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    公开号:WO1991006640A1
    申请号:PCT/JP1990/001395
    申请日:1990-10-31
    公开日:1991-05-16
    发明作者:Shigeaki Maruo；Katsunori Miyazaki；Naoyoshi Yamada；Yohji Ezure
    申请人:Nippon Shinyaku Co., Ltd.；
    IPC主号:C12N11-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書 '
    [0002] 安定 化固定 化酵素 技 術 分 野
    [0003] 本発明は、 サイ クロデキス ト リ ングリ コ シル ト ラ ンスフ ヱ ラーゼ （CGTase) 、 ダルコア ミ ラーゼ （GA) 、 ）9一ア ミ ラ一ゼ、 ；9—ダルコ シダーゼ （ GD) 、 ）9一ガラク ト シダ一 ゼ等で代表される糖質関連酵素を対象とする固定化酵素を、 より安定化するための技術に関する。
    [0004] 糖質関連酵素は、 今日の化学工業において汎用されてい る。 CGTaseは、 澱粉からサイ クロデキス ト リ ンを製造する のに工業的規模で通常用いられている酵素である。 サイ ク 口デキス ト リ ンは、 医薬品の安定性を高めたり臭い物質の 脱臭に応用が広い包接化合物を製造するのに必須の物質で あり、 従って、 CGTaseを安定化することは、 工業上、 非常 に意義の高い技術である。
    [0005] また、 GAや ) 9一アミ ラーゼは、 澱粉からグルコースやマ リレトースを製造する際に日常的に用いられる酵素であって、 GAや ]9ーァミ ラーゼの安定化は極めて意義の大きい技術で め 。
    [0006] 更に、 j9ーグルコ シダーゼは、 木材糖化に重要な役割を 果たす酵素で、 安定なものが求められていたものであり、 この酵素の安定化は工業上極めて意義の大きい技術である。
    [0007] 従 来 の 技 術 酵素反応の技術についての近年の技術的進歩は目覚まし く、 まさに隔世の感があり、 ことに固定化酵素法は、 例え ば溶液中での酵素反応等のこれまでの従来方法に比べ使用 酵素量が少なくて済む点や効率的な反応を行うことができ る点で格段の効果があった。
    [0008] キ トサンビーズ応用の固定化酵素法については複数の特 許出願がなされており、 例えば、 特開昭 63— 196290号公報 には、 多孔質のキ トサンビーズに、 サイ ク デキス ト リ ン グルカノ ト ラ ンスフ ラーゼを固定化させた後、 さ らに架 橋剤で架橋処理する技術が開示されている。
    [0009] 上記酵素の効率的応用方法については、 多くの研究がな されていたが、 酵素そのものの安定化については、 必すし も充分な成果が得られていたわけではない。 酵素は使用時 間とともにその活性を喪失して行く ものであり、 例えば CGTaseにあっては数日で活性が半減し、 数十日経過すれば 全く活性を失うのが通常であった。
    [0010] 固定化酵素にしても、 このような場合には酵素そのもの を新しく供給する以外に方法はなかったが、 本発明者らは 比較的微量で一定の安定化させる作用のある物質 （^下 「 安定化剤」 ともいう） を酵素反応に共存させることでこの 技術的課題が解決することを見出し、 特許出願した （特願 平 1一 033481号) 0
    [0011] 発 明 の 開 示
    [0012] 上記手法によればなるほど酵素の安定化を望むことがで きるものの、 この安定化剤は酵素反応時に酵素に接する状 態で提洪させる必要があるためにある程度の量を必要と し、 かつ反応終了時には反応混合物中から回収する必要があつ O
    [0013] 本発明の目的は、 これらの技術的課題を解決しようとす るものであった。
    [0014] 本発明の要旨は、 酵素の安定化剤を、 酵素とともに担体 に固定させたところにある。
    [0015] このような構成を有する固定化酵素は、 本発明者らによ つて初めて創成されたものである。
    [0016] 下、 本発明の構成について詳述する。
    [0017] 本発明において使用する担体としては、 糖質蘭連酵素を 固定化することができるすべての担体を適用することがで きるが、 例えば、 今日の固定化酵素製造に汎用されるキ ト サンビーズのほか、 ァガロース樹脂や硬質多孔性合成樹脂 等を挙げることができる。 これらの樹脂は、 ビーズ状に成 形したもののほか、 平膜状のものでもよい。
    [0018] 本発明に係るキ トサンビーズとしては、 例えば、 キ トパ ール （富士紡繽㈱製） BCW- 1000シ リ ーズ等を使用すること ができる。
    [0019] 本発明に係る了ガロース榭脂としては、 例えば、 セフ ァ ロース 6 B (フ アルマシア社製） 等を使用することができ る o
    [0020] 本発明に係る硬質多孔性合成樹脂としては、 例えば、 親 水性多孔性ポ リマー BF-4611 、 BF - 4612 (オルガノ社製 ) 等を使用することができる。
    [0021] 本発明においては、 担体の表面上に酵素を固定化する手 段としては、 架榛剤をまず担体と反応させて、 担体表面に 架橋を形成させる。 その後、 本発明に係る酵素.を架橋剤の 末端に固定する。
    [0022] 本発明においては、 この際に、 酵素と同時に安定化剤を 架擂剤の末端に面定することができる。 本発明において は更に、 酵素を架橋剤末端に固定した後、 残存する架橋剤 末端に安定化剤を固定することができるし、 また安定化剤 を架橋剤末端に固定した後、 残存する架榛剤末端に酵素を 固定することができる。
    [0023] 本発明に係る架橋剤として、 ォキシラ ン等のェポキサイ ドを保有する炭素鎖を用いることができるほか、 例えば、 グルタールアルデヒ ド等を始めとする固定化酵素製造時に 一般的に用いることができる架橋剤を使用することができ る 0
    [0024] 本発明に係る安定化固定化酵素を生成させるためには、 例えば、 CGTaseの例においては、 適当な温度 （例、 室温） において、 適当な了ルカ リ液 （例、 0. 6N のカセイ ソーダ 溶液） 中に、 適当な担体 （例、 キ トサンビーズ） を加え、 適当な瀵度 （例、 アルカ リ と同量） の適当な架橋剤 （例、 ォキシラ ン） を加え、 適当な温度 （例、 8〜50で〉 、 適当 な時間 （例、 1〜4時間） 、 穏やかに振盪し、 その後濾過 して担体を水洗した後、 氷又は適当な緩衝液 （例、 PH 6. 0 の 0. 025M 酢酸緩衝液） 中で、 適当な濃度 （例、 1 ~ 500 ui g/ m£ ) の CGTase溶液を加え、 このとき同時に適当な安定 化剤 （例、 グルコ シルモラノ リ ン） を適当な濃度 （例、
    [0025] 0. 9〜 1 g r ) 加え、 適当な時間 （例、 1 〜48時間） 穏 やかに振盪した後濾過して、 氷洗して得ることができる。
    [0026] 上記の方法は、 本発明者らによって初めて確立された手 法である。
    [0027] 本発明に係る安定化剤としては、 次の一般式 〔 I〕
    [0028] 〔 I〕
    [0029] (ここに Rは、 永素、 低級アルキル、 ハイ ドロキシアルキ ル、 フ エ二ル了ルキル、 フ エ二 Jレアルケニル、 フ エニル了 ルキニル、 フユノキシアルキル、 フ ノキシアルケニル又 はフヱノ キシアルキニルを表す。 ここにおけるフ エエルと は置換若しく は無置換のものを含むものとする。 Xは氷素 又はアキシアル若しく はェクァ ト リ 了ルの水酸基を示す。
    [0030] ) で表される化合物又はこれらのグルコ ースオ リ ゴマーを 挙げることができる。
    [0031] 本発明に係る 〔 I 〕 で表される化合物は公知の物質であ つて、 例えば、 特公昭 56— 099195号公報、 特公昭 60— 2038 号公報、 特公昭 61— 2076号公報、 特公昭 62— 242691号公報 等に開示された方法により取得することができる。
    [0032] 本発明に係るダルコースォ リ ゴマーとは、 次の一般式 〔 Π〕
    [0033]
    [0034] (ここに Rは、 前記と同じ。 IIは 0から 24までの整数を表 す） で表すことができる。
    [0035] 本発明に係る一般式 〔 I〕 及び 〔H〕 における Rに示さ れる低級了ルキルと しては、 メ チル、 ェチル、 π-プロ ビル、 イ ソプロ ピル、 n-ブチル、 イ ソブチル、 sec-ブチル、 tert- ブチル等を挙げることができる。
    [0036] ハイ ドロキシ了ルキルにおけるアルキルの炭素数は、 1
    [0037] 〜 5のものを挙げることができる。
    [0038] フヱ二ル了ルキルにおけるアルキルの炭素数は、 1 〜 5 のものを挙げることができる。 この場合にはフヱ二ルは置 換若しく は無置換のものも含むものである。
    [0039] フエニル了ルケニルにおけるアルケニルの炭素数は、 2
    [0040] 〜 5のものを挙げることができる。 この場合にはフヱニル は置換若しく は無置換のものも含むものである。
    [0041] フヱニルアルヰニルにおける了ルキニルの炭素数は、 2 ~ 5 のものを挙げることができる。 この場合にはフヱニル は置換若しく は無置換のものも含むものである。
    [0042] フエノ キシ了ルキルにおけるアルキルの炭素数は、 1〜 5のものを挙げることができる。 この場合に {まフヱニルは 置換若しく は無置換のものも含むものである。
    [0043] フエノキシ了ルケニルにおけるアルケニルの炭素数は、 2〜 5 のものを挙げることができる。 この場合にはフ エ二 ルは置換若しく は無置換のものも含むものである。
    [0044] フ ヱノキシアルキニルにおける了ルキニルの炭素数は、 2〜 5 のものを挙げることができる。 この場合にはフエ二 ルは置換若しく は無置換のものも舍むものである。
    [0045] 本発明に係る安定化剤としては、 上記に掲げるもののほ か、 例えば、 一サイ クロデキス ト リ ン、 ガラク ト スタチ ン又はその誘導体等を挙げることができる。
    [0046] 本発明に係る安定化にあたっては、 担体 l g に対して、 例えば、 1〜50mgの酵素が吸着している状態で、 例えば、 10 ju g 〜 6 mgの安定化剤が存在するような固定化の行い方 をするのがよい。 この際には、 安定化剤の使用量は、 その 目的に ¾じて適宜変化させることができる。
    [0047] 以下の実施例でも明らかなように、 本発明に係る安定化 剤の必要量は、 れまでの方法によるものより遙かに少な い量で足りる。 このことが特徵的な本発明の効果の一つで ある。
    [0048] 発明を実施するための最良の形態
    [0049] £1下に本発明の安定化法の実施例を掲げて、 本発明を更 に詳しく説明する。
    [0050] 参考例 1
    [0051] ポヰシ_活性化セファロースビーズ
    [0052] セフ ァ π—ス 6 Bをグラスフィ ルタ一上に置いて吸引濾 過する。 濾過後の乾燥物をサク シヨ ンドライ とし、 このも のの 10g に、 ォキシラ ン （アルド リ ツチ社製） と 0. 6 のカセイ ソーダ溶液 を加え、 室温で 16時間緩く振盪 して反応させる。 後に十分水洗して得られたビーズをェポ キシ活性化セファ ロースビーズとして使用した。
    [0053] 参考例 2
    [0054] ェポキシ活性化キ トサンビーズ
    [0055] キ トサンビーズ （ 0 1. 5鯽） をメスシ II ンダ一で 10m£は かりとり、 グラスフィ ルター上で十分に永洗する。 このビ ーズに lOmgのォキシラ ンと 0. 6N のカセイ ソーダ溶液 10m£ を加え、 室温で 16時間緩く振盪しながら反応させる。 十分 に水洗して得られたビーズをエポキシ活性化キ トサンビー ズとして使用した。
    [0056] (以下次頁） g
    [0057] 実施例 1
    [0058] エポキシ活性化セフ ァ ロースビーズ 3g に 0. IN のカセ ィ ソーダ溶液 を加え、 更に 60mgのモラノ リ ンを加えて 溶解させ、 40 ^：で 1時間ゆるく振盪した。 これをグラスフ ィルタ ー上で十分に水洗し、 の水に分散させて、 60mg の i9—ダルコ シダーゼ粉末 （アーモン ド由来、 シグマ社製 ) を溶解させ、 40 "Gで 20時問ゆる く振盪しながら反応させ、 最^的に得られたモラノ リ ンー β —ダルコ シダーゼ結合セ フ ァ ロースは十分に水洗した。
    [0059] 実施例 2
    [0060] ェポキシ活性化セファロースビーズ 2g を水 ΙΟπώに分散 させ、 これに メチルモラノ リ ン 2g と j3—ダルコ シダー ゼ （シグマ社製） 40mgを加えて溶解し、 40でで 20時間ゆる く振盪しながら反応させ、 グラスフィ ルタ一上で濾過して 十分水洗した。
    [0061] 実施例 3
    [0062] エポキシ活性化セファ ロ一スビーズ 2g を水 10m£に分散 させ、 これにモラノ リ ン 500ragとグルコア ミ ラーゼ （リ ゾ ブス 二べウス由来、 生化学工業社製） 30mgを加えて溶解 し、 室温で 20時間ゆる く振蘯しながら反応させ、 グラスフ ィルタ一上で濾過して十分氷洗した。
    [0063] 実施例 4
    [0064] エポキシ活性化キ トサンビーズ を氷 lOmHこ分散させ、 これに、 グルコア ミ ラーゼ （了スペルギルス由来、 ダルコ ザィ ム NL - 3、 天野製薬社製） 500 ^とモラ ノ リ ン 500mg とを加えて溶解し、 室温で 20時間ゆる く振盪しながら反応 させ、 グラスフィ ルタ ー上で濾過して十分氷洗した。
    [0065] 実施例 5
    [0066] エポキシ活性化キ トサンビーズ 5m£を 0. 1N カセイ ソ一 ダ溶液 5m£に分散させ、 これに N- (2—ハイ ドロキシェチル） モラノ リ ン 1 g を加え、 401で 20時間ゆるく振盪しながら 反応させ、 その後グラスフィ ルター上で濾過して十分水洗 した。 このビーズを水 5m£に分散させ、 これにダルコアミ ラーゼ （天野製薬社製） l m£を加え、 室温で 16時間ゆるく 振盪しながら反応させ、 グラスフィルター上で據過して十 分氷洗した。
    [0067] 実施例 6
    [0068] エポキシ活性化セフ ァロースビーズ 5g に 0. 1 のカセ ィ ソーダ溶液 を加え、 分散させ、 これにな一サイ ク口 デキス ト リ ン 3g を溶解して、 40 *Cで 24時間ゆるく振盪し ながら反応させ、 グラスフィルター上で濾過して十分氷洗 した。 その後このものを 10m£の水に分散させ、 30ragのダル コアミ ラーゼ （生化学工業社製） を溶解させ、 40でで再度 20時間ゆるく振盪しながら反応させ、 グラスフィ ルター上 で濾過して十分水洗した。
    [0069] 実施例 7
    [0070] ェポキシ活性化キ トサンビーズ 10m£を 1 N のカセイ ソ一 ダ溶液 10m£に加え、 さらに 10g のダルコシルモラノ リ ンを ji 丄 加え溶解し、 40でで 16時間ゆる く振繮する。 グラスフィル ター上で水洗を十分に行ったのち、 このものをカセイ ソ一 ダ溶液で PH 10に調製した の水に分散させ、 の CGTase (バチルス ' ステ了 サ一モフィ ラス由来、 林原生 物化学研究所社製） を加えて 40 tで 6時間ゆる く振璗しな がら反応させたのち、 グラスフィ ルタ ー上で濾過して十分 水 ¾ した。
    [0071] 実施例 8
    [0072] ェポキシ活性化キ トサンビーズ を、 水 10m2に加え、 さ らにダルコ シル N-メチルモラノ リ ン 2. 5g を加え溶解 し、 0. 3m£の CGTaseを加えて 401で 16時間緩やかに振盪し ながら反応させたのち、 グラスフィ ルターで攄過し十分氷 洗した。
    [0073] 実施例 9
    [0074] エポキシ活性化キ トサンビーズ 3 を、 氷 5 m£に加え、 さ らに 1ーデォキシガラク トスタチン 250tngと /3—ガラ ク ト シダーゼ （リ ゾブス由来、 東洋紡社製） 20ragを加えて 溶解させた。 そして、 25でで 16時間緩やかに振盪しながら 反応させたのち、 グラスフィルターで濾過し十分水洗した。 実施例 10
    [0075] エポキシ活性化キ トサンビーズ を、 氷 5 に加え、 さらに 1， 4-ジデォキシガラタ トスタチン SOOragと β —力'ラ ク ト シダーゼ （東洋紡社製） 20rogを加えて溶解させた。 そ して、 25 tで 16時間緩やかに振盪しながら反応させたのち、 グラスフィルタ一で濾過し十分水洗した。
    [0076] 実施例 11
    [0077] ェポキシ活性化キ トサンビーズ 3 m£を、 0. INカセイ ソ一 ダ溶液 5？ ^に加え、 分散させ、 これにダルコ シルモラノ リ ン 500mgを溶解し、 37 :で 16時間緩やかに振盪.しながら反 応させたのち、 グラスフ ィ ルターで濾過し十分氷洗した。 その後、 これに 一アミ ラーゼの抽出液 （天野製薬社製、 i9一アミ ラーゼ it 1500 10 gを 70m£の氷で抽出） 5 を加 え、 室温で再度 16時間緩やかに振盪しながら反応させたの ち、 グラスフ ィ ルターで濾過し十分水洗した。
    [0078] [試験例]
    [0079] 本発明における安定化の評価法の骨子は、 本発明物とコ ン ト ロ ールのビーズ量を通常当該酵素の活栓測定に推奨さ れている 37 ：〜 40 tの温度で活性がほぼ等しくなるように 定め、 次にそれらのビーズを高温に移して失活の挙動を比 較するところにある。
    [0080] 試験例 1
    [0081] 実施例 1で得た本発明物質 50mgと、 実施例 1 と同様の方 法によってモラノ リ ンのみを加えないで調製した物質 （コ ン ト ロール） の 200mgを、 それぞれ試験管にとり、 10m£の 0. 12Mサ リ シン溶液
    [0082] ( 0. 1M 酢酸緩衝液 P H 5. 0)に分散させ、 58 tでィ ンキュ ベー ト して経時的にサンプリ ングして遊錐するダルコース をダルコースォキシダーゼ法で測定した。 結果を図一 1 に 示した。 本発明物質がコ ン ト π—ルに比べて熱安定である ことが明白である。
    [0083] 試験例 2
    [0084] 実施例 1で得た本発明物質 25mgと、 同様の方法によって モラノ リ ンのみを加えないで調製した物質 （コ ン ト ロール ) の 40mgを、 それぞれ試験管内にとり、 750 / ^の 0. 1M 酢酸緩衝液 （ P H 5. 0)を加えて、 40 t〜75 :の各温度で 30 分間加温し、 その後室温に冷却し 250 ·βの 0. 12M サリ シン溶液 （0. 1M酢酸緩衝液， pH 5. 0)を加えて、 30でで 30 分間反応させ、 遊離するグルコース量をグルコースォキシ ダーゼ法で測定し、 40 :での発色量に対する百分率を活性 残存率と して図一 2に示した。 本発明物質の熱安定性が明 白である。
    [0085] 試験例 3
    [0086] 実施例 2で得た本発明物質 20mgと、 実施例 2 と同様の方 法によって N-メチルモラノ リ ンのみを加えないで調製した 物質 （コ ン ト 口ール） の 120mgを、 それぞれ試験管にとり、 10ιπ£の 0. 12Mサ リ シン溶液 （ 0. 1M 酢酸緩衝液 P H 5. 0)に 分散させ、 58ででイ ンキュベー ト して経時的にサンプリ ン グして遊雜するダルコースをグルコースォキシダーゼ法で 測定した。 結果を図一 3に示した。 本発明物質がコ ン ト 口 ールに比べて熱安定であることが明白である。
    [0087] 試験例 4
    [0088] 実施例 2で得た本発明物質 6mgと、 同様の方法によって N-メチルモラノ リ ンのみを加えないで調製した物質 （コ ン トロール） の 60ragを、 それぞれ試験管内にとり、 750 の 0.1M 酢酸緩衝液
    [0089] ( H 5.0)を加えて、 40で〜？ 5での各温度で 30分間加温し、 その後室温に冷却し 250 / ^の 0.12M サ リ シン溶液 （ 0.1ϋ齚酸緩衝液， pH 5.0)を加えて、 30tで 30分簡反応さ せ、 遊雜するグルコース量をグルコースォヰシダーゼ法で 測定し、 40 :での発色量に対する百分率を活性残存率とし て図一 4に示した。 本発明物質の熱安定性が明白である。 試験例 5
    [0090] 実施例 3で得た本発明物質 60mgと、 同様の方法によって モラノ リ ンのみを加えないで調製した物質 （コ ン トロール ) の l ingを、 それぞれ試験管にとり、 これらに 0.021M の P-二 ト ロフヱニルー — D-ダルコ ビラノ シ ドを 200 ^ と
    [0091] 0.1M 酢酸緩衝液 （ PH 6.0) ϋを加えて 55 でィ ン キュペー ト して、 経時的にそれぞれの試験管に 2 m£の 0.1 M の炭酸ソーダ溶液を加えて 2000rpmで 1分間遠心分雜し たのち、 上清の吸光度を 400nmで測定した。 結果を図一 5 に示した。 本発明物質の熱安定性が明白である。
    [0092] 試験例 6
    [0093] 実施例 4で得た本発明物質 100粒と、 同様の方法によつ てモラノ リ ンのみを加えないで調製した物質 （コ ン ト ロー ル） の 1粒を、 それぞれ試験管にとり、 これらに 0.021M の p—二 ト口フヱニルー — D-ダルコ ビラノ シ ドを 200 X ί ι 5 JP90/01395 と 0. 1M 酢酸緩衝液 （ PH 6.0) 800 ^を加えて 60 :でィ ンキュベー ト して、 経時的にそれぞれの試験管に 2 m£の
    [0094] 0.1 の炭酸ソーダ溶液を加えて、 吸光度を 400nmで測定 した。 結果を図一 6 に示した。 本発明物質の熱安定性が明 白である。
    [0095] 試験例 7
    [0096] 実施例 5で得た本発明物質 3粒と、 同様の方法によって N-(2—ハイ ドロキシェチル） モラノ リ ンのみを加えないで 調製した物質 （コ ン ト ロ ール） の 2粒を、 それぞれ試験管 にとり、 これらに 0.021M の p-ニ ト ロ フ； c二ルー な一 D-グ ルコ ビラノ シ ドを 200 u £ と 0. 1M 酢酸緩衝液（PH 5.5) 800 ju £を加えて 63 :でイ ンキュベー ト して、 経時的にそ れぞれの試験管に 2 w£の 0.1M の炭酸ソーダ溶液を加えて、 上清を適宜希釈して吸光度を 400nmで測定した。 結果を図 一 7 に示した。 本発明物質の熱安定性が明白である。
    [0097] 試験例 8
    [0098] 実施例 6で得た本発明物質 1.5mgと同様の方法によって 一サイ クロデキス ト リ ンのみを加えないで調製した物質 (コ ン ト ロ ール） の 3mgをそれぞれ試験管にとり、 これら に 0.021M の p-二 ト フユ二ルー 一D-グルコ ピラノ シ ド を 200 x ^と 0.1M 酢酸緩衝液 （ PH 6.0) 800 iを加え て 55ででィ ンキュペー ト して、 経時的にそれぞれの試験管 に 2 ^の 0, 1M の炭酸ソーダ溶液を加えて 2000rproで 1分 間遠心分雔したのち、 上清の吸光度を 400nraで測定した。 結果を図一 8に示した。 本発明物質の熱安定性が明白であ る。
    [0099] 試験例 9
    [0100] 実施例 6で得た本発明物質 lOmg と同様の方法によって 一サイ クロデキス ト リ ンのみを加えないで調製した物質 (コ ン ト ロ ール） の 20mg をそれぞれ試験管にとり、 これ らに 1 id 0. 05M酢酸緩衝液 （ PH 4. 6)を加えて、 40 ：〜 70 での各温度で 30分間加温し、 その後室温に冷却し、 l m£の 10%マル ト ース液を加え、 40tで 20分間反応させ、 その後 2 ^の 0.1N カセイ ソーダを加え、 その液から 100 ^を とり、 遊雜するグルコース量をグルコースォキシダーゼ法 で測定し、 40 での発色量に対する百分率を活性残存率と して図一 9に示した。 本発明物質の熱安定性が明白である。 試験例 10
    [0101] 実施例 7で得た本発明物質 2粒と同様の方法によってグ ルコ シルモラ ノ リ ンのみを加えないで調製した物質 （コ ン ト ロール） の 10粒をそれぞれ試験管にとり、 これらに 500 ·2の 0.05M リ ン酸緩衝液 （ PH 6.2)を加えて、 60で〜 75 tの各温度で 30分間加温し、 その後室温に冷却し、 0.2M の酢酸緩衝液 （ PH 4.5)に、 20mMの 一サイ クロデキス ト リ ンと lOOmMのシユ ークロースを溶解させたもの 250 X ^ と、 ダルコァミ ラーゼ溶液 （ダルコ了ミ ラーゼ （生化学ェ 業社製） 10mgを 0.2M 酢酸緩衝液（PH4.5)1.5 に溶解した もの） 250 ^を加えて、 40でで 30分間反応させ、 遊離さ 丄 γ P T/JP90/01395 れるグルコ ース量をグルコ ースォキシダーゼ法で測定し、 40 :での発色量に対する百分率を活性残存率として図一 10 に示した。 本発明物質の熱安定性が明白である。
    [0102] 試験例 11
    [0103] 実施例 8で得た本発明物質 500粒と、 同様の方法によつ てダルコ シル N -メチルモラノ リ ンのみを加えないで調製 した物質 （コ ン ト ロール） の 50粒をそれぞれ試験管にとり、 これらに 500 iの 0. 05Mのリ ン酸緩衝液 （ P H 6. 2)を加 えて、 60〜75 tの各温度で 30分間加温し、 その後室温に冷 却して、 0. 2M の酢酸緩衝液 （ P H 4. 5)に、 20mMの ーサ イ ク デキス ト リ ンと lOOraMのシュ一ク ロースを溶解させ たもの 250 £ とダルコア ミ ラーゼ溶液 （グルコア ミ ラー ゼ（ 生化学工業社製） 10mgを 0. 2M 酢酸緩衝液 （ PH 4. 5) 1. 5m£に溶液したもの） 250〃 ^を加えて、 40でで 30分間 反応させ、 遊錐されるグルコ ース量をグルコースォキシダ ーゼ法で測定し、 40ででの発色量に対する百分率を活性残 存率として図一 11に示した。
    [0104] 本発明物質の熱安定性が明らかである。
    [0105] 試験例 12
    [0106] 実施例 9で得た本発明物質 1粒と、 同様の方法によって 1 ーデォキシガラク トスタチンのみを加えないで調製した 物質 （コ ン ト ロー ） の 1粒をそれぞれ試験管にとり、
    [0107] 0. 02Mの 0 -二 ト σ·フ エ二ルー |3— D—ガラク ト ピラノ シ ド 溶液 （0. 1M酢酸緩衝液、 PH 5. 0) 1. 5m£を加えた。 これを 65 でイ ンキュベー ト して経時的にそれぞれの試験管に 2 ^の 0. 2M炭酸ソーダ溶液を加えた。 コ ン ト ロ ールは、 発色 の強さに応じて更に水で 10倍希釈して吸光度を 420nmで測 定した。 結果を図一 12に示した。
    [0108] 本発明物質の熱安定性が明らかである。
    [0109] 試験例 13
    [0110] 実施例 9で得た本究明物質 1粒.と、 同様の方法によって 1ーデォキシガラク トスタチンのみを加えないで調製した 物質 （コ ン ト ロ ール） の 1粒をそれぞれ試験管にとり、
    [0111] 1. 5m£の 0. 1M酢酸緩衝液（pH 5. 0〉を加えて、 50 t〜75 :の いくつかの温度で 30分間加温した。 その後、 室温に冷却し、
    [0112] 500〃 の 0. 02Μ 0-二 ト ロ フ ヱ二ルー /9一 D—ガラ ク ト ビラ ノ シド溶液 （0. 1M酢酸緩衝液、 5. 0) を加えて、 37 :で 15分間反応させた。 これに 2 m£の 0. 2M炭酸ソーダ溶液 を加えて、 吸光度を .420nmで測定し、 50 :での発色量に対 する百分率を活性残存率として図一 13に示した。
    [0113] 本発明物質の熱安定性が明らかである。
    [0114] 試験例 14
    [0115] 実施例 10で得た本発明物質 8粒と、 同様の方法によって 1, 4 -ジデォキシガラク ト スタチンのみを加えないで調製し た物質 （コ ン ト ロ ール） の 1粒をそれぞれ試験管にとり、.
    [0116] 0. 02Mの 0-二 ト π フ ヱニルー 3— D—ガラ ク ト ピラ ノ シ ド 溶液 （0. 1M酢酸緩衝液、 PH 5. 0) 500 ·2 と 0. 1M酢酸緩衝 液（ΡΗ 5. 0) 1. 5 を加えた。 これを 65ででイ ンキュベート して、 経時的にそれぞれの試験管に 2 ra£の 0, 2M炭酸ソ一ダ 溶液を加えた。 コ ン ト ロ ールは、 発色の強さに応じて更に 水で 10倍希釈して吸光度を 420nmで測定した。 結果を図一 14に示した。 本発明物質の熱安定性が明らかである。 試験例 15
    [0117] 実施例 10で得た本発明物質 8粒と、 同様の方法によって 1， 4-ジデォキシガラク トスタ チ ンのみを加えないで調製し た物質 （コ ン ト ロ ール） の 1粒をそれぞれ試験管にとり、 1. 5 ^の 0. 1M酢酸緩衝液（pH 5. 0)を加えて、 501：〜 75での いくつかの温度で 30分間加温した。 その後、 室温に冷却し、 500 μ 0. 02 o-二 ト ロ フ ヱ ニルー /9一 D—ガラク ト ビラ ノ シド溶液 （0. 1M酢酸緩衝液、 pH 5. 0) を加えて、 37 で 15分間反応させた。 これに 2 m£の 0. 2M炭酸ソーダ溶液 を加えて、 吸光度を 420nmで測定し、 50ででの発色量に対 する百分率を活性残存率として図一 15に示した。
    [0118] 本発明物質の熱安定性が明らかである。
    [0119] 試験例 16
    [0120] 実施例 11で得た本発明物質 2粒と、 同様の方法によって ダルコ シルモラノ リ ンのみを加えないで調製した物質 （コ ン ト ロ ール） の 10粒をそれぞれ試験管にとり、 2. 5m£の 0. 02M 酢酸緩衝液（P H 4. 8)と 2. 5 ^の 1 0 %可溶性澱粉溶液 を加えて、 651でイ ンキュベー ト した。 そして、 柽時的に 50 ·βをサンプリ ングし、 500 // ^の 3， 5 -ジニ ト ロサリチ ル酸溶液を加え、 5分間沸騰水中で加熱した後水冷した。 次いで、 永 5 を加え十分攪拌したのち吸光度を 535nmで 測定した。 結果を図一16に示.した。
    [0121] 本発明物質の熱安定性が明らかである。
    [0122] 試験例 17
    [0123] 実施例 11で得た本発明物質 5粒と、 同様の方法によって ダルコ シルモラノ リ ンのみを加えないで調製した物質 （コ ン ト ロール） の 10粒をそれぞれ試験管にとり、 250 £の 0. 02M 酢酸緩衝液（PH 4. 8)を加えて、 50 ：〜 75でのいくつ かの温度で 30分間加温した。 その後、 室温に冷却し、 250 ·βの 1 %可溶性澱粉溶液を加え、 更に 30でで 30分間反応 させた。 次いで、 1 m£の 3, 5-ジニ トロサ リ チル酸溶液を加 え、 5分間沸騰永中で加熱した後水冷し、 水 4. 5m£を加え て十分攪拌した。 そして、 吸光度を 535nmで測定し、 50 t での発色量に対する百分率を活性残存率として図一 17に示 しん o
    [0124] 本発明物質の熱安定性が明らかである。
    [0125] ( £1下次頁）
    [0126] 図面の簡単な説明
    [0127] 図一 1 は、 試験例 1 における結果を示す。 攀は実施例 1 で得た本発明物質を、 〇は同様の方法によってモラノ リ ン のみを加えないで調製した物質を、 それぞれ表す。 縦軸は 溶液の吸光度を、 横軸は経過時間 （時間） を、 それぞれ表 す。
    [0128] 図一 2 は、 試験例 2における結果を示す。 攀は実施例 1 で得た本発明物質を、 〇は同様の方法によってモラノ リ ン のみを加えないで調製した物質を、 それぞれ表す。 縦軸は 活性残存率を、 横軸は温度 （t ) を、 それぞれ表す。
    [0129] 図一 3 は、 試験例 3における結果を示す。 書は実施例 2 で得た本発明物質を、 〇は同様の方法によって N-メチルモ ラノ リ ンのみを加えないで調製した物質を、 それぞれ表す。 縦軸は溶液の吸光度を、 横軸は経過時問 （時簡） を、 それ ぞれ表す。
    [0130] 図一 4は、 試験例 4における結果を示す。 藝は実施例 2 で得た本発明物質を、 〇は同様の方法によって N-メチルモ ラノ リ ンのみを加えないで調製した物質を、 それぞれ表す。 縦軸は活性残存率を、 横軸は温度 （t: ) を、 それぞれ表す。
    [0131] 図一 5 は、 試験例 5 における結果を示す。 拳は実施例 3 で得た本発明物質を、 〇は同様の方法によってモラノ リ ン のみを加えないで調製した物質を、 それぞれ表す。 縦軸は 溶液の吸光度を、 横軸は経過時間 （時間） を、 それぞれ表 す。 図一 6は、 試験例 6における結果を示す。 攀は実施例 4 で得た本発明物質を、 〇は同様の方法によってモラノ リ ン のみを加えないで調製した物質を、 それぞれ表す。 縦軸は 溶液の吸光度を、 撗軸は経過時間 （時間） を、 それぞれ表 す。
    [0132] 図一 7 は、 試験例 7 における結果を示す。 攀は実施例 5 で得た本発明物質を、 〇は同様の方法によって N- (2—ハイ ドロシキエチル） モラノ tj ンのみを加えないで調製した物 質を、 それぞれ表す。 縦軸は溶液の吸光度を、 撗軸は経過 時間 （時間） を、 それぞれ表す。
    [0133] 図一 8は、 試験例 8における結果を示す。 書は実施例 6 で得た本発明物質を、 〇は同様の方法によってなーサイ ク ロデキス ト リ ンのみを加えないで調製した物質を、 それぞ れ表す。 縦軸は溶液の吸光度を、 横軸は経過時藺 （時間） を、 それぞれ表す。
    [0134] 図一 9 は、 試験例 9 における結果を示す。 馨は実施例 6 で得た本発明物質を、 〇は同様の方法によって α—サイ ク ロデキス ト リ ンのみを加えないで調製した物質を、 それぞ れ表す。 縦軸は活性残存率を、 横軸は温度 （t ) を、 それ ぞれ表す。
    [0135] 図一 10は、 試験例 10における結果を示す。 書は実施例 7 で得た本発明物質を、 〇は同様の方法によってダルコ シル モラノ リ ンのみを加えないで調製した物質を、 それぞれ表 す。 縦軸は活性残存率を、 横軸は温度 （で） を、 それぞれ 表す。
    [0136] 図一 11は、 試験例 11における結果を示す。 磨は実施例 8 で得た本発明物質を、 〇は同様の方法によってグルコ シル モラノ リ ンのみを加えないで調製した物質を、 それぞれ表 す。 縦軸は活性残存率を、 横軸は温度 （t ) を、 それぞれ 表す。
    [0137] 図一 12は、 試験例 12における結果を示す。 秦は実施例 9 で得た本発明物質を、 〇は同様の方法によって 1一デォキ シガラク トスタチンのみを加えないで調製した物質を、 そ れぞれ表す。 縱軸は溶液の吸光度を、 横軸は経過時間 （時 間） を、 それぞれ表す。
    [0138] 図一 13は、 試験例 13における結果を示す。 撃は実施例 9 で得た本発明物質を、 〇は同様の方法によって 1一デォキ シガラク トスタチンのみを加えないで調製した物質を、 そ れぞれ表す。 縦軸は活性残存率を、 横軸は温度 （t ) を、 それぞれ表す。
    [0139] 図一 Uは、 試験例 14における結果を示す。 撃は実施例 10 で得た本発明物質を、 〇は同様の方法によって 1, 4-ジデォ キシガラク トスタチンのみを加えないで調製した物質を、 それぞれ表す。 縦軸は溶液の吸光度を、 横軸は経過時藺 ( . 時間） を、 それぞれ表す。
    [0140] 図一 15は、 試験例 15における結果を示す。 書は実施例 10 で得た本発明物質を、 〇は同様の方法によって 1， 4-ジデォ キシガラク トスタチンのみを加えないで調製した物質を、 それぞれ表す。 縦軸は活性残存率を、 橫軸は温度 （t ) を、 それぞれ表す。
    [0141] 図一 16は、 試験例 16における結果を示す。 着は実施例 11 で得た本発明物質を、 '〇は同様の方法によってグルコ シル モラノ リ ンのみを加えないで調製した物質を、 それぞれ表 す。 縦軸は溶液の吸光度を、 横軸は経過時間 （時間） を、 それぞれ表す。
    [0142] 図一 17は、 試験例 Πにおける結果を示す。 書は実施例 11 で得た本発明物質を、 〇は同様の方法によってダルコ シル モラノ リ ンのみを加えないで調製した物質を、 それぞれ表 す。 縦軸は活性残存率を、 横軸は温度 （t ) を、 それぞれ 表す。
    [0143] 産業上の利用可能性
    [0144] 以上のように、 本発明によれば、 糖質関連酵素を安定化 するのに必要な安定化剤の使用量は、 従来よりも少なくて 済み、 反応系からの安定化剤の回収が容易にできる。 従つ て、 サイ ク πデキス ト リ ン、 グルコース、 マルト ース等の 糖質関連酵素を用いて製造される物質に対して、 工業上極 めて有用である。
    权利要求:
    Claims 請 求 の 範 囲
    1 . 担体の表面に酵素を固定させてなる固定化酵素であ つてその対象が糖質蘭連酵素であるものにおいて、 当該酵 素を安定化させる作用のある物質を同時に担体に固定化さ せることを特徴とする、 安定化固定化酵素。
    2 . 安定化させる作用のある物質が、 次の一般式 〔 I〕
    R
    〔 I〕
    (ここに Rは、 氷素、 低級アルキル、 ハイ ド πキシアルキ ル、 フ ヱニル了ルキル、 フ ヱ ニルァルケニル、 フ ヱニル了 ルキニル、 フ ヱノ キシアルキル、 フエノキシアルケニル又 はフ ヱノ キシアルキニルを表す。 ここにおけるフヱニルと は置換若しく は無置換のものを含むものとする。 Xは氷素 又はアキシアル若しく はェクア ト リ アルの水酸基を示す。 ) で表される化合物又はこれらのダルコースオ リ ゴマー、 である請求項 1記載の安定化面定化酵素。
    3 . 安定化させる作用のある物質が 一サイ クロデキス ト リ ンである、 請求項 1記載の安定化固定化酵素。
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    法律状态:
    1991-05-16| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IT LU NL SE |
    1991-05-16| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AU CA HU JP KR US |
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    1992-05-01| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 2072616 Country of ref document: CA |
    1992-08-19| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1990916059 Country of ref document: EP |
    1995-02-19| WWR| Wipo information: refused in national office|Ref document number: 1990916059 Country of ref document: EP |
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