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    公开号:WO1988000965A1
    申请号:PCT/JP1987/000573
    申请日:1987-07-31
    公开日:1988-02-11
    发明作者:Tadashi Ishibashi；Hideo Kawaguchi；Saeko Yoshino；Yoji Odawara
    申请人:Hitachi, Ltd.；
    IPC主号:C12M27-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書
    [0002] 発明の名称
    [0003] 動物細胞の培養方法及び培養装置
    [0004] 〔産業上の利用分野〕
    [0005] 本発明は細胞の増殖に必要な酸素の供耠及び装置に係 り 、 特に機械撹拌式培養槽にて培養する の に好適な動物 細胞の培養方法及び培養装置に関する。
    [0006] 〔従来の技術〕
    [0007] 機械撹拌式培養槽で動物細胞を増殖させる と き培養槽 内上部の気相部に存在する酸素が液面を介して液相部に 溶解する こ とで必要な酸素は供袷されている。 こ の と き の酸素の.移動速度 （気相から液相への溶解速度） は培養 液容量当 り の気液界面積及び気液界面の更新に係わる撹 拌機 （羽根） の回転数の影響を強く受ける。 と こ ろが、 回転数の増加はせん断力の増大に継がり 、 細胞が損傷を 受け死に至る為、 限界がある。 また動物細胞培養用の培 養液に血清を使用する為、 通気撹拌を行う と発泡が激し く 槽内容積に対する液量比は小さ くせねばな らない。 更 には、 培養液が泡となって溢流して培養の継続が不能に なって しま う 。 その為、 微生物培養のよ う に大量通気， 強撹拌によって酸素の移動速度 （気相から液相への溶解 速度） を上げる こ と ができないこ と から、 改良が試みら れてきた。 改良の試みと して、 ①酸素含有ガスを培養液に通気し て、 気液界面積を増加させよう とするもの、 ②液面を撹 拌し （乱し） 、 気液界面の更新を促すものとがある。 ① こつレヽて tま文敏 1 ： [Ann. Mew York Acad.Sci. Vo fl
    [0008] 1 3 P p . 3 6 1 〜 3 6 4 ( 1 9 8 3 ) 、 ②について は文献 2 ： Biotechnology and B io engineering, Vo β XXVI， P p . 1 2 2 〜 1 2 5 ( 1 9 8 5 ) において述べ られている。 しかし、 未だ満足すべき装置及び方法は開 発されていない。
    [0009] 従来技術には上記したよ う な欠点があ り、 各所でその 改良が試みられているのが現状であるが、 問題点を以下 に詳述する。
    [0010] 通気撹拌方式
    [0011] 培養液に窒素含有ガスを吹き込み （通気） 、 更に撹拌 羽根にて液を撹拌する と共に吹き込みガスを液内に分散 させる こ と を 目的と している。 この方法は、 ガスが液中 で小気泡を形成し、 滞留する為気液界面面積が増加し、 酸素移動速度が速く なる効果を有する。 しかし、 動物細 胞培養に使用する培養液には血清など蛋白質成分が多く、 極めて発泡し易い性質をもっている。 また発泡は細胞膜 の分解を引き起す （文献 1 ) といわれており 、 細胞増殖 を妨げる原因となる。 これらの対策と して、 消泡剤 （界 面活性剤） の添加が考えられるが、 微生物細胞と異な り、 動物細胞は界面活性剤に対する抵抗性が弱く 、 増殖阻害 を起す為、 使用できない。 毒性が弱 く 、 かつ有効なも の は見出さ れていない。
    [0012] これに対 して発泡によ る損傷から細胞を保護するため にアルギン酸ソ一ダな どの半透性のカプセルに細胞を包 括 し、 該カプセルを倍地内に浮遊させ、 案内に酸素含有 ガスを吹き込んで発泡状態で培養する発明がある。 し か し、 こ の方式ではカプセルを無菌的に調製でき る装置が 必要であ り 、 培養システムが複雑と な る。 また、 発泡に 伴い排気系に培地が入 り込むため、 除菌フ ィルタ 一の 目 詰 り 防止や配管の清掃施策が要求される。
    [0013] ②液面撹拌方式
    [0014] こ の方法は撹拌軸に液面を乱す為の羽根を設け液面を 撹乱 し、 気液接触面積を増加させよ う とする ものであ る (文献 2 ) 。 surface aerator と呼ばれる羽根は低速回 転ではそれな り の効果を有する が、 高酸素移動速度を得 る為に高速回転させる と泡立て機と 同様の作用 と なる。 そ こで気相部に酸素ガス を注入する こ とで酸素移動速度 を向上させる試みがなされている。
    [0015] 〔発明が解決し ょ う とする問題点〕
    [0016] 以上のよ う に、 従来技術では操作条件と培養液の発泡 性と の係 り についての配慮が不十分であ り 、 高密度培養 実現に対する大きな制限因子の 1 つ になってい る。 本発明の 目的は、 培養液を発泡させる こ とな く 、 効率 よ く酸素を液中に供給できる動物細胞の培養方法及び培 養装置を提供する こ とにある。
    [0017] 〔問題点を解決するための手段〕 一"^, -- 上記目的ば、 機械撹拌式の培養槽において液面上 の 気相空間に単一も し く は複数個の気体吹き込みノズル ¾ 液面に向けて設け、 該ノ ズルから酸素 有ガスを達:镜的 '： に吐出して液面に逆円錐状の凹みを形成することで達成 でき る。
    [0018] 第 1 の発明の特徵は、 .動物細胞を機械撹拌式の培養槽 にて培養する に当 り、 培養液の撹拌を液面の乱れやボル テックス形成を抑えながら行ない、 かつ吹き込みノ ズル から酸素含有ガスを液面に向けて連続的に吐出し、 液面 に凹みを形成させる動物細胞の培養方法にある。 この場 合、 上記ノズル先端から静止液面までの距離を h cmと し、 ガスの吹き込み量 Q (cm /sec ) と ノズル先端でのガス 線速度 V (cm /sec ) との積 f G を と リ 、 この直を
    [0019] 6 . 2 5 X 1 0 5 X h 2以下となるよ う に操作する こ とが 望ま しい。 したがって、 ノズル穴径 1 ranの場合を考える と、 上記ノ ズルから吐出する酸素含有がスの液面に対し 垂直方向の液面での線速度を 5 m / s 以上 6 5 m Z s 以 下とすることが望ま しい。
    [0020] 第 2 の発明の特漦は、 動物細胞を機械撹拌式の培養槽 にて培養する装置において、 液面上部の気相空間に酸素 含有ガスを連続的に吐出するための単一も し く は複数個 の気体吹込みノ ズルを液面に向けて設置したこ と を特徵 とする動物細胞の培養装置にある。
    [0021] この場合、 培養液を撹拌するための撹拌羽根が中央部 を抜いた短形板を 1 ノ 2 回転ひねった構造である こ と が 望ま しい。
    [0022] 第 3 の発明の特徵は、 動物細胞を分散した培養液を撹 拌機で撹拌しながら培養槽にて培養するにあた り 、 培養 液の液面を実質上平滑に保ちつつ培養液の撹拌を行い、 かつ多数の吹き込み穴を有する吹き込みノ ズルか ら酸素 含有ガスを液面に向けて連続的に吐出 し、 液面に多数の 凹みを形成させ酸素ガスを培養液に溶解する動物細胞の 培養方法にある。
    [0023] 第 4 の発明の特徵は、 動物細胞を分散した培養槽の培 養液を機械撹拌しながら培養する方法において、 培養液 の発泡及び該動物細胞の破壊を防止しながら培養液の撹 拌をする こ と、 及び吹き込みノ ズルから酸素含有ガスを 液面に向けて吐出 し、 液面に凹みを形成させながら酸素 ガスを培養液に理解させる こ と、 を有する動物細胞の培 突方法にある。
    [0024] 第 5 の発明の特徵は、 動物細胞を機械撹拌式の培養槽 にて培養するにあた り 、 培養液の撹拌を液面の乱れゃボ ルテックス形成を抑えながら行い、 かつ吹き込みノズル から酸素含有ガスを液面に向けて連続的に吐出し、 液面 に凹みを形成し凹みの底部から液面に向かう培養液の流 れを形成しつつ酸素ガスを培養液に溶解させる動物細胞 の培養方法にある。
    [0025] 第 6 の発明の特徴は、 動物細胞を分散する培養液を収 容する培養槽と、 該培養液を撹拌する撹拌機と及び該培 養液の液面に酸素ガスを供給する手段と を有する培養装 置において、 液面上部の気相空間に、 酸素含有ガスを液 面に向けて違続的に吐出するための気体吹き込みノズル を設置した動物細胞の培養装置にある。
    [0026] 第 7 の発明の特徵は、 動物細胞を分散する培養液を収 容する培養槽と、 該培養液を撹拌する撹拌機と及び該培 養液の液面に酸素ガスを供耠する手段と を有する培養装 置において、 液面上部の気相空間に、 酸素含有ガスを液 面に向けてほぼ垂直に吐出するための気体吹き込みノズ ルを設置した動物細胞の培養装置にある。
    [0027] 第 8 の発明の特徵は、 動物細胞を分散する培養液を収 容する培養槽と、 該培養液を撹拌する撹拌機と及び該培 養液の液面に酸素ガスを供給する手段と を有する培養装 置において、 酸素含有ガスを液面に向けてほぼ垂直に吐 出するための気体吹き込みノ ズルと、 該ノ ズルからの吐 出圧力を制御し該液面に凹みを形成する制御手段を有す る動物細胞の培養装置にあ る。
    [0028] 第 9 の発明の特瀲は、 培養槽の培養液に分散された動 物細胞を機械撹拌 し ながら培養する方.法において、 培養 液の発泡及び該動物細胞の破壊を防止 し なが ら培養液の 撹拌をする こ と 、 及び吹き込み ノ ズルから酸素含有ガス を液面に向けて垂直方向に 5 m /秒〜 6 5 m Z秒 （但 し ノ ズルの吹径を 1 腿と して計算 し た場合の液面での線速 度） の速度で吐出 し、 液面に凹みを形成させなが ら酸素 ガス を培養液に溶解させる こ と 、 を有する動物細胞の培 ¾方法にある 3 ♦
    [0029] 以下、 本発明を図 を用いて さ ら に詳細に説明する。 第 1 図において、 培養槽 1 は、 撹拌羽根 3 によ って培 養液を撹拌する機械撹拌式槽であ る。 撹拌羽根 3 は、 撹 拌モ一タ ー 4 の駆動軸に取 り付け られ、 該撹拌モー タ ー 4 に よ り 回転する 。 なお、 撹拌羽根 3 の回転は、 マ グネ ッ ト方式でも良 く 、 特に限定するものではない。 槽内に は液面に酸素含有ガスを吐出する ガス吹き込み管 2 ， P Hセンサー 6 ， 溶存酸素セ ンサー 7 及び温度セ ンサ一 8 が設置さ れてい る。 また、 恒温水槽 5 は、 培養槽 1 を 加温するも のであ る。 紿気ロ 1 1 及び排気口 1 2 に取 り 付けた除菌フィルタ ー 1 3 は 0 . 2〜 0 . 4 δ i mの孔径 であ り 、 酸素含有ガス中の雑菌を除 く と 同時に排気口 1 2 からの雑菌進入を防 ぐものである。 なお、 排気に伴 う培養液の水の蒸散を抑えるため、 培養温度の飽和蒸気 圧に近い値で蒸気圧を調整した酸素含有ガスを培養槽 1 に供給する。 このため、 フィルタ一材質は結露になる 目 づま り の少ないテフロ ンなどの疎水性のものを使甩する。
    [0030] 第 2 図は、 ガス吹き込み管 2 の一例である 3 ガス吹き 込み管 2 は、 緩衝管 2 a ， 吹き込みノ ズル 2 b及び送気 管 2 c によ り構成される。 酸素含有ガスは、 送気管 2 c を通して緩衝管 2 a に入り 、 緩衝管 2 a の下部に取リ付 けられた各々の吹き込みノ ズル 2 b から均圧にて連続的 に吐出される。 吹き込みノ ズル 2 b のガス吐出面は， 液 面に向けられるが、 好適には静止液面に平行とする と良 い。 また、 吹き込みノ ズル 2 b の六怪及びガス吐出間の 液面までの距離は、 吐出したる酸素含有ガスによ り液面 に逆円錐状の凹みを形成できる条件にあれば良い。 ノ ズ ル六径 1 腿の場合には吐出 したる酸素含有ガスの液面で の垂直方向に対する線速度を 5 m / s 以上となるよう に すれば、 液面に逆円錐状の凹みを形成できる。 吹き込み ノ ズル 2 b の数は、 特に限定するものでなく 、 最大の酸 素移動速度の得られる数に設定する と良い。 複数個の吹 き込みノズル 2 b を設置する場合、 液面の凹みが重なら ないよう に平面的に位置を決める と良い。
    [0031] と こ ろで、 液表面の乱れが多い場合、 吹き込みノ ズル 2 b から吐出 した酸素含有ガスによ り、 液内にガスを卷 き込んで発泡を引 き起こす。
    [0032] また、 液表面に深いボルテッ ク スが形成される場合、 吹き込み ノ ズル 2 b の液面までの距離が遠 く な リ 液面に 凹みが形成されない。 したがって、 好適な液面は、 乱れ の少ない平ら なものが良い。
    [0033] 液面の乱れやボルテッ ク スの形成は、 主に撹拌羽根 3 の形状に左右されるので、 適切なも の を選定する必要が あ る。 第 1 図に示 した中央部の抜けた矩形の撹拌羽根 3 は、 液面の乱れやボルテッ ク スの形成を抑える こ と ので き る一例である 。
    [0034] 以下、 装置に係わる動物細胞の培養操作について第 1 図 を用いて述べる。
    [0035] 動物細胞は、 固体表面に付着生育する もの と 、 浮遊状 態で増殖でき るも のに大別でき る 。 前者の場合、 マイ ク 口 キャ リ ア一法、 即ち、 デキス ト ラ ンな どのマイ ク ロ ビ —ズに細胞を付着させて、 該ビーズを浮遊させる こ とで、 浮遊状態で培養でき る 。 し たがって、 淳遊培養に係わる 本発明は、 上記両種の動物細胞に対 して使用でき る。
    [0036] 培地は、 培地供給口 9 から培養槽 1 に無菌的に付込ま れる 。 培地は、 ガス吹き込み管 2 を設置するのに必要な 最少限の空間 （液面から ノ ズル吐出面までの距離も含め る）. を残 して仕込むこ と ができ る が、 好適な仕込み率は 4 〇 〜 7 0 %であ る 。 培養は、 培地供給口 9 から種細胞 が接種されて開始される。 培養液の温度は、 温度センサ 一 8 の信号によ リ温度制御計が勤き恒温水槽 5 に送られ る温水の温度及び流量が調節されて、 所要範囲に制御さ れる。 培養初期では 5 %程度の炭酸ガスを含む酸素含有 ガスが、 液面に凹みを形成しない流量でガス吹き込み管 2 から培養槽 1 の気相部に送られる。 増殖に必要な酸素 は、 該気相部から液面を介して供給される。 細胞瀵度が 低密度では、 溶存酸素濃度は、 増殖の制限因子となる レ ベルにない。 この時の撹拌羽根 3 の回転数は、 細胞を充 分に均一分散できる値があれば良い。 そ して細胞の增殖 に伴い酸素消費量が増加し溶存酸素''學度が増殖の制限因 子となる レベルにまで低下した時から酸素吹き'込みガス によ り液面での凹み形成を開始する。 即ち、 酸素センサ 一 7 からの信号を受けた溶存酸素制御計によ り酸素含有 ガスの吹き込み量の調整弁を開き、 液表面での垂直方向 での線速度が 5 m Z s 以上となるよう に吹き込み量を if 加させる 3 増加の イ ミ ングは、 1 0〜 3 0分間毎に溶 存酸素濃度の レベルを判定して該制限因子となる レベル 以下である時とする。 また、 高レベルの溶存酸素濃度は 却って增殖を阻害する。 したがって、 溶存酸素濃度を、 増殖の制限因子となる値及び増殖阻害を起こす値の間に ある よ う に、 吹き込み量を制御する こ と になる。 上記範 囲内で溶存酸素濃度を上記操作で制腐する と、 細胞濃度 の増加と共に酸素含有ガスの吹き込み量は徐々 に増加す る。 と こ ろ が、 ガス吹き込み管に吹き込んだガス量と ノ ズル先端におけるガス線速度と の積である f G が 6 . 2 5 X 1 0 5 X h 2よ り 大き く な る と 、 ノ ズル径 1 ramの場合には ガス吹込み管 2 の吹き込み ノ ズル 2 b か ら吐出され 酸 素含有ガスの液面における垂直方向の線速度が、 6 5 / s e c よ り 大き く な り 、 液内に気泡が入 り込み， 培養液 の発泡を引 き起こす。 即ち、 吹き込みガス量には限界が あ る 。 したがって酸素含有ガスの吹き込み量が、 限界値 よ り 大き く なる場合.は、 酸素含有ガスの酸素分圧 を高 く する と 良い。
    [0037] と こ ろで、 細胞濃度が 1 X 1 0 3個 m β 以上の高密 度では、 老廃物が蓄積 し、 ま た栄養源が不足する 。 こ の ため、 培養液取 り 出 し 口 1 0 か ら培養液を取 り 出 し . 細 胞を無菌的に分離する。 そ して該細胞を新 し い培地と と も に培地供給口 9 から培養槽 1 に戾す。 こ の操作は間け つ的あ る いは連続でも良い。 なお、 細胞の分離方法につ いては特に限定する ものでない。 と こ ろが、 この操作だ けでは、 Ρ Η値が最適値以下 と なる。 これは、 細胞濃度 の増加に伴い炭酸ガスの発生量及び発生速度が増加 し、 溶存炭酸ガス濃度が増加する ためである 。 本発明では、 炭酸ガスの液相と 気相と の交換が良好に行なおれる 。 し たがって、 ρ Ηセ ンサ一 S の信号を受けた ρ Η計によ り 、 酸素含有ガスと炭酸ガスの混合比を変える。 即ち、 P H 値が最適値以下となった時に炭酸ガスの混合比を下げた 酸素含有ガスを吹き込むこ とで、 液相の炭酸ガスを気相 に排出 して P H値を上昇させる こ と ができる。 この時、 炭酸ガスの混合比の低下割合は、 0 . 1〜 0 . 5 % と して 徐々 に行う と良い。 また、 乳酸の蓄積..量の多い場合、 重 炭酸ソーダなどのアル力 リ剤の添加を併甩.する と効果的 である。
    [0038] 〔作用〕
    [0039] 前記ノ ズルから液面に向かって酸素含有ガスを連繞的 吐出せしめ、 液面に逆円錐状の凹みを形成させる ことは、 凹みによる気液界面積を増加させる こ と、 及び吐出ガス が逆円錐状の凹みの底部から液面に向かう流れを強制的 に作る こ と とな り気液界面の更新率が高め られる こ と の 作用によって酸素移動速度を向上させ ¾ こ と ができる。 この と き、 ノ ズルから吐出したる酸素含有ガスの液表面 での運動エネルギーを液素面を押し下げる程度とすれば、 液表面の張力を破って液相への酸素含有ガスの入り込み がない。 即ち、 培養液の発泡を抑える ことができる。
    [0040] 以上の作用によ り 、 培養液の発泡を抑えて、 酸素移動 速度を向上させる ことができる。
    [0041] 図面の簡単な説明
    [0042] 第 1 図は本発明の一実施例の槽内搆造図、 第 2図は該 槽内に具備 し たガス吹き込み管の構造図、 第 3 図は該槽. 内に具備 した撹拌羽根の構造図、 第 4 図は液中へのガス の巻込みが起こ る臨界値を示す線図、 第 5 図はガスの液 中への巻込みが生 じ始めたと きの 値と ノ ズル六面と 水面と の距離と の関係を示す線図、 第 6 図はガス吹き込 み管の ノ ズルから吐出 し たる空気の液面での垂直方向の 線速度と酸素移動速度係数と の関係を示す線図、 第 7 ， 8 図は吹き込み空気量をパラ メ ータ ーと し た撹拌羽根の 回転数と酸素移動速度係数と の関係を示す線図、 第 9 , 1 及び 1 1 図は培養試験結果で各々細胞濃度、 溶存酸 素濃度及び P Hの経時変化を示す線図である 。
    [0043] 〔実施例〕 - 実施例 1
    [0044] 本発明に よ る酸素含有ガス吹き込み機構を有する培養 槽における溶存酸素計を用いたガスァ ゥ ト法によ り 水系 での酸素移動容量係数を求めた。
    [0045] 使用 し た培養槽の搆造は、 第 1 図に示すも ので、 内容 積は 5 β である。 槽本体は、 パイ レ ッ ク スガス製で外径 1 6 0 瞧 、 高さ 2 7 0 醒であ る 。 ガス吹き込み管は、 1 4 の管を外径 7 8 DMの 円型 ドーナツ型の融衝管下部 に ノ ズル穴径 1 腿の吹き込み ノ ズル 6 個を 6 0 ° 間か く で ノ ズル六面が水平に取 り付けた構造であ る。 また、 撹 拌羽根は、 第 3 図に示す 2種を供試 した。 撹拌羽根 Aは、 ^ 8 0 ran , 高さ 1 0 0 腿の板で幅 5 0 隱、 高さ 6 0 腿で 中央部を抜いた矩形板を 1 / 2回転ひねった構造である。 撹拌羽根 Β は、 檑 8 0 nm、 高さ I O O IMの矩形板を 1 / 2 回転でひねった構造である。 両羽根とも槽底部から 2 0 腿の位置に底部がく る よ う に撹拌軸に取リ付けた。 なお、 ガス吹込み管や撹拌羽根の材質は S じ S 3 1 6使 用 した。
    [0046] 上記構造の培養槽に蒸留水 2 . 5 β を仕込み、 ガス吹 き込み管は、 ノズル穴面が水面から 2 0 腿 となるよ う に 取リ付けた。 まず， 窒素ガス液中に通気して、 溶存酸素 濃度をゼ,口付近まで下げ、 次いで、 槽の気相部を空 で 置換後、 所定の条件で撹拌及びノ ズルからの空気の吐出 を開始した。 溶存酸素計にて溶存酸素濃度の増加の経時 変化を求めて、 同データ から酸素移動容量係数を求めた 3 なお、 測定温度は、 3 7 ± 丄 と し、 また、 吹き込む空 気は予め上記温度の飽和蒸気圧に調整したものを使用 し た。
    [0047] 第 6 図は、 各吹き込み量における ノ ズルから吐出した る空気の液面での垂直方向の線速度と酸素移動容量係数 を示したものである。 撹拌羽根は、 Αを使用 し、 回転数 は 8 0 rpm と一定と した。 また、 空気の通気量は 0 〜
    [0048] 2 2 ώ /min と した。 ノズルから吐出したる空気の液面 での垂直方向の線速度は、 水を抜いた槽にて熱線流量計 にて ノ ズル吐出面から 2 0 mmでの流速を測定 した値を用 いた。 液面での凹みは、 該線速度が 5 m Z s 以上で形成 さ れ、 それ と 同時に酸素移動容量係数が増加し た。 なお、 該線速度が 5 m Z s 以下での酸素移動容量係数は、 従来 法、 即ち、 槽上部の気相部から液面を通 して酸素が移動 する場合の値であった。 また、 ノ ズル六径が 1 謹 の も の は、 該線速度 S 5 m 以上では酸素移動容量係数が、 急激に増加 し た。 これは、 気泡の液内への卷込が原因で あった - そ こで、 血清を 1 0 %混合 して、 発泡テス ト を 行った と こ ろ、 該線速度が 6 5 m / s 以上では、 著 し い 発泡を 引 き起こすこ と がわかった。
    [0049] 次に、 撹拌羽根の違い に よ る効果を検討する ため、 第 3 図に示す撹拌羽根 A と B にて酸素移動速度係数を測定 し た。 第 7 図は、 撹拌羽根 A、 第 8 図は撹拌羽根 B の場 合であ る。 前者は、 酸素移動速度が撹拌羽根の回転数に 比例 して増加 したの に対 して、 後者では、 8 0 r p ni で最 大と な り 、 それ以降'减少 し た。 この違いは、 前者では撹 拌数の回転数が増加 しても液面の乱れも少な く 平らであ る の に対 して、 後者ではボルテッ ク ス を形成する ためで あ る こ と がわかった。 即ち、 ノ ズル吹き出 し面から、 液 面までの距離がボルテッ ク スによ リ遠く な る液面での空 気の線速度が遅く なる ためである。 この結果か ら 、 撹拌 羽根は、 回転によ りボルテッ ク スの生 じ ないもの を選定 しなければな らないこ とがわかった。
    [0050] と こ ろで、 酸素移動速度を向上せしめる方法と して、 酸素富化ガスを利用する と良い。 そこで酸素 4 0 %の酸 素富化ガスを用いて、 酸素移動容量係数を測定した。 測 定条件は、 撹拌羽根 Aを用いて、 回転数を 8 0 ΓΡΠΙ と一 定と した。 また、 酸素富化ガスの通気量は、 I 2. δ β Z mと した。
    [0051] 測定結果を第 5 図に示す。 空気を用いた場合に比べ 1 . 5 倍程向上させる こ とがわかった。 本発明と酸素富 化ガスを組合せる こ とで、 よ り高い酸素移動容量係数が 得られ効果的である。
    [0052] 実施'例 2
    [0053] 実施例 1 で用いた装置において、 ノ ズル穴径を 0. 3 ， 0.4 ， 1 .0 ， 2 , 5及び 5鹏と した場合の各々の条件 での酸素移動容量係数を求めた。
    [0054] 測定条件ば、 次の通りである - 各ノ ズルは、 ガス吹き 込み管に 6個を ノ ズル穴面が水面から 2 O nmとなるよ う に取り付けた。 槽内の蒸留水の仕込み量は 2.5 β ，また、 撹拌羽根 Αを用いて、 回転数は 8 0 rpm —定と した。 な お、 測定温度は、 3 7 ± 1 °Cと し， 測定方法は、 実施例 1 と同じガスアウ ト法である。
    [0055] 測定結果を第 4図に示す。 図において、 f G は、 次に 述べるよ う にガス吹き込み管に吹き込んだガス量と ノ ズ ル先端における ガス線速度と の積である。
    [0056] 機械設計便覧 〔機械設計便覧編集委員会編、 丸善株式 会社発行、 昭和 3 3年 （ 1 9 5 8 ) 6 月 2 5 日〕 、 頁 15 04において、 平板に噴流が直角に当たる場合の平板に 力、 かる力 F は， ∑'式のよ う に示さ れている 。
    [0057] F = ( 7 / g ) Q v … '：、
    [0058] 3 は流体の単位体積の重量、 g は重力加速度、 Q は、 流量、 V は噴流の速さ を示す。
    [0059] ノ ズルから噴き出 したガスの液面を押す力は上記式よ り 吹き込みガス流量と ノ ズル先端における ガス線速度と の積に比例する と考え られた。 'こ こで、 各条件における ノ ズル 1 個当 り の吹き込みガス流量 g ( cnf ズ sec)及びノ ズル先端でのガス線速度 V- ( cm / m ) を計算し 、 吹き込 みガスの液面を押す力 F G を求めた。 即ち、 ノ ズル 1 個 当 り か ら吹き出すガスの V 液面を押す力 f は、 式と考 えた。
    [0060] f = k X q X V …② k ： 比例定数
    [0061] ， し たがって、 F Gは、 ③式と な る。
    [0062] F G = 6 X f -- Έ) と こ ろで、 q は、 'Φ式
    [0063] q = Q G / 6 ··■ Φ
    [0064] Q G ： ガス吹き込み管に吹き込んだガス量 であるので、 F Gは、 ⑤式となる。
    [0065] F c= k X QG X v …⑤ (⑤式において、 Q G X V を f Gと した。 ）
    [0066] 第 4 図によれば、 ノズル穴径を変えても、 f. G が同.一 であれば、 酸素移動容量係数 （ h _ は、 ほぼ同じであ る こ と が判明した。 即ち、 吹き込みガズの液面を抨す ^ が、 同一であればノ ズル穴径を変えても同一の酸素移 ir 容量係数を得られこと がわかった。 また、 各ノズル穴径 とも f G 値が、 2 . 5 X 1 03 C (cm /sec)2) では液中に ガスを巻き込むのが観察された。
    [0067] この結果から、 予め任意の ノ ズルを用いて酸素移動容 量係数と f G 値との関係を求めておけば、 ノ ズル径を変 えた場合において、 液面での線速度を測定せずとも f G 値を計算する ことで、 酸素移動容量係数を求める こ と ができる。
    [0068] 実施例 3
    [0069] 実施例 2 に於いて、 ノズル穴面と静止水面との距離を 変えた時の吹き込みガスの液中への巻き込みが生じ始め る f G 値を求めた a
    [0070] 第 5 図に結果を示す。 FG は、 液中へのガス巻込みが 生じ始めた時の f c 値である。 ノ ズル六面と水面との距 離は、 1 0 m , 2 0 mn及び 4 0 mnと した 3
    [0071] 図よ リ ガスの液中への巻き込みが始まる f G 値は、 ノ ズル穴面と水面と の距離の二乗に反比例する こ と が判明 した。 したがって、 図から ノ ズル穴面と 静止水面と の距 離を h emとする と 、 ガスの液中への巻き込みが生 じない f G値は， 6 . 2 5 X 1 0 5 X h 2以下とすれば良い こ と が わかる。
    [0072] 〔実施例 4 〕
    [0073] 実施例 1 で使用 した培養槽にて培養試験を行った。 な お、 比較例と して従来法での培養試験を行った。
    [0074] 供試細胞は、 J T C一 1 (ラ ッ ト復水肝ガン由未の株 化細胞で浮遊性） を用いた。 また、 培地は、 D M— 160
    [0075] (.搔東製薬製） に新生仔牛血清 1 0 %混合 したも の を使 用 した。 培地の仕込み量は、 2 . 5 J2 と し た。 撹拌 ¾根 は、 第 3 図の A タ イ プを使用 し、 ガス吹き込み管の ノ ズ ル吹き 出 し面は、 液面から 2 0 ramと し た。
    [0076] 培養条件は、 次の通 り であ る。 撹拌羽根の回転数は 8 0 rpin 一定と し、 培養温度は、 3 6 ± 1 Cにて制御 し た。 酸素含有ガスは、 空気と炭酸ガスの混合ガスと し、 予め温度 3 7 °Cの温水にスパージング して飽和蒸気圧と し たも の を使用 した。 そ して 0 .4 5 ^ の除菌フ ィルタ 一を通 して、 槽内に供給 し た。 培養初期では該混合ガス を液面に凹み を形成させない通気量 0 . 2 β /minで通気 し た。
    [0077] なお、 炭酸ガス初期の濃度は 5 V V 。/。 と した。 吹き 込み酸素含有ガスによる液面での凹み形成の開始ば、 溶 存酸素讓度が 2 ppm 以下となった時点と した。 それ以後、 溶存酸素濃度が 2 ρρπι と なる よ う に、 酸素含有ガスの吹 き込み量を制御した。 炭酸ガスの混合割合の減少は、 細 胞濃度 1 .5 X 1 05 個 Zm fiの時点から行った。 なお、 比較例では、 炭酸ガス濃度 5 VZ V %の空気混合ガスを 通気量 0 .2 Δ Zmin—定で通気した。 また、 老廃物の除 去及び栄養源の供耠を行う ため、 途中培地交換を行った、 その交換率は 1 0 0 % と した。
    [0078] 培養結果を第 9 ， 第 1 0 ， 第 1 1 図に示す。 第 9 図に 示すよう に本発明では細胞は、 比較例 （従来法） と同じ 増殖速度で増加し、 比較例が細胞濃度 3 X 1 03 個/" m fi程度で頭打ち となるのに対して 1 . 2 X 1 07 個 Z m β までほぼ指数的に増殖した。 培養期間を通しての Ρ Η値は第 1 1 図に示すよ う に雨者とも 6 9 〜 7 5 の範 囲にあ り 、 本株では ρ Η値は、 増殖の制限因子とはなつ ていない。 したがって、 上記の差は、 次の理由による。 比較例の溶存酸素濃度は、 第 1 0図に示すよう に細胞濃 度が 1 .4 X 1 03個 Z m β以上でほとんどゼロ とな り 、 増殖の制限因子となっている。 これに対して、 本発明で は実施例 1で示すよ う に高い酸素移動速度が得られるの で培養終了まで溶存酸素濃度を 1 . 8 〜 2 . 6 pPm とする こ と ができ、 増殖に必要な酸素を充分に供給できたから であ る。
    [0079] また、 培養期間を通して著しい発泡はな く 、 培養終了 時の細胞生存率は 8 5 %で培養開始時の 8 8 % と比べ大 きな减少はなかった。
    [0080] 以上から、 本発明によ り酸素含有ガスと して空気を用 いた場合でも細胞を従来法の 3倍強の高密度で培養でき る こ と が確認できた。
    [0081] と こ ろで、 本発明では溶存炭酸ガスの液相と気相の置 換が良好に行なえる。 これは、 液面での凹み形成を開始 した時点の P Hの変化に現られている。 比較例では P H 値は 下するのに対して、 本発明では上昇した。 即ち本 · 発明では酸素含有ガスを液面に吐出 して液面に凹みを形 成する こ と で液相一気相間の気体に物貧移動を促進 し液 相の炭酸ガスを良好に気相に排出できたからである。 ま た、 炭酸ガス生成速度の高い高密度培養でも、 本発明で は液相—気相間の気体の物質移動速度を高く でき るので、 炭酸ガス瀵度の低い酸素含有ガスを利用する こ とで液相 から気相への炭酸ガスを排出できる。 こ のため、 第 1 1 図に示すよ う に溶存炭酸ガスの蓄積に伴う P H値の低下 を抑える こ と ができた。
    [0082] 〔発明の効果〕
    [0083] 本発明によれば、 機械撹拌式の培養槽において槽上部 の気相と培養液の液相間との気体の物質移動を培養の発 泡を抑えて促進できる。
    权利要求:
    Claims請求の範囲
    1 . 動物細胞を機械撹拌式の培養槽にて培養する に当 り 、 培養液の撹拌を液面の乱れやボルテッ ク ス形成を抑え ながら行ない、 かつ吹き込みノズルから酸素含有ガス を液面に向けて連続的に吐出 し、 液面に凹みを形成さ せる こ と を特徵とする動物細胞の培養方法。
    2 . 特許請求の範囲第 1 項において， 吹き込みノ ズル先 端から静止液面までの距離を h と したと き、 酸素含有 ガスの吹き込み量と ノ ズル先端でのガス線速度との積 が 6 . 2 5 X 1 0 5 X h 2以下となる よ う に上記ガスを 吐出する こ と を特墩とする動物細胞の培養方法。
    3 " . 特許請求の範囲第 1 項において、 吹き込みノ ズル穴 径 1 腿の ノ ズルから吐出する酸素含有ガスの液面での 垂直方向に対する線速度を S m Z s 以上 6 5 m / s 以 下となるよ う に上記ガスを吐出する こ と を特徵とする 動物細胞の培養方法。
    . 動物細胞を機械撹拌式の培養槽にて培養する装置に おいて、 液面上部の気相空間に酸素含有ガスを連続的 に吐出するための単一も し く は複数個の気体吹込みノ ズルを液面に向けて設置したこ と を特徴とする動物細 胞の培養装置。
    . 特許請求の範囲第 4項において、 培養液を撹拌する ための撹拌羽根が、 中央部を抜いた矩形板を 1 ノ 2 回 転ひねった構造である こ と を特徴とする動物細胞の培 . 動物細胞を分散した培養液を撹拌機で撹拌しながら 培養槽にて培養する にあたり、 培養液の液面を実質上 平滑に保ちつつ培養液の撹拌を行い、. かつ多数の吹き 込み六を有する吹き込みノ ズルから酸素含有ガスを液 面に向けて違繞的に吐出 し、 液面に多数の凹みを形成 させ酸素ガスを培養液に溶解する こと を特徴とする動 物細胞の培養方法。
    . 動物細胞を分散した培養槽の培養液を-機械撹拌しな がら培養する方法において、 培養液の発泡及び該動物 細胞の破壤を防止しながら培養液の撹拌をする こ と、 及び吹き込みノ ズルから酸素含有ガスを液面に向けて 吐出し、 液面に凹みを形成させながら酸素ガスを培養 液に溶解させる こ と 、 を有する こ と を特墩とする動物 細胞の培養方法。
    . 動物細胞を機械撹拌式の培養槽にて培養する にあた リ 、 培養液の撹拌を液面の乱れやボルテック ス形成を 抑えながら行い、 かつ吹き込みノ ズルから酸素含有ガ スを液面に向けて連続的に吐出 し、 液面に凹みを形成 し凹みの底部から液面に向かう培養液の流れを形成し つつ酸素ガスを培養液に溶解させる こ と を特镦とする 動物細胞の培養方法。
    . 動物細胞を分散する培養液を収容する培養槽と 、 該 培養液を撹拌する撹拌機と及び該培養液の液面に酸素 ガス を供給する手段と を有する培養装置において、 液 面上部の気相空間に、 酸素含有ガスを液面に向けて連 続的に吐出するための気体吹き込み ノ ズルを設置 し た こ と を特徵とする動物細胞の培養装置。
    . 動物細胞を分散する培養液を収容する培養槽と 、 該 培養液を撹拌する撹拌機と及び該培養液の液面に酸素 ガス を供給する手段と を有する培養装置において、 液 面上部の気相空間に、 酸素含有ガス を液面に向けてほ ぼ垂直に吐出する ための気体吹き込み ノ ズルを設置 し たこ と を特徵とする動物細飽の培養装置。
    . 動物細胞を分散する培養液を収容する培養槽と 、 該 培養液を撹拌する撹拌機と及び該培養液の液面に酸素 ガスを供給する手段と を有する培養装置において、 酸 素含有ガス を液面に向けてほぼ垂直に吐出するための 気体吹き込み ノ ズルと 、 該ノ ズルからの吐出圧力 を制 御 し該液面に凹み を形成する制御手段を有する こ と を 特徴とする動物細胞の培養装置。
    . 培養槽の培養液に分散された動物細胞を機械撹拌 し な がら培養する方法において、 培養液の発泡及び該動 物細胞の破壤を防止 し ながら培養液の撹拌をする こ と 、 及び吹き込み ノ ズルか ら酸素含有ガスを液面に向けて 垂直方向に 5 πι /秒〜 6 5 m /秒 （但し ノズルの穴径 を 1 腿と して計算した場合の液面での線速度） の速度 で吐出し、 液面に凹みを形成させながら酸素ガスを培 養液に溶解させること、 を有する こ と を特漦とする動 物細胞の培養方法。
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