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    公开号:WO1989006485A1
    申请号:PCT/DE1989/000043
    申请日:1989-01-23
    公开日:1989-07-27
    发明作者:Brigitte Damm；Lothar Willmitzer
    申请人:Institut Für Genbiologische Forschung Berlin Gmbh；
    IPC主号:C12N15-00
    专利说明:
    [0001] Regenerationsverfahren zur Herstellung von intakten fertilen Arabidopsis-Pflanzen aus Protoplasten
    [0002] Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Regenerationsverfahren, bei dem ausgehend von Protoplasten durch Verwendung einer Polymermatrix Hikrokolonien und schließlich intakte fertile Arabidopsis-Pflanzen gebildet werden.
    [0003] Durch die europäische Patentschrift EP 22 434 ist die Immobilisierung von Biokatalysatoren (wie z.B. Protoplasten) in dem Polysaccharid Alginat bekannt. Vo L. T. Xuan und L. Menczel (Z. Pflanzenphysiol. 96. 77 (1980) wird ein Verfahre zur Produktion von Sprossen aus Protoplasten beschrieben. Die von diesen Autoren erhaltenen Sprossen wurden jedoch nicht auf Vermehrungsfähigkeit getestet.
    [0004] Es wurde nun überraschend gefunden, daß sich aus Protoplasten, die in eine Polymermatrix eingebettet werden, Hikrokolonien bilden, die zu intakten vermehrungsfähigen Pflanzen regeneriert werden können.
    [0005] Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Regeneration von intakten fertilen Arabidopsis-Pflanzen aus Protoplasten, die man aus unterschiedlich differenzierten Geweben von Arabidopsis thaliana (embryonales Gewebe, Kotyledonen, Hypokotyl, Primärwurzeln), aus verschiedenen Organen von Arabidopsisthaliana-Pflanzen unterschiedlichen Alters von 4 Tagen bis zur Blüte der Pflanzen sowie aus dedifferenziertem Gewebe (wie Kallus oder Suspensionskultur) isoliert, das dadurch gekennzeichnet ist, daB man diese Protoplasten zum Wachstum in der Dunkelheit als Individuen in ein anionisches Polymerisat einbettet und anschlieβend nach 3 wöchigem Wachstum auf einem Kulturmedium ins Dauerlicht überführt, die in der Polymermatriκ nach insgesamt 5-6 Kulturwochen gebildeten Hikrokolonien durch Depolymerisation freisetzt, sie bis zu einem Mindestdurchmesser von 1 mm in einer Photoperiode kultiviert und in einem Regenerationsmedium elongierte Sprosse und in einem Bewurzelungsmedium neue Arabidopsis-Pflanzen heranzieht. Nach dem erfindungsgemäBen Verfahren können besonders Arabidopsis thaliana Pflanzen sowie deren Mutanten regeneriert werden. Als Polymermatrix kommen in dem erfindungsgemäßen Verfahren anionische Polymerisate, wie z. B. anionische Polysaccharide, insbesondere Alkali- und Erdalkalialginate in Betracht. Als besonders vorteilhaft erweisen sich Natrium-, Kalium- und Calciumalginat.
    [0006] Als vorteilhaft für die Regeneration erweist es sich die isolierten Protoplasten nach ihrer Einbettung in die Polymermatrix für einen Zeitraum zwischen 30 Minuten bis zu 3 Tagen (bevorzugter Bereich 6-8 Std.) bei Temperaturen von 2-10°C, insbesondere 4-6°C zu inkubieren.
    [0007] Als Medium eignen sich modifizierte B5-Medien. Die Abweichungen bestehen insbe sondere in der Wahl der Hormone [2,4-Dichlor-phenoxy-essigsäure (2,4-D); α-Naphthyl-essigsäure (NAA); 2,4,5-Trichlorphenoxyessigsäure (2.4.5-T); Indol3-buttersäure (IBA); Indol-3-essigsäure (IAA); Isopentyl-adenin (2-iP); Gibberellinsäure (GA ); Benzyl-amino-purin (BAP); Kinetin (Kin) u.s.w.] und der Osmotika [Glukose, Manπit, Sucrose u.s.w.] und modifizierte MS- und Nitsch Medien.
    [0008] Unter modifizierten MS-Medien versteht man Medien mit Variationen bei den Hormonen und Osmotika. wie sie oben für modifizierten B5-Medien bereits genannt wurden.
    [0009] Weitere Modifikationen betreffen die Wahl der Stickstoffquelle (Glutamin. NH4 + u.s.w. zusätzlich zur ursprünglichen Stickstoffquelle Nitrat) und der Vitamine (Vitamine der B-Reihe, wie z.B. Vitamin B1 B2, B6 u.s.w.).
    [0010] Die eingesetzten Hormone, Osmotika, Vitamine, Stickstoffquellen u.s.w. werden in den in der Literatur beschriebenen Konzentrationsbereichen eingesetzt. Lösungsmittel und Puffer entsprechen den in der einschlägigen Literatur beschrie benen Mitteln.
    [0011] Bei der Einbettung von Protoplasten in die Polymermatrix werden die Protoplasten in einem solchen Verhältnis mit einer 2-3 Zigen (bevorzugt 2.5-2,8 % ) Lösung eines anionischen Polymerisats in einer 0,4-0,6 M (bevorzugt 0.4-0,5 M)
    [0012] Lösung eines Osmotikums vorsichtig vermischt, daß Plattieruπgsdichten von 2-3 × 105 Protoplasten/ml entstehen. Arabidopsis thaliana (Ackerschmalwand) ist durch seine kurze Generationszeit von 4-6 Wochen, seinen minimalen Platzbedarf von mehreren tausend Pflanzen pro Quadratmeter, durch die große Zahl an kartierten Mutanten sowie durch sein kleines Genom von nur 70.000 Kb besonders gut für molekularbiologische Arbeiten geeignet.
    [0013] Eine wichtige Voraussetzung, um mit dieser Pflanze überhaupt arbeiten zu können, ist jedoch die Etablierung eines effizienten und reproduzierbaren Protoplast-Pflanzen-Regenerationssystems, wie z.B. das erfindungsgemäß beschriebene Verfahren.
    [0014] Von J.Potrykus et al., Plant Molec. Biol. Rep. 2, 177 (1985) und R.D. Shillito et al., Bio/Technology 3, 1099 (1985) sind Verfahren entwickelt worden, die eine direkte Einschleusung eines Gens in pflanzliche Zellen ohne Verwendung von biologischen Vektoren, wie z.B. von pflanzeninfektiösen Systemen (pflanzenpathogene Baktereien, Viren oder Pilzen) ermöglichen. Die als "Direkter Gentransfer" bezeichneten Verfahren erlauben eine Transformation von pflanzlichen Zellen ohne Einsatz eines biologischen Vektors.
    [0015] Die vorliegende Erfindung beinhaltet ein Regenerationsverfahren, bei dem man sowohl von Arabidopsis-Protoplasten als auch von Arabidopsis-Protoplasten/DNA-Suspensionen ausgeht und die jeweils erhaltenen Protoplasten in ein anionisches Polymerisat einbettet und danach, wie bereits oben erwähnt, Arabidopsis-Pflanzen heranzieht.
    [0016] Das Verfahren zur Transformation von Arabidopsis thaliana durch direkten Gentransfer in Mesophyllprotoplasten besteht darin, daß man Mesophyllprotoplasten aus beliebigem Pflanzengewebe von Arabidopsis thaliana isoliert und in einem der üblicherweise zur Kultivierung pflanzlicher Protoplasten verwendeten Nährmedien kultiviert, diese Protoplasten vor der Transformation 0,5-8 Stunden in dem Vorinkubatioπsmedium W5 bei 4°C vorinkubiert, nach Abtrennung des Vorinkubationsmediums die Protoplasten in dem Transformationsmedium MaMg-Lösung bei einer Dichte von 1,6 .10 Protoplasten/ml resuspendiert, daraufdie DNA, die aus dem Plasmid pM13-hpt oder aus einer Mischung aus dem Plasmid pM13-hpt und einer Carrier-DNA besteht, zugibt, und nach 5-10 Minuten die Protoplasten/DNA-Suspension mit PEG-CMS Lösung mischt, so daß eine Endkonzentration von 10-307. PEG im Transformationsgemisch entsteht, und nach 20-30 Minuten Inkubationszeit den Transformationsansatz mit dem 10fachen Volumen W5 über mehrere Minuten schnittweise verdünnt und die erhaltenen Protoplasten, wie im Anspruch 1 beschrieben, in ein anionisches Polymerisat einbettet und schließlich genetisch veränderte Arabidopsis-Pflanzen heranzieht.
    [0017] Mit diesem Verfahren lassen sich gewünschte Gene in einfacher Weise und in guten Ausbeuten auf pflanzliches Material, Protoplasten, Mesophyllprotoplasten übertragen, wodurch Pflanzen mit verbesserten Eigenschaften entstehen. Nach der Transformation erweist sich die erhaltene Protoplastenpopulation bei weitem nicht so heterogen wie nach Transformation mit Hilfe von Elektroporation. Man erhält z.B. Überlebensraten von über 75% an behandelten Protoplasten.
    [0018] Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich alle Pflanzen, die durch normale Regeneration aus Protoplasten erhalten werden können, in höheren Ausbeuten zu intakten vermehrungsfähigen Pflanzen regenerieren.
    [0019] Damit lassen sich natürlich auch durch direkten Gentransfer veränderte Protoplasten vorteilhaft, d.h. in höheren Ausbeuten zu genetisch veränderten Pflanzen regenerieren.
    [0020] Am 19.01.1989 wurden bei der Deutschen. Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Braunschweig, die folgenden Plasmide hinterlegt:
    [0021] Plasmid pRT102gus (DSM 5147) Plasmid pM13-hpt (DSM 5148) Bei s piel 1
    [0022] Isolierung von ProtoDlasten und deren Einbettung in Alginate
    [0023] Pflanzen von Arabidopsis thaliana "Columbia", "Wassilewskja", "Landsberg erecta" und "Estland" werden aus oberflachensterilisiertem Samen im Kulturraum bei 21 ±1°C 50 % Luftfeuchte, 3000 Lux und einer Photoperiode von 16/8 Std. angezogen. Als Medium für die Anzucht wird ein halbkonzentriertes MS Medium * 1 mit 10 g Saccharose/I und 8 g Agar (Difco)/l benutzt (=AM)+1 (Murashige und
    [0024] Skoog, 1962).
    [0025] Als Ausgangsmaterial für die Protoplastemsolierung dienen Blatter von 3 bis 4 Wochen alten Pflanzen, Arabidopsis thaliana "Columbia", Wassilewskja" , "Landsberg erecta" und "Estland". Etwa 1 g Blattmasse wird vorsichtig in 0,5 M Mannit geschnitten und die Blattstücke werden anschließend für 1-2 Std. in dieser Losung plasmolysiert. Danach werden die Stucke für 14-18 Std. bei 26 ±1°C im Dunkeln in folgender Enzymlosung inkubiert: 1.0 1 Cellulase "Onozuka R-10 (Serval, 0,25 % Macerozyme R2-10 (Serva), 8mM CaCl 0,4 M Mannit, pH 5.5.
    [0026] Nach der Inkubation wird das Isolationsgemisch durch ein 125 μm und 63 μm Stahlsieb filtriert, im Verhältnis 2:1 mit 0,2 M CaCl versetzt und bei 60 g für 5 min. zentrifugiert. Das Pellet wird in 0,5 M Mannit und 0,2 M CaCl im Verhältnis 1:2 resuspendiert. Nach einer funfminutigen Zentrifugation bei 40 g wird das Pellet in 0,5 M Mannit und 0,2 M CaCl im Verhältnis 2:1 aufgenommen.
    [0027] Es wird erneut bei 40 g für 5 min. zentrifugiert. Danach wird das Pellet in 4°C kaltem 0,5 M Mannit aufgenommen und dabei eine Dichte von 4-6 × 105 Protoplasten/ml eingestellt. Die Mesophyllprotoplasten werden dann wie folgt in Alginat eingebettet. Alle Lösungen sind auf 4°C gekühlt. Die Protoplasten werden im Verhältnis 1:1 mit einer Lösung aus 2.8 % Na-Alginat (Carl Roth KG) in 0,4 M Mannit vorsichtig vermischt, so daß Plattierungsdichten von 2-3 × 105 Protoplasten/ml entstehen. Die Mischung wird in eine Losung A aus 50 mM CaCl in 0,4 M Mannit getropft, so daß Alginat-beads entstehen. Nach 1-2 Std. bei Raumtemperatur wird die Losung A durch eine Losung B aus 10 mM CaCl in 0,4 M Mannit ersetzt. Bei spiel 2
    [0028] Kultur der eingebetteten Protoplasten und Regeneration von Mischkolonien
    [0029] Die eingebetteten Protoplasten werden in der Lösung B 1-2 Tage bei 4°C aufbewahrt. Danach wird die Lösung B durch Kulturmedium ersetzt und die Kulturen bei 26 ±1°C im Dauerdunkel aufbewahrt. Als Medien während dieser Kultur im Dunkeln wird ein modifiziertes B5-Medium (Gamborg et al., 1968) mit 0,4 M Glucose, 2,4 D und BAP eingesetzt. Die Kulturmedien werden nach 10 Tagen erneuert.
    [0030] Nach 3 Wochen im Dunkeln werden die Kulturen ins Dauerlicht (700 Lux) bei 26 ±1°C überführt und mit folgenden Medien inkubiert: modifizierte B5 Medien wie oben bereits genannt oder ein modifiziertes MII-Medium nach Li und Kohlenbach (1982) mit 0,4 M Glucose. Während dieser Kulturperiode werden die Medien alle 2 Wochen erneuert.
    [0031] Beispiel 3
    [0032] Depolvmerisation. Regeneration und Bewurzelung von Sprossen
    [0033] Nach insgesamt 5 bis 7 Kulturwochen werden die nach Beispiel 1 und 2 hergestellten Mikrokolonien durch Depolymerisation der Alginatmatrix mit 20 mM Na-Citrat in 0,3 M Mannit freigesetzt. Die Mikrokolonien werden dann in einem modifizierten MII Medium wie zuvor bei 26 ±1°C 60 % Luftfeuchte, 3000 Lux und einer Photoperiode von 16/8 Std. kultiviert. Das Kulturmedium wird alle 2 Wochen erneuert.
    [0034] Kolonien mit einem Mindestdurchmesser von 1 mm werden auf Regenerationsmedium gesetzt. Als Regenerationsmedien dienen modifizierte MS-Medien (Murashige und Skoog, 1962) mit 2 % Saccharose sowie ein PG3-Medium mit 2 % Saccharose nach Negrutiu et al., (1975). Kalli mit regenerierten Sprossen werden zur Elongation auf ein SEM-Medium, welches ein modifiziertes MS Medium (Murashige und Skoog. 1962) mit 2 % Saccharose, BAP 1 mg/ml, NAA 0,1 mg/l und GA 0,1 mg/l ist, überführt. Elongierte Sprosse werden von Kallus abgetrennt und auf einem halbkonzentrierten MS-Medium (Nurashige und Skoog, 1962) mit 10 g Saccharose/1 und 1 mg IBA/1 bewurzelt. Alle Regenerationsmedien, das SEM Medium und das Bewurzelungsmedium enthalten 8 g Agar (Dιfco)/1. Sproßregeneration und Bewurzelung der Sprosse werden bei einer Photoperiode von 16/8 Std., 3000 Lux, 25°C und 50 % Luftfeuchte durchgeführt.
    [0035] Beispiel 4
    [0036] Aus Blättern von 3-4 Wochen alten Pflanzen können mit der beschriebenen Methode 0,5-1,0 × 107 Protoplasten/g Mesophyll isoliert werden. Die Mesophyllprotoplasten beginnen, 5 Tage nach Zugabe des Kulturmediums sich zu teilen. Die Teilung der Mesophyllprotoplasten ist vom Kulturmedium unabhängig.
    [0037] Kulturmedien 2,4 D BAP
    [0038] B5a 1,0 0.15 mg/l
    [0039] B5b 1,0 0,5
    [0040] In den ersten Kulturwochen im Dunkeln entstehen kompakte, globulare Mikrokolonien mit einem Durchmesser bis zu 100 μm. Aufgrund fehlender Synchronisation findet man daneben auch Kolonien, die nur aus sehr wenigen Zellen bestehen.
    [0041] Im Dauerlicht färben sich die Mikrokolonien hellgrün und nehmen weiter an Größe zu. Die während dieser Kulturphase eingesetzten Medien unterscheiden sich nicht wesentlich in ihrem Einfluß auf die Entwicklung den eingebetteten Mikrokolonien.
    [0042] Kulturmedium 2,4 D Kin BAP
    [0043] B5a 1,0 - 0,15
    [0044] B5b 1,0 - 0,5 mg/l
    [0045] Mlla 0,2 1,0 - Beispiel 5
    [0046] Nach der Befreiung aus den Alginat-beads werden die entstandenen Mikrokolonien ausgezählt und ihre plating-efficiency bestimmt.
    [0047] plating efficiency = Zahl der makroskopisch sichtbaren Kolonien
    [0048] Zahl der ausplattierten Protoplasten
    [0049] Die plating efficiency für A. thaliana "Columbia" beträgt: ca. 0,5-0,7 %.
    [0050] In der anschließenden Flüssigkultur sterben die kleinsten Mikrokolonien ab, während sich die größeren weiterentwickeln.
    [0051] Kulturmedium 2,4 D Kin für Flüssigkultur
    [0052] Mlla 0.2 1,0 mg/l
    [0053] Es entstehen grüne Kolonien, die jedoch in der Flüssigkultur kaum noch an Größe zunehmen, sondern bei einem Durchmesser von 1-2 mm ihr Wachstum einstellen. Durch eine zweiwöchige Erneuerung des jeweiligen Kulturmediums können die Kolonien noch 5-6 Wochen am Leben erhalten werden. Morphogenese ist in den Flüssigmedien jedoch nicht zu beobachten.
    [0054] Beispiel 6
    [0055] Haben die Kolonien einen Mindestdurchmeser von 1 , 0 mm erreicht werden sie auf verschiedene Regenerationsmedien plattiert.
    [0056] Regenerationsmedien BAP 2 ip Kin IAA NAA
    [0057] 2MSa - 7.0 - 0,05 - 2MSb 1.0 - 0,1 mg/l PG3 - - 1,0 0,03 -
    [0058] Auf den Regenerationsmedien färben sich die Kolonien dunkelgrün und nehmen wieder an Größe zu, innerhalb von 2 Wochen entstehen erste Sproßknospen. Nach einer Subkultur der Kalli setzt multiple Sproßbildung mit jeweils mehr als 10 Sprossen auf einem Kallus ein. Die eingesetzten Regenerationsmedien führen zu verschiedenen Regenerationsraten.
    [0059] a) Sproßbildung nach 4 Wochen für "Columbina"
    [0060] 2MSa 2MSb PG3
    [0061] 90 % 84 % 73 %
    [0062] 84 % 81 % -
    [0063] 96 % 88 % 29 %
    [0064] 78 % 80 % 38 %
    [0065] 82 % - 53 %
    [0066] 92 % 96 % 43 5
    [0067] a)
    [0068] Werte aus 6 unabhängigen Versuchen
    [0069] Kalli mit Sprossen werden auf das SEM-Medium gesetzt, wo die Sprosse elongieren und besser weiter wachsen können als auf den Regenerationsmedien. Nach 1-2 Wochen werden die jeweils größten Sprosse vorsichtig vom Kallus abgetrennt und einzeln auf das Bewurzelungsmedium gesetzt. Innerhalb von 8-10 Tagen bilden sich die ersten Adventivwurzeln. Wurzelbildung nach 4 Wochen Genotypen
    [0070] 79 % Columbia 51 % Columbia 57 % Wassilewskja 54 % Wassilewskja 73 % Estland 23 % Landsberg erecta
    [0071] Während regenerierte Sprosse zum Teil bereits auf den Regenerationsmedien Blütenansätze zeigen, beginnen alle Sprosse auf dem SEM-Medium zu blühen. Fruchtansatz und gute Samenbildung ist dagegen in der Regel nur bei bewurzelten Pflanzen zu beobachten.
    [0072] Beispiel 7
    [0073] Transformation von Arabidopsis thaliana durch direkten Gentransfer in Mesophyllprotoplasten
    [0074] A. Zur Transformation eingesetzte DNA
    [0075] Für die Transformationsexperimente werden 20 - 50 μg des Plasmids pM13-hpt, entweder in circulärer Form oder linearisiert durch das Restriktionsenzym Hindlll, alleine oder zusammen mit 50 - 100 μg Carrier DNA (Kalbsthymus DNA) auf 1,6 x 10 Protoplasten eingesetzt. Die Kalbsthymus DNA wird auf eine Größe von ungefähr 10 kb geschert. Das Plasmid pM13-hpt trägt das Gen für die Hygromycinphosphotransferase (HPT) unter der Kontrolle des 35 S Promoters des Cauliflower Mosaic Virus. In einigen Experimenten wird pM13-hpt zusammen mit dem Plasmid pRT102gus (R.Töpfer, persönliche Mitteilung), das das Gen für die B-Glucuronidase (GUS) unter der Kontrolle des 35 S Promoters des Cauliflower Mosaic Virus enthält, zu den Protoplasten gegeben, um die Kotransformationsrate eines selektierbaren (HPT) und eines nicht-selektierbaren (GUS) Gens, die auf zwei verschiedenen Plasmiden vorhanden sind, zu bestimmen. Alle DNAs werden in bidestilliertem Wasser in einer Konzentration von 1 μg/μl gelost. Konstruktionsbeschreibung des Plasmids pM13-hpt
    [0076] Das Plasmid pM13-hpt wurde wie folgt konstruiert:
    [0077] Die kodierende Region des Hygromycin-Phosphotransferasegens (Hpt) [Gritz und Davies (4)] wurde als BamH1-Fragment aus dem Plasmid pLG90 (von Dr. Gritz und Dr. Davies zur Verfügung gestellt) isoliert und in einen Expressionsvektor (pA8; A. v. Schaewen, Doktorarbeit) mit pflanzlichen Regulationselementen kloniert. dieser Vektor ist ein pUC-Derivat, das den 35S-Promotor und -Terminator des Cauliflower Mosaic Virus enthält, die durch einen Polylinker zur Insertion fremder Sequenzen getrennt sind. Das so erhaltende Hpt-Gen unter in Pflanzen funktionalen Regulationssignalen wurde als Eco R1-Fragment in die Eco R1- Schnittstelle des Vektors pM13mp18 [Yanisch-Perron (3)] inseriert.
    [0078] B. Transformation von Protoplasten
    [0079] Mesophyllprotoplasten von Arabidopsis thaliana "Columbia" werden wie in Beispiel 1 dargestellt isoliert. Nach dem letzten Waschen werden die Protoplasten in einem Salzmedium [W5; Menczel et al. (1)] aufgenommen und bei 4 °C ca. 0,5 -8 h vorinkubiert. Zur Transformation werden die Protoplasten dann in einer Dichte von 1,6 × 10 Protoplasten/ml in MaMg-Lösung (Negrutiu et al. 1987) aufgenommen. Transformiert wird in Einheiten von 0,3 ml Protoplasten in MaMg-Lösung bei Raumtemperatur. Zu einer Transformationseinheit wird dann die DNA, die entweder nur aus Plasmid-DNA pM13-l.pt oder aus einer Mischung aus Plasmid-und Carrier-DNA besteht, zugegeben. Nach 5 - 10 Minuten wird die Protoplasten/DNASuspension mit PEG-CMS Lösung [Negrutiu et al. (2)] gemischt, so daß Endkonzentrationen von 10, 20 oder 30 Z PE6 im Transformationsgemisch entstehen. PEG (Polyethylenglykol) 4000 oder 6000 werden benutzt, um PEG-CMS herzustellen. Nach einer Inkubationszeit von 20 - 30 Minuten wird der Transformationsansatz vorsichtig mit 10 Volumen W5 über einen Zeitraum von 15 Minuten schrittweise verdünnt und dann bei 60 g für 5 Minuten zentrifugiert. Die Protoplasten werden in 2 ml 0,4 M Mannit und 0,5 ml W5 resuspendiert und nochmals bei 60 g für 5 Minuten zentrifugiert. Danach werden sie in einer Dichte von 4 - 6 × 105 Protoplasten/ml in 0,5 M Mannit aufgenommen und in Alginat eingebettet wie unter Beispiel 1 beschrieben. Kontrollen werden genauso hergestellt, nur daß keine DNA zu den Protoplasten gegeben wird. C . Kotransformationsexperimente
    [0080] Kotransformationsexperimente werden im wesentlichen durchgeführt wie unter Beispiel 7A beschrieben. Gleiche Mengen von pM13-hpt(20 μg) und pRT102gus (20 μg) werden mit 50 μg Carrier DNA gemischt und zu 1.6 × 106 Protoplasten hinzugegeben. Beide Plasmide werden in ihrer circularen Form eingesetzt. PEG wird bis zu einer Endkonzentration von 20 Z zugegeben. Nach der Transformation werden die Protoplasten ebenfalls in Alginat eingebettet.
    [0081] D. Protoplastenkultur, Selektion von transformierten Zellinien und Regeneration von Pflanzen
    [0082] Die eingebetteten Protoplasten werden im wesentlichen wie unter Beispiel 2 und 3 beschrieben kultiviert. Die folgenden Modifikationen werden angewandt:
    [0083] Routinemäßig wird Kulturmedium B5a (Beispiel 4) während der dreiwöchigen Kulturperiode im Dunkeln eingesetzt. 10 - 11 Tage nach der Protoplastenisolation und -transformation wird mit der Selektion begonnen, indem B5a durch B5a, das 20 μg Hygromycin B/ml enthält, ersetzt wird. Nach 3 Wochen wird B5a durch MIIa (Beispiel 4), das ebenfalls 20 μg Hygromycin B enthält, ersetzt und die Kulturen werden in Dauerlicht überführt. Das Selektionsmedium wird alle 10 Tage erneuert. Hygromycin resistente Zellkolonien, die aus transformierten Protoplasten regeneriert wurden, werden nach 8 Kulturwochen ausgezählt und die Transformationsfrequenzen werden bestimmt. Danach werden die Zellkolonien aus dem Alginat durch Depolymerisation der Matrix mit Zitrat (Beispiel 3) freigesetzt.
    [0084] Regeneration von Pflanzen von selektierten Linien wird unter nicht-selektiven Bedingungen durchgeführt. Resistente Kolonien, die größer als 1 mm im Durchmesser sind, werden direkt auf Sproßregenerationsmedium 2MSb (Beispiel 6) plattiert, während kleinere Kolonien weiterhin in Mlla (Beispiel 4). jetzt jedoch mit 0,3 MGlukose, zum fortgesetztem Wachstum kultiviert werden, so daß sie später auf 2MSb transferiert werden können. Resistente Kolonien, die beginnen, Sprosse zu differenzieren, werden auf 2MSa transferriert und dort für 1 - 2. Wochen kultiviert, bevor sie dann auf Sproßelongationsmedium SEM (Beispiel 3) überführt werden.
    [0085] Abgetrennte elongierte Sprosse werden bewurzelt wie unter Beispiel 3 beschrieben. Literaturangaben:
    [0086] (1) Menczel et al. 1981. Theor. Appl. Genet. 59: 191-195.
    [0087] (2) Negrutiu et al. 1987, Plant. Mol. Biol. 8:363-373.
    [0088] (3) Yanisch-Perron et al. 1987, Gene. 33, 103-119.
    [0089] (4) Gritz and Davies 1983, Gene, 25, 179-188.
    [0090]
    - -

    权利要求:
    Claims
    Patentansprüche
    1 ) Verfahren zur Regeneration von intakten fertilen Arabidopsis-Pflanzen aus Protoplasten, die man aus unterschiedlich differenzierten Geweben, aus verschiedenen Organen oder aus dedifferenziertem Gewebe von Arabidopsis-Pflanzen isoliert, dadurch gekennzeichnet, daß man diese Protoplasten zum Wachstum in der Dunkelheit als Individuen in ein anionisches Polymerisat einbettet und anschließend nach 3 wöchigem Wachstum auf einem Kulturmedium ins Dauerlicht überführt, die in der Polymermatrix nach insgesamt 5-6 Kulturwochen gebildeten Mikrokolonien durch Depolymerisation freisetzt, sie bis zu einem Mindestdurchmesser von 1 mm in einer Photoperiode kultiviert und in einem Regenerationsmedium elongierte Sprosse und in einem Bewurzelungsmedium neue Arabidopsispflanzen heranzieht.
    2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Arabidopsis thaliana regeneriert.
    3) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Mutanten von Arabidopsis thaliana regeneriert.
    4) Verfahren zur Transformation von Arabidopsis thaliana durch direkten Gentransfer in Mesophyllprotoplasten, dadurch gekennzeichnet, daß man Mesophyllprotoplasten aus beliebigem Pflanzengewebe von Arabidopsis thaliana isoliert und in einem der üblicherweise zur Kultivierung pflanzlicher Protoplasten verwendeten Nährmedien kultiviert, diese Protoplasten vor der Transformation 0,5-8 Stunden in dem Vorinkubationsmedium W5 bei 4°C vorinkubiert, nach Abtrennung des Vorinkubationsmediums die Protoplasten in dem Transformationsmedium MaMg-Lösung bei einer Dichte von 1,6 .106 Protoplasten/ml resuspendiert, daraufdie DNA, die aus dem Plasmid pM13-hpt oder aus einer Mischung aus dem Plasmid pM13-hpt und einer Carrier-DNA besteht, zugibt, und nach 5-10 Minuten die Protoplasten/DNA-Suspension mit PEG-CMS Lösung mischt, so daß eine Endkonzentration von 10-30% PEG im Transformationsgemisch entsteht, und nach 20-30 Minuten Inkubationszeit den Transformationsansatz mit dem 10fachen Volumen W5 über mehrere Minuten schrittweise verdünnt und die erhaltenen Protoplasten, wie im Anspruch 1 beschrieben, in ein anionisches Polymerisat einbettet und schließlich genetisch veränderte Arabidopsis-Pflanzen heranzieht. 5) Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als DNA die Plasmide pM13-hpt und pRT 102gus mit einer Carrier DNA mischt und zu den Protopla sten hinzugibt.
    类似技术:
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    DE3802237A1|1989-07-27|
    EP0378587A1|1990-07-25|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1989-07-27| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): JP US |
    1989-07-27| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CH DE FR GB IT LU NL SE |
    1989-12-06| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1989901529 Country of ref document: EP |
    1990-07-25| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1989901529 Country of ref document: EP |
    1992-01-24| WWW| Wipo information: withdrawn in national office|Ref document number: 1989901529 Country of ref document: EP |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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