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    公开号:WO1990002761A1
    申请号:PCT/JP1989/000936
    申请日:1989-09-13
    公开日:1990-03-22
    发明作者:Noriaki Endo；Yasuhiko Masuho；Takeshi Hara
    申请人:Teijin Limited；
    IPC主号:C07K16-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 発明の名称
    [0002] ヒト ■ モノクローナル抗体とその製造法 技術分野
    [0003] 本発明は、 ヒト癌に選択的に反応するヒト · モノクロ
    [0004] —ナスレ ίΛ体 (monoclonal antibody，以下 MCAと う ) とその製造法に鬨する。 その目的とするところは、 癌の 診断および治療に役立つところの、 ヒト癌およびヒト癌 に鬨連する糖蛋白質抗原または糖脂質抗原に対して反応 性を有するヒト MC Aを提供することにある。
    [0005] 背景技術
    [0006] 癌はその診断および治療法が確立されておらず、 より 優れた方法を開発すべく種々の試みがなされてきている , 中でも、 抗体を用いた診断および治療の試みは、
    [0007] Mil steinと Kohl erによって確立されたハイブリ ドーマ法 によって、 高純度の MC Aが作製できるようになって以 来、 多くの研究者によって行なわれてきた。
    [0008] かかる診断および治療において重要な要件の一つは抗 体の特異性である。 すなわち、 癌細胞および Zまたは癌 組織に対する反応性を有し、 かつ、 正常細胞および Zま たは組織との反応性が皆無または軽微であるか、 あるい は比較的限られた正常細胞および Zまたは組織とのみ反 応するような抗体が、 かかる診断， 予防および治療には 望まれる。 さらに、 抗体が多種の癌細胞および または 癌組織と反応することがその汎用性の観点から、 望まし いことが多い。
    [0009] ある種のガンダリオシド等の糖脂質あるいは糖蛋白質 等の糖鎖に対する抗体はかかる要件を満たす可能性があ る [例えば、 Hakomoriと Kaanagi,ジャーナル■ ォブ . ナ ショナル · キャンサー · インスティテュート （ <J. Natl. Cancer last. ) ， 第 71卷， 第 231-251 頁] 。
    [0010] 例ぇば1^0! 611-卩1^6(1611 1<；11抗原 （以下 T F抗原とい う 〉 は末端糖鎖と して、 抗原決定基のガラク卜ース （ ;3 1→3〉 N—ァセチルガラクトサミン （以下 1 β 1→ 3 Gal N Ac という 〉 を有することを特徴とする糖蛋白 質または糖脂質抗原であり、 各種のヒト癌組織に外部に 露呈した状態で存在する腫瘍関連抗原である [ G. F.
    [0011] Springer, サイエンス （ Science) , 第 224 卷， 第 1198- 1206頁， 1984年] 。 従って、 （Jal β 1→3 Gal N Ac を 有する糖蛋白質または糖脂質と反応する M C Aは、 癌の 診断， 治療の上で有用であると考えられる。
    [0012] Rahmanと Loagenecker [シヤーナル - ォブ · ィ ミュノ ロジー 〈 J. Imminol. ) , 第 129 卷， 第 2021-2024 頁， 1982年] は、 シァリダ一ゼ処理して末端糖鎖精造を Gal β l→ 3 Gal N A c と した糖蛋白質を有するヒト赤血球 でマウスを免疫し、 そのマウス脾細胞とマウス ， ミエ口 一マ細胞を融合することによって、 Gal β 1→ 3 « Gal N Ac 特異的 MCAを産生するハイプリ ドーマを作製し たが、 その後この MC Aはヒト癌細胞とは反応しないこ とが報告されている [Longenecker ら， インターナショ ナル ' ジャーナル ' ォブ ' キヤンサー （ Int. J. Cancer) 第 33卷， 第 123-129 頁， 84年参照] 。
    [0013] しかるにその後、 彼らは、 Gal β 1→ 3 Gal N Ac と 反応し、 かつヒト癌細胞に対する反応性を有する MCA の取得を報告している [例えば、 Longenecker ら， ジャ ーナル · ォブ ' ナショナル■ キャンサー ■ インステイチ ユート （ J, Natl. Cancer Inst. ) , 第 78卷， 第 489- 496 頁， 1987年] 。 かかる MCAは癌の診断， 治療にお ける有用性が期待される。 しかしながら、 これらはマウ ス由来の MC Αであり、 人体に投与したとき異物と して 認識され不都合な副作用を引き起こす可能性が強い。 そ こで、 末端糖鎖構造と して Gal yS 1→3 Gal N Ac を有 する糖蛋白質あるいは糖脂質と反応し、 かつヒ卜癌細胞 と反応する、 マウス由来ではなく、 ヒト由来の MCAの 創製が望まれる。 .
    [0014] 一方、 正常人の血清中には主と して IgM からなる自然 抗体と しての抗 TF抗体が存在することが知られており [Springer^ , ナツ一 レヴィ ッセンシャフテン
    [0015] ( aturwissenschaften) , 第 69卷， 第 346-348 頁， 1982 年] 、 Brayらが報告している如く （ J. I UHO 1.，第 126 卷， 第 1 6-1969 頁， 1981年） 、 TF抗原鬨連糖鎖など を用いた免疫吸着カラム等による、 かかる抗 TF抗体の ヒト血清中からの収集も可能と考えられる。 しかしなが ら血清中での存在量は少く、 かつ元来かかるヒト血液を その原料ソースと している場合には、 その安定な供耠に 難がある。 かかる点においても、 ヒト由来で、 Gal 1 →3 Gal N Ac を含有する糖蛋白質または糖脂質と反応 し、 かつヒト癌細胞と反応する MC Aの作製が望まれる が、 今までかかる MC Aの作製は成功していない。
    [0016] また、 Kabat らの報告 （ J. ImniMol.，第 128 卷， 第 540-544 頁， 1982年〉 によれば、 偶発性モノクローナル ァーグロプリン血症と肺癌を併発していた患者において たまたま体内で産生されていたラクトー N—テトラオ一 ス [ガラクト一ス （ 1→3 ) N—ァセチルダルコサミ ン （；3 1→3〉 ガラクトース （ 1→4 ) グルコース (以下 Gal 1→3 Gic N Ac β 1→ 3 Gal β 1→4 Glc という ） ] に対して特異的に反応するモノクローナ ル IgM 抗体のために、 その患者の進行肺癌が治癒し、 そ の後長期間癌の再発が見られなかったという例が知られ ている。 従ってラクト一N—テトラオースあるいはその 部分構造であるガラクト一ス （ 1—3 ) N—ァセチル ダルコサミン （以下 Gal >S l→3 Glc NAc という ） を 末端糖鎖構造として有するオリゴ糖または糖蛋白質また は糖脂質と反応する抗体は癌の治療に有用な可能性があ る。 ハイプリ ドーマ法等によるかかる反応性を有するヒ ト MCAの作製が望まれるが、 今までそのような MCA の作製は成功していない。
    [0017] 一般にヒト由来の MC Aはマウス · ミエローマ細胞， ヒト ■ ミエローマ細胞あるいは他のリンパ系樹立細胞と ヒト ' リンパ球とを細胞融合して得られるハイプリ ド一 マから産生される。 あるいはヒト · リンパ球を E Bウイ ルスによって形質転換させたリンパ芽球細胞からも産生 される。 80年から現在まで、 多くのヒト MCA作製の 試みがなされてきたが、 いずれの方法もそれぞれ固有の 問題をかかえている。 マウス · ミエローマとヒト . リン パ球との細胞融合で得られたハイブリ ド一マの MC A産 生は不安定であるし、 ヒト · ミエローマ細胞とヒト · リ ンパ球との細胞融合は極めて効率が悪い。 また E Bウイ ルスによって得られるリンパ芽球細胞の MC A産生は量 が少なく、 かつ不安定である。 その上、 E Bウィルスは 腫瘍を引き起こす能力を有しており、 安全性上問題があ る。 このように、 MC A産生細胞を樹立する技術におい て大きな障害があるが、 さらにヒト癌に選択的に反応す るヒト MCAを得るためにもいくつかの障害がある。 そ のうちの一つは、 いかにしてヒト癌に選択的に反応する ヒト MC Aを産生するハイプリ ドーマを選別取得するか という課題である。 一般に癌細胞自身との反応性で選別 した場合には、 ヒ ト癌に選択的に反応するヒト MC Aを 得る効率は非常に悪い。 発明の開示
    [0018] 本発明者らは、 腫瘍に鬨連した抗原物質中の糖鎖構造 と反応し、 かつヒト癌細胞に反応するヒト M C Aを取得 することを目的として鋭意研究を行なった結果、 in vitro でマイ ト一ジェン存在下に培養したヒ f ■ リンパ 球と、 マウス · ミエ口一マ細胞とを融合させ、 末端糖鎖 構造として Gal β l -→ 3 Gai N Ac を有する糖蛋白質ま たは糖脂質に対する反応性で先ず選別し、 ついでヒト癌 細胞との反応性を検討するとともに、 さらに種々の糖蛋 白質， 糖脂質， オリゴ糖などとの反応性を検索する方法 によって、 末端糖鏆構造として Gal β l→3 Gal N Ac および Zまたは Gal β l→ 3 Glc N A c を有するオリゴ 糖または糖蛋白質または糖脂質と反応し、 かつヒト癌細 胞と反応するヒト M C Aを産生するハイプリ ドーマを得 ることができた。 そして、 このハイプリ ドーマおよび Z またはそれに由来する細胞株を培養し、 培養上清から該 ヒト M C Aを取得することができた。 本発明のヒト M C Aは、 末端糖鎖楕造として Gal /3 1— 3 Gal N A c を有 する糖蛋白質 （例えばァシァログリコホリン Aおよびァ シァロフ ツインなど〉 または上記末端糖鎖構造を有す る糖脂質 （例えばガンダリオシド GM1， ガンダリオシド G Dlb など） 、 並びに末端糖鎖構造として Gai β 1— 3 Glc N Ac を有するオリゴ糖 （例えばラクト一 N—テト ラオースなど） または上記末端糖鎖構造を有する糖蛋白 質 （例えば Gal β l→3 Glc Ν Ac を結合したゥシ血清 アルブミンなど） または上記末端糖鎖構造を有する糖脂 質 （例えばラクトテトラオシルセラミ ドなど） と反応し さらにはヒト癌細胞、 例えばヒト結腸癌細胞およびヒト 乳癌細胞などと反応する抗体である。
    [0019] 発明を実施するための最良の形態
    [0020] ヒト ■ リンパ球は脾臓， リンパ節， 末梢血， 骨髄， 扁 桃， アデノィ ド等の中に含まれている。 本発明の目的の ためには、 いかなるソースのリンパ球でも用いることが できるが、 脾臓， リンパ節または扁桃のリンパ球が特に 適している。
    [0021] マウスのミエローマ細胞と しては、 8—ァザグァニン 耐性株を用いるのが有利であり、 公知のものでは、 BALB /cマウスの P3X 65Ag8株， P3-NSl/l-Ag4-l株， P3x63Ag ϋΐ株, SP2/0Agl4 株， P3x63Ag8.6.5.3 株， MPC11-45. 6. TGI.7 株， SP-1株等を用いることができる。
    [0022] 本発明においては、 ヒトのリンパ球とマウスのミエ口 —マ細胞とを融合させるに先立って、 望ましくはヒトの リンパ球を in vitroでマイ ト一ジェン存在下に培養する。 マイ ト一ジェンと しては、 リンパ球の分化及び増殖を 促進させるものならば何でもよいが、 例えば、 ポ一ク - ウイ一ド . マイ トジェン （ PWM〉 ， B細胞増殖因子（B cell growth factor, BCGF) ， プロテイ ン A， フイ トへ ムァグルチニン （ P HA ) , コンカナバリン Aを用いる ことができる。 特に好ましいのは 2 〜200 /mlの P WMあるいは 10り 分の 1容から 3分の 1容の BCGFである さらに、 Gal β 1→ 3 Gal N Ac および/または Gal β l→ 3 Glc N Ac を末端糖鎖構造として有する糖蛋白 質または糖脂質、 あるいはかかる糖蛋白質または糖脂質 を細胞表面に有する細胞などを抗原ソースとして共存さ せて、 リンパ球を培養してもよい。
    [0023] リンパ球の培養の条件は特に限定されるものではない が、 リンパ球の濃度は 1 X 105 〜1 X 107 個 mlが適当 であり、 培養温度は 35〜4G Cで培養時間は 4〜1G日、 好 ましくはら〜 8日である。 培養液としてはヒト， ゥシ， ゥマ等の血清および Zまたはかかる血清成分を含むもの が用いられる。
    [0024] かくして得られたヒトの抗体産生細胞 （リンパ球） と マウスのミエ口一マ細胞とは、 次いで公知の方法に従つ て細胞融合せしめられる。 例えば、 リンパ球とミエ口一 マ細胞を 10 : 1〜1 ： 100 、 好ましくは.1 ： 1〜1 ： 10 の比率で混合し、 適当な細胞融合溶液、 例えば約 35%ポ リエチレンダリコール （分子量 1, 000 〜6, 000 程度〉 お よび約 7. 5 %ジメチルスルホキシドを含む R P M I 1640 を加えて、 室温〜 37°Cで 1〜数分間撹拌し、 その後 10% ゥシ胎児血清加 R P M I 4Qで徐々に希釈し、 洗浄の後 H A T (ヒポキサンチン一アミノプテリン一チミジン） 選択培養液にて細胞濃度が 1〜5 X 105 個 Zmlとなるよ うに調整する。 これを 0.2 mlずつ、 例えば 穴プレート に分注し、 5%C02を含む空気中で 35〜38でで 3〜4週 間培養する。 HAT培養液中ではハイプリ ドーマのみが 生存し、 8—ァザグァニン耐性のミエローマ細胞及びミ エロ一マ同士の融合細胞は生存し得ない （未融合の抗体 産生細胞は数日で死滅する〉 。
    [0025] 培養後、 培養液中の抗体価をチ ックし、 目的とする 抗体を産生しているハイプリ ドーマのみを選択し単離す る （クローニング） 。 培養液中の抗体価のチェックは、 例えばラジオィムノアツセィ法 （ R I A ) ， 酵素抗体法 ( E L I SA ) , 螢光抗体法などの方法で行なうことが できる。 抗原と して Gal ^ l→3Gal NAc を末端糖鎖 構造と して有する糖蛋白質および糖脂質、 例えばァシァ ログリコホリン A， ァシァ口フェツイン， ガングリオシ ド GM1， GDlb を用い、 かかる抗原に対して反応する M C Aを産生するハイプリ ドーマを選択し、 しかる後に、 かかる検出法にて選択されたハイプリ ドーマの培養上清 にっき、 さらに種々の糖蛋白質， 糖脂質， オリゴ糖など との反応性、 並びにヒト癌細胞およびヒト正常細胞との 反応性を検討することによ り、 末端糖鎖構造と して 1 β 1 -→ 3 Gal N A c および Zまたは Gal β 1 -→ 3 Glc N Ac を有するオリゴ糖糖蛋白質または糖脂質と反応し、 かつヒト癌細胞と反応するヒト MC Aを産生するハイブ リ ドーマを効率よく得ることができる。 ヒ ト癌細胞との 反応性は、 例えば R I A法， E L I S A法， 蛍光抗体法 などの方法で行なうことができる。
    [0026] クロ一ニングによって選択された、 本発明の抗ヒト癌 ヒト MC Aを産生するマウスーヒトハイプリ ドーマは、 凍結して保存することができる。 かかるハイプリ ドーマ のセルライン （細胞株） およびノまたはそれに由来する 細胞株を、 例えば適当な方法で大量に培養すると、 培養 上清から本発明の目的とするヒト MC Aを得ることがで きる。
    [0027] 以上の如く して得られた本発明のヒト MC Aは、 次の ような特性を有する。 本発明で得られたヒ卜 MC Aは、 末端糖鎖構造と して Gal β l→3Gal N Ac および ま たは Gal β l→3Glc N Ac を有する糖蛋白質、 例えば ァシァログリコホリン A, ァシァ口フェツイン， Gal β 1→3 Glc N Ac を結合せしめたゥシ血清アルブミンな どとは反応するが、 Gal β l→3Gal N Ac にシアル酸 が結合した糖鎖構造を有するグリコホリン A, フ ツイ ンおよび Gal β 1→ 3 Gal N Ac と Gal 1→3 Glc N Ac のいずれをも含有しない糖蛋白質、 例えばゥシのチ ログロブリンあるいは酸処理によりシアル酸をはずした ヒトの《 i —酸性糖蛋白質などとは全く反応しないか、 または軽微の反応性を示すのみである。 さらには、 ガン グリ才シドとの反応性において、 Gal β 1→ 3 Gal N Ac を末端に有する GM1， GDlb とは反応するが、 末 端ガラク トースにシアル酸の結合した GTlb および Gal β 1→ 3 Gal N A c を含まない GM2， GM3などとは全く 反応しない。 また、 オリゴ糖との反応性において、 末端 に Gal β 1→ 3 Glc N A c を有するもの、 例えばラクト — N—テトラオース， Gal β 1→ 3 Gal N A c a 1 - O M e などが強い反応性を示す。 一方、 ヒト由来の細胞株 に対する反応性では、 癌細胞、 例えば多くの結腸癌細胞 乳癌細胞とは反応するが、 正常細胞、 例えば線維芽細胞: リンパ球とは反応しない。 従って本発明にて得られたヒ ト M C Aは、 末端糖鎖構造として Gal /3 1→ 3 Gal
    [0028] N A c および/"または Gal β 1→ 3 Glc N A c を有する オリゴ糖または糖蛋白質または糖脂質と反応し、 かつヒ ト癌細胞と反応する特性を有する抗体である。 かかる特 性を有する抗癌ヒト M C Aはこれまで全く作られたこと はなく、 本発明において初めて得られたものである。
    [0029] 以下、 実施例により本発明を詳述する。 実施例 1
    [0030] (1) ヒ卜 . リンパ球の培養
    [0031] ヒ トの扁桃リンパ球を培養液 A ( RPMI 1640 + 10%胎児 ゥシ血清 + 2 mMグルタミン + 1 mM ピルビン酸ナトリウ ム + 0.02iuZmlセリン + 80 g Zmlゲンタマイシン） に 浮遊させた。 細胞漶度は 12X 105 個 ロであった。 この 細胞浮遊液を l inlずつ、 培養プレート （ 24穴） の 5穴に 入れた。 各穴には最終濃度が 20 x g Zmlとなるように P WMを添加し、 この培養プレートを 37 ， 5%C02含有 空気中で 6日間培養した。
    [0032] (2) マウス ' ミエローマ細胞 P 3 x Ag8 U 1株
    [0033] ( P 3 U 1と略記する〉 との細胞融合
    [0034] 前もって P 3 U 1を培養液 B ( G I T培地 +80t g / mlゲンタマイシン） 中で培養しておいた。 使用時の細胞 濟 ί¾は 6 X105 個 Zmlであった。 上記 {1} の培養リンパ 球 （ 5穴を一緒にした〉 と P 3 U 1を、 それぞれ別々に 無血清 R P M I 1640で 2回洗浄した。 こう して得たリン パ球と 2 X 107 個の P 3 U 1 とを試験管の中で一緒にし、 1500 rpm で 5分間遠心し、 上清を捨てた。 細胞ペレツト を、 試験管をたたくことによって、 よく分散させた。 こ れに 0.5 mlのポリエチレングリコール液 （ R P M I 1640 5, 75ml +ポリエチレングリコール 1000 3.5 ml十ジメチ ルスルホキサイ ド 0.75ml〉 （以下、 P E G液という 〉 を 加えて'、 細胞をゆるやかに浮遊させた。 1分後に 0.5 ml R P M 1 1640を加え、 さらに 1分後に 1 ml R P M I、 さ らに 2分後に 4 mlの H AT培養液 （ G I T培地 +8( g Zmlゲンタマイシン + 95 Mヒポキサンチン + 0.4 JUL M アミノアテリン +1.6 Mチミジン） 、 さらに 2分後に は 4 mlの H A T培養液を加えた。 最後に、 HAT培養液 で 100 ml細胞浮遊液と した。 これを培養プレート （ 96穴） 5枚に蒔いて、 VTC、 5%C02含有空気中で培養した。 1週間毎に半量の培養液を新しい HT培養液 （ HATか らアミノアテリンを除去したもの） で交換していきハイ プリ ド一マを得た。
    [0035] (3) 抗体活性の測定
    [0036] E L I S Aによって測定した。 抗原と して 1 Mホウ 酸バッファ一 （pH 8.6) に溶解したァシァ口フエツイン (シグマ社より購入〉 10 g Zmlを、 100 j ^ Z穴ずつ それぞれファルコン · ミクロテスト ] Πの 96穴ァレートに 固定して用いた。 このプレ一卜にハイブリ ド一マ培養上 清 50 ϋ を加えて、 室温で 1時間放置した。 1 %ゥシ血 清アルブミン （以下 B S Αという ） を含有するハンクス 塩類緩衝液 （以下、 H B S S— Bという ） で 3回洗浄の 後、 ャギ抗ヒト IgM 抗体一アル力リホスファタ一ゼ複合 体 （ 2000倍希釈液〉 を 50 ϋ 加えて、 室温で 1時間反応 させた。 さらに H B S S— Βで 3回洗浄したのち、 Ρ — ニトロフエニルホスフェートを 1 Μジエタノールアミン + l mM gCl2 の pH9.8 溶液に 0.6mg Zmlの割合で溶か した溶液 100 を加えた。 30分から 60分後に 405nm の 吸光度を測定し、 抗体活性陽性のハイプリ ドーマを選別 した。
    [0037] (4) ハイブリ ドーマのクローニング
    [0038] クローニングは限定希釈法を用いた。 抗ァシァロフエ ツイン抗体陽性の穴よ り細胞を取り出し、 細胞数を数え、 培養液 Bを用いて 2個. Z穴あるいは 10個 Z穴で細胞を蒔 いた。 2週間後に細胞が十分増殖した時点で、 その上清 の抗ァシァロフエツイン抗体価を E L I S Aによって測 定し、 MC A産生ハイプリ ドーマを選別した。
    [0039] こう して、 ハイプリ ドーマ 11-50 が樹立された。 この ハイプリ ド一マは安定に IgM 型の MCAを産生し続けて いる。 ハイプリ ドーマ 11-50 は、 工業技術院微生物工業 技術研究所に昭和 6 3年 9月 2 9日に微ェ研菌寄第 10303 号 （FERM P-10303) として寄託された。 実施例 2
    [0040] (1) ハイプリ ドーマ 11-50 産生 MC Aの各種糖蛋白との 反応性
    [0041] ァシァログリコホリン， ァシァ口フェツイン， ゥシ - チログロブリン （以上シグマ社より購入） およびヒ卜 a i —酸性糖蛋白 （シグマ社より購入） を 0· 1 N HC1 にて 80で， 1時間処理して作製したァシァ口 α i —酸性 糖蛋白の 4種の糖蛋白を抗原として E L I SAを行なつ た。 これら抗原蛋白は 100， 10, 1, .0. i I /ml ( 0.1 M ホウ酸バッファー， PH 8.6)に調製し、 100 Ζ穴ず つそれぞれファルコン ' ミクロテスト IIの 穴プレート に固定して用いた。 その後の手順は、 実施例 1一（3) に 記載した方法に準じて行なった。 その結果を第 1表に示 した。
    [0042] ハイプリ ドーマ 11-50 産生 MCAは Gal 1→ 3 Gal N Ac を末端に有するァシァログリコホリン， ァシァ口 フェツインと強く反応したが、 Gal a 1→4 Gal を多量 に有するゥシ ' チログロブリンおよび Ga! β 1→4 Gic N Ac を多量に有するァシァ口" i 一酸性糖蛋白とは全 く反応しないか、 軽微の反応を示すのみであった。 また Gal β 1→ 3 Gal N Ac または Gal β 1→3 Glc N A c を B S Aに結合した糖蛋白と共に強く反応した。
    [0043] 1
    [0044]
    [0045] *1 値は、 405nm の吸収を示す。
    [0046] *2 Gal β 1→3 Gal N Ac を結合した B SA (ピアス社より購入）
    [0047] *3 Gal β 1→ 3 Glc N Ac を結合した B SA (ピアス社よ り購入〉
    [0048] (2) ハイプリ ドーマ 11-50 産生 MC Aの各種糖脂質との 反応
    [0049] 第 2表に記載した糖脂質を、 クロ口ホルム一メタノー ル （ 1 ： 2 〉 混液に 0.625 mg/ml , 1.25mg/ml , 2.5 mg /ml , 5mg/' mlになるように溶解した溶液を、 50 α Ζ 穴ずっフアルコン · ミクロテスト ΙΠプレートに入れ、 風 乾後抗原プレートと して用いた。 その後は実施例 1 一 (3) に準じて行なった。 その結果を第 2表に示した。 ハイプリ ド一マ 11-50 産生 M C Aは Gal β 1→ 3 Gal N A c を末端に有するガンダリオシド GM1， GDlb と強 く反応した。 ^
    [0050]
    [0051] *1 値は、 405nm の吸収を示す 実施例 3
    [0052] 各種ヒト細胞との反応
    [0053] (1) 培養ヒト細胞株との反応
    [0054] 各種ヒト培養細胞株に、 ハイプリ ドーマ 産生ヒ ト MCAを反応させた。 さらにフルォレツセンイソチォ シァネイ ト ( f luoresceinisot io-cyanate, F I T C ) 標識抗ヒト IS 抗体を反応させ、 蛍光顕微鏡下で観察し た。 その結果、 該 MCAは LS174T, HT29などの結腸癌細 胞、 KNS-62などの肺癌細胞および T47Dなどの乳癌細胞の 細胞膜と強く反応することが確認された。
    [0055] (2) シァリダーゼ処理ヒ卜 · リンパ球との反応
    [0056] シァリダーゼ （シグマ社より購入， TypeV ) l UZml にて 37で， 45分間処理したヒト脾細胞と未処理の脾細胞 に対するハイプリ ドーマ 11-50 産生 MC Aの反応性を、 実施例 3—（1) に記載した間接蛍光抗体法により調べた, その結果、 該 MCAは、 シァリダーゼ処理した脾細胞と のみ強く反応することが確認された。 実施例 4
    [0057] (1) 各種糖蛋白による、 ハイプリ ドーマ 11-50 産生 MC Aのヒ 卜結腸癌細胞株 SW48G に対する反応性の阻害 ハイプリ ドーマ 11-50 培養上清を H B S S— Bにて 30 倍に希釈した溶液 と H B S S— Bにて段階希釈し た各種糖蛋白 （第 3表に記載した） 溶液 5θ χ を予め混 合した後その 50 を、 ヒ ト結腸癌細胞株 〈大日 本製薬より購入〉 をグルタールアルデヒドを用いて付着 後固定した 96穴ァレートに加えて、 室温で 1時間放置し た。 その後の手順は、 実施例 1一（3) に記載した方法に 準じて行なった。 その結果を第 3表に示した。
    [0058] Gal β 1→3 Glc N Ac を結合した B S Aが最も強い 阻害活性を示し、 次いでァシァログリコホリン， Gal β l→3 Gal N Ac を結合した B S Aが強い阻害活性を示 し、 次いでァシァロフヱツイ ンに阻害活性が見られた。 これに対して、 ゥシ · チログロブリンおよびァシァ口 ！ 一酸性糖蛋白および末端のガラクトース残基にシァ ル酸の結合したグリコホリンおよびフェツインには全く 阻害活性が認められなかった。
    [0059] 第 3 表
    [0060]
    [0061] *1 値は％阻害を示す。
    [0062] %阻害は以下の式より算出した 阻害剤存在下の A405
    [0063] %阻害二 ( 1 ■ ) X 100 阻害剤非存在下の A405
    [0064] (2) 各種ォリゴ糖による、 ハイプリ ドーマ 11-50 産生 M C Aのヒト結腸癌細胞株 SW48G に対する反応性の阻
    [0065] H B S S— Bにて段階希釈した各種オリゴ糖 （第 4表 に記載した〉 を用い、 実施例 4一（1) に記載した方法 準じて行なった。 その結果を第 4表に示した。 第 4 表
    [0066]
    [0067] *1 M C Aの癌細胞への結合を 50%阻害するオリ ゴ糖の濃度
    [0068] *2 BioCar 社より購入 ラクトー N—テトラオースが最も強い阻害効果を示し 次いで Gal β 1→ 3 Gal N A c « 1 - O M e が強い阻害 効果を示した。 かかる二種のォリゴ糖が有意の阻害効果 を示す濃度範囲において、 他のオリゴ糖は全くあるいは ほとんど阻害効果を示さなかった。
    [0069] 以上（1) ， (2) の結果よ り、 ハイプリ ドーマ 11- 50が産 生する M C Aは末端糖鎖構造の Gal β 1→ 3 Gl c N A c および Gal β 1→3 Gal N Ac に反応性を有しているこ とが示された。 実施例 5
    [0070] ハイブリ ドーマ 11-50 産生 MC Aのアイソタイアの 同定
    [0071] ヒト MCAのアイソタイアの同定は以下の如く行なつ た。 すなわち、 抗原としてァシァ口フェツインを用い、 2次抗体に、 アルカリホスファターゼで標識したャギ抗 ヒト IgM ないしはヒト IgG 、 ないしはヒ ト 鎖ないしは ヒトス鎖を用いた E L I S Aを行なった。 その結果、 該 ハイプリ ドーマのアイソタイプは IgM , λと同定された 産業上の利用可能性
    [0072] 本発明のヒ卜 · モノクローナル抗体はヒ卜癌に選択的 に反応するので、 癌の診断、 治療などの分野で有用であ ると思われる。
    权利要求:
    Claims請求の範囲
    1. 末端糖鎖構造と して、 ガラクト一ス （ /3 1→3 〉 N --ァセチルガラクトサミンおよび Zまたはガラクトー ス （；3 1→3〉 N —ァセチルダルコサミン—を有するォ リゴ糖または糖蛋白質または糖脂質と反応し、 かつヒ ト癌細胞と反応するヒト · モノクローナル抗体。
    2. I gM 型の請求の範囲第 1項記載のヒト ■ モノクロ一 ナル抗体。
    3. 工業技術院微生物工業技術研究所に微ェ研菌寄第
    10303 号 （ PERM P- 1 0303 ) と して寄託されたハイプリ ドーマ 1 1 - 50 によって産生される請求の範囲第 2項記 載のヒト ■ モノクローナル抗体。
    4. ヒ ト . リンパ球とマウス ■ ミエ口一マ細胞とを細胞 融合させ、 得られたハイプリ ド一マの中から、 末端糖 鎖構造と してガラクト一ス （ 5 1→3 〉 N —ァセチル ガラクトサミンおよびノまたはガラクト一ス （ 1→ 3 ) N—ァセチルダルコサミンを有するオリゴ糖また は糖蛋白質または糖脂質と反応し、 かつヒト癌細胞と 反応するヒト . モノクローナル抗体を産生するハイブ リ ドーマを選別し、 次いでかかるハイプリ ドーマおよ び Zまたはそれに由来する細胞株を培養し、 培養上清 からヒ ト ■ モノクローナル抗体を採取することを特徴 とするヒト · モノクローナル抗体の製造法
    5. ハイプリドーマが工業技術院微生物工業技術研究所 に微ェ研菌寄第 10303 号 （FERM P-10303) と して寄託 されたハイプリ ドーマ 11-50 である、 請求の範囲第 4 項記載のヒト · モノクロ一ナル抗体の製造法。
    6. 末端糖鎖構造としてガラクトース （ 3 1→3〉 N— ァセチルガラクトサミンおよびノまたはガラクトース
    { β 1→3 ) Ν—ァセチルダルコサミンを有するオリ ゴ糖または糖蛋白質または糖脂質と反応し、 かつヒト 癌細胞と反応するヒト ■ モノクローナル抗体を産生す るハイブリ ドーマ。
    7. 工業技術院微生物工業技術研究所に微ェ研菌寄第
    10303 号 （FEilM P-10303) として寄託された請求の範 囲第 6項記載のハイプリ ドーマ （ハイプリ ド一マ
    50} 。
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    EP0407586A1|1991-01-16|
    EP0407586A4|1991-01-30|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1990-03-22| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): JP US |
    1990-03-22| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CH DE FR GB IT NL SE |
    1990-05-10| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1989910188 Country of ref document: EP |
    1991-01-16| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1989910188 Country of ref document: EP |
    1992-04-28| WWW| Wipo information: withdrawn in national office|Ref document number: 1989910188 Country of ref document: EP |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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