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    公开号:WO1988006188A1
    申请号:PCT/JP1988/000139
    申请日:1988-02-12
    公开日:1988-08-25
    发明作者:Noriko Ito；Shinzo Imamura；Haruyo Sato
    申请人:Toray Industries, Inc.；
    IPC主号:C12P13-00
    专利说明:
    [0001] 明
    [0002] D —ァラニンの製造法
    [0003] 技 術 分 野
    [0004] 本発明は D—ァラニンを発酵法によって工業的に製造 する方法に関するおのである。
    [0005] 北
    [0006] 冃 技
    [0007] グルコースなどと D L —ァラニンを含有する培地中で 酵母を培養することにより D—ァラニンを製造する方法 は、 「発酵と代謝」 第 Ί 5号 8 9 〜 9 4ページ （ 9 6 7年） に開示されている。 また、 グルコースなどと D L ーァラニンから L —ァラニン酸化能を有する微生物を用 いて D —ァラニンとピルビン酸を同量程度併産する方法 は特公昭 4 2— 2 0 6 8 3号公報に開示されている。
    [0008] 従来の方法はともに安価な D L — ァラニンから、 高 i な D —ァラニンを高純度で得る方法として優れている。
    [0009] しかしながら、 前者には D L —ァラニン濃度を 2 0 2 Z J2以上にすると菡の生育が阻害されるばかりでなく選 択的分解能も低下することが明示されている。 つまり、 原科の D Lーァラニン濃度が 2 0 3 Z i2以下に制限され るため、 D —ァラニンの収量は量論量とれたとしても高 々 Ί 0 3 Z i2 に過ぎず、 工業的に有利な方法とはいえな い。
    [0010] また、 後者において-も D L —ァラニン濃度は高々 5 0 g Z j2であり、 D —ァラニンの収量も高々 1 と 低い。 しかも菌の培養およびし一ァラニンの酸化に要す る時間は合計 7 2時間と長く、 工業的に十分な方法とは いえない。
    [0011] しかも、 後者の方法では、 D —ァラニンを取得するた めには大量のピルビン酸の分雛除去が不可避となり、 ェ 業的に不利である。
    [0012] 発 明 の 開 示
    [0013] 本発明者らは、 上記問題点を解決することができ、 ェ 業的に有利な D —ァラニンの製造法を提供することを目 的として鋭意研究した結果、 特定の酵母を特定炭素源お よび特定窒素源の培地で培養することにより数 + j2 以上の睿積濃度で D —ァラニンが得られることを見出し ナ一 本発明の つの目的は、 微生物を用いた選択資化法に よ.り、 Dしーァラニンから D —ァラニンを高収率で、 す なわち、 ほぼ量論量で取得する方法を提供することにあ る。
    [0014] 本発明のもう 1 つの目的は、 菌の生育を阻害すること なくかつ選択的分解能も低下させることなぐ、 高濃度の D L—ァラニンを培地に供給して高収量の D —ァラニン を取得する方法を提供することにある。
    [0015] 本発明の他の目的は、 培養終了時の培地中に他の有機 副生物およぴ有鏺不純物がほとんど存在しない方法を提 供することにある。
    [0016] 本発明のさらなる目的は、 菌の培養および D L —ァラ ニンの半量資化に要する時間が短縮された効率のよい方 法を提供することにある。 ―
    [0017] 本発明のこれらおよび他の目的は、 以下の詳細説明か ら明らかとなる。
    [0018] これらの目的は実質的に D L—ァラニンを単一炭素源 および単一窒素源として含有する培地中で、 キャンディ ダ属、 サッカロマイコプシス属、 ピキア属、 卜ルロプシ ス属、 クリプ卜コッ カス属、 ハンゼヌラ属または 卜 リコ スポロン属に属しかつ Lーァラニンを資化し D —アラこ
    [0019] 10 ンを実質的に資化しない能力を有する酵母を培養し、 培 養物から D—ァラニンを採取することを特徴とする D— ァラニンの製造法により達成される。
    [0020] 発明を実施するための最良の形態
    [0021] 以下、 本発明の構成を詳述する。
    [0022] 本発明で使用する酵母としては、 キャンディダ属、 サ ッカロマイコプシス属、 ピキア属、 卜ルロプシス属、 ク リブ卜コッカス属、 ハンゼヌラ属または 卜 リコスポ口ン 属に属する酵母が挙げられる。 これらの酵母のうち実質 的に D L —ァラニンを単一炭素源および単一窒素源とし て含有する培地中で生育可能であって、 かつ L 一ァラニ ン資化能を有し、 D —ァラニンを実質的に資化しない酵 母が本発明では甩いられる。
    [0023] ここで、 D —ァラニンを実質的に資化しない酵母とは、 本発明の効果を実質的に阻害しない範囲において D —ァ ラニンを少曇のみ資化する酵 S、 あるいはし一ァラニン の資化後、 L—ァラニンの不存在条件下では D—ァラニ ンを資化する酵母も含まれる。 - - - たとえば、 キャンディダ♦ フミコーラ（ anciida
    [0024] umicola) AT C C 3 699 2、 キャンディダ · ルゴ一 ザ（Candida rugosa) A T C C 1 057 1 、 サヅカロマイ コプシス ♦ リポリティ力（Sacciaromycopsis I i ρο I yt i ca)
    [0025] A T〇 C 20306、 サッカロマイコプシス ♦ リポリテ ィ力（Saccharomycopsi s 11 polyt ica) I 厂 0 07 1 1 , クリプ卜コッカス ♦ ラウレンティ （じ ryputococcus
    [0026] !au rent i ί ) A T C C 3 683 2、 卜ルロプシス ♦ キャン ディダ（Toru lopsis Candida) A T C C 20284. 卜ル ロプシス ♦ グラプラタ（Toru I opsi s g i abrata j I F 0
    [0027] 0ひ 05、 ピキア ♦ プルトニ一（Pichia burton i i ) A T
    [0028] C C 202 79、 ピキア ♦ ノ。ス 卜リス（Pi eh i a pastoris) I F 0 0948、 ハンゼヌラ · ボリモルファ
    [0029] (Hansenu la polymorphs) A丁 G G 2 60 Ί 2、 ハンゼ ヌラ カプスラータ (Hansenu I a capsu I ata ) A T C C
    [0030] 67 53、 卜リコスポロン ♦ ベィゲリ一（Trichosporon beige! i i ) A丁 C C 3 6993などが挙げられる。
    [0031] 本発明では、 実質的に D L—ァラニンを阜一炭素源お ょぴ単一-窒素源として含有する培地中で培養を行う α す なわち、 本発明では、 培地中の炭素源および窒素源とし て、 実質的に D L—ァラニンを用いるが、 本発明の効杲 を阻害しない範囲内で少 たとえば、 Ί 0 gノ
    [0032] の範囲内で、 他の炭素源および /または窒素源を含有し ていてちょい · ' ： 培養液中に炭素源としてグルコースを Ί 0 / ]2以上 共存させると L—ァラニンの資化速度が遅くなるので、 グルコースはできるだけ含有させないようにすることが 好ま しい。
    [0033] また、 培養液中には、 使用する微生物に応じて、 金属 イオンの塩類を添加してもよい。 金属イオンとしては、 たとえば Ν & τ、 κ ÷ C a 2 M g 2 F e L i 2 +、 Z n 2 C o M n2 +などが挙げられ、 これらの 金属イオンの硫酸、 塩酸、 リ ン酸など各種の無機酸の塩 を用いることができる。
    [0034] 培地中の D L—ァラニン濃度は. Ί ώ中に Ί〜 250 、 好ましくは 60〜 200 ^である。 D L—ァラニン濃度 が低いと生産効率が悪く、 逆に濃度が高いと培養時問が 長くなる。 また、 微生物によっては微生物の生育が阻害 される場合もある。
    [0035] D L—ァラニンは始めから培養液に全量仕込んでもよ いが、 濃度が高くなると微生物の生育が遅くなり培養時 間が長くなることもあるので、 初濃度を 20〜 50 /' な にし、 残りの D L—アラこンを分割添加する流加培養 法が好ましい。
    [0036] 培養は酸性で実施するのが好ま しい。 培養液は通常培 養開始時に Ρ.Η 5に調整するが、 培養が進むにつれて Ηが上昇する。 そのままで培養すると D—ァラニンの回 収率が低下するので ρ Ηを酸性側にコン 卜口一ルする必 要がある。 Ρ Ηがアルカリ側になると D —ァラニンの回 収率が低下する原因として、 ァラニン ♦ ラセマーゼが活 性化されること、 または D —ァラニンアミノ 卜ランスフ エラ一ゼが活性化されることなどにより、 D—ァラニン が資化されるものと考えられる。
    [0037] これらの理由から、 培養時の Ρ Ηは通常 4〜 6 . 5、 好ましくは 4 . 5〜 6 . 0に調整する。 調整用の酸とし ては、 たとえば、 リン酸、 硫酸、 塩酸などの無璣酸水溶 液が好ましい。
    [0038] 前記 「発酵と代謝」 には、 培養時の Ρ Ηが高い側で選 択分解が行われ、 低 、側ではむしろ選択性が劣るもので あることが、 要約に、 結論として記載されている σ たと えば前記 「発酵と代謝」 図 4には 卜ルロプシス ♦ ファメ ータによる選択分解が Ρト！ 8 . 5で完結した例が示され ている。
    [0039] 本発明のごとく培養時の Ρ Ηが 6 . 5以下の場合には 通常の細菌が生育しにくいため、 培養中に錐菌に汚染さ れにくいという利点も生じる。
    [0040] 培養温度は通常 2 0〜 4 0 °C 好ましくは 2 5 3 0 Όである。
    [0041] 培養は通気しながら攛拌 る 通気きは通常 0 . 5〜 2 . 0 WH 、 好ましくは 0 . 6 1 . 2 VVM である。 通 気量が少なすぎるとしーァラニン資化速度が遅くなる傾 向となり、 また、 多くても効果に変わりなく、 むしろ 養液の蒸発を促進するために培養液濃度が高くなつたり 発泡が激しくなり好ましくない。
    [0042] —ァラニンがすべて資化された時点で通常、 培養を 終了する。 L —ァラニンの全量資化は溶存酸素 （ D O ) をモニターすることにより、 また、 ァラニンの D、 Lを 分析することにより知ることができる。 また、 Lーァラ ニンの資化によって生じるアンモニアを中和するために、 培養中に酸を添加するが、 Lーァラニンの資化終了とと もに酸の添加は不要となるので、 その酸の添加量をモニ ターすることにより知ることちできる。
    [0043] Lーァラニンがすべて資化されたのち、 さらに培養を 続けると D —ァラニンも徐々に資化される場合もあるの で、 培養の終点を明確に知ることが好ま しい。
    [0044] かく して得られた培養液を遠心分離により菌体を除去 したのち、 通常の方法によって D —ァラニンを単離すれ ばよい。
    [0045] たとえば、 イオン交換樹脂 S K— Ί B (三菱化成製） に通液してァラニンを樹脂に吸着させたのちよく洗淨す る。 次いでアンモニア水溶液で溶出させたのち、 溶出液 を濃縮すればよい。 ここで得られた粗 D —ァラニンを水 で再結晶すれば 製された D -ァラニンが得られる。
    [0046] 本発明は次の効果を発揮する。
    [0047] ( 1 ) D L —ァラニンから D —ァラニンを高収率で、 すな わち、 ほぼ量論量で取得することができる。
    [0048] ( 2 ) さらに、 菌の生育を阻害することなくかつ選択的分 解能をも低下させることなく高濃度の D L —ァラニン を培地に供給して高収量の D—ァラニンを取椁するこ とができる _。
    [0049] 加えて、 湾費された L -ァラニンは、 ほとんど炭酸 ガスと水にまで変換されて、 培養終了時の培地中に他 の有機副生物およぴ有璣不純 ¾がほとんど存在しない ため、 D—ァラニンの単離および精製が容易となる。
    [0050] (4) さらに、 菌の培養および D L—ァラニンの半量資化 に要する時間が短縮され効率よく D—ァラニンを取得 できる。
    [0051] (5) 培養を P H 6. 5以下の酸性条件で実施するため、 培養中に雜菌に汚染されにくい。
    [0052] 以下、 実施例によって本発明を具体的に説明する 実施例においてァラニンの D L分析は、 濃縮乾燥した Dーァラニン含..有粉末をメタノール一塩酸 よりメチル- エステル化したのち 3 , 5—ジニ卜口フエ二ルイソシァ ネー卜と反応させたのちこれを次の条件により H P L C で分析する方法によって行つた。
    [0053] カラム ： OA— Ί 000 (住友化学）
    [0054] π—へキサン ： ジクロルメタン ： エタノール
    [0055] ( 20 ： 8 ： 1 )
    [0056] ί I
    [0057] 検 出 じ V 254 nm
    [0058] 実施例 1
    [0059] 乾燥プイヨン 30 Zi2 ( P H 6, 0〉 を含む培地 5 0 /H5を Ί il三角フラスコに分注し、 20 °C 20分問 滅菌し、 種培養培地とし こ。'これにキャンディダ ♦ フミ コーラ AT〇〇 36992を一白金耳植菌し、 30°Cで 一日振とう培養した。 一方、 D L—ァラニン Ί 00 ^ 、 リ ン酸一カリウム 2 Z J2、 硫酸マグネシウム◦ . 5 ^Ζ 、 粉末酵母エキス〇 . 52 / J2を含む培地 （ P H 5. 0 ) 1 i2を 3 ώのミニジャーフアーメンターに仕 込み滅菌して主培養培地とした。 これに先の種培養液を 接種し、 30°C、 1 . 0 WH 通気攪拌培養をした。 なお 培養中は 2 N硫酸により P H 5. 0 ± 0. Ί に調整を行 つた。 約 70時間で培地中の L—ァラニンは全量資化さ れ、 D—ァラニン 48 g、 硫酸アンモニゥム 353を含 む培養液約 Ί . 2 ]2を得た。
    [0060] この培養液を— 1 〇， 000 rpm 1 0分間遠心分離して 菌体を除いたのち、 イオン交換樹脂 S K- - つ B ( H型〉 を充塡したカラムにとおし、 D—ァラニンを吸着させた , このカラムを十分水洗したのち 4 %アンモニア水で D— ァラニンを溶出した。 この溶出液を減圧濃縮し乾固して
    [0061] D—ァラニン 452を得た。 H P L Cにより分析したと ころ、 光学純度は 99. 6%ee以上であった。 化学純度 は 99. 4 %であった。
    [0062] 実施例 2
    [0063] 実施例 Ί に示した操作のうち、 主培養培地中の D L— ァラニン濃度を 802 Z J2 とし、 他は同じ条件で培養を 行った。 約 35時間で培養は終了し、 D—ァラニン 38 g、 硫酸アンモニゥ厶 を含む培養液約つ . 2 ώを 得た。
    [0064] この培養液を遠心分雛して菌体を除いたのち、 水酸化 カルシウム Ί 8. 3 ^を加えて攪拌し、 約 2時間塩交換 を行った。 この懸濁液を Ί Z3量まで減圧濃縮したのち 瀘過して無機塩を除いた。 瀘液は、 イオン交換樹脂 S K - 1 B (アンミニゥム型） を充塡したカラムにとおし、 微量の金属イオンを吸着させた。 溶出液とカラムの洗淨 液を合せ、 濃縮晶析させ、 D—ァラニン 323を得た。 光学純度 99. 9%ee、 化学純度 99 , 9%であった。 実施例 3
    [0065] D L—ァラニン 2 0 ^ ZJ 、 リン酸一カリウム 2 3 J2、 硫酸マグネシウム〇 . 5 gZi 、 粉末酵母エキス 0 5 S ZJ2を含む培地 （ Ρ H 5. 0〉 を 1 J2三角フ ラスコに分注し、 滅菌して種培養培地とした。 これにキ ヤンディダ * フミコーラ ATCC36992を一白金耳 植菌し、 3〇°Cで約 24時間振とう培養した。 一方、 上 記培地組成のうち、 D L—ァラニンを 4 0 とした 培地 Ί J2を 3 J2のミニジャーファーメンターに仕込み減 菌し主培養培地とした。 これに先の種倍溶液を接種し、 30°C、 Ί . で通気攪拌培養をした。 培養中は、
    [0066] 2 硫酸により P H 5. 0 ± 0. に調整を行つた。 約 20時間後、 培地中の L—ァラニンの約 80 %が資化さ れたところで、 この培養液を同じ構成成分の斩しい主培 養培地 Ί ώに 5%シードで接種し、 先ほどと同条件で通 気攪拌培養を行った。 再び約 20時間培養したところで 次にこの垲養液を D L—ァラニン 802 /J2を含有し他 成分は前回までと同様である主培養培地 Ί J2に 5 %シ一 ドで接種した。 同条件で通気 IS拌培養を約 6〇時間行う と、 培地中の Lーァラニンが全量資化された。 培養終了 後実施例 2に示した操作により得られた D—ァラニンの 収量、 光学純度、 化学純度は実施例 2とほぼ同様であつ た。
    [0067] 実施例 4
    [0068] 実施例つ に示した操作のうち、 主培養培地を D L—ァ ラニン 553、 リ ン酸一カ リ ウム 22、 硫酸マグネシゥ ム 0. 52、 粉末酵母エキス Ί 3を含む培地 700/ ^と し、 実施例 1 と同条件で培養を行った。 約 20時間後、 D L—ァラニン 4 53を含む水溶液 300/ ^を 5 i / hrの流速で添加を始めた。 約 20時^ Sで添加を終えたの ちも、 さらに培養を続けた。 培養を始めてから約 6〇時 間で培養は終結した。
    [0069] 培養液から実施例 Ί に示した操作で得られた D—ァラ ニンは収量、 光学純度、 化学純度ともに実施例 1 と同様 であった。
    [0070] 実施例 5 Ί 4
    [0071] 乾燥ブイ ヨン 303 / Q,からなる種培地 （ P H 5. 〇 ） 5 を Ί 8 X 1 80腿の試験管に分注し、 滅菌した。 こ れに表 1 に示した酵母を一白金耳植菌し、 3〇°Cで 1 2曰振とう培養した。 一方、 D L—ァラニン 1 0 ^ / d リン酸— 力リ ゥム 2 ^ Z J2、 硫酸マグネシウム〇 . 5 g 、 粉末酵母エキス 0. 5 Ζώよりなる主培養培地 ( H 5. 0〉 を Ί 8 Χ Ί 80腿試験管に分注して 滅菌した。 これに先の種培養液を 5 %シードで接種し、 30°Cで振とう培養した。 24時間後、 遠心分離して菌 体を除いたのち減圧濃縮して乾固ののち乾燥した。 得ら れた固形分について H P L Cにより残存したァラニンの L体、 D体の残存率を求めた。
    [0072] 結果を表 1に示す。
    [0073] 「
    [0074] 比較例
    [0075] 実施例 2に示した操作のうち、 主培養培地にダルコ一 ス 1 0 ^ Z £を加え他は同じ条件で培養を行つた。 培養 は約 5 4時間で終了し、 D—ァラニン 3 2 、 硫酸アン モニゥム 2 9 を含む培養液約 Ί . 2 J2を得た。 この培 養液の 5 ϋ /^を実施例 5〜 Ί 4 と同様の処理をして得ら れた固形分を H P L Cにより分析した結果、 D—ァラニ ンの光学純度は 9 9 . 6 以上であつた。
    [0076] 産業上の利用可能性
    [0077] D—ァラニンは医薬品原料または甘味料 ァリテーム の原料として有用である。
    权利要求:
    Claims請 求 の 範 囲
    (1) 実質的に D L—ァラニンを単一炭素源および単一窒 素源として含有する培地中で、 キャンディダ（Candida) 属、 サッカロマイコプシス（Saccdaromycops i s)属、 ピ キア（Pichia)属、 卜ルロプシル（Toruiopsis)属、 クリ プトコッカス（C「yptococcus)属、 ノ、ンゼヌラ（Hansenu ra) 属または 卜リコスポ口ン（Torycosporon)属に属し かつ、 Lーァラニンを資化し D—ァラニンを実質的に 資化しない能力を有する酵母を培養し、 培養物から D —ァラニンを採取することを特徴とする D—ァラニン の製造法。
    (2) キャンディダ属に属する微生物がキャンディダ属フ ミコーラ種またはキヤンディダ属ルゴ一ザ種に属する 微生物である請求項（1) 記載の方法。
    (3) 培養を P H 4〜 6. 5で行う請求項（1) 記載の方法。
    类似技术:
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
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    JPH088878B2|1996-01-31|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1988-08-25| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): US |
    1988-08-25| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CH DE FR GB IT LU NL SE |
    1988-10-06| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1988901636 Country of ref document: EP |
    1989-02-01| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1988901636 Country of ref document: EP |
    1994-08-17| WWG| Wipo information: grant in national office|Ref document number: 1988901636 Country of ref document: EP |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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    DE19883851108| DE3851108D1|1987-02-13|1988-02-12|Verfahren zur herstellung von d-alanin.|
    EP19880901636| EP0301107B1|1987-02-13|1988-02-12|Process for preparing d-alanine|
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