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    公开号:WO1989004487A1
    申请号:PCT/EP1988/001016
    申请日:1988-11-10
    公开日:1989-05-18
    发明作者:Armin Gilak
    申请人:Armin Gilak；
    IPC主号:B01L3-00
    专利说明:
    Immunologisches Trenn- und Nachweisverfahren fürMehrfachbestimmungenDie Erfindung betrifft ein immunologisches Trenn- undNachweisverfahren zur Bestimmung von wenigstens zweiAntigenen in einer Flüssigkeitunter Verwendung eines an seiner Innenseite mit Antikörpernbeschichteten Röhrchens,einer mit Antikörpern beschichteten Kugel und lediglich einer Markierungsart. Bei der Vielzahl der zu diagnostischen oder therapeutischenZwecken zu bestimmenden Parameter besteht ein erheblichesBedürfnis, solche Bestimmungen schnell und ungefährlich ftirdas Laborpersonal, am besten parallel durchzuführen. Für diese Zwecke erweisen sich immunologischeUntersuchungsmethoden als besonders geeignet. So schlagtdie DE-C2 29 43 648 vor, zum Nachweis verschiedener Liganden in einer Flüssigkeitsprobe verschiedenartige mit Antikörpernbeschichtete Festphasen, die sich leicht voneinander trennen lassen, einzusetzen. Nach der Inkubation dieser Festphasen mit den Probelösungenmuss der radioaktive Uberstandentfernt und anschliessenddieFestphasen voneinander getrennt werden. Aus der DE-C2 32 17 032 ist ein vereinfachtesSeparationsverfahren für immunologische Bestimmungen bekannt. Gemäss diesem Verfahren wird einAntigen/Antikörperkomplex von der uberstehenden Reagenzlbsungdurch eine trockene chromatographische Säule getrennt. Dieses Verfahren eignet sich aber nur zurBestimmung einer unbekannten Substanz. Die DE-C2 33 22 373 schlägtvor, Trägerpartikelmit einem fluoreszierenden Markierungsstoffzu markieren und anschliessend mit Antigenen und/oder Antikbrpernzu beladen.Die Unterscheidung zwischen den einzelnen Partikelnkann dadurch erfolgen, dassentweder unterschiedlicheFluoreszenzmarkierungsstoffe verwendet werden oder aber diePartikel mit unterschiedlichen Konzentration oder mit mehreren Markierungsstoffen verbunden sind. Dieses Verfahren ist hinsichtlich der verschiedenen Markierungsstoffeund der damit verbundenen verschiedenen Einstellungen am Nachweisgerätmit Nachteilen behaftet. AllgemeineVerfahrensweisen zur Durchführung einesRadioimmunoessays oder eines sogenannten immunoradiometrischen Tests (IRMA) sind in der Chemiker zeitung, 103, (1979) Nr. 2, S. 53 - 68 festgehalten. Dem vorgenannten Stand der Technik hasten die Nachteile an, dassentweder nur eine Substanz nachgewiesen werden kann oder die Trennung der zu bestimmenden Substanzen einen vergleichsweise hohen Aufwand erfordern. Demgemäss liegtder Erfindung die Aufgabe zugrunde, einVerfahren bereitzustellen, welches eine einfache und schnelle Trennung immunologisch nachweisbarer Substanzen ermöglicht und im Falle der Verwendung radioaktiverMarkierungsmittel eine kontaminationssichere Verfahrensweise erlaubt. Diese Aufgabewird erfindungsgemäss dadurch gels,dass man ein erstes zu bestimmendes Antigen nach der IRMA-Technik an der Innenwand des Reaktionsgefässes und ein zweites Antigen gemäss einem herkömmlichenFestphasen-RIA an einer Kugel bindet, die überstehende Flüssigkeit,die neben überschüssigenReagenzien noch einen dritten zu bestimmendenImmunkomplex enthält,durch eine trockene Chromatographiesulevon den Festphasenkomplexen abtrennt und dabei den dritten zu bestimmenden Komplex in den oberenTeil der Saulewandern lässt, anschliessend zur Messung die chromatographische Säule entfernt und in eine geeignete Messvorrichtungeinbringt, das Rohrchenverschliesst, auf denKopf stellt und den Immunkomplex im unteren Teil sowie den an der Kugel im Verschlussteilnacheinander mitt. Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform lässt sich das erfindungsgemässe Verfahren auch zur Bestimmung von lediglich zwei Antigenen einsetzen, indem man entweder die beschichtete Kugel weglässt und einen zweiten Immunkomplex in der Chromatographiesäule nachweist oder indem man eine mit Antikörpernbeschichtete Kugel einsetzt und die Chromatographiesaulenur zum Abtrennen bzw. Aufsaugen uberschussigerReagenzien verwendet. Die Markierung der Antikörper bzw. Antigene erfolgt vorzugsweise mit Radioisotopen, lässt sich aber je nach dem zu behandelndenanalytischen Problem bzw. Laborgegebenheiten vorteilhafterweise auch durch Fluoreszenz- undLuminiszenzmarkierung oder durch enzymatische Methoden bewirken. Als bevorzugtes Radioisotop wäre 125Jod zu nennen. Zur Fluoreszenzmarkierung liege sich in geeigneterWeise Fluoresceinisothiocyanat einsetzen. Im Falle einerEnzymmarkierung würde eine durchlässige Chromatographiesäule verwendet werden und die Bestimmung photometrisch erfolgen. Je nach analytischem Problem wird man vorzugsweise polyclonale oder monoclonale Antikörper verwenden. In bevorzugter Weise konnenbeide Antikörperartenauch nebeneinander verwendet werden oder zur Bindung vonAntigenen mikrofeine Kieselsäure oder Proteine verwendet werden.Die biologischen Materialien können vorteilhafterweise mit dem Carbodiimidverfahren an dieFestphase gekoppelt werden. Zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens eignet sich in besonderer Weise die Vorrichtung aus der DE-C2 33 47 464 in Verbindung mit der Chromatographiesauleaus derDE-C2 37 17 032. Gegebenenfalls ist im oberen inner yenTeil des ReaktionsgefäBesein Ring vorgesehen, dessen innererDurchmesser vorzugsweise 1 bis 2 %kleiner ist als derDurchmesser der Kugel. zur Messung wird somit die Kugel entweder durch Adhesion in der Verschlusskappe derVorrichtung oder am Ring des Reaktionsgefässes fixiert. Sie verharrt in dieser Stellung auch noch nach mehrmaligemWenden des Reaktionsgefässes. Vorteilhafterweise lassen sich zur Trennung der beidenFestphasen-Immunkomplexe magnetische Mittel einsetzen. So ist beispielsweise ein Permahentmagnet in der Verschlussklappegeeignet, eine eine metallische Substanz enthaltende Kugel zu fixieren. Die zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens notwendigen Reagenzien und Vorrichtungsteile sind in einerTestkombination zusammengestellt. Diese Testkombination enthältdie oben beschriebene Vorrichtung, wobei beispielsweise der untere Teil des Reaktionsgefässes und dieKugel mit biologischen Materialien, beispielsweiseAntigenen, Antikorpernund anderen Proteinen versehen sind. Weiterhin enthältdiese Testkombination eine Verschlusskappe, eine trockene chromatographische Saul,weitere markierte und nichtmarkierte Antikörper sowie markierte und nichtmarkierteAntigene und 0,9 %-ige Kochsalzlösung. Die mit der Erfindung erreichten Vorteile bestehen darin, dass Reaktionsdurchführung, Trennung und Nachweis in einerVorrichtung durchgeführtwerden knnen,ohne dass sentrifugier-oder Dekantierschritte zwischengescha1-et werden müssen, ohne daB gegebenenfalls die Gefahr einer Kontaminierung des Labors oder Laborpersonals durch Verspritzen von Reagenzlösungbesteht. Es eignet sich insbesondere fur immunologisch nachweisbare Substanzen, die sinnvollerweise nebeneinander bestimmt werden. Nachfolgend wird die Durchführung des erfindungsgemässenVerfahrens naher erläutert. Eine Möglichkeitzur Durchführung des erfindungsgemässenVerfahrens besteht in der Verwendung einer Reaktions- undSeparationsvorrichtung, die im oberen Teil eines Röhrchens 1 nahe der Röhrchenöffnung einen Ring 4 aufweist. DieDifferenz zwischen Ringaussen- und Ringinnenradius beträgt etwa 1/10 des Aussendurchmessers des Rings. Zwischen demBoden des Röhrchens1 und dem Ring 4 befindet sich eineKugel 3, deren Durchmesser geringfügiggrösser als derInnendurchmesser des Rings 4 ist. Je nach durchzuführenderMessung sind der untere Teil der Röhrcheninnenwand2 und/oder die Kugel 3 mit biologischem Material beschichtet. Zwischen der Kugel 3 und einer Verschlusskappe 5 enthält dieVorrichtung eine herausnehmbare Chromatographiesäule 6. Im folgenden reagieren Antikorper1 und 1' mit Antigen A,Antikörper 2 mit Antigen B und Antikörper 3 mit Antigen C. Der untere Teil einer Röhrcheninnenwandist mit gegenAntigen A gerichteten nicht markiertem Antikbrper1 uberzogen.Eine Kugel ist mit gegen Antigen B gerichtetemAntikörper 2 beschichtet. zur Testdurchführungwerden zu denAntigen A-, B- und C-Standardlösungen sowie gegebenenfalls verdünntenPatientenseren, die zuvor in ein mit nichtmarkiertem Antikörper 1 beschichtetes probenröhrchen pipettiert worden sind, ein Gemisch aus Antikörper 3, 125J markiertem Antikörper 1' und ebenso markiertem Antigen B und Antigen C hinzugegeben. zum Volumenausgleich sowie zur Erhöhungder Spezifität der Nachweisreaktion werden gegebenenfalls noch weitere Zusätze verwendet. Die Teströhrchenwerden mit einer Verschlusskappe verschlossen, grtindlichmit einem Vibrations-Mischer geschtitteltund anschliessendetwa 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Da ein Überschuss von Antikbrper1 vorliegt, sind nach derInkubation alle Antigen A-Moleküle sandwichartig zwischen den an der Gefässwand immobilisierten Antikörpern1 und den radioaktiv markierten Antikörpern1' gebunden. Gleichzeitig konkurrieren nicht markiertes Antigen C und markiertesAntigen C ebenso wie nicht markiertes, an der Kugel gebundenes Antigen B, sowie markiertes Antigen B um dieBindungsstellen an ihren jeweiligen Antikörpern. Nach der etwa einstündigenInkubation wird eineChromatographiesäule in das Röhrchenauf die Kugel gestellt und durch Kapillarwirkung die Lösung des Probenrohrchensaufgesaugt. Dabei wird sie von dem an der Rbhrchenwandbefindlichen Antigen A-Sandwich-Komplex und dem an der Kugel vorhandenen Antigen B-Antikörper-Komplex getrennt. Durch Hinzuftigenvon 0,5 ml physiologischer Kochsalzlösung werden die Festphasen-Immunkomplexe gewaschen und tiberdiesan derGefässwand adsorbiertes Material gelöst und ebenfalls in dieSäule aufgesaugt. Durch die Chromatographiewerden Reaktionsprodukte undReaktanten entsprechend ihrem Molekulargewicht getrennt. Antikörper und Immunkomplexe wandern aufgrund ihres höherenMolekulargewichtes in den oberen Teil derChromatographiesäule, wohingegen niedermolekulareReaktionsmittel im unteren Teil der Sauleverbleiben, so auch die markierten Antigene. Der AntigenC-Antikörper-Komplex wird somit im oberen Teil der Saulezu finden sein.Zur Antigen C-Messung wird die gesamte Vorrichtung in dasMessgefäss eines Gamma-Counters gestellt und die Impulsratebestimmt. Die Antigen B-Messung erfolgt ohne Säule, wobei das Rbhrchenumgedreht, also mit der Öffnung nach unten, insMessgefäss hineingestellt wird. Die Kugel mit dem zu messendenAntigen B Antikörper-Komplexbefindet sich nun in derVerschluBkappe. Zur Bestimmung des Antigen A wird das Rbhrchenwiederum umgedreht, also in die normale Position gebracht, wobei die Hohlkugel in leicht benetztem Zustand in der Verschlusskappe bleibt und nicht auf den Boden des Rohrchens zurückfällt.In dieser Stellung wird das Röhrchen in die Messzelle des Gamma-Counters zur Messung des wandständigenAntigen A-Festphasen-Immunkomplexes hineingestellt. Das erfindungsgemässe Verfahren lässt sich aber auch mit einemRing an der oberen Röhrcheninnenseite durchführen,wobei dann die Kugel nicht in der Verschlusskappe, sondern durchAdhäsionskraft an dem Ring haftet und ebenfalls bei senkrecht, in Normalposition stehendem Röhrchen nicht auf den Röhrchenboden zurückfällt. Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert. Beispiel 1Zur Bestimmung unbekannter MengenTSH (Thyreotropes Hormon) und FT3 (freies Trijodthyronin) und FT4 (freiesThyroxin) wird zu jeweils 100 ul Serumproben und FT3-,FT4 - und TSH-Standardlösungen in ein mit Maus-anti-TSH-Antikörpernbeschichtetes Röhrchen, welches eine mit T4-Antikörpern beschichteteHohlkugel enthalt,ein Gemisch von 200 /ul aus 125J markiertem monoklonalenTSH-Antikörpern und 125J markierten T3 und T4 sowie entsprechenden hochspezifischen polyklonalenT3-Antikörpern hinzugegeben. DasReaktionsgemischwird auf einem Vibrations-Mischer gemischt und etwa eine Stunde bei 370C oder über Nacht beiRaumtemperatur inkubiert. Nun wird eine Chromatographiesaule in das Reaktionsgefäss eingebracht und dadurch die flussige Phase aufgesaugt und entsprechend ihres Molekulargewiahtsderart getrennt, dass die hochmolekularen Lösungsbestandteilein den oberen Teil der Saulewandern. Nachdem die Röhrchenwandund damit dieFestphasen-Immunkomplexe sowohl der Hohlkugel als auch derRöhrchenwand mit 0,5 ml physiologischer Kochsalzlösunggewaschen worden sind und diese Lösung ebenfalls durch dieChromatographiesaule aufgesaugt wurde, wird das Röhrchenaufrecht mit Hohlkugel und Säule in die MesszelleeinesGamma-Counters zur FT3-Messung gestellt und die Impulsrate gemessen. Nach Entfernung der Chromatographiesauleund Drehung des nahezu trockenen Röhrchensauf den Kopf wird es mit der öffnung nach unten, wobei die Hohlkugel auf dem Ring aufliegt,in die Messzellezur Bestimmung der FT4-Impulsrate gebracht. Anschliessendwird das Röhrchenwieder in die normale Stellung, mit Röhrchenöffnung nach oben, gedreht, wobei die Kugel durch den Ring im oberen Teil des Röhrchens festgehaltenwird, und zur Bestimmung der TSH-Impulsrate in die Messzelle des Gamma-Counters gestellt. Die Auswertung der Messergebnissevon FT3, FT4 und TSH erfolgte unter Verwendung der vorliegenden Messprotokolle undEichkurve aus 5 Standards. Zur Erstellung derStandardeichkurve wurde die gemessene Prozentbindung gegen die entsprechende Standardkonzentration nach derSpline-Approximation-Standardkurve aufgetragen. Messung zu Beispiel (1)Protokoll: FT3-RIAStandards cpm 1 cpm 2 cpm x (pmol FT3/1)So 34230 34501 34365 0,00 S135541 35303 354222,20S2 38328 38720 38524 @4,40 S343310 43219 43264 8,80 54 50701 50501 50601 17,60 S561420 61880 61650 35,20Kontrolle 1 36989 36798 36893 3,40. Kontrolle 2 46322 46450 46386 12,50Protokoll FT4-RIAStandards cpm 1 cpm 2 cpmx (pmol FT4/1)S0 12363 12280 12321 0,00S1 11500 11620 11560 3,20S2 9435 9530 9482 6,40S3 7004 7100 7052 12,80 s44910 4790 4850 25,60S5 2783 2801 2792 51,20Kontrolle 1 5901 5699 5650 19,4Kontrolle 2 3288 3201 3244 43,1Protokoll: TSH-IRMAStandards cpm 1 cpm 2 cnm :e(mU TSH/ml)So 252 263 257 0,00 S1990 1005 997 1,50 S22271 2199 2235 5,00S3 4171 4161 4166 10,00 54 9831 9888 9859 25,00 55 18270 18360 18315 50,00Kontrolle 1 755 770 762 0,90Kontrollc 2 8148 8190 8169 20,90 Kurvenzum Beispiel(1)EMI10.1 Einheiten x¯Achse: p-Mol / LiterEMI10.2 Einheiten x¯Achse: p-Mol / LiterEMI10.3 Einheiten x Achse: m-Unit / ml Serum Beispiel 2Zur Bestimmung des Total-T3 und Total-T4 und des TSF im Serum werden jeweils 100 ul Serumproben und Standard losungenaus Total-T3, Total-T4 und TSH wie in Beispiel 1 in Reaktionsröhrchenmit den entsprechenden Antikbrpernpipettiert sowie 500 ;1eines flüssigenGemisches von entsprechenden Tracern und T3-Antikörpern mit Zusatz von 0,03 M Thiomersal als Deblockierungsmittel zur vollständigen Freisetzung von T3 und T4 aus ihren Träger- próteinenwie z.B. TBG. AnschlieBend wird, wie im Beispiel 1 beschriebentverfahren.Die erhaltenen Werte sind in den folgenden Messprotokollen und Kurven aufgeführt. Messung zu Beispiel (2)Protokoll: TT3-RIAStandards cpm 1 cpm 2 cpm x (nmol TT3/ml)So 41411 41112 41261 0,00S1 42461 42220 42340 0,76S2 46801 46422 46611 1,53 S351961 51798 51879 3,07S4 61433 61433 61317 6,15S5 74533 74333 74433 12,30Kontrolle I 44255 43998 44126 1,13Kontrolle II 55693 55100 55396 3,89Protokoll: TT4-RIAStandards cpm 1 cDm 2 cpm x (nmol TT4/ml)So 14835 14750 14792 0,00 5113944 13855 13899 25,74S2 11322 11299 11310 64,35S3 8523 8460 8491 102,96S4 5868 5766 5817 157,44 S53372 3402 3387 257,40Kontrolle I6828 6730 6779 138,99Kontrolle II 4066 3999 4032 217,50Protokoll: TSH-IRMAStandards cpm 1 cpm 2 cpm x(mU TSH/ml)So 210 215 212 0,00S1 990 960 975 1,50 S22381 2299 23405,00 S34330 4420 4375 10,00 S410982 10882 10932 25,00 55 16840 16799 16819 50,00 Kontroller 822 789 805 1,10 Kontroll@II 8433 8400 8416 19,40 Kurven zum Beispiel (2)EMI13.1 Einheiten x-¯Achse: n-Mol / ml SerumEMI13.2 Einheiten x¯Achse: n-Mol / ml SerumEMI13.3Linheitenx¯Achse: m-Unit / mlSerum
    权利要求:
    Claims Patentansprüche
    1. Immunologisches Trenn- und Nachweisverfahren zur Bestimmung von wenigstens zwei Antigenen in einer Flüssigkeit unter Verwendung eines an seiner Innenseite mit Antikörpern beschichteten Rδhrchens, dadurch gekennzeichnet, daß man
    -ein erstes zu bestimmendes Antigen mittels der IRMA-Technik an der Rδhrcheninnenwand, ein zweites
    Antigen mittels eines herkömmlichen Festphasen-RIA an einer Kugel bindet,
    die überstehende Flüssigkeit, die neben überschüssigen Reagenzien noch einen dritten zu bestimmenden Immunkomplex enthält, durch eine trockene Chromatographiesäule von den Festphasenkomplexen abtrennt und dabei den dritten zu bestimmenden Immunkomplex in den oberen Teil der Säule wandern läßt.
    zur Messung die chromatographische Säule in eine geeignete Meßvorrichtung einbringt, das Röhrchen verschließt, auf den Kopf stellt und getrennt die Messung im unteren Teil des Röhrchens und im Verschlußteil in einer Meßvorrichtung durchführt.
    2. Immunologisches Trenn- und Nachweisverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Bestimmung von zwei Antigenen mit dem beschichteten Röhrchen und der chromatographischen Säule arbeitet.
    3. Immunologisches Trenn- und Nachweisverfahren nach
    Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man
    Antikörper bzw. Antigene mit einem Radioisotop markiert.
    4. Immunologisches Trenn- und Nachweisverfahren nach
    Anspruch 3 , dadurch gekennzeichnet, daß man als Radioisotop125 Jod einsetzt.
    5. Immunologisches Trenn- und Nachweisverfahren nach
    Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man monoclonale Antikörper einsetzt.
    6. Immunologisches Trenn- und Nachweisverfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man
    Antikörper bzw. Antigene fluoreszenzmarkiert.
    7. Immunologisches Trenn- und Nachweisverfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Antikörper bzw. Antigene luminiszenzmarkiert.
    8. Immunologisches Trenn- und Nachweisverfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Antikörper bzw. Antigene enzymatisch markiert.
    9. Trenn- und Nachweisverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kugel zur Messung an einem im oberen inneren Teil des Röhrchens angeordneten Ring fixiert.
    10. Trenn- und Nachweisverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kugel durch magnetische Mittel von dem am Boden des Rδhrchens vorliegenden Festphasenkomplexes trennt.
    11. Reaktions- und Separationsvorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Röhrchen (1) im oberen Teil nahe der Öffnung einen Ring (4) aufweist, wobei die Differenz zwischen Ringaußen- und Ringinnenradius etwa 1/10 des Außendurchmessers des Rings beträgt und zwischen dem Röhrchenboden und dem Ring (4) eine Hohlkugel (3) vorgesehen ist, deren Durchmesser geringfügig größer als der Innendurchmesser des Rings (4) ist.
    12. Reaktions- und Separationsvorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Kugeldurchmesser 1 bis 2 % größer als der Innendurchmesser des Rings ist.
    13. Reaktions- und Separationsvorrichtung nach Anspruch 11 und 12 , dadurch gekennzeichnet, daß an die Röhrcheninnenwand und/oder die Kugel biologische Materialien gebunden sind.
    14..Testkombination, enthaltend eine Vorrichtung nach
    Anspruch 11 bis 13 zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche aus mit Antikörpern beschichteten Röhrchen und Kugeln, einem Verschlußteil und einer chromatographischen Säule, wobei gegebenenfalls das Röhrchen einen im oberen inneren Teil angeordneten Ring enthält, dessen Innendurchmesser 1 bis 2 % kleiner als der Kugeldurchmesser ist, sowie markierte und nicht markierte Antikörper bzw. Antigene und 0,9 %-ige Kochsalzlösung.
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    EP0386074A1|1990-09-12|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1989-05-18| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): FI JP US |
    1989-05-18| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CH DE FR GB IT LU NL SE |
    1990-05-11| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1988909756 Country of ref document: EP |
    1990-09-12| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1988909756 Country of ref document: EP |
    1992-04-30| WWW| Wipo information: withdrawn in national office|Ref document number: 1988909756 Country of ref document: EP |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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