゥシの脳から抽出された ガングリオシ ド類が、 障害を受けた末梢神経の再生に促 進的に働き、 特に、 アルコール症の多発性神経炎や糖尿 病性ニューロパチ一の治療薬と して有用であることが報 告されている 〔 「医薬と薬学」 、 第 1 3卷、 6号、 14 07〜 14 1 2 ( 1 985) 、 「プラクティ ス」 、 (4 ) 、 4 52〜 4 56 ( 1 987 ) 、 「医薬ジャ― ナル」 、 ^ (7) 、 5 5〜 62 ( 1 986) 〕 。
    [0007] 上述したように、 ガンダリオシ ド類は生体内において 種々の機能を有する重要な物質群であり、 従って、 各種 のガンダリオシ ドを純粋に取出す方法の確立が望まれて いる。 従来、 特定のガンダリオシ ドを製造するに当って は、 種々のク ロマ ト グラフ ィ ーを使用する方法が試みら れているが、 出発原料である牛脳等から抽出されたガン グリオシ ド成分が、 多種類のガングリオン ドを微量ずつ 含む混合物であるため、 繁雑な操作を行なっても目的物 を得るのが非常に困難であり、 的確な精製方法は見出さ れていない。 また、 化学的手法によってガングリオシ ド 類を合成する試みも成されているが、 工程が複雑であり、 副反応が起り易く、 副生物の分離が困難である。
    [0008] —方ノイラ ミニダ一ゼは、 単独では、 ガングリォシ ド 類には直接作用しないと考えられていた酵素であり、 実 際、 コール酸塩等の界面活性剤の存在下にガングリオシ ド G M 1からァシァロガングリォシ ド G A 1を生成するとい う報告がなされているのみである 〔斎藤正樹 ： 代謝、 1 6、 7 6 1 ( 1 9 7 7 ) 〕 。 しかも、 ノイラ ミニダ一 ゼにアイソザィムが存在することは全く知られていない,
    [0009] 発 明 の 開 示
    [0010] 本発明の目的は、 ガングリオシ ド類から、 特定のガン ダリオシ ド即ちガンダリオシ ド G M 1を得る方法を提供す > にめる。 本発明の他の目的は、 ガングリオン ド GM1を高純度で 収率良く得る方法を提供することにある。
    [0011] 即ち本発明は、 ガングリオシ ド類にノイラ ミニダ一ゼ
    [0012] • ァイソザィム Sを作用させて、 ガンダリオシ ド GM1を 得ることを特徴とするガングリオン ド GM1の製造法を提 供する。
    [0013] 本発明者は鋭意研究の結果、 アースロバクタ一
    [0014] (Arthrobacter ) 属細菌起源のノィラ ミニダ一ゼには 新規なアイソザィムが存在し、 該ノイラ ミニダ一ゼ · ァ イソザィム Sをガンダリオシ ド類に作用させる場合には、 ガングリォシ ド GM1が選択的に且つ高純度で収率良く得 られることを見出した。 また本発明によれば、 副生物が 生成しないので、 得られるガンダリオシ ド GM1を容易に 精製できる。 さらに本酵素を用いてガングリオシ ド G M1 を製造する場合には、 界面活性剤を使用する必要がない という利点もある。
    [0015] 本発明で使用するノイラ ミニダ一ゼ · アイ ソザィム S (以下単にアイ ソザィム Sという） は、 下記の理化学的 性質を有する。
    [0016] (1) 作用 ： ガングリォシ ド類から選択的にガングリオシ ド GM1を生成する。
    [0017] (2) 分子量 ： 約 520 0 0ダル ト ン 分子量は、 以下に示すゲル沪過ク口マ トグラフィ一及 び S D S— P A G E電気泳動によって行なった。
    [0018] 〔ゲル沪過ク口マ トグラフィ一〕
    [0019] セフアデックス G 1 50 (フアルマシア社製） を用い るゲル沪過法によった。 溶出液と しては、 50 mMリ ン 酸緩衝液を用いた。
    [0020] 〔 S D S— P A G E電気泳動法〕
    [0021] U. K. L aeminli [ ature , 227 , 680
    [0022] ( 1 97 0) 3 の方法に従い、 S D S—ポリアク リルァ ミ ドゲルを用いて電気泳動を行なった。
    [0023] (3) 至適 ρ Η : 3. 8〜4. 4 (牛脳ガングリォシ ド類 を基質と した場合）
    [0024] (4) 安定 ρ Η域 ： 3. 5〜： L 0. 0
    [0025] (5) 作用適温 ： 4 5〜 5 5 C
    [0026] (6) 熱安定性 ： 60 °C以下
    [0027] —方、 アースロノくク タ一 * ゥ レアフ ァ シエンス
    [0028] ( A rthrobacter ureaf aciens ) 起源のノィラ ミニダー ゼは I及び Πに分離されており、 その理化学的性質は下 記第 1表の通りである 〔Y. Uchida et al ， J .
    [0029] B iochem. , 86, 42 5 , ( 1 9 7 9) 〕 。 I I
    [0030] 分子量（ゲル jp 法) 5 1 0 0 0 39000 至適 p H 5. 0〜 5. 5 5. 0〜 5. 5 安定 P H 6. 0〜 9. 0 6. 0〜 9. 0 作用適温 53 °C 53 °C
    [0031] 熱安定性 50 °C以下 50 °C以下 上記から、 アイソザィム Sと従来のノィラ ミニダーゼ は、 分子量、 至適 p H、 安定 p H、 作用適温及び熱安定 性といった理化学的性質を異にし、 異なった分子種の酵 素であることが判る。
    [0032] アイ ソザィム Sの活性測定は、 ノイラ ミニダ一ゼの場 合と同様に行なわれる。 例えば、 ジャーナル ォブ バ ィォロジカル ケミ ス ト リー U.Biol.Chem., 234 , 1 97 1 ( 1 9 59 ) 等に記載のチォバルビツール酸 法に従って行なえばよい。 アイソザィム Sの 1単位は、 37 °Cで 1分間に 1マイ クロモルの N—ァセチルノイラ ミ ン酸を生成する酵素量とする。
    [0033] アイ ソザィム Sは、 アースロバクタ一属細菌を培養し 得られる培養物から採取できる。
    [0034] アースロバクター属細菌と しては公知のものを用いる ことができ、 例えばアースロバクタ一 · ゥレアファ ンェ ンス M 1 0 5 7株 （微ェ研条寄第 1 3 9 1号） 等のァ一 スロノくクタ一 ♦ ウレァファ シエンス等を挙げることがで さる o
    [0035] アースロバクター属細菌の培養は、 通常の液体培地及 び固体培地のいずれを用いても実施できるが、 通常液体 培地を用いるのが有利である。 また所望の酵素を生産す るためには、 振盪培養や通気攪拌培養等を行なうのが好 ま しい。 培地と しては特に制限がなく 、 微生物の培養に 用いられる通常の栄養源等を含有する各種の培地を使用 できる。 栄養源と しては、 例えば、 ブドウ糖、 果糖、 乳 糖、 転化糖、 澱粉糖化液、 コロ ミ ン酸、 ソルビトール、 グリセロール等の糖質類、 ピルビン酸、 リ ンゴ酸、 コハ ク酸等の有機酸類、 ペプチ ド類、 肉エキス、 酵母エキス， カザミ ノ酸、 尿素、 アンモニゥム塩、 硝酸塩等の窒素源、 リ ン、 マグネシウム、 カ リ ウム、 ナ ト リ ウム等の無機塩 類、 硼素、 銅、 沃素、 鉄、 マンガン、 亜鉛、 コバル ト、 モリ ブデン等の微量元素類、 ビタ ミ ン類等の微量成育因 子等を挙げることができる。 更に、 例えば動物組織抽出 物又は浸出物等を含有する天然乃至半合成培地等も使用 できる。 培地の具体例と しては、 例えば、 ト ッ ド · へゥ ィ ッ ト肉汁 （ T odd H evi tt B roth) やブレイ ン · ハ一 ト ♦ イ ンフユ一ジ ョ ン ( B rai n H eart I nf usion ) 培地等の名称で市販されているもの等を挙げることがで さ 。
    [0036] 培養は、 通常 20〜4 0 °C程度、 好ま しく は 2 5〜 30 °C程度の温度下に行なわれ、 1 0〜 70時間程度で 終了する。
    [0037] アースロバクター属細菌の培養液から、 公知の方法に 従ってアイソザィム Sを採取することができる。 例えば 培養液から菌体を分離除去し、 得られる清澄液に、 硫安 分画、 ァフィ 二ティ クロマ トグラフィー、 必要に応じィ オン交換ク ロマ トグラフィ ー、 ク ロマ トフ ォーカ シング ゲル沪過等の精製操作を施せばよい。
    [0038] かく して得られるアイソザィム Sをガンダリオシ ド類 に作用させることにより、 ガングリオン ド GM1を選択的 に得ることができる。 該酵素反応は、 ガンダリォシ ド類 及び緩衝液、 更に必要に応じて殺菌水を含む原料液に、 アイソザィム Sを添加することにより行なわれる。
    [0039] 上記酵素反応において、 ガンダリォシ ド GM1の原料で あるガングリォシ ド類と しては特に制限されず公知のも のが使用でき、 例えば、 ガンダリオシ ド GDl a 、 G Di b GT i a 、 GTi b 及び GQl b から選ばれた少なく と も 1種 牛脳から抽出されたガングリォシ ド混合物等を挙げるこ とができる。 ガングリォシ ド類の使用量は特に制限され ないが、 通常原料液 1 mfi当り 50 mg以下、 好ま しく は 0. 1〜 3ng程度とすればよい。 緩衝液としては p Hが 3〜 6程度の公知のものが使用でき、 例えば 1 0〜
    [0040] 200 mM程度の酢酸緩衝液 （p H 3. 5〜 5. 0) 、 Mcllvaine緩衝液 （p H 3. 5〜 5. 5) 等を挙げるこ とができる。 アイソザィム Sの使用量も特に制限されず 広い範囲に亘り得るが、 通常原料液 Ι ϋώ当り 1 O mU以 上、 好ま しく は 0. 1〜 1 0 U程度とすればよい。 反応 温度及び P Hは酵素が作用し得る温度及び p Hであれば 特に制限されないが、 通常 20〜 50 °C程度の温度及び 3〜 6程度の p Hとすればよい。 反応時間は基質濃度、 反応温度等に応じて適宜選択すればよいが、 例えば 37 ての時には 30分〜 24時間程度とすればよい。
    [0041] 反応液からガングリオシ ド GM1を精製するに当っては 公知の方法が採用できる。 例えば、 反応液から溶媒抽出 した後、 濃縮、 脱塩、 凍結乾燥等を行なうことにより精 製できる。
    [0042] 実 施 例
    [0043] 以下に参考例及び実施例を挙げ、 本発明をより一層明 瞭なものとする。
    [0044] 参考例 1
    [0045] ラ ク ト一ス 5. O g、 リ ン酸第 2ア ンモニゥム 2, 0 g、 塩化ナ ト リ ウム 3. 0 g s リ ン酸第 2カ リ ウム
    [0046] 1. 0 g、 硫酸マグネシウム 0. l g及び脱塩水
    [0047] l O O O mfiを含む培地 （ p Hを 7. 0に調整） を、 2 £ 容坂ロフラスコにいれ、 オートク レープで加熱滅菌した。
    [0048] これに、 アースロノ ク タ一 《 ゥ レアフ ァ シエンス M l
    [0049] 0 5 7株を接種し、 2 8 Cで 24時間振盪培養を行ない、 得られた培養液を遠心分離 （ 1 0 0 0 0 r p m、 1 0分） して培養上清を得た。
    [0050] 得られた培養上清に硫安を加え、 硫安 8 0 %飽和で沈 澱する部分を採取し、 これを少量の水に溶かし、 1 0 m M酢酸緩衝液 （ p H 4. 5 ) で透析した。 透析液を、 可 溶性デンプンとコロ ミ ン酸とを含む 2 N水酸化ナ ト リ ウ ム溶液にェピクロルヒ ドリ ンを加えて調製した、 コロ ミ ン酸をリガン ドとするゲルを充填したカラムに通塔して ノィラ ミニダーゼを吸着させ、 l O O mM酢酸緩衝液
    [0051] ( p H 4. 5 ) で溶出した。
    [0052] 次いで、 ノィラ ミニダーゼ活性区分を硫安塩折し、 脱 塩水で透析し、 透析液をクロマ トフオーカシングにより 3成分に分離した。 クロマ トフ ォーカ シングは、 透析液 を、 2 5 mMイ ミ ダゾ一ルー H C J2 ( p H 7. 4 ) で平 衡化したポリバア ツファ一交換体充填カラムに通塔し、 p H 3. 8に調整したポリ ブア ツファー 7 4 〔フアルマ シァ社製〕 で溶出して行なった。
    [0053] 得られた 3成分を個々に硫安塩折し、 l O O mMリ ン 酸緩衝液 （p H 7. 0) に溶解し、 IHtrogel A c A 4 4 〔 1. B. F. バイオテクニクス社製〕 を用いてゲル 沪過し、 4成分を得た。 その中の 1成分から、 アイソザ ィム Sの 6 50単位を得た。
    [0054] アイソザィム Sの酵素活性は、 チォバルビツール酸法 に従い、 以下のようにして測定した。
    [0055] 即ち、 酵素液 0. l mfi、 0. 4 %N—ァセチルノイラ ミ ンラク トース溶液 0. 0 5mfi及び 0. 2M酢酸緩衝液 (p H 5. 0) 0. 0 5 πΐβを、 37。Cで 1 0分間反応さ せ、 遊離した N—ァセチルノイラ ミ ン酸をチォバルビッ ール酸法で定量した。 アイソザィム Sの 1単位は、 37 °Cで 1分間に 1マイ クロモルの N—ァセチルノイラ ミ ン 酸を生成する酵素量と した。
    [0056] 実施例 1
    [0057] 0. 4 %ガングリオシ ド GTl b 溶液 1 mG、 4 0 mM酢 酸緩衝液 （p H4. 0 ) 110及び蒸留水 1 HISを混合し、 これにアイソザィム Sの水溶液 1 ιηδ ( 5 U /ΐηβ) を加え て 37 °Cで 1時間反応させた後、 反応液にクロ口ホルム を 1 Z 1 0容添加し、 酵素反応を停止した。 反応液から クロ口ホルム ： メ タノール （ 2 : 1 ) を用いて生成した ガングリォシ ド GM1を抽出した後、 凍結乾燥し、 ガング リオシ ド GM1 2. 4nigを白色粉末と して得た。
    [0058] 上記で得られた白色粉末は、 下記条件の薄層クロマ ト グラフィ一による分析の結果、 ガングリオシ ド GM1の標 準物質 （純度 99 %以上、 ホーネン社製） と同じ R f 値 (0. 48) の単一スポッ トを示し、 該標準物質と同等 以上の純度のガングリオシ ド GM1であることを確認した。 〔薄層ク口マ トグラフィ 一条件〕
    [0059] 薄層プレー ト ； メルク社製高性能 T L C (H P T L C)
    [0060] No.564 1
    [0061] 展 開 溶 媒 ； クロ口ホルム ： メ タノール ：
    [0062] 0. 02% C a C £ 2 = 60 : 3 5 : 8 発 色 剤 ； レゾルシン塩酸試薬
    [0063] 実施例 2
    [0064] 0. 2 %ガングリオン ド GDl b 溶液 1 πΐβ、 4 0 mM酢 酸緩衝液 （p H4. 0) 1 mfl及び殺菌水 1 ΙΠβを混合し、 これにアイ ソザィム Sの水溶液 1 πΐβ (3 UZiS) を加え て 37。Cで 5時間反応させた後、 反応液にクロ口ホルム を 1 1 0容添加し、 酵素反応を停止した。 反応液より、 クロ口ホルム ： メ タノール （ 2 ： 1 ) を用いて生成した ガングリォシ ド GM1を抽出した後、 凍結乾燥し、 ガング リオシ ド GM1約 1. 5mgを白色粉末と して得た。 実施例 1 と同様にしてガンダリオシ ド GM1の生成を確認した。 実施例 3
    [0065] ガングリオシ ド類と して、 牛脳抽出ガングリオシ ド混 合液 ΐ ιηδ (ガングリオン ド類 1 Omgを含む） を使用する 以外は、 実施例 2と同様にして反応及び精製を行ない、 ガンダリオシ ド GM1約 6. 2mgを白色粉末と して得た。 実施例 1 と同様にしてガングリォシ ド GM1の生成を確認 した。
    权利要求:
    Claims

    請求の範囲
    ① ガングリオシ ド類にノィラ ミニダ一ゼ， ァイソザィ ム Sを作用させて、 ガンダリオシ ド G M 1を得ることを 特徴とするガンダリォシ ド G M 1の製造法。
    ② ノィラ ミニダ一ゼ · ァイソザィム Sがアースロバク ター属細菌の培養物から得られる請求項①の方法。
    ③ アースロバクター属細菌がアースロバクタ一 · ウレ ァフ ァ シエンスである請求項①の方法。
    ④ アースロ ノくク タ一 ♦ ウ レァフ ァ シエンスがアース口 ノ クタ一 · ウ レァファ シエンス M l 0 5 7株である請 求項①の方法。
    ⑤ ノイラ ミニダ一ゼ · ァイソザィム Sが下記理化学的 性質を有する請求項①の方法。
    作用 ： ガングリオシ ド類から選択的にガンダリオシ ド G M 1を生成する。
    分子量 ： 約 5 2 0 0 0ダルト ン （ゲル泸過クロマ ト グラフィ一及び S D S - P A G E電気泳動法 による）
    至適 p H ： 3 . 8〜4 . 4 (牛脳ガンダリォシ ド類 を基質と した場合） 。
    熱安定性 ： 6 0て以下。
    ⑥ ガングリォシ ド類が、 ガングリオシ ド G D 1 β 、 GDlb 、 GTl a 、 GTlb 及び GQlb から選ばれた少な く とも 1種又は牛脳から抽出されたガングリオン ド混 合物である請求項①の方法。
    ⑦ ガングリオシド類及び緩衝液を含む原料液に、 ノィ ラ ミニダーゼ · ァイソザィム Sを添加して反応が行な われる請求項①の方法。
    ⑧ 原料液が更に殺菌水を含む請求項⑦の方法。
    ⑨ ガングリォシ ド類の使用量が、 原料液 1 mfi当り 50 rag以下である請求項⑦の方法。
    ⑩ ガンダリオシ ド類の使用量が、 原料液 Ι ΐπδ当 0. 1 〜 3 nig程度である請求項⑨の方法。
    ⑪ ノイラ ミニダ一ゼ · ァイソザィム Sの使用量が、 原 料液 1 ΙΠβ当り 1 O mU以上である請求項⑦の方法。
    © ノイラ ミニダ一ゼ · ァイソザィム Sの使用量が、 原 料液 1 fflfi当り 0. 1〜 1 0 U程度である請求項⑪の方 法 ο
    ⑫ 反応が 20〜 50 程度の温度下に行なわれる請求 項①の方法。
    ⑭ 反応が ρ Η 3〜 6程度で行なわれる請求項①の方法,
    类似技术:
    公开号 | 公开日 | 专利标题
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    US5296360A|1994-03-22|
    JP2724588B2|1998-03-09|
    EP0451267B1|1995-08-09|
    DE68923801D1|1995-09-14|
    JPH01281082A|1989-11-13|
    EP0451267A1|1991-10-16|
    EP0451267A4|1993-04-28|
    DE68923801T2|1995-12-07|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1991-05-16| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): US |
    1991-05-16| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CH DE FR GB IT LU NL SE |
    1991-06-17| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1989911863 Country of ref document: EP |
    1991-10-16| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1989911863 Country of ref document: EP |
    1995-08-09| WWG| Wipo information: grant in national office|Ref document number: 1989911863 Country of ref document: EP |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    JP63109530A|JP2724588B2|1988-05-02|1988-05-02|ノイラミニダーゼ・アイソザイムｓ及びガングリオシド類の製造法|DE68923801T| DE68923801T2|1988-05-02|1989-10-30|Verfahren zur herstellung von gangliosid gm1.|
    EP89911863A| EP0451267B1|1988-05-02|1989-10-30|Process for preparing ganglioside gm1|
    US07/679,087| US5296360A|1988-05-02|1989-10-30|Process for producing ganglioside GM1|
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