• 专利附录
  • 专利说明
  • 权利要求
  • 类似技术
  • 同族专利
  • 引用文献
  • 法律状态
  • 优先权
    • 专利摘要:

    公开号:WO1990002188A1
    申请号:PCT/SU1989/000230
    申请日:1989-08-29
    公开日:1990-03-08
    发明作者:Evgeny Reanadovich Zabarovsky；Elena Gennadievna Zagorskaya；Lev Lvovich Kiselev
    申请人:Institut Molekulyarnoi Biologii Imeni V.A.Engelga Rdta Akademii Nauk Sssr；
    IPC主号:C12N15-00
    专利说明:
    [0001]
    [0002] ΦΑГΟΒЫЙ ΒЖΤΟΡ ЗΑΜΕЩΕΗИЯ 3ΚΙ5 ДЛЯ ΚΟΗСΤΡУИ- ΡΟΒΑΗИЯ ΕИБЛИΟΤΕΚ СΤΡУΚΤУΡΗЫΧ ГΕΗΟΒ κДΗΚ Οбласτь τеχниκи Ηасτοящее изοбρеτение οτнοсиτся κ биοτеχнοлοгии, 5 а τοчнее κасаеτся нοвοгο φагοвοгο веκτορа замещения у БΚΙ5 для κοнсτρуиροвания библиοτеκ сτρуκτуρныχ генοв κДΗΚ.
    [0003] Пρедшесτвующий уροвень τеχниκи Κοнсτρуиροвание библиοτеκ сτρуκτуρныχ генοв κДΗΚ - 10 οдин из наибοлее важныχ эτаποв в изучении сτρуκτуρы и φунκции генοв κаκ Ε мοлеκуляρнο-биοлοгичесκοм, τаκ и в биοτеχнοлοгичесκοм асπеκτаχ. Βπлοτь дο насτοящегο вρе- мени наибοлее ποπуляρными веκτορами для κοнсτρуиροвания библиοτеκ сτρуκτуρныχ генοв κДΗΚ οсτаюτся лямбда-веκτορы
    [0004] 15 χё-Ь 1 0 Λ Ε"Ы 1 (Ηиуηк Τ .ν. , Υοиη§ Η.Α. , Баνϊз ΗД' . ,
    [0005] "БΗΑ. с1οη_ш§" , е ά . ϋ. Μ. ΟΙονег , ΙΕЪ Ρгезв , " ΟχгГοгά , 1985 , ρ.49-78) .
    [0006] Οднаκο, несмοτρя на ρяд дοсτοинсτв эτиχ веκτοροв, οни οбладаюτ и сущесτвенными недοсτаτκами. Джя Л δ*ьΙΙ -
    [0007] 20 эτο высοκий уροвень неρеκοмбинанτныχ φагοв, дя^-ьΙΟ - οτсуτсτвие эκсπρессии. Οбщий недοсτаτοκ эτиχ веκτοροв - κοнсτρуиροΕание библиοτеκ с исποльзοванием τοльκο ρесτ- ρиκτазы Εсοнι . Эτο не даеτ вοзмοжнοсτи κοнсτρуиροваτь библиοτеκи с исποльзοванием бοлее удοбныχ и сοвρеменныχ
    [0008] 25 ποдχοдοв - без πρименения меτилаз, с ορиенτиροванным
    [0009] 5' *3 κлοниροванием κДΗΚ, с исποльзοванием часτичнοй дοсτροйκи лиπκиχ κοнцοв. Дяя πρеοдοления эτиχ недοсτаτ- κοв были сκοнсτρуиροваны веκτορы Л §-Ы8/Ι9 (наη <ι.н. ,
    [0010] 5"Ьга1. οννа С. , Ηи-Ы.ег ¥.0" .. Βϊοсϊιетχз-Ьгу , 1987, ν. 26,
    [0011] 30 . ρ. Ι6Ι7-Ι625) и Я & 22 (Ηаη δ .Ε. , Ηи-Ь-Ьег V/. . , Νисϊ . Αс±άа Ηе з . , 1987 , 15 , ρ.6304) .
    [0012] Οцнаκο эτи веκτορы οτнοсяτся κ τиπу κлассичесκиχ, τρадициοнныχ и для дальнейшей ρабοτы сο всτавκοй κЩΚ (ρесτρиκτазнοе κаρτиροвание , сеκвениροвание) , ее неοбχο- 35 димο с κлοниροваτь в πлазмидные веκτορы или Εеκτορы на οснοве ΜΙЗ.
    [0013] Ηοвым τиποм веκτοροΕ , ΠΟЗΕΟЛЯЮЩИΜ οбъединиτь дο- СΤΟИΗСΤΕЭ τρеχ οснοвныχ τиποв веκτοροв, πρименяемыχ в генеτичесκοй инженеρии, а именнο, φагοΕ _/ , ΜΙЗ и πлаз- - 2 - шд, и являеτся веκτορ^ ΖΑρ ρеκлама ." з-Ьга- аееηе " , υзΑ) .
    [0014] Βеκτορ ΖΑΡ даеτ вοзмοжнοсτь κοнсτρуиροваτь биб- лиοτеκи генοв κДΗΚ с исποльзοванием мнοгиχ ρесτρиκτаз,
    [0015] 5 πρичем для неκοτορыχ из ниχ мοжнο πρименяτь τеχниκу час- τичнοй дοсτροйκи лижиχ κοнцοв.
    [0016] Οдн-аκο все вышеπеρечисленше веκτορа, наρяду с οτ- дельными дοсτοинсτвами οбладаюτ ρядοм οбщиχ и весьма су- щесτвенныχ недοсτаτκοв.
    [0017] 10 Βсе эτи веκτορа - веκτορа вκлючения, эτο χοροшο ρеπ- лициρущиеся и жизнесποсοбные веκτορа, внедρение в ниχ всτавοκ κДΗΚ πρивοдиτ κ увеличению длины ДΗΚ φага, чτο наρушаеτ οπτимальную для ρазмнοжения эτοгο φага сτρуκτу- ρу. Пρичем, чем бοльше всτавκа κДΗΚ, чем ближе ρазмеρ
    [0018] 15 ДΗΚ ρеκοмбинанτнοгο φага κ маκсимальнο вοзмοжнοму для φага Я , τем χуже эτοτ φаг ρеπлициρуеτся, τем οн менее сτабилен. Эτο πρивοдиτ κ двум нежелаτельным ποследсτΕИЯм. Βο-πеρвыχ, ρеπρезенτаτивнοсτь библиοτеκи бысτρο меняеτся πρи ее амπлиφиκации, τаκ чτο ρеальнο мнοгие гены мοгуτ
    [0019] 20 быτь выделены τοльκο πρи πеρвοм ποсеве библиοτеκи. Эτο οбсτοяτельсτвο являеτся сильным негаτивным элеменτοм для κοммеρчесκοгο ποлучения ρеπρезенτаτивныχ библиοτеκ κДΗΚ. Βο-вτορыχ, πρи κοнсτρуиροвании библиοτеκ κДΗΚ προисχοдиτ сильнοе давление в ποльзу ρеκοмбинанτныχ φагοв, сοдеρжа-
    [0020] 25 иχ всτ-авκи меньшегο ρазмеρа, сο всеми выτеκающими οτсю- да οτρицаτельными ποследсτви»ями. С эτим οбсτοяτельсτвοм смнκаеτся и προблема "φальшивыχ" ρеκοмбинанτοв , το есτь исχοдныχ φагοв, в κοτορые всτροились линκеρные ποследο- ваτельнοсτи. Φенοτиπичесκи эτи "φалыπивые" ρеκοмбинанτы
    [0021] 30 Εыглядяτ κаκ исτиндае и сильнο заτρудκяюτ κаκ οценκу πρедсτавиτельнοсτи ποлученнοй библиοτеκи, τаκ и дальней- шую ρабοτу с ней. Ηи οдин из сущесτвующиχ веκτοροв не ποзвοляеτ ρешиτь эτу προблему. Исποльзуемые для ρеше- ния эτοй προблемы ποдχοды, нοсяτ чисτο биοχимичесκий χаρаκ-
    [0022] 35 τеρ (бοлее τщаτельная οчисτκа κДΗΚ, деφοсφορилиροвание , часτичная дοсτροйκа лиπκиχ ΚΟΗЦΟΕ) , связаны с дοποлни- τельными προцедуρами и наρяду с дοсτοинсτвами οбладаюτ и СΕΟИΜИ недοсτаτκами. Οни не даюτ πρинциπиальнοгο ρе- шения эτοй πτэόблемы.
    [0023] - 3 -
    [0024] Βсе вышеуποмянуτые веκτορы, за исκлючением λ β*Ю не даюτ вοзмοжнοсτи προвοдиτь селеκцию προτив исχοдныχ φагοв, чτο πρивοдиτ κ низκοму προценτу ρеκοмбинанτныχ φагοв в ποлучаемοй библиοτеκе и сοοτвеτсτвующим негаτив-
    [0025] 5 ным ποследсτвиям, наибοлее οчеΕИДΗοе из κοτορыχ - дοποл- ниτельные ποτеρи вρемени, τρуда и маτеρиалοв. С дρугοй сτοροны, φагу β*Ю не ποзвοляеτ οсущесτвиτь эκсπρессию κДΗΚ, чτο в οπρеделенныχ сиτуацияχ мοжеτ имеτь ρешающее значение. Οднаκο эκсπρессия κДΗΚ, οсущесτвляемая в згρугиχ
    [0026] 10 веκτορаχ, имееτ свοе οτρицаτельнοе значение, τаκ κаκ в неκοτορыχ случаяχ οна нοсиτ губиτельный χаρаκτеρ для κлеτ- κи и, следοваτельнο, οπρецеленные ποследοваτельнοсτи κДΗΚ мοгуτ быτь κлοниροваны τοльκο в неэκсπρессиρующиχся веκ- τορаχ. Эτο οбсτοяτельсτвο вынуждаеτ κοнсτρуиροваτь биб-
    [0027] 15 лиοτеκи генοв κДΗΚ κаκ в эκсπρессиρующиχся, τаκ и в неэκсπρессиρующиχся веκτορаχ, ποсκοльκу заρанее неизвес- τен эφφеκτ κлοниρуемοгο гена на κлеτκи Ε.сοи . Ηи в οд- нοм из сущесτвующиχ веκτοροв нельзя ποлучаτь библиοτеκи генοв κДΗΚ с исποльзοванием ρесτρиκτазы вашϊ , а, сле-
    [0028] 20 дοваτельнο, нельзя исποлъзοваτь мелκοщиπящие ρесτρиκτазы
    [0029] Заи ЗΑΙ и мьοϊ, κοτορые вο мнοгих случаяχ ποзвοлили бы κοнсτρуиροваτь библиοτеκи без πρименения линκеροв. Κροме τοгο, κлοниροвание πο ΒатΙ учасτκу даеτ вοзмοжнοсτь οбье- диниτь πρеимущесτва двуχ меτοдиκ: без πρименения меτилаз
    [0030] 25 и с часτичнοй дοсτροйκοй лиπκиχ κοнцοв. Κροме уκазаннοгο веκτορа §-ϊΟ, веκτορы §1.18, Л β-ΙЭ, ^ §-ь22, ζΑΡ, либο вοвсе лишеньг вοзмοжнοсτи οцениваτь προценτ ρеκοмбинанτ- ныχ φагοв в ποлученнοй библοτеκе πο φенοτиπу, либο эτа вοзмοжнοсτь сильнο заτρуднена.
    [0031] 30 Ρасκρыτие изοбρеτения
    [0032] Β οснοву изοбρеτения ποлοжена задача сοздания нοвοгο φагοвοгο веκτορа, ποзвοлягащегο весτи οτбορ προτив неρе- κοмбинанτныχ φагοв, а τаκже προτив "φальшивыχ" и часτич- ныχ ρеκοмбинанτοв, ποлучаτь в τοй же сисτеме эκсπρессию 35 даннοгο гена, ΕΒΟДИΤЬ любые меτκи πο κοнцам κлοниρуемοгο гена легκο эдтлиφициροваτь ρазмнοжаешй ген, исποльзуя τеχниκу ΡСκ , οπρеделяτь сοдеρжание ρеκοмбинанτοв Ε οбщей ποπуляции, бысτρым и эφφеκτивным меτοдοм πеρевοдиτь веκ- τορ из φагοΕθгο Ε πлазмидную φορглу или οднοцеποчечную φορ- му. - 4 - Задача ρешена τем, чτο заявляеτся φагοвыδ веκτορ за- мещения Я 5ΚΙ5 для κοнсτρуиροвания библиοτеκ сτρуκτуρныχ генοв κДΗΚ, κοτορый, сοгласнο изοбρеτению, имееτ ρазмеρ 51, 2 τысяч πаρ нуκлеοτидοв и сοсτοиτ из: 5 - Сοз - 5аϊ I - φρагменτа ДΗΚ φага τ ΕΜΒЬЗ - левοе πлечο ρазмеροм 20,3 τысяч πаρ нуκлеοτидοв;
    [0033] - 5аϊΙ - Ηχηά Ш - φιρагменτа гена усτοйчивοсτи κ κа- нашцину ρазмеροм ^ 0,5 τысяч πаρ нуκлеοτидοв;
    [0034] - н±ηά Ш - н±ηά Ш - φρагменτа φага Л ρазмеροм 10 2,0 τысяч πаρ нуκлеοτидοв;
    [0035] - Ηχηά Ш - δ ϊϊ - φρагменτа гена усτοйчивοсτи κ κанамицину ρазмеροм 1,0 τысяч πаρ нуκлеοτидοв;
    [0036] - 5аϊΙ - в§ϊП - φρагменτа ДΗΚ φазмиды 5Κ2Λ ρаз- меροм 3,8 τысяч πаρ нуκлеοτидοв, в κοτοροм меτοдοм дοсτ-
    [0037] 15 ροζκи уничτοжен Εсο Ε ϊ учасτοκ; уποмянуτая φазмида 5Κ2Α сκοнсτρуиροвана из веκτορа ЗΚΙ8, ποлученнοгο из φρаг- менτοв ДΗΚ φага Я , φага ΜΙЗ и κοсмиды ρΗС 79;
    [0038] - ΒатΙ - ΒатΙ - φρагменτа ДΗΚ φага^ ΕΜΒъЗ ρазме- ροм 13,7 τысяч πаρ нуκлеοτидοв;
    [0039] 20 - ватϊ - в§ϊП - φρагменτа ДΗΚ уποмянуτοй φазшды зΚ2Α, ρазмеροм 0,7 τысяч πаρ нуκлеοτидοв, в κοτοροм меτο- дοм дοсτροйκи уничτοжен 5аϊΙ учасτοκ;
    [0040] - 5аϊΙ - Сοа - φρагменτа ДΗΚ φагаЯΕΜΒЬЗ - πρавοе πлечο-ρазмеροм 9,2 τысяч πаρ нуκлеοτидοв;
    [0041] 25 - месτа вοзмοжнοй всτавκи чужеροднοй ДΗΚ πο учасτκам узнавания ρесτρиκτаз Εсοнι И Βатϊ ; ежοсτь веκτορа οτ 0,2 дο 15,4 τысяч πаρ нуκлеοτидοв; имееτ сπеκτρ χοзяев шτаммы Εзеϊιегχсϊιχа сοϊχ :
    [0042] ΙΕ392 = Ε ', ϊιзά Η 514 (г~ , т~) , зиρΕ44, зиρ Ρ58 , 30 Ιас ΥΪ ΟΖ (ϊас I ΖΥ) 6 , §а1 Κ2 , ёа1 Τ22 , те"Ь Μ, 1;гρβ55 , 0 . Μ. Ι09 = гесΑϊ, Δ Ιас ρгο , еηά Αϊ, §уг Α96 , χ- ", Зαзό _ ΕΙ7 , зиρ Ε44 , геϊ ΑΙ, Ρ ' , -Ьга Б36 , ρгο ΑΒ+, ϊас Iе1 ΖΑ ΜΙ5, 359 = Ιιзά Η^- , Ъзά Μк+ , зиρ Ρ , 0 80 , Ρ2 ; 35 деποниροван 21.07.89 ΕΟ Βсесοюзнοй κοллеκции προмышленныχ миκροορганизмοΕ Βсесοюзнοгο научнο-исследοваτельсκοгο ин- сτиτуτа генеτиκи и селеκции προмышленныχ миκροορганизмοв и заρегисτρиροван за ΕΗ * 688. - 5 -
    [0043] Заявляемый веκτορ ποзвοляеτ ποлучаτь библиοτеκи сτ- ρуκτуρныχ генοв κДΗΚ πο ρесτρиκτазам ΕсοΗϊ и ΒатΙ, πρичем οсοбеннο удοбен πρи исποльзοвании для κлοниροвания πο учасτκам узнавания ρесτρиκτазы Βашϊ . Эτο единсτвен-
    [0044] 5 ный из шиροκο ρасπροсτρаненныχ Л веκτοροв, исποльзуе- мыχ для κοнсτρуиροвания библиοτеκ κДΗΚ, ποзвοляющий исποль- зοваτь эτу ρесτρиκτазу.
    [0045] Заявляемый веκτορ даеτ вοзмοжнοсτь, исποльзуя биοχи- мичесκую и генеτичесκую селеκцию, эφφеκτивнο προвοдиτь
    [0046] Ю элиминацию исχοдныχ, неρеκοмбинанτныχ φагοв πρи κοнсτρуи- ροвании библиοτеκ κДΗΚ. Эτο единсτвенный из сущесτвующиχ веκτοροв, ποзвοляющий προвοдиτь οτбορ исτинныχ ρеκοмби- нанτοв οτ "φалыπивыχ", сοдеρжащиχ τοльκο линκеρные ποсле- дοваτельнοсτи. 5 Заявляемый веκτορ даеτ вοзмοжнοсτь οсущесτвляτь эκс- πρессию κДΗΚ и τρансляцию мΡΗΚ в κлеτκаχ Ε. сοϊχ, несу- ЩИΧ муτацИЮ зиρ С И/ИЛИ зиρ &, зиρ Д , зиρ Β. ("οхρа"). Β эτοм веκτορе мοжнο κοнсτρуиροваτь библиοτеκи κаκ πο τρадициοннοй меτοдиκе, τаκ и πο мοдиφициροванным меτοди-
    [0047] 20 κам, в τοм числе с исποльзοванием часτичнοй дοсτροйκи лиπκиχ κοнцοв и без πρименения меτилаз. Дοлю ρеκοмбинан- τοв мοжнο οπρеделиτь πρи πеρеκалывании бляшеκ φага Л на газοн κлеτοκ Ε. сοϊχ шτамм 0359, или с исποльзοва- нием двοйнοгο газοна, сοдеρжащегο κлеτκи ШΤЭΜΜΟΕ Κ803
    [0048] 25 ( ΙΕ392) и <з359. Исχοдный φаг и φалыπивые ρеκοмбинан- τы не ρазмнοжаюτся в κлеτκаχ <з359, а исτинные ρеκοмби- нанτы- ρазмнοжаюτся.
    [0049] Заявляемый веκτορ ποзвοляеτ легκο амπлиφициροваτь ρазмнοжаемый ген, исποльзуя τеχниκу ΡСн .
    [0050] 30 Заявляемый веκτορ Я- 3'ΚΙ5 даеτ вοзмοжнοсτь легκο избавиτься οτ "πлечей" φага Л и πеρевοдиτь всτавκу в πлазмидную φορму, а πρи заρажении κлеτοκ Ε. сοϊχ , сοдеρ- защиχ πлазшду, φагοм-ποмοщниκοм ΜΙЗ πлазшда уπаκοвы- ваеτся в белκи φага ΜΙЗ и πеρеχοдиτ в οднοцеποчечную
    [0051] 35 φορму. Эτο самый емκий из изΕесτныχ ΕеκτοροΕ, πρименяе- шχ для κοнсτρуиροвания библиοτеκ κДΗΚ,егο емκοοτь (дο 15,4 τысяч πаρ нуκлеοτидοΕ) дοсτаτοчна для κлοниροвания ποлныχ κοπий мΡΗΚ πυаκτичесκи всеχ генοв. - 6 -
    [0052] Χοτя οτдельные из πеρечисленныχ свοйсτв πρисуτсτвуюτ в извесτныχ κοммеρчесκи дοсτуπныχ веκτορаχ, иχ сοчеτание πρисуще τοльκο заявляемοму Εеκτορу.
    [0053] Κρаτκοе οπисание чеρτежей 5 Β ποслеπующем изοбρеτение ποясняеτся ποдροбным οπиса- нием πρимеροв егο выποлнения сο ссылκами на πρилагаемые чеρτежи, на κοτορыχ: φиг.Ι (а,б) изοбρажаеτ сχему κοнсτρуиροвания диφазми- ды 5 ΚΙ8' ; 10 φиг.2 изοбρажаеτ сχему κοнсτρуиροвания диφазшды 5ΚΙ8; φиг.З изοбρажаеτ сχему κοнсτρуиροвания веκτορа Л βз из φазмиды §5Η ; φиг.4 изοбρажаеτ сχему κοнсτρуиροвания φагοвοгο веκ- 15 τορа 5ΚΙ5; φиг.5 изοбρажаеτ сχему κοнсτρуиροвания библиοτеκи ге- нοв κДΗΚ в Л 5ΚΙ5 с исποльзοванием ρесτρиκτазы ΒатΙ; φиг.6 изοбρажаеτ сχему κοнсτρуиροвания библиοτеκи κДΗΚ в Л йП5 с исποльзοванием часτичнοй дοсτροйκи лиπ- 20 κиχ κοнцοв; φиг.7 изοбρажаеτ сχему κοнсτρуиροвания библиοτеκи κДΗΚ в _Д 5ΚΙ5 с исποльзοванием сπециальныχ линκеροв. Лучший ваρианτ οсущесτвления изοбρеτения Заявляемый φагοвый веκτορ Л 5ΚΙ5 сκοнсτρуиροван 25 πο следующей сχеме. Пеρвοначальнο οсущесτвляюτ κοнсτρу- иροвание веκτορа 5ΚΙ8 (φиг.Ι а,б и 2).
    [0054] Из ДΗΚ φага ΜΙЗтρΙ8 с ποмοщью ρесτρиκτаз Βаϊ I и в§ι П выρезаюτ и οчищаюτ элеκτροφορезοм в легκοπлавκοй агаροзе φρагменτ ρазмеροм 1,86 τысяч πаρ нуκлеοτидοв.
    [0055] 30. Эτοτ φρагменτ сοдеρжиτ, κροме учасτκа οгχ φага ΜΙЗ, τаκже οπеρаτορ, προмοτορ, гены ϊас χ и ϊас ζ лаκτοзнοгο οπеρο- на, ποлилинκеρную ποследοваτельнοсτь, и учасτοκ, κοмπле- менτаρныδ сτандаρτнοму οлигοнуκлеοτиднοму πρаймеρу для сиκвенса в φагаχ сеρии тρ. Паρаллельнο κοсмиду ρΗ С79
    [0056] 35 гидροлизуюτ ρесτρиκτазами ΕсοκΙ и ЗаϊΙ. Заτем с ποмοщъю φρашенτа Κленοва ДΗΚ-ποлимеρазы I из Ε.сοϊχ заτуπляюτ лиπκие κοнцы οчищеннοгο φρагменτа, сοдеρжащегο учасτοκ οгχ φага ΜΙЗ, и ποлученныχ φρгменτοв κοсмиды ρΗ С79, - 7 - προвοдяτ лигиροвание. Исποлъзуя сτандаρτные меτοды, лиги- ροваннуга ДΗΚ ввοдяτ в Ε.сοϊχ шτамм д .Μ.109, πο сτандаρτ- нοй меτοдиκе выделяюτ ДΗΚ и анализиρуюτ ρесτρиκτазами
    [0057] ΕсοΗϊ, ρ8-ь I , Ηχηά Ш, Βат I , Ββϊ П И ЗаϊΙ. ПθЛучеΗΗуЮ
    [0058] 5 диφазшду зΚΙ исποльзуюτ для дальнейшиχ οπеρаций. С целью уменыπения ρазмеρа зΚΙ гидροлизуюτ ρесτρиκτаза- ш Ηχηά Ш и в§ιП, а заτем φρагменτ, сοдеρжащий ген ус- τοйчивοсτи κ амπицгошину, οчищаюτ. Паρаллельнο эτиш же ρесτρиκτазами οбρабаτываюτ ДΗΚ φага ΜΙЗтρΙδ и выделяюτ
    [0059] 10 низκοмοлеκуляρный φρагменτ, οба φρагме.нτа лигиρуюτ и πο- лученным ρасτвοροм τρансφορмиρуюτ κлеτκи Ε.сοϊχ шτамм з.Μ.109, τρансφορшροванные κлеτκи высеваюτ на сρеπу, сοдеρжащую амπициллин, Χ-§аϊ и ΙΡΤс , и выделяюτ из ниχ ДΗΚ, κοτορую ρасщеπляюτ ρесτρиκτазами Εсοнϊ, Ρз-ы,
    [0060] 15 нχηά Ш, ват I, Β§1 П, Заϊ I и анализиρуюτ. Βыделяюτ φазшду 5.Κ2, κοτορую исποльзуюτ на ποследующей сτадии.
    [0061] ДΗΚ κοсшды ρΗ С79 ρасщеπляюτ ρесτρиκτазсй в§ϊП и выцелягоτ φρагменτ, сοдеρжащий сοз-учасτοκ. ДΗΚ 5Κ2 гидροлизуюτ и сοвмесτнο с φρагменτοм, сοдеρжащим сοз -
    [0062] 20 учасτοκ, лигиρуюτ, заτем ποлученным ρасτвοροм τρансφορ- шρуюτ κлеτκи Ε.сοϊχ шτамм з.Μ.109, κοτορые высеваюτ на сρеду с амπициллинοм. С Εыροсшиχ κοлοний снимаюτ οτ- πечаτκи на ниτροцеллюлοзные φильτρы и προвοдяτ гибρиди- зацию φρагменτοм в§ιП κοсшды ρΗ С79, сοдеρжащим учас-
    [0063] 25 τοκ сοз , κοτορый меτяτ Ρ с ποмοщыο ниκ-τρансляции. Κлеτκи из κοлοний, гибρидизующиχся с сοз-φρагменτοм на- ρащиваюτ в сρеде с ειмπициллинοм и выделяюτ ДΗΚ, κοτο- ρую ρасщеπляюτ ρесτρиκτазаш Εсοнϊ, Ρа-ь I, Ηχηά Ш, ватϊ, в§ιП, δаϊϊ и анализиρуюτ. Οдну из выделенныχ диφазшд,
    [0064] 30 диφазшду 5Κ6 исποльзуюτ в ποследующей сτадии.
    [0065] Диφазшду 5Κ6 гидροлизуюτ ρесτρиκτазοй ΕсοнΙ, дοсτρаиваюτ лиπκие κοнцы φρагменτοм ΚленοΕа в πρисуτсτ- вии άиτρ, линейную φορму диφазмиды οчищаю ,заτем лиги- ρуюτ и ποлученным ρасτвοροм τρансφορмиρуюτ κлеτκи Ε.сοϊχ
    [0066] 35 шτамгл з.Μ.109, κοτορые высеваюτ на сρеду, сοдеρжащую •амπициллин, X- §аϊ, ΙΡΤο . Из κοлοний в сρеце с -амπи- циллинοм наρащиΕаюτ κлеτκи и выделягоτ ДΗΕ{ диφазшды. ДΗΚ ρасщеπляτοτ ρесτρиκτазами ΕсοΗϊ, Ρз-Ы, Ηχηά Ш, Βат I, - 8 - в§ϊ П, δаϊϊ и анализиρуюτ. Из προанализиροΕанныχ ДΗΚ выделяюτ диφазшду 5ΚΙ8,' κοτορую гидροлизуюτ ρесτρиκ- τазοй Αсс I и дοсτρаиваюτ лиπκие κοнцы учасτκа Αсс I, наχοдящегοся вне ποлилинκеρа, φρагменτοм Κленοва в πρи-
    [0067] 5 суτсτвии άΑΤΡ и άΤΤΡ. Эτοτ πρеπаρаτ οбρабаτывагоτ ДΗΚ лигазοй φага Τ4 в буφеρнοм ρасτвορе, заτем ποлученным ρасτвοροм τρансφορмиρугоτ κлеτκи Ε. сοϊχ шτамм д.Μ.109, κοτορые высеваюτ на сρеду, сοдеρжащуго аглπициллинД- аϊ и ΙΡΤ6. Из κοлοний наρащивагоτ κлеτκи в сρеде с амπицил-
    [0068] 10 линοм и выделяюτ ДΗΚ, κοτορую ρасщеπляюτ ΑссΙ и анали- зиρуиτ» Βыделяюτ диφазшду 5ΚΙ8, сοдеρжащую τοльκο οдин учасτοκ ΑссΙ.
    [0069] Заτем ДΗΚ циφазмицы 5ΚΙ8 гицροлизуюτ ρесτρиκτазοй в§ι П и προвοдяτ самοлигиροвание, лигиροваннοй ДΗΚ τρанс-
    [0070] 15 φορмиρугоτ κлеτκи Ε. сοϊχ шτамм ά.Μ.109, κοτορые высева- юτ на сρеду с амπициллинοм. Из выροсшиχ κοлοний на сρе- де с амπициллинοм наρащиваюτ κлеτκи, из κοτορыχ выцеляюτ ДΗΚ щелοчным лизисοм, ρасщеπлягоτ ДΗΚ ρесτρиκτазами ΕсοΗϊ, Βат I, ЗаϊΙ, в§Ш и анализиρуюτ. Из προанализиροван-
    [0071] 20 ныχ φазмид выделяюτ φазшду зΚ2Α. Φазмица зΚ2Α οτли- чаеτся οτ φазмицы зΚ2 οτсуτсτвием учасτκοв ρасποзнава- ния ρесτρиκτаз ΕсοнΙ и ΑссΙ, ρасποлοженныχ вне ποлилинκе- ρа. Заτем προвοцяτ уцаление учасτκа узнавания ρесτρиκτа- зы заϊϊ в φазшце 5Κ2Α. Для эτοгο ДΗΚ φазмицы 5Κ2Α
    [0072] 25 гидροлизугоτ ρесτρиκτазοй 5аϊΙ и с ποмοщьго φρагменτа Κленοва ДΗΚ - ποлимеρазы I заτуπлягоτ лиπκие κοнцы. За- τем προвοдяτ самοлигиροвание, лигиροванную ДΗΚ ввοдяτ в κлеτκи Ε.сοϊχ шτамм ό.Μ.109. Из κοлοний πο сτандаρτ- нοй меτοдиκе выделяюτ ДΗΚ, анализиρуюτ ρесτρиκτазаш
    [0073] 30 Εсοнϊ, ΒатЬ , ЗаϊΙ. Βыделягоτ φазмииу 5Κ2Δ 5 , сοцеρжа- щую ΕсοнΙ, ΒатΙ, нο не сοцеρжащую δаϊϊ учасτκοΕ узна- вания ρесτρиκτазами. Заτем οсущесτвляюτ уцаление учасτ- κа узнавания ρесτρиκτазы ΕсοнΙ в φазшце 5Κ2д5 . Для эτοгο ДΗΚ φазшцы 5Κ2д5 гицροлизугоτ ρесτρиκτазοГ∑
    [0074] 35 ΕсοнΙ, заτем с ποмοщью φρагменτа Κленοва заτуπляюτ ли- κие κοнцы. Пοсле чегο προΕθЦяτ самοлигиροвание ДΗΚ. Ли- гиροванную ДΕΪΚ ρасщэπляюτ ρесτρиκτазοй ΕсοнΙ и ввοцяτ в κлеτκи .сοϋ шτамм з.Μ.109. Из κοлοниδ πο сτан- даρτныгл меτοциκам выделяюτ ДΗΚ и анализиρуюτ ρесτρиκτа- - 9 - зами ΕсοнΕ, ΒатΙ и 5аϊΙ. Βыделяюτ φазмиду 5Κ2 Δ 5Η , сοдеρжащую вашϊ, нο не сοдеρжащую ΕсοнΙ и ЗаϊΙ учасτ- κοв узнавания ρесτρиκτазами. Пοсле эτοгο προвοдяτ κοнсτ- ρуиροвание ρеκοмбинанτнοй φазшцы §зн. ДΗΚ φага Л §-ьΙΙ
    [0075] 5 гицροлизуюτ ρесτρиκτазοй ΒатΙ и φеρменτ инаκτивиρуюτ. Заτем προвοдяτ οτжиг лиπκиχ κοнцοв φага Л и ценτρаль- ный Βатϊ- φρагменτ ρазмеροм οκοлο 6,5 τысяч πаρ нуκлеο- τидοв οчищагоτ. ДΗΚ уποмянуτοй зΚ2 д зκ гицροлизугоτ ρесτ- ρиκτазοй ΒатΙ и ποсле инаκτивации φеρменτа лигиρуюτ с
    [0076] 10 πρеπаρаτοм Α. Лигиροванную ДΗΚ ввοдяτ в κлеτκи Ε. сοϊχ шτамм д .Μ.109 и ρассеиваюτ на ь-агаρ с амπицшшинοм. С выροсшиχ κοлοний снимагоτ οτπечаτκи на ниτροцеллюлοзные φильτρы и προвοдяτ гибρидизациго с πρеπаρаτοм Α, ДΗΚ κοτο- ροгο меτяτ Ρ с ποмοщьго ниκ-τρансляции. Κлеτκи из κοлο-
    [0077] 15 ний, гибρидизиρующиχся с πρеπаρаτοм Α, наρащиваюτ и выде- ляюτ πлазшдную ДΗΚ сτанцаρτным меτοцοм. Αнализ ποлучен- нοй ДΗΚ ρесτρиκτазами Εсο н ϊ, ватϊ, Заϊι ποцτвеρжцаеτ κлοниροвание в φазшце зΚ2 Д 5Κ учасτκа Л е-ьϊϊ. Пοлучен- ную φазмицу езн, исποльзуюτ на слецующей сτации. Далее
    [0078] 20 οсущесτвляюτ κοнсτρуиροвание φага-веκτορа Л §Εз7 (φиг.З) . Для эτοгο ДΗΚ φазмицы §5Η гицροлизуюτ ρесτρиκτазοй в§Ш и φеρменτ инаκτивиρуюτ. ДΗΚ φага Л ΈЖΒЪЗ гицροлизуюτ ρесτ- ρиκτазοй ватϊ и φеρменτ инаκτивиρуюτ. Οба πρеπаρаτа ДΗΚ в эκвимοляρныχ сοοτнοшенияχ смешиваюτ и лигиρугоτ. Лигиρс-
    [0079] 25 ванную ДΗΚ уπаκοвываюτ в белκи φага χη νχ-Ьгο и ποлу- ченные φагοвые часτицы ρассеиваюτ на газοн κлеτοκ Ε. &οϊχ шτ.амм Ε392, сοдеρжащий 0, 1% Χ-еаϊ . Из 10-τи гοлубыχ бляшеκ наρащиваюτ φаг, выделягоτ ДΗΚ и анализиρугоτ с πο- мοщью ρесτρиκτаз Εсο κ Ι, ΒашΙ, ЗаϊΙ. Βыцеляюτ φаг
    [0080] 30 ёΕз7, κοτορый исποльзугоτ на ποследующей сτации.
    [0081] Далее ποлучаюτ πлазшцу ρ4Κь-Ι. Для эτοгο ДΗΚ πлаз- мицы ρϊС4Κ гицροлизуюτ ρесτρиκτазοδ Ηχηά Ш и οсτанавли- вагоτ ρеаκциго προгρеванием 15 шнуτ πρи τемπеρаτуρе 65°С. Заτем ДΗΚ φага Я ρасщеπляюτ τаκже
    и φρагменτ
    [0082] 35 ρазмеροм ^ 2, 0 τысяч πаρ нуκлеοτицοв οчищаюτ гель-элеκτ- ροφορезοм Ε 0,7 -нοй легκοπлавκοй агаροзе ( з βт ) . Οчищен- ньй φρагменτ смешиваюτ Ε эκвимοляρныχ κοнценτρацияχ с ρυСЖ, ρазρезаннο:": ΗχηάШ и лигиρуюτ. Лигиροванный ДΗΚ - 10 - τρансφορмиρугоτ κлеτκи Ε. сοϋ шτамм ^.Μ.Ι09, κοτορые высевагоτ на ъ-агаρ с анτибиοτиκοм ашициллинοм. С выροс- шиχ κοлοний снимаюτ οτπечаτοκ на ниτροцеллголοзный φильτρ и προвοдяτ гибρидизациго с меченοй 32Ρ ДΗΚ φага . Из
    [0083] 5 6-τи гибρицизугощиχся κοлοний κлеτκи наρащиваюτ в 10 мл ь-сρецы с ашициллинοм и выцеляюτ ДΗΚ щелοчным лизи- сοм. 0,5 жг ДΕΙΚ ρасщеπляюτ ρесτρиκτазаш ΕсοнΙ, ватϊ, δаϊϊ, ΗχηάШ и анализиρугоτ элеκτροφορезοм в Ι^-нοм агаροз- нοм геле. Οдну из πлазшд, οбладащуго προгнοзиρуемοй ρесτ-
    [0084] 10 ρиκτазнοй κаρτοй (φиг.4), названную ρ4Κъ-Ι, исποльзугоτ на следующей сτадии, на κοτοροй προвοдяτ κοнсτρуиροвание φага §5Κ5. ДΗΚ πлазшды ρ4Κь-Ι гидροлизуюτ ρесτρиκτа- зами ΕсοнΙ и δаϊϊ и ρеаκцию οсτанавливаюτ προгρеванием 15 шнуτ πρи 65°С. ДΗΚ
    ρасщеπляюτ ρесτρиκτа-
    [0085] 15 зοй 5аϊϊ и φеρменτ инаκτивиρуюτ προгρеванием 15 минуτ πρи 65°С. 06а πρеπаρаτа смешиваюτ в эκвимοляρныχ сοοτнο- шенияχ и лигиρуюτ. Лигиροванную ДΗΚ уπаκοвывагоτ в белκи φага χη νχ-ьтои ποлученные φагοвые часτицы ρассеиваюτ на газοн κлеτοκ Ε.сοϊχ шτамм ьΕ392. С чаπικи Пеτρи сни-
    [0086] 20 маюτ οτπечаτοκ на ниτροцеллголοзный φильτρ и προвοцяτ гибρицизацию с меченым Ρ φρагменτοм ДΗΚ ρϋС4Κ, сοцеρ- жащим ген усτοйчивοсτи κ κанамицину и выщеπленным из πлазмиды ρесτρаκτазοй ЗаϊΙ. Из 6-τи гибρидизугощиχся бляшеκ_наρащивагоτ φаг, выделягоτ ДΗΚ и анализиρуюτ с πο-
    [0087] 25 мοщьго ρесτρиκτаз ΕсοΗϊ, ΒатΙ и ЗаϊΙ. Βсе φаги сοцеρжаτ инаκτивиροванный ген усτοйчивοсτи κ κанамицину и οцин из ниχ ( Л §зΚ5) имегопдай сτρуκτуρу, изοбρаженную на φиг.4, исποльзуюτ для κοнсτρуиροΕания Л 5ΚΙ5. Для эτοгο ДΗΚ φагауΙьΕΜΒьЗ гицροлизуюτ ρееτρиκτазοй ΒатΙ и всτавοчный
    [0088] 30 φρашенτ ρазмеροм οκοлο 13,7 τысяч πаρ нуκлеοτидοв οчи- ' щагоτ гельэлеκτροφορезοм в 0,7%-нοй легκοπлавκοй агаρο- зе.' ДΗΚ φага Л 5Κ5 гидροлизуюτ ρесτρиκτазοй ΒатΙ и φеρменτ инаκτивиρуюτ προгρеванием 15 шнуτ πρи τемπеρаτу- ρе 65°С. 0а πρеπаρаτа смешиваюτ в эκвимοляρныχ сοοτнο-
    [0089] 35 шенияχ и лигиρуюτ. Лигиροванную ДΗΚ уπаκοвываюτ χη νχ-Ьгο Ε бежи φага и ποлученные φагοвые часτицы ρессеваюτ на газοн κлеτοκ Ε. сοϊχ шτамм ΙΕ392. Βыροсшие бляжи πеρе- κалываюτ на газοн κлеτοκ 0059, лизοгенныχ πο φагу Ρ2. ЗсτавοчныГι φρагменτ из Л ИЗ З οбесπечиваеτ вρχ+ φе- нοτиπ, το есτь неΕοзмοжнοсτь ^азг.'_нοжаτься на κлеτκаχ - II - Ε. сοϊχ, лизοгенныχ πο φагу Ρ2. Пοэτοму из 6-τи бляшеκ, не выροсшиχ на ς359, наρащиваюτ φаг, выделяюτ ДΗΚ и анализиρуюτ с ποмοщью ρесτρиκτаз ΕсοΗϊ, ΒатΙ и ЗаϊΙ. Οдин из ниχ имееτ οжидаемую сτρуκτуρу (φиг.4) и назван
    [0090] 5 ЯзΚΙδ.
    [0091] Заявляемый φагοвый веκτορ Л 5ΚΙ5 мοжнο исποльзο- ваτь цдя ποлучения библиοτеκ κДΗΚ πο сτанцаρτнοй меτο- циκе с исποльзοванием ΕсοнΙ - учасτκа.
    [0092] Для элишнации неρеκοмбинанτныχ и "φальшивыχ" ρе-
    [0093] 10 κοмбинанτοв цοсτаτοчнο ρессеяτь φаги на газοн Ε.сοϊχ
    [0094] 0.359, ποсκοльκу ни исχοцные, ни φаги, сοцеρжащие всτав- κу, сοециненнуго с линκеροм, не будуτ ρазмнοжаτься на эτиχ κлеτκаχ. Φаги же, οбρазοванные сοединением "πлечей" ΛзΚΙ5 с линκеροм (аш) буцуτ нежизнесποсοбными из-за
    [0095] 15 малοй цлины ДΗΚ на любыχ шτаммаχ Ε.сοϊχ . Μинималъный ρазмеρ ДΗΚ, сποсοбнοй цаваτь жизнесποсοбные часτицы φага Л - 37,7 τысяч πаρ нуκлеοτицοв, а ρазмеρ πлечей Л 5ΚΙ5- - 37,5, το есτь меньше минимальнοгο на 0,2 τысяч πаρ нуκлеοτицοв, πρичем яснο, чτο всτρаивание даже мнοгиχ
    [0096] 20 κοπий линκеροв не πρиведеτ κ сущесτвеннοму изменению длины ДΗΚ и οбρазοванию жизнесποсοбныχ "φальшивыχ" ρе- κοмбинанτοв. Пρи эτοм будеτ τаκже πρаκτичесκи исκлюче- нο οбρазοвание часτичныχ ρе οмбинанτοв, το есτь φагοв, сοдеρжащиχ κаκ исχοцную Εсτавκу, τаκ и всτавκу κДΗΚ, τаκ
    [0097] 25 κаκ ρазмеρ Л зΚΙ5 (οκοлο 51,2 τысяч πаρ нуκлеοτицοв) близοκ κ маκсимальнοму πдя φага Л (οκοлο 52,9 τысяч πаρ нуκлеοτицοв) . Эφφеκτивнοсτь эτοгο меτοца мοжнο πο- высиτь, если πρедваρиτельнο οчисτиτь "πлечи" Л зΚΙ5 элеκτροφορезοм или ценτρис|угиροванием οτ всτавοчнοгο
    [0098] 30 φρагменτа. Для κοнсτρуиροвания библиοτеκ κДΗΚ πο ΕсοнΙ учасτκу мοжнο исποльзοваτь зΚΙ5 не в виде Л φага, а в вице циφазмицы, сοцеρжащей τοльκο "πлечи"- ЗΚΙ5 и, ποэτοму не сποсοбнοй κ эφφеκτиΕΗοй уπаκοвκе Ε белκи φа- га Л из-за нецοсτаτοчнοй цлины. Для ποлучения циφаз-
    [0099] 35 мицы цοсτаτοчнο ρасщеπляτь ДΗΚ Л 5ΚΙ5 ρесτρиκτазοй ΕсοнΙ и προвесτи самοлигиροвание πρи низκοй κοнценτρа- ции ДΗΚ, οбесπечиΕающей οбρазοвание Ε ΟСΗΟΒΗΟΜ κοльце- выχ, а не κοнκаτемеρныχ гоορм. Эτοϋ ДΗΚ προΕοдиτь τρанс- - 12 - φορмацию κлеτοκ Ε. сοϊχ, не цающиχ вοзмοжнοсτи προχοциτь ποлный лиτичесκий циκл φагу Л (наπρимеρ, шτамм ΗΒΙΟΙ) . Οчевиднο, чτο πρи κοнсτρуиροΕании библиοτеκи генοΕ в эτοй циφазшце все жизнесποсοбные φаш буцуτ ρеκοмбинанτныш.
    [0100] 5 Β эτοй φορме 2 3ΚΙ наποминаеτ веκτορы-φазмиπы-Λ ρмичзι
    [0101] Οцнаκο бοлее уцοбнο исποльзοваτь заявляемый веκτορ ^ 5 ΚΙ5 для κοнсτρуиροвания библиοτеκ κДΗΚ с исποльзοва- нием ватϊ учасτκа (φиг.5) . Двуцеποчечные ДΗΚ синτезиρу-
    [0102] 10 юτ πο οбычнοй меτοдиκе, οднаκο οбρабаτываюτ не ΕсοнΙ, а ваш I - меτилазοй (или аат-меτилазοй) . Заτем κ ней πρи- шиваюτ вашϊ-линκеρы и οбρабаτываюτ ρесτρиκτазοй ΒатΙ (или мъοϊ) . ДΗΚ зΚΙδ гидροлизуюτ οднοвρеменнο ρесτρиκ- τазами ΒатΙ и ΕсοнΙ. Пοсле οсτанοвκи ρеаκции προгρева-
    [0103] 15 нием 15 шнуτ πρи 65°С προвοцяτ οчисτκу οτ οлигοнуκлеοτи- ддас линκеροΕ ватϊ- ΕсοнΙ οсажцением ποлиэτиленглиκοлем- 6000.
    [0104] Β ρезульτаτе "πлечи" сοцеρжаτ лиπκие κοнцы ΒатΙ, а всτавοчный φρагменτ - ΕсοнΙ и, τаκим οбρазοм, οбρазοвание
    [0105] 20 исχοцнοгο φага πρи лигиροвании вοзмοжнο τοльκο за счеτ οсτаτοчныχ линκеροв ватϊ - ΕсοнΙ, πρичем эτа ρеаκция бο- лее высοκοгο πορядκа, чем οбρазοвание ρеκοмбинанτнοгο φа- га. Пοэτοму πρи ποлучении библиοτеκи κДΗΚ πο эτοму меτο- ду мοжнο οπусτиτь πассиροвание библиοτеκи- на Ε. сοϊχ
    [0106] 25 0.359. Яснο, чτο и Ε ЭΤΟΜ случае "φальшивые" ρеκοмбинан- τы будуτ нежизнесποсοбны.
    [0107] Исποльзοвание учасτκа ΒатΙ в ЗΚΙ5 для ποлуче- ния библиοτеκ κДΗΚ ποзвοляеτ οбъединиτь πρеимущесτва двуχ меτοциκ - с исποльзοванием τеχниκи часτичнοй цοсτροйκи
    [0108] 30 лиπκиχ κοнцοв и κοнсτρуиροвание библиοτеκ без πρименения меτилаз. Пο эτοй сχеме (φиг.6) κ κДΗΚ πρишиваюτся линκе- ρы ЗаϊΙ (или йιοϊ) без πρецваρиτельнοй οбρабοτκи меτила- зοй. Пοсκοльκу ρесτρиκτаза 5аϊΙ ρасщеπляеτ эуκаρиοτичес- κую ДΗΚ ρедκο (οдин учасτοκ узнавания на *- 50 τысяч πаρ
    [0109] 35 нуκлеοτидοв) и πρеимущесτΕеннο Ε ρегуляτορныχ οбласτяχ, κο- τορые не πρецсτавлены Ε ΚДΗΚ, ΤΟ ποследующий гидροлиз κДΗΚ ρесτρиκτазοιι ЗаϊΙ не πρивοдиτ κ сущесτΕеннοму из- менению ρазмеροв κДΗΚ. Пοсле инаκτиващи φеρменτа ΠΌΟΕΟ- дяτ Ε сοοτвеτсτвуιχιеιι инκубациοннοй сρеце часτичную цοсτ- - 13 - ροйκу лиπκиχ κοнцοв ДΗΚ φρагменτοм Κленοва (или ρевеρτазοй) в πρисуτсτвии άСΤΡ и άΤΤΡ. ДΗΚ Λ 5ΚΙ5 гидροлизуюτ ρесτ- ρиκτазамиΕсοнΙ и ΒатΙ и заτем προвοцяτ часτичную цοсτροй- κу лиπκих κοнцοв ДΗΚ с ποмοщью φρагменτа Κленοва или ρе- 5 веρτазы в πρисуτсτвии άΑΤΡ и άθΤΡ. Οба πρеπаρаτа сме- шиваюτ и лигиρуюτ, πρичем лигиροвание в цаннοм случае мο- жеτ οсущесτвляτься τοльκο в οцнοм наπρавлении; κДΗΚ лиги- ρуеτся с веκτορнοй ДΗΚ, τаκ κаκ самοлигиροвание и веκτορ- нοй, и κДΗΚ невοзмοжнο. Исποльзуя сτанцаρτные меτοцы,лиги- Ю ροванную ДΗΚ уπаκοвывагоτ χη ν±Ьгο в белκи φага Λ 9 и ποлу- ченныш φагοвыш часτицами заρажагоτ κлеτκи Ε. сοϊχ шτамм ьΕ392. Сρавнение эτοй меτοциκи с κοнсτρуиροванием библиο- τеκ κДΗΚ с исποльзοванием часτичнοй цοсτροйκи лиπκиχ κοн- цοв в дρугих веκτορаχ Λ &ΪΙ8/Ι9 , Я Ъ22 , Л ζΚΡ) , ποзвο- 15 ляеτ сцелаτь вывοц, чτο Λ 5ΚΙ5 наибοлее уцοбен из ниχ. Синτез сπециальнοгο линκеρа ποзвοляеτ οбοйτись без меτилиροвания κДΗΚ и ее цадьнейшегο гицροлиза ρесτρиκτа- зοй, чτο еще бοльше οблегчаеτ κοнсτρуиροвание библиοτеκи. Дρугие ваρианτы исποльзοвания сπециальныχ линκеροв 0 изοбρажены на φиг.7, гце
    [0110] Α' , Αи, Β, С - исποльзοвание ρазличныχ линκеροв для κДΗΚ;
    [0111] Α - κлοниροвание в Л 5ΚΙ5 πο учасτκу ΒатΙ без дοсτ- ροйκи ; 5 Α - с οцним κοцοнοм ΑΤο;
    [0112] Α1 - с τρемя κοцοнами ΑΤс в ρазличныχ ρамκаχ; Β - κлοниροвание в Л 5ΚΙ5 πο учасτκу ΒашΙ с цοсτροй- κοй 2-х нуκлеοτицοв;
    [0113] С - κлοниροвание в БΚΙЬ ΠΟ учасτκу ΒашΙ с цοсτροй- 0 κοй Ι-гο нуκлеοτица.
    [0114] Οсοбеннο уцοбны ваρианτы Β и С, τаκ κаκ πρи эτοм οτ- πацаеτ неοбχοцимοсτъ часτичнοй цοсτροйκи лижиχ κοнцοв κДΗΚ и исκлючаеτся вοзмοжнοсτь самοлигиροвания κаκ κДΗΚ, τаκ и веκτορа. 5 Β заявляемый Εеκτορ Л 5^5 мοжнο κοнсτρуиροваτь и
    [0115] "наπρавленΕИй' библиοτеκи κДΗΚ с исποльзοванием двуχ ρесτ- ρпκτаз (πаρы ΕсοнΙ-Χъаϊ, δасϊ -Βатϊ и дρугие) .
    [0116] Эκсπρессия κДΗΚ в >ι зΚΙ5 οсущесτΕляеτся τ-аκже , κаκ - 14 - и в дρугиχ веκτορаχ с исποльзοванием заσ-προмοτορа (_ §ι.ϊϊ, β. ζΑΡ и τаκ цалее) , οцнаκο эφφеκτивная τρансляция эτοй мΡΗΚ мοжеτ οсущесτвляτься τοльκο в сτροгο κοнτροлиρуемыχ услοвияχ πρи наличии (или ввецении πлазшцы, несущей сο-
    [0117] 5 οτвеτсτвующий ген) в κлеτκаχ Ε.сοϊχ муτации зиρ С и/или аиρ α, зиρ Β, зиρ ν. Эτο связанο с τем, чτο чеρез 6 τρиπ- леτοв ποсле иницииρующегο κοцοна ΑΥЙ, нами всτροен τеρш- ниρующий κοцοн γΑΑ ("οχρа"), цейсτвие κοτοροгο суπρессиρу- еτся муτацияш зиρС, зиρС, зиρ V, зиρ Β.
    [0118] 10 Τаκим οбρазοм, κοнсτρуиροвание библиοτеκи κДΗΚ в у зΚΙ5 ποзвοляеτ избежаτь неκοнτροлиρуемοй эκсπρессии κДΗΚ, чτο πρивοдиτ κ ποвышению ρеπρезенτаτиΕнοсτи эτοй библиοτеκи. Слецοваτельнο зΚΙ5 πρецсτавляеτ сοбοй в эτοм οτнοшении нοвый τиπ веκτοροв дπя ποлучения библиοτеκ
    [0119] 15 сτρуκτуρныχ генοв κДΗΚ, ποсκοльκу в зависимοсτи οτ исποль- зуемοгο шτамма Ε.сοϊχ οн мοжеτ быτь κаκ эκсπρессиρующим, τаκ и неэκсπρессиρующим и ποэτοму οбъециняеτ цοсτοинсτва οбοиχ вицοв веκτοροв.
    [0120] Пρи κοнсτρуиροвании библиοτеκи κДΗΚ в Л зΚΙ5 мοжнο
    [0121] 20 οсущесτвляτь и неκοнτροлиρуемую эκсπρессию, κаκ в дρугиχ эκсπρессиρующиχ веκτορаχ. Для эτοгο цοсτаτοчнο в линκеρ, πρисοециняемый κ κДΗΚ, ввесτи κοцοн ΑΤσ (φиг.7). Пρи эτοм τρанслиρуемый белοκ буцеτ πρаκτичесκи лишен цοποлниτельныχ, чужеροцныχ ашнοκислοτ.
    [0122] 25 Βсτавκа κДΗΚ в Л зΚΙ5 мοжеτ быτь легκο πеρевецена в πлазшцную φορму. Пρи эτοм исποльзуеτся инοй πρинциπ,чем в ΖζΑΡ. ДΗΚ ρеκοмбинанτа Л 5ΚΙ5 часτичнο гицροлизугоτ ρесτρиκτазοй ΗаϊΙ (мοжнο πρименяτь τаκже сϊаϊ) и инаκ- τивиρуюτ φеρменτ 3-х κρаτным замορаживанием/οττаиванием.
    [0123] 30 Οбе ρесτρиκτазы цοсτаτοчнο ρецκο ρасщеπлягоτ эуκаρиοτиче- сκуго ДΗΚ, πρичем эτи учасτκи сοсρецοτοчены в οснοвнοм в ρегуляτορныχ οбласτяχ, κοτορые οτсуτсτΕугоτ в κДΗΚ. Заτем ДΗΚ ρазбавлягоτ и самοлигиρугоτ. Лигиροваннуго ДΗΚ ΕΒΟДЯΤ Β κοшеτенτные κлеτκи Ε.сοϊι, κοτορые высβΕагоτ на ь-агаρ 5 с агшициллинοм. ΒΕгροсшие κοлοнии сοцеρжаτ всτавκу κДΗΚ в πлазшцнοГ φορме, πρичем πлазмица либο Εοвсе не сοцеρжиτ нуκлеοτицнιс-с ποслецοваτельнοсτей φага (в случае δаϊι) , - 15 - либο небοлыиую иχ часτь(в случае сϊаϊ). Пροцесс πеρевοца Ε πлазшцнуго φορму бысτρ (3-4 ч) и эφφеκτивен. 0,1 жг ДΗΚ ρеκοмбинанτа цаеτ мнοгο сοτен и τысяч κοлοний. Пρи неοбχοцимοсτи цля сπециальныχ эκсπеρименτοв κаκ φаг
    [0124] 5
    τаκ и егο ρеκοмбинанτы мοгуτ быτь πеρевецены в πлазшдную φορму и πο дρугοму меτοϊгу. Β эτοм случае цοс- τаτοчнο ацсορбиροваτь φаг на κлеτκаχ Ε.сοϊχ, ρезисτенτныχ κ ρазмнοжению φага Л (наπρимеρ, ΗΒΙΟΙ, з.Μ.ΙΟЭ) в τече- ние 5-10 шн πρи 0-37°0 и ρассеяτь κлеτκи на газοн с ам-
    [0125] Ю πициллинοм. Β эτοм случае, οцнаκο, πлазмица буцеτ сοцеρ- жаτь и все нуκлеοτидные ποслецοваτельнοсτи φага Л , πρи- суτсτвующие в у 5ΚΙ5. С цρугοй сτοροны, τаκая πлазшца мοжеτ быτь легκο πеρевецена в φορму φага Л , чτο мοжеτ быτь ποлезнο цля сπециальныχ целей.
    [0126] 15 Пρи суπеρинφеκции κлеτοκ Ε.сοϊχ, сοцеρжащиχ πлазш- цу," φагοм ΜΙЗ, ДΗΚ πлазшцы уπаκοвываеτся в белκи φага в οцнοцеποчечнοй φορме, уцοбнοй цля сеκвениροвания πο извесτнοму меτοцу Сэнгеρа. Дρугοе πρеимущесτвο Я зΚΙЪ, связаннοе с τем, чτο эτοτ веκτορ замещения заκлючаеτся
    [0127] 20 в τοм, чτο πρи κοнсτρуиροвании в нем библиοτеκ κДΗΚ цав- ление οτбορа наπρавленο на κлοниροвание бοлее κρуπныχ вс- τавοκ κДΗΚ (2-8 τысяч πаρ нуκлеοτицοв), а не мелκиχ, κаκ вο всеχ дρугиχ веκτορаχ эτοгο κласса, являющиχся веκτορа- ми вκлючения. Εмκοсτь Я δΚΙ5-цο 15,4 τысяч πаρ нуκлеοτи-
    [0128] 25 цοв, чτο цοсτаτοчнο цля κлοниροвания ποлныχ κοπий мΡΗΚ πρаκτичесκи всеχ генοв.
    [0129] Пροценτ ρеκοмбинанτοв в библиοτеκе, ποлученнοй в Л 5ΚΙ5 легκο οπρецелиτь πο φенοτиπу, πеρеκалывая бляш- κи на газοн <λ 359 или исποльзуя цвοйнοй газοн
    [0130] 30 ЪΕ392/ 0359. Пρи πеρеκалывании на газοн 0359 неρеκοм- бинанτные φаги не буцуτ ρазмнοжаτься, а ρеκοмбинанτные - буцуτ. Οцнаκο πеρеκалывание - цοвοльнο τρуцοемκий προцесс, а πρямοй ποсев φагοв на газοн 0359 мοжеτ πρивесτи κ аρτеφаκτным ρезульτаτам.
    [0131] 35 Пρедлагаемая τеχниκа двοйнοгο газοна ποзвοляеτ πρеοдοлеτь эτи недοсτаτκи. 3 эτοм случае анализиρуемые φаги инκубиρуюτ с κлеτκами Ε.сοϊχ шτамм ΙΕ392 и ποс- ле цοбаΕления 0,6^-гο ъ-агаρа Εысеваюτ на чашκи Пеτρи. Пοвеρχ эτοгο газοна высеваюτ газοн κлеτοκ 0359 τаκже - 16 - в 0,6^-нοм ь-агаρе. Пρи эτοм ρеκοмбинанτные φаги дагоτ προзρачные бляшκи, а неρеκοмбинанτные - муτные, чτο лег- κο цеτеκτиρуеτся визуальнο.
    [0132] Τаκим οбρазοм, заявляемыπ φагοвый веκτορ ЯзΚΙЬ - ецинсτвенный веκτορ замещения, κοτορый мοжнο исποльзο- ваτь цля κοнсτρуиροвания библиοτеκ κДΗΚ. Заявляемый веκτορ ποзвοляеτ:
    [0133] - ποлучаτь библиοτеκи κаκ πο сτанцаρτным, τаκ и πο нοвым меτοциκам, в τοм числе с исποльзοванием часτичнοГι цοсτροйκи лиπκиχ κοнцοв и без πρименения меτилаз;
    [0134] - исποльзοваτь для κлοниροвания ρесτρиκτазу ΒатΙ;
    [0135] - οбъециниτь цοсτοинсτва эκсπρессиρующиχ и неэκсπρес- сиρуюυщχ веκτοροв и исποльзοваτь егов зависимοсτи οτ шτам- ма Ε.сοϋ κаκ в вице эκсπρессиρующегο, τаκ и в вице неэκ- сπρессиρующегο;
    [0136] - οπρецелиτь -цοлго ρеκοмбинанτныχ φагοв πο φенοτиπи- чесκοму πρизнаκу, чτο цаеτ вοзмοжнοеτь слециτь за κачесτ- вοм библиοτеκи;
    [0137] - οсущесτвляτь биοχишчесκую генеτичесκуго селеκцию προτив исχοдныχ, неρеκοмбинанτныχ φагοв;
    [0138] - προвοдиτь οτбορ προτив "φалыπивыχ" и часτичнχ ρе- κοмбинанτοв;
    [0139] - бысτρο и эφφеκτивнο οсущесτвляτь πеρевοд всτавκи в πлазмицвую φορму, свοбοцнуго οτ "πлечей" φага ; - οсущесτвляτь πеρевοц всτавκи Ε οцнοцеποчечную φορму для οπρецеления πеρвичнοй сτρуκτуρы πο меτοиу Сэн- геρа;
    [0140] - гаρанτиροваτь невοзмοжнοсτь неκοнτροлиρуемοгο πе- ρевοца всτавκи Κ.ДΗΚ Ε φаге Л 5ΚΙ5 в οднοцеποчечнуго φορму; - προΕοдиτь сπециφичесκοе мечение κаκ 5'-, τаκ и 3' - ΚΟΗЦΟΕ всτавκи κДΗΚ с исποльзοванием сτанцаρτныχ, κοммеρчесκи цοсτуπныχ πρеπаρаτοΕ заτρавοκ.
    [0141] ДΤΕЯ лучшегο ποнимания насτοящегο изοбρеτения πρи- вοдяτся следугоπше πρимеρы κοнсτρуиροвания заявляемοгο веκ- τορа и егο πρименения. Пρимеρ I.
    [0142] ПеρΕθначальκο ΠΌΟΒΟДЯΤ ^0^0^^141.0^3^^ циάзазмицы •5ΚΙ8.
    [0143] Сχема κοнсτρуиροΕания πρецсτавлена на φиг.Ι и 2. - 17 - Из 5 жг ДΗΚ φага ΜΙЗшρΙδ с ποмοщьго ρесτρиκτаз Βаϊι и в§ιП (πο 10 единиц аκτивнοсτи) выρезаюτ и οчищаюτ элеκτ- ροφορезοм в легκοπлавκοй агаροзе φρагменτ ρазмеροм 1,8 τы- сяч πаρ нуκлеοτидοв. Эτοτ φρашенτ сοцеρжиτ^ κροме учасτκа 5 οгχ φага ΜΙЗ τаκже οπеρаτορ, προмοτορ, гены ϊас χ и ϊас ζ лаκτοзнοгο οπеροна, ποлилинκеρную ποслецοваτельнοсτь, и учасτοκ, κοшлеменτаρный сτанцаρτнοму οлигοнуκлеοτицнο- му πρаймеρу для сиκвенса в φагаχ сеρии тρ . Паρаллель- нο κοсмица ρΗ С79 (2 жг) в сτанцаρτныχ УСЛΟΕИЯΧ гидροли- 10 зуеτся ρесτρиκτазаш Εсοнϊ и δаϊι (πο 20 ециниц аκτивнοс- τи) . Ηа вτοροй сτации с ποмοщью φρагменτа Κленοва ДΗΚ- ποлимеρазы I из Ε.сοϊχ (5 ециниц аκτивнοсτи) в 50 мκл бу- φеρа, сοцеρжащегο 20 мΜ Τρис-ΗСΙ (ρΗ 7,4) ; 5 мΜ м§σι2 ; 10 мΜ 2-меρκаπτοэτанοла; 50 мΜ яасι; 50 мκг/мл ДΗΚ в πρи-
    [0144] 15 суτсτвии всеχ 4-х цезοκсинуκлеοτицτρиφοсφаτοв (15 мκΜ) заτуπлягоτ лиπκие κοнцы κаκ οчищеннοгο φρагменτа, сοцеρ- жащегο учасτοκ οгχ φага ΜΙЗ, τаκ и φρагменτοв πлазмицы ρΗ С79, ρасщеπленнοй ρесτρиκτазами ΕсοнΙ и 5аϊϊ. Лигиρο- вание вецуτ в эκвимοляρнοм сοοτнοшении φρагменτοв , сο-
    [0145] 20 деρжащиχ οгχ ΜΙЗ и сοз-учасτοκ φага Λ οбъеме
    [0146] 100 мκл, сοдеρжащем 50 мΜ τρис-ΗСΙ (ρΗ 7,5) , 10 мΜ м§σϊ2, 10 мΜ циτиοτρеиτа, 3 мΜ аценοзинτρиφοсφаτа, 25 ециниц аκτивнοсτи ДΗΚ-лигазы φага Τ4 и 50 мκг/мл суммаρнοй ДΗΚ. Исποльзуя сτанцаρτные меτοцы, лигиροванную ДΗΚ ввοцяτ в
    [0147] 25 Ε.сοϊχ шτ-амм ^ .Μ. Ι09. Ρассев баκτеρий προизΕθЦяτ на чаш- κи Пеτρи с 2%-ным ъ-агаροм, сοцеρжащем 25 жг/мл ам- πициллина, 0, 1 ΙΡΤΟ и 0, 1% κρасиτеля Χ-§аϊ . Из ΙΟ-τи гοлубыχ κοлοний πο сτанцаρτным меτοциκам выцелягоτ ДΗΚ ( Ι0 мκг) и анализиρугоτ ρесτρиκτазами ΕсοнΙ, Ρд-ьΙ,
    [0148] 30 нχηά Ш, ΒатΙ, в§ιП и ЗаϊΙ. Κοнсτρуκцию, κοτορая οблаца- еτ προгнοзиρуемοй ρесτρиκτазнοй κаρτοй (φиг. Ι) , и назван- ную циφазмицοй зΜ, исποльзугоτ для цальнейшиχ οπеρаций. С цельго уменыπения ρазмеρа 5 жг зΚϊ гидροлизуюτ ρесτ- ρиκτазаш ΗχηάШ и в^ιП (πο 5 ециниц аκτивнοсτи) , а за-
    [0149] 35 τем φρагменτ, сοцеρжащий ген усτοйчиΕοсτи κ алшициллину , οчищаюτ элеκτροφορезοм в легκοπлавκοй агаροзе. Паρаллель- нο эτими же ρесτρиκτазами οбρабаτываюτ 5 жг ДΗΚ φага ,113 тρ ϊδ и τаκже выцеляюτ низκοмοлеκуляρный φρагменτ из легκοπлавκοй агаροзы ποсле элеκτροφορеза. 06а φρагменτа лπгиρуюτ в 0, 1 ш ρасτвορа, сοцеρжащегο 50 мΜ Τρис-ΗСΙ - 18 - (ρΗ 7,5), 10 мΜ м§сι2 , 10 мΜ диτиοτρеиτа, 3 мΜ аценοзин- τρиφοсφаτа, 5 ециниц аκτивнοсτи ДΗΚ-лигазы φага Τ4 πρи суммаρнοй κοнценτρации ДΗΚ φρагменτοв 50 жг/мл, ΙΟ-τью мκл эτοгο ρасτвορа τρансφορмиρуюτ κлеτκи Ε. сοϊχ шτамм 5 з.Μ.109 и τρансφορшροванные κлеτκи высеваюτ на ь-агаρ, сοдеρжащий 25 жг/мл амπициллина, а τаκже πο 0,1$ Χ-βаϊ и ГΡΤα . Из гοлубыχ κοлοний наρащиваюτ κлеτκи в 10 мл ь-сρецы с ашициллинοм (100 жг/мл) и выцеляюτ щелοчным лизаτοм ДΗΚ ( -~ 10 жг). 0,5 ДΗΚ ρасщеπляюτ ρесτρиκτаза-
    [0150] 10 Ш ΕсθΗϊ, Ρв-Ь I, ΗχηάΙΙΙ, ΒатΙ , Β§1П, Заϊϊ И анЭЛИЗИΡУЮΤ элеκτροφορезοм в агаροзнοм геле. Κοнсτρуκцию, κοτορая οб- лацаеτ щшюзиρуемοй ρесτρиκτазнοй κаρτοй (φиг.Ι) и назван- ную 5Κ2, исποльзуюτ на следующей сτации. 5 жг ДΗΚ κοсми- цы ρΗ С79 ρасщеπлягоτ ρесτρиκτазοй в§ιП и φρагменτ, сο-
    [0151] 15 цеρжащий сοз-учасτοκ, элгоиρугоτ из легκοπлавκοй агаροзы ποсле элеκτροφορеза. 2 жг ДΗΚ 5Κ2 τаκже гицροлизуюτ в§ι П,и эτοτ πρеπаρаτ лигиρуюτ с φρагменτοм, сοцеρжащим сοз-учасτοκ в буφеρе, сοцеρжащем 50 мΜ Τρис-ΗСΙ (ρΗ 7,5), 10 мΜ Μβсι2, Ю мΜ циτиοτρеиτа, 3 мΜ аценοзинτρиφοсφаτа,
    [0152] 20 5 ециниц аκτивнοсτи ДΗΚ-лигазы φага Τ4 πρи 2-κρаτнοм мο- ляρнοм избыτκе φρагменτа и суммаρнοй κοнценτρации ДΗΚ
    [0153] ~ 50 жг/мл. ΙΟ-τью мκл эτοгο ρасτвορа τρансφορмиρуюτ κлеτκи Ε.сοϊχ шτамма ' д.Μ.109, κοτορые высевагоτ на ι*- -агаρ с амπициллинοм (25 жг/мл) . С выροсшиχ κοлοний сни-
    [0154] 25 магоτ οτπечаτκи на ниτροцеллюлοзные φильτρы и προвοцяτ гибρицизациго φρагмеκτοм в§ιП κοсшды ρΗ С79, сοдеρжащем учасτοκ сο$ , κοτορый меτяτ Ρ с ποмοщьго ниκ-τρансляции. Κлеτκи из 5 κοлοний гибρицизугощиχся с сοз-φρагменτοм, на- ρащиваюτ в 10 мл ъ-сρецы с амπициллинοм ( ^ΙΟΟ жг/мл)
    [0155] 30 и выцелягоτ ДΗΚ щелοчным лизисοм (~Ι0 жг), 0,5 жг ДΗΚ ρасщеπляюτ ρесτρиκτазаш ΕсοнΙ, Ρз-ьΙ, ΗχηάШ, ΒатΙ, в§Ш, ЗаϊΙ и анализиρуюτ элеκτροφορезοм в агаροзнοм геле. Βсе 5 циφазмиц οблацаюτ πραшοзиρуемοιϊ ρесτρиκτазнοй κаρτοй (φиг.Ι), οцну из ниχ (ЗΚ6) исποльзуюτ на следугощей сτации.
    [0156] 35 5 жг ДΗΚ з-Κб часτичнο гицροлизуюτ ρесτρиκτазοй Бсοнϊ, и линейную φορглу циφазмиды οчищаюτ элеκτροφορе- зοм в легκοπлавκοй агаροзе. ПοлученныГι πρеπаρаτ οбρабаτы- ваюτ в 45 мκл ρасτΕορа, сοцеρжащегο 20 ыΜ Τρис-ΗСΙ (ρΗ 7,4) - 19 - 5 мΜ ΜβСϊ2, Ю мΜ 2-меρκаπτοэτанοла, 50 мΜ щс , πο 15 мκΜ всеχ 4-х дезοκсинуκлеοзиц τρиφοсφаτοв и 5 ециниц аκτивнοсτи Κленοва ДΗΚ-ποлимеρазы I в τечение 20 мин πρи τемπеρаτуρе 20°С. Заτем в ρасτвορ цοбавляюτ 5 мκл буφеρа 500 мΜ
    [0157] 5 "Τρис-ΗСΙ (ρΗ 7,5) , 100 мΜ м§σι2, 100 мΜ диτиοτρеиτа, ЗΟмΜ аденοзинτρиφοсφаτа и 20 единиц аκτивнοсτи ДΗΚ-лигазы φага Τ4. Лигиροванне вецуτ πρи Ι6°С в τечение 14 ч. ΙΟ-τью мκл эτοгο ρасτвορа τρансφορмиρуюτ κлеτκи Ε. сοϊχ шτамм ό.Μ. Ι09 κοτορые высеваюτ на ь-агаρ с амπициллинοм (25 жг/мл) ,
    [0158] 10 Χ-ёаϊ (0,1 ) и ΙΡΤс. (0, 1$) . Из 5-τи гοлубыχ κοлοний в 10 мл ъ-сρецы с аглπициллинοм (100 мκл/мл) наρащиваюτ κлеτκи и выцеляюτ ДΗΚ циφазмицы (10 жг) , ДΗΚ ρасщеπляюτ ρеСΤρИΚΤЭЗаш ΕθθΗϊ, Ρз-Ьϊ , Ηχηά Ш, ΒашΙ, в§ιП, ЗаϊΙ и анализиρуюτ элеκτροφορезοм в агаροзнοм геле. Из 5-τи προ-
    [0159] 15 анализиροванныχ ДΗΚ 2 οκазались иценτичны исχοцнοй зΚб, а τρи не сοцеρжаτ ΕсοнΙ - учасτκа πеρец τеτρациκлинοвым προмοτοροм, и, τаκим οбρазοм, οблацаюτ προгнοзиρуемοй ρесτρиκτазнοй κаρτοй (φиг.Ι) .
    [0160] Эτа циφазшца ποлучила название зΚΙ8; . 0,5 жг ДΗΚ
    [0161] 20 5ΚΙ81 ποлнοсτью гидροлизуюτ ρесτρиκτазοй ΑссΙ и цοсτρаи- ваюτ лиπκие κοнцы учасτκа ΑссΙ, наχοдящегοся вне ποлилин- κеρа, φρагменτοм Κленοва в πρисуτсτвии άΑΤΡ и άΤΤΡ.Эτοτ πρеπаρаτ οбρабаτывагоτ ДΗΚ лигазοй φага Τ4 (5 единиц аκτив- нοсτи) в 50 мκл ρасτвορа, сοдеρжащегο 50 мΜ Τρис-ΗСΙ
    [0162] 25 (ρΗ 7,5) , 10 мΜ м§сϊ2 , Ι0 мΜ диτиοτρеиτа, 3 мΜ ΑΤΡ πρи Ι6°С Ε τечение нοчи. ΙΟ-го мκл эτοгο ρасτвορа τρансφορш- ρугоτ κлеτκи Ε.сοϊχ шτамм д .Μ.109, κοτορые высевагоτ на ιϊ-агаρ, сοдеρжащий ашициллин (25 жг/мл) , X - §аϊ (0, 1$) и ГΡΤс (0, 1$) . Из 6 гοлубыχ κοлοний наρащиваюτ
    [0163] 30 κлеτκи в 10 мл ь-сρеды с ашициллинοм (100 жг/мл) и выделяюτ щелοчным лизисοм ДΗΚ ( ^ 10 жг) . 0, 5 жг ДΗΚ ρасщеπляюτ ρесτρиκτазοй ΑссΙ и анализиρугоτ элеκτροφορе- зοм в агаροзнοм геле. 4 πлазшцы οκазались иденτичны ЗΚΙ8' , а 2 сοдеρжали τοльκο οдин учасτοκ ΑссΙ. Эτу циφаз-
    [0164] 35 шцу , назΕаннуго 5ΚΙ8 (φиг.2) , исπαльзуюτ на слеπугощей сτации.
    [0165] ДΗΚ циφазмицы 5ΚΙ8 гицροлизуюτ ρесτρиκτазοй вβϊи π οсτанавливаюτ ρеаκциго προгρеванием 15 шнуτ πρи 65°С. Заτем ДΗΚ ρазвοцяτ в 3 ρаза и προизвοдяτ саιлοлигиροвание . - 20 -
    [0166] Лигиροваннοй ДΗΚ τρансφορшρуюτ κлеτκи Ε. сοϊχ шτамм ό.Μ.109, κοτορые высеваюτ на ъ -агаρ с анτибиοτиκοм аши- ιχиллинοм. Из 10 выροсшиχ κοлοний κлеτκи наρащиваюτ в 10 мл ъ -сρеды с аглπициллинοм и выделяюτ ДΗΚ щелοчным лизисοм.
    [0167] 5 0,5 жг ДΗΚ ρасщеπляюτ ρесτρиκτазаш ΕсοΚΙ, Βат Ι, Заϊ ϊ, Ββϊ П и анализиρуиτ элеκτροφορезοм в Ι -нοм агаροзнοм ге- ле. 6 φазшц οбладаюτ προгнοзиρуемοй ρесτρиκτазнοй κаρτοй, οдну из ниχ, названнуго 5Κ2Α, исποльзуюτ для следующей сτадии, Φазшда зΚ2Α οτличаеτся οτ φазшцы 5Κ2 οτсуτсτ-
    [0168] Ю вием учасτκοв ρасποзнавания ρесτρиκτаз ΕсοΚΙ и ΑссΙ, ρасπο лοженныχ вне ποлилинκеρа. Τаκим οбρазοм, φазмица з Κ2Α сοцеρжиτ φρагменτ πлазшцы ρБΗ322 с учасτκοм начала ρеπли- κации и генοм усτοйчивοсτи κ ашициллину , и φρагменτ φага ΜΙЗшρΙδ с ποлилинκеροм, генοм ϊас ζ и учасτκοм, οτвеτсτвен
    [0169] 15 ным за уπаκοвκу οцнοцеποчечнοй ДΗΚ в белκи φага ΜΙЗ. Ρазме зΚ2Α οκοлο 4,5 τысяч πаρ нуκлеοτицοв (τ.π.н. ) .
    [0170] Заτем προвοцяτ уцаление учасτκа узнавания ρесτρиκτазы 5аϊ Ι в φазмиде 5Κ2Α. ДΗΚ φазшцы 5Κ2Α гицροлизуюτ ρесτ ρиκτазοϊ Заϊ Ι и οсτанавливаюτ ρеаκцию προгρеванием Ι5ш-
    [0171] 20 нуτ πρи τемπеρаτуρе 65°С. С ποмοщью φρагменτа Κленοва ДΗΚ- ποлимеρазы I из Ε.сοϊχ в πρисуτсτвии всеχ 4-х цезοκсинуκ- леοзицτρиφοсφаτοв "заτуπляюτ" лиπκие κοнцы. Заτем ρасτвορ ДΗΚ ρазвοдяτ в 3 ρаза и προвοцяτ самοлигиροвание . Лигиρο- ванную ДΗΚ ввοцяτ в κлеτκи Ε.сοϊχ шτамм з.Μ.109. Ρассев
    [0172] 25 баκτеρий προизвοцяτ на чажи Пеτρи с 2$-ным ъ-агаροм, сοцеρжащим 25 жг/мл аглπициллина, 0,1 ГΡΤσ и 0,1$ X- аϊ . Из 10-τи белыχ κοлοний πο сτанцаρτным меτοциκам выцеляюτ ДΗΚ и анализиρуюτ ρесτρиκτазами Εсοнϊ, ΒатΙ, ЗаϊΙ. Φазмиду, сοдеρжащую Εсснϊ, Βат I, нο не сοдеρжащую
    [0173] 30 заϊι - учасτκοв узнавания ρесτρиκτазаш и названную ЗΚ2Α исποльзуюτ на следугощей сτадии, на κοτοροй προвοдяτ уцале- ние учасτκа узнавания ρесτρиκτазы ΕсοнΙ в φазшце ЗΚ2 Δ 5. Для эτοгο ДΗΚ φазшцы ЗΚ2Δ З гицροлизуюτ ρесτρиκτазοй ΕсοκΙ и οсτанавливаюτ ρеаκциго προгρеванием 15 мин πρи ο 35с 65°С. С ποмοщьго φρагменτа ΚленοΕа Ε πρисуτсτвии ΕСΘΧ 4-х цезοκсинуκлеοзицτρиφοсφаτοв заτуπляюτ лиπκие κοнπы. Заτем ДΗΚ ρазвοдяτ в 3 ρаза и προвοдяτ еамοлигиροвание. Лигиρο- ванную ЩΚ ρасщеπляюτ ρесτρиκτазοй ΕсοнΙ и ΕΕΟДЯΤ Β κлеτ- - 21 - κи Ε.сοϋ шτамм д.Μ.109, ρассев баκτеρий προизвοцяτ на ъ-агаρ с 25 жг/мл амπициллинοм. Из 10-τи κοлοний πο сτанцаρτным меτοдиκам выделяюτ ДΗΚ и анализиρуюτ ρесτρиκ- τазами ΕсοнΙ, Βат I и ЗаϊΙ. Φазмиду, сοдеρжащую ΒатΙ,
    [0174] 5 нο не сοдеρжащую Εсοн I и баϊϊ учасτκοв (назΕанную зΚ2д зн ) , исποльзуюτ цля κοнсτρуиροвания ρеκοмбинанτнοй .:φазшды ёзн. ДΗΚ φаτаΛβέ II гидροлизуюτ ρесτρиκτазοй ΒатΙ и φеρменτ инаκτивиρуюτ προгρеванием. Заτем προвο- дяτ οτжиг лиπκиχ κοнцοв φага инκубацией ρасτвορа ДΗΚ
    [0175] Ю πρи τемπеρаτуρе 42°С в τечение I ч, и ценτρальный .ватϊ - φеρменτ ρазмеροм οκοлο 6,5 τысяч πаρ нуκлеοτицοв οчищаюτ гель-элеκτροφορезοм в 0,7^-нοй легκοπлавκοй агаροзе (πρе- πаρаτ Α). ДΗΚ φазмицы зΚ2д зн гицροлизуюτ ρесτρиκτа- зοй ΒатΙ и ποсле инаκτивации φеρменτа προгρеванием лиги-
    [0176] 15 ρуюτ с πρеπаρаτοм Α. Лиг.иροванную ДΗΚ ввοдяτ в κлеτκи Ε.-сοϊχ шτамм ό.Μ.109 и ρассеиваюτ на ъ-агаρ с амπицил- линοм (25 мκг/мл). С выροсших κοлοний снимаюτ οτπечаτκи на ниτροцеллюлοзные φильτρы и προвοдяτ гибρидизацию с πρе- πаρаτοм Α, ДΗΚ κοτοροгο меτяτ Ρ с ποмοщью ниκ-τρансля-
    [0177] 20 ции. Κлеτκи из 5 κοлοний, гибρицизугощиχся с πρеπаρаτοм Α, наρащивагоτ в 10 мл ] сρеды с амπициллинοм (100 мκг/мл и выделягоτ πлазшцную ДΗΚ сτанцаρτнм меτοцοм. Αнализ ποлученнοй ДΗΚ ρесτρиκτазаш ΕсοнΙ, ΒатΙ, ЗаϊΙ ποцτвеρж- цаеτ κлοниροвание в φазшце 8Κ2ΔЗΗ учасτκа Λ β"ЫΪ.
    [0178] 25 Эτу φазшду, названную βЗ-Η, исποльзуюτ для κοнсτρуиροва- ния φага-веκτορа _/ βΕз7 (φиг.З). 0,5 мκг ДΗΚ φазшцы н гицροлизуюτ ρесτρиκτазοй Ββ и φеρменτ инаκτивиρуюτ προг- ρеванием. 3 мκг ДΗΚ φага^вмвъЗ гицροлизугоτ ρесτρиκτазοй Βатϊ. и φеρменτ инаκτивиρуюτ. Οба πρеπаρаτа ДΗΚ в эκвимс-
    [0179] 30 ляρныχ сοοτнοшенияχ смешиΕаюτ и лигиρуюτ. Лигиροваннуго ДΗΚ уπаκοвываюτ в белκи φага^ χη νχ-Ьгο и Ι/ΙΟΟ ποлучен- ныχ φагοвыχ часτиц ρассеивагоτ на газοн κлеτοκ Ε. сοϊχ шτамм ъΕ392, сοцеρжащий 0,1^ Χ-βа1 . Из ΙΟ-τи гοлубыχ бляшеκ наρащиваюτ φаг, выцеляюτ ДΗΚ и анализиρуюτ с πο-
    [0180] 35 мοщъю ρесτρиκτаз ΕсοΗϊ, ваηϊ, 5аϊΙ. Οцин из φашв, наз- ванный Ι§Εз7, имееτ οжицаемую сτρуκτуρу (φиг.З). Εгο исποльзуюτ на следующей сτадии.
    [0181] 0,5 ыκг ДΚΚ πлазшды ρυС4Κ гидροлизугоτ ρесτρяκτазοй н±ηά Ш и οсτанавливаиτ ρеаκцию προгρеванием 15 минуτ - 22 - πρи 65°С. Заτем 4 мκг ДΗΚ φага Л ρасщеπляюτ ΗχηάШ и φρагменτ ρазмеροм ~ 2,0 τысяч πаρ нуκлеοτицοв οчищаюτ гель-элеκτροφορезοм в 0,7^-нοй легκοπлавκοй агаροзе (δ±βта ). Οчищенный φρагменτ смешиваюτ в эκвимοляρныχ κοн-
    [0182] 5 ценτρацияχ с ρυС4Κ, ρазρезаннοй ΗχηάШ и лигиρугоτ. Лигиρο- ваннοй ДΗΚ τρансφορмиρуюτ κлеτκи Ε.сοϊχ шτамм З.Μ.Ι09, κοτορые высеваюτ на ъ-агаρ с анτибиοτиκοм ашициллинοм ( -* 25 мκг/мл) . С выροсшиχ κοлοний снимаюτ οτπечаτοκ на ниτροцеллюлοзный φильτρ и προвοдяτ гибρидизацию с мече-
    [0183] 10 нοй Ρ ДΗΚ φага • Из 6-τи гибρицизугощиχся κοлοний κлеτκи наρащиваюτ в 10 мл ъ-сρецы с амπициллинοм и выцеля юτ ДΗΚ щелοчным лизисοм ( ~ 10 мκг). 0,5 жг ДΗΚ ρасщеπля- юτ ρесτρиκτазаш Εсοнϊ, ΒашΙ, ЗаϊΙ, ΗχηάЩ и анализиρугоτ элеκτροφορезοм в Ι^-нοм агаροзнοм геле. Οцна из πлазмиц,
    [0184] 15 οблацающая προгнοзиρуемοй ρесτρиκτазнοй κаρτοй, назван- ная ρ4Κъ-Ι исποльзуеτся на следующей сτадии.
    [0185] 0,5 мκг ДΗΚ πлазшцы ρ4Κϊг-Ι гицροлизуюτ ρесτρиκτаза- ми ΕсοнΙ и ЗаϊΙ и ρеаκцию οсτанавливаюτ προгρеванием 15 шнуτ πρи 65°С. 2 жг ДΗΚ φага Л дΕз ρасщешшюτ ρес-
    [0186] 20 τρиκτазοй ЗаϊΙ и φеρменτ инаκτивиρуюτ προгρеванием 15 ми- нуτ πρи 65 С. Οба πρеπаρаτа смешиваюτ в эκвимοляρныχ сο- οτнοшенияχ и лигиρуюτ. Лигиροваннуго ДΗΚ уπаκοвывагоτ в бел- κи φага χη νχ-Ьгο и 1/500 ποлученныχ φагοвыχ часτиц ρассеивагоτ на газοн κлеτοκ Ε.сοϊχ шτамм ЬΕ392.
    [0187] 25 С чашκи Пеτρи снимагоτ οτπечаτοκ на ниττюцеллтолοзный φильτρ и προвοцяτ гибρицизацию с меченным Ρ φρашенτοм ДΗΚ ρϋС4Κ, сοцеρжащим ген усτοйчивοсτи κ κанашцину и вы- щеπленным из πлазшды ρесτρиκτазοй 3-аϊΙ, Из 6-τи гибρи- цизующиχся бляшеκ в 10 мл " ъ-сρецы с κлеτκшли Ε. сοϊχ
    [0188] 30. шτамм ЪΕ392 наρащивагоτ φаг, выцеляюτ ДΗΚ и анализиρуюτ с ποмοщью ρесτρиκτаз ΕсοΕΙ, ватϊ и ЗаϊΙ. Βсе φаги сοцеρ- жаτ инаκτивиροванный ген усτοйчивοсτи κ κанашцину и οцин из ниχ ( βΚ5) исποльзуюτ цля κοнсτρуиροвания Л 5ΚΙ5. 10 жг φага _/ ζмвъЗ гицροлизуюτ ρесτρиκτазοй ΒашΙ
    [0189] 35 и всτаΕοчный φρагменτ ρазмеρθχΜ οκοлο 13,7 τысяч πаρ нуκле- ΟΤИЦΟΕ οчишаюτ гель-элеκτροφορезοм Ε 0,7^-ΗΟЙ легκοπлаΕκοй агаροзе. 2 жг ДΗΚ φага Л β2Κ5 гицροлизуюτ ρесτρиκτазοй ЗатΙ и φеρменτ инаκτивиρугаτ προгρеванием 15 ωщ τ πρи - 23 -
    [0190] 65°С. Οба πρеπаρаτа смешиваюτ в эκвимοляρныχ сοοτнοше- нияχ и лигиρуюτ. Лигиροванную ДΗΚ уπаκοвываюτ χη ν-ι-Ьгο в белκи φага и Ι/Ι00 ποлученныχ φагοвыχ часτиц ρассеиваюτ на газοн κлеτοκ Ε.сοϊχ шτамм Ι3..392. Быροсшие бляшκи πе- 5 ρеκалыΕаюτ на газοн κлеτοκ ς359, лизοгенныχ πο φагу Ρ2. Βсτавοчный φρашенτ изτ -змвъЗ οбесπечиваеτ зρ!+φенοτиπ, το есτь невοзмοжнοсτь ρазшοжаτься на κлеτκаχ Ε.сοϊχ , лизοгенныχ πο φагу Ρ2. Пοэτοму из 6-τи бляшеκ, не выροс- шиχ на $59, наρащиваюτ φаг, выделяюτ ДΗΚ и анализиρу- 10 юτ с ποмοщью ρесτρиκτаз ΕссΗΙ, ΒатΙ и ЗаϊΙ. Οдин из ниχ имееτ οжидаемую сτρуκτуρу и назван »^5ΚΙ5. Пρимеρ 2.
    [0191] Κлοниροвание Ε у 5ΚΙ5 φρашенτοв генοмнοй ДΗΚ челο- веκа. 15 3 мκг ДΗΚ челοвеκа ρасщеπляюτ ρесτρиκτазοй ΒатΙ Ε сτандаρτныχ услοвияχ и инаκτивиρугоτ φеρменτ προгρеΕани- ем 15 шнуτ πρи 65°С.
    [0192] 3 мκг ДΗΚ Л 5Κ9 гидροлизуюτ ρесτρиκτазаш ΒатΙ и ΕсοЯΙ и инаκτивиρугоτ φеρменτы προгρеванием и οчищагоτ οτ 20 οлигοнуκлеοτицныχ линκеροв οсажцением ποлиэτиленглиκοлем- 6000.
    [0193] Οба πρеπаρаτа смешиваюτ (весοвοе сοοτнοшение ДΗΚ веκ- τορа и генοмнοй ДΗΚ 2:1) и προвοдяτ лигиροвание πρи сум- маρнοй κοнценτρации ДΗΚ 250 мκг/мл. 25 I • 10 мκг лигиροваннοй ДΗΚ уπаκοвываюτ в белκи φага χη νχ-Ьгο и 1/500 ποлученныχ φагοвыχ часτиц ρассе- ваюτ на газοн Ε.сοϊχ шτамм ъΕ392. Пρи πеρеκοле 50 бляшеκ на газοн с.359 τοльκο οцна из ниχ не выροсла, τаκим οб- ρазοм, ρеκοмбинанτные φаги сοсτавлягоτ свыше 95 . Из 6-τи 30 случайнο οτοбρанныχ бляшеκ с газοна ЪΕ392 в 10 мл ъ - сρеды с ъΕ392 были выρащены φаги и выцелена из ниχ ДΗΚ. Элеκτροφορеτичесκий анализ„ДΗΚ ποκазал, чτο все οни - ρеκοмбинанτы и сοцеρжаτ всτавκу ДΗΚ οτ 4 цο 7 τы- сяч πаρ нуκлеοτицοΕ 0,5 жг ДΗΚ οцнοгο из ниχ (φаг Λ- I) 35 гицροлизуюτ в τечение 30 вдн I ецинипу ρесτρиκτазы Заϊι. Φеρменτ инаκτивиρугаτ 3-χ-κρаτным замορажиΕанием/οττаи- ванием. ДΗΚ ρазвοцяτ и лигиρугаτ πρи κοмнаτнοй τемπеρа- τуρе в τечение I ч. 0,1 мκг лигиροваннοй ДΗΚ дοбавлягоτ - 24 - κ κοмπеτенτным κлеτκам Ε.сοϊχ шτамм з.Μ.109, инκубиρугоτ 10 шн πρи 0°С, заτем 3 мин πρи 38°С и, ποсле цοбавления I мл ъ-сρецы, еще 45 вдн πρи 37°0. Заτем 0,2 мл κлеτοκ ρассеΕагоτ на ъ-агаρ с амπициллинοм (25 мκг/мл). Из
    [0194] 5 3-х κοлοний в 10 мл Ζ -сρецы с амπициллинοм (50 мκг/мл) наρащиваюτ κлеτκи и выцеляюτ ДΗΚ щелοчным лизисοм. Элеκτ- ροφορеτичесκий анализ ДΗΚ ποκазываеτ, чτο πлазшцы сοцеρ- жаτ τу же всτавκу ДΗΚ, чτο и исχοцный φаг Л I.
    [0195] Пροмышленная πρименимοсτь
    [0196] 10 Βеκτορ з Ι5 наχοциτ πρименение для κοнсτρуиροва- ния библиοτеκ генοв κДΗΚ и κлοниροвания из эτиχ библиοτеκ инτеρесующиχ генοв.
    权利要求:
    Claims

    - 25 -
    ΦΟΡΜУΙΑ ИЗΟБΡΕΤΕШШ Φагοвый веκτορ замещения Я 5ΚΙ5 для κοнсτρуиροвания библиοτеκ сτρуκτуρныχ генοв κДΗΚ,χ а ρ а κ τ е ρ и з у га - щ и Гι с я τем, чτο οн имееτ ρазмеρ 51,2 τысяч πаρ нуκлеο- 5 τицοв и сοсτοиτ из:
    -Сοа - 5аϊι - φρагменτа ДΗΚ φагау ΕмвъЗ - левοе πле- чο ρазмеροм 20,3 τысяч πаρ нуκлеοτицοв;
    - 5аϊι - Ηχηά Ш - φρагменτа гена усτοйчивοсτи κ κа- намицину ρазмеροм ~ 0,5 τысяч πаρ нуκлеοτицοв;
    Ю - нχηά Ш - нχηά Ш - φρагменτа φага Л ρазмеροм
    2,0 τысяч πаρ нуκлеοτицοв;
    - Ηχηά Ш - 5аϊΙ - φρагменτа гена усτοйчивοсτи κ κа- намицину ρазмеροм ~ 1,0 τысяч πаρ нуκлеοτицοв;
    - Заϊι - в§ιП - φρагменτа ДΗΚ φазшцы зΚ2Λ, ρаз- 5 меροм 3,8 τысяч πаρ нуκлеοτицοв, в κοτοροм меτοцοм цοсτ- ροйκи уничτοжен ΕСΟΕΙ учасτοκ; уποмянуτая φазмица 8Κ2Α сκοнсτρуиροвана из веκτορа зΚΙ8, ποлученнοгο из φρаг- менτοв ДΗΚ φага Я , φага ΜΙЗ и κοсмицы ρΗ 079;
    - ΒатΙ - ΒатΙ - φρагменτа ρазме- 0 ροм 13,7 τысяч πаρ нуκлеοτицοв;
    - ΒашΙ - в§ιП - φρагменτа ДΗΚ уποмянуτοй φазшцы 8Κ2Α ρазмеροм 0,7 τысяч πаρ нуκлеοτицοв, в κοτοροм меτο- дοм цοсτροйκи уничτοжен заϊ учасτοκ;
    - 5аϊΙ - Сοз - φρагменτа ДΗΚ φага Я ΕΜΒЪЗ - πρавοе5 πлечο ρазмеροм 9,2 τысяч πаρ нуκлеοτицοв;
    - месτа вοзмοжнοй Εсτавκи чужеροцнοй ДΗΚ πο учасτκам узнаΕания ρесτρиκτаз ΒашΙ и Εсοκϊ;
    Εмκοсτъ веκτορа οτ 0,2 πο 15,4 τысяч πаρ нуκлеοτи- цοв; имееτ сπеκτρ χοзяев шτаммы ΕзсϊιегχсЬχа сοϊχ: 0 ЪΕ392 = ϊ", ьвά Й 514 (г~, т~), аиρ Ε44, зиρ Ρ<58,
    Ιас ΥϊΟΖζϊасΙΖΥ )6, §аϊΚ2, §а1 Τ22, теШ., "ЬгρΕ55,
    Ο.Μ.Ι09 = гесдϊ, дϊас ρгο, еηά Αц, §уг Α9б, "Ыι±-1 ,
    Ьвά Κ17, зиρ Ε44, геϊ Α1 , ρ», -Ьга БЗб, ρгο ΑΒ+, Ιас Ι ΖΔΜϊ5 Ρ359 = ЬвάΗк-, ЬаάΜк+, зиρ Ρ, 080, Ρ2 ; 5 деποниροван 21.07.89 вο Зсесοгазнοй κοллеκции προмышленныχ миκροορганизмοв Βсесοгазнοгο научнο-исслецοваτельсκοгο ин- сτиτуτа генеτиκи и селеκшιи προмышленныχ миκροορганизмοв и заρегисτρиροван за ΡΗ ;688.
    类似技术:
    公开号 | 公开日 | 专利标题
    Pei et al.2017|Polylox barcoding reveals haematopoietic stem cell fates realized in vivo
    Long et al.2018|Correction of diverse muscular dystrophy mutations in human engineered heart muscle by single-site genome editing
    Gaide et al.2015|Common clonal origin of central and resident memory T cells following skin immunization
    Hargreaves et al.2014|Restriction and recruitment—gene duplication and the origin and evolution of snake venom toxins
    Hoffman et al.2016|Concise review: stem cell trials using companion animal disease models
    Finch2010|Evolution of the human lifespan and diseases of aging: roles of infection, inflammation, and nutrition
    Chapman et al.2003|The sex peptide of Drosophila melanogaster: female post-mating responses analyzed by using RNA interference
    DeOrio et al.1982|Lumbar disc excision in children and adolescents.
    Ito et al.2006|Interferon‐gamma is causatively involved in experimental inflammatory bowel disease in mice
    Voelker et al.2010|Pliocene forest dynamics as a primary driver of African bird speciation
    Heil et al.2005|Postsecretory hydrolysis of nectar sucrose and specialization in ant/plant mutualism
    Booth et al.2012|Facultative parthenogenesis discovered in wild vertebrates
    Stutt et al.2001|Traumatic insemination and sexual conflict in the bed bug Cimex lectularius
    Macpherson et al.2007|The functional interactions of commensal bacteria with intestinal secretory IgA
    Brown et al.1960|Comparative biochemistry of urea synthesis. 3. Activities of urea cycle enzymes in various higher and lower vertebrates
    Newport et al.1987|The nucleus: structure, function, and dynamics
    Hanson et al.1953|Structural basis of the cross-striations in muscle
    US5733731A|1998-03-31|Peptide library and screening method
    Greely2016|The end of sex and the future of human reproduction
    Dow et al.2010|Drosophila provides rapid modeling of renal development, function, and disease
    Cheng et al.1999|Tissue tropism, transmission and expression of foreign genes in vivo in midgut symbionts of tsetse flies
    Kaplan et al.2007|Hematopoietic stem-cell contribution to ectopic skeletogenesis
    Stumpf et al.2013|The primate vaginal microbiome: comparative context and implications for human health and disease
    Aksoy et al.2003|Interactions between tsetse and trypanosomes with implications for the control of trypanosomiasis
    Manzini et al.2006|Genetically modified pigs produced with a nonviral episomal vector
    同族专利:
    公开号 | 公开日
    DE3990972C2|1992-12-24|
    GB2230012A|1990-10-10|
    JPH03505402A|1991-11-28|
    SE9001560D0|1990-04-30|
    GB9009525D0|1990-07-25|
    SE465577B|1991-09-30|
    SU1650699A1|1991-05-23|
    SE9001560L|1990-04-30|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1990-03-08| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): CH DE GB JP KR SE US |
    1990-04-30| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 90015603 Country of ref document: SE |
    1990-04-30| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 90015603 Country of ref document: SE |
    1990-08-23| REG| Reference to national code|Ref country code: DE Ref legal event code: 8642 |
    1990-11-22| RET| De translation (de og part 6b)|Ref document number: 3990972 Country of ref document: DE Date of ref document: 19901122 |
    1990-11-22| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 3990972 Country of ref document: DE |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    SU884478259A|SU1650699A1|1988-08-31|1988-08-31|Фаговый вектор замещени @ К15 дл конструировани библиотек структурных генов к ДНК|
    SU4478259/31||1988-08-31||DE19893990972| DE3990972T1|1989-08-29|1989-08-29|Phagen-vektor der substitution sk15 zum konstruiereen von bibliotheken der sturkturgene kdns|
    GB9009525A| GB2230012A|1988-08-31|1990-04-27|Substitution phage vector lambda sk15 for construction of kdna gene libraries|
    [返回顶部]