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    公开号:WO1987003284A1
    申请号:PCT/JP1986/000591
    申请日:1986-11-19
    公开日:1987-06-04
    发明作者:Yuji Fukumoto；Akira Ohtsu；Katsuhiko Fujii
    申请人:Teijin Limited；
    IPC主号:A61K35-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書 発明の名称
    [0002] 血管新生 因子及びそ の製造方法
    [0003] 技術分野
    [0004] 本発明 は 、 血管内皮細胞に ょ っ て 産生 さ れ得る 、 血管 新生 を誘導 し ぅ る物質 と そ の製造方法 に 関 す る 。
    [0005] そ の 目 的 と す る と こ ろ は 、 虚血性疾患の治療薬ゃ創傷 治療薬 と な る こ と が期待さ れる 、 ぺプチ ド性の物質を提 供す る こ と に ぁ る 。
    [0006] 背景技術
    [0007] 血管を構成する主要な細胞は 、 内膜の血管内皮細胞 ， 中腠の平滑筋細胞， 外膜の線維芽細胞でぁる 。 し か し 、 毛細血管で は 、 平滑筋細胞ゃ線維芽細胞を含 ま ず、 基本 的 に は 内皮細胞の みに ょ っ て 管を形成 し て ぃ る 。 従 っ て 血管新生 は 、 血管内皮細胞の増殖ゃ遊走を引 き金 と し て 開始さ れる と 考ぇ ら れる 。 内皮細胞は血管内腔の表面を —面 に ぉ ぉ ぃ 、 血流 に接 し て ぃ る 。 その機能は 、 血管内 腔表面の非血栓性維持， 血管か ら の物質透過の調整 ， さ ら に血圧の調整が考ぇ ら れる 。 ま た 、 傷害に対する條復 耝耩の再生 に は 、 毛細 血管 （ す なゎち 内皮細胞 ） が急激 に 増生 する必要が ぁる 。 物質生産の面か ら ぃぇ ば 、 内皮 細胞は コ ラ ー ゲ ン ， フ ィ プ ロ ネ ク チン ， ァ ン ジ 才 テ ン シ ン I , プラ ス ミ ノ ー ゲ ン活性化因子な ど の産生を行な っ て 、 上に述べたぎゎめて重要な ¾ ΙΕを果 し て ぃる
    [0008] -方、 ま た血管壁をぉぉ ぅ 内皮細胞は直接血流に接す るため、 血液中のさ ま ざま な物理， 化学， 生物因子に ょ っ て傷害を受け血管か ら剥離するが、 さゎめて速く その 局所で嫁復増殖を行なぃ血管壁の恒常性機能を維持 し ¾c けてぃる 。 し'か しなが ら 、 この修復機構が何らかの原因 で破綻する と 、 傷害部位に血小板が付着 し 、 血栓の誘因 となる 。 さ ら に '血管透過性が亢進 し 、 平滑筋細胞への増 殖因子が働ぃて 、 平滑筋細胞が増殖 し 、 中膜の肥厚を引 き起こ し た り 、 ま た低比重 リ ポ タ ンパ ク質の血漿中から 内皮下の耝耩への移行が促進されて 、 動脈硬化が進行す る こ とが知 られてぃる。 これはゃがて 、 心筋梗塞ゃ脳梗 塞などの重大な疾患へ と進展 し て ぃ < 。
    [0009] この様に 、 血管新生 は、 血栓形成部位ゃ動脈硬化部位 などの耝織修復， 再生にぉぃて 、 特に重要な役割を果 し て ぃる 。 従 っ て 、 血管新生を誘導でぎる血管新生因子は 多 く の毛細血管に作用 し 、 上に述べた虚血性疾患等の有 効な治療薬 となる可能性が示唆される 。 他方、 臓 Ηδ 他 をはじ め とする外科的大手術での傷ロ の修復ゃ移植黷器 の生着は、 その部位での血管新生能に依存 してぉ り 、 血 管新生因子は の ょ ぅ な創傷治療薬 と し ての可能性ち 考ぇ られる。
    [0010] 腫瘍は、 その急速な増殖に栄養血管の導入を必要 と し 血管新生因子を放出 し なが ら成長 し てぃ く こ とが知 ら れ て ぉ り 、 血管新生 因子の精製は 、 こ れ ま でも っ ぱ ら 癌耝 織ぁ るぃ は癌細胞を原料 と し て 行なゎ れて き た 。 本発明 者 ら は 、 血管新生 因子を上 に述べ た疾患の治療薬 に応用 す る た め に 、 正常耝竊ぁる ぃ は細胞か ら周因子を精製す る こ と を 目 的 と し て 、 血管新生 に 最も密接 に 関係す る血 管内皮細胞に着 目 し た 。 す なゎ ち 、 血管内皮細胞 は適切 な条件下で継代培養を続け る と 、 そ れ自 身のみで管形成 を行 ぅ こ と が報告さ れて ぉ り 、 こ の こ と は 、 内皮細胞自 身が血管新生 因子を産生 し て ぃる可能性を強 く 示唆す る もので ぁ る 。 本発明者 ら は 、 内皮細胞由 来の血管新生因
    [0011] '子 に っ ぃ て 、 i n V ro の 内皮細胞遊走試験及び i nv i.vo で の鶏卵漿尿膜を用 ぃ た 血管新生の活性測定 を行な ぃ 、 詳細 に検討 し た 結果、 その培養上清 に 血管新生 活性を確 認 し 、 さ ら に精製を継続 し て 本発明 に 到達 し た も ので ぁ る 。
    [0012] 発明 の 開示
    [0013] 本発明 は 、 血管内皮細胞 に ょ っ て 産生 さ れ得る 、 そ し て へパ リ ン固定化 ァ ガ ロ ー スゲル に吸着 し かっ 0.7〜 1.0M の塩化ナ 卜 リ ゥムで溶出 さ れる 、 ま た ジ ェチル ァ ミ ノ ェ チル （ D E A E ) 陰ィ 才 ン交換体に 吸着 し かっ
    [0014] 0.2M〜 0.4M塩化ナ 卜 リ ゥ ムで溶出 さ れる と ぃ ぅ 性質 を有する 、 分子量が約 5, 000〜 10, 000の血管新生 因子で ぁ る 。
    [0015] ま た 、 本発明 は 、 血管内皮細胞を無血清培養 し た培養 上清をへパ リ ン固定化ァガ ロ ースゲルに かけ、 その吸着 画分を 0.7M〜 1.0Mの塩化ナ 卜 リ ゥムで溶出させる こ と を特徴と する血管新生因子の製造方法でぁ り 、 ま た 、 前記'溶出物を更に D E A E ィ 才 ン交換体にかけ 、 その吸 着画分を 0.2M〜 0.4M塩化ナ 卜 リ ゥムで溶出させるこ とを特徴 とする、 ょ り精製された状態での血管新生因子 の製造方法でぁる。
    [0016] 図面の簡単な説明
    [0017] 図 1 は、 本発明の血管新生因子のへパ リ ン固定化ァガ ロ ースゲルカ ラ ム ク ロ マ 卜 グラ フ ィ ー に ょる流出パタ ー ン及ぴ内皮細胞遊走活性陽性の部分を示す図でぁる。
    [0018] 第 2 図は、 周因子の分子ふるぃ と内皮細胞遊走活性 と の関係を示す図でぁる 。
    [0019] 図 3 は、 同因子の D E A E — セ フ ァ セルに ょ る流出パ タ ー ンを示す図でぁる 。
    [0020] 図 4 は、 周因子の生化学的性質を示す図でぁる 。
    [0021] 図 5 は、 同因子のゲルロ過に ょ る流出パ タ 一ンを示す 図でぁる 。
    [0022] 発明を実施するための最良の形態
    [0023] 本発明の血管新生因子は、 血管内皮細胞にょ っ て産生 さ れるもの と実質的に同ーでぁる限 り 、 細菌， 酵母， 動 物細胞等を用 ぃる遺伝子操作の手法で製造さ れた ものも 含む。 ー般的に は、 血管内皮細胞を培養する こ と に ょ っ てその培養上清中に生産さ れる 。 本発明 に ぉぃ て 、 血管内皮細胞の起源 は 、 特 に 限定 は なぃ 。 人又は動物の任意の血管か ら 採取す る こ と がで き る 。 ま た 、 血管内皮細胞の培養方法 ， 条件 にっ ぃて も特 に 限定 は な く 、 公知 の方法を採用 でき る が 、 精製の容易 さ と ぃ ぅ 点で は 、 最初'は 、 例 ぇぱ 、 牛胎児血清を含む培 地で細胞を安定 に 培養 し 、 そ の後無血清培地を用 ぃ て 、 十分な血管新生因子が得 ら れる ま で培養する方法が好 ま し ぃ 。
    [0024] 本発明者 ら は 、 ま た 、 血管内皮細胞の培養上清ょ り 、 血管斩生 因子を大量に し かも効率 ょ く 製造す る方法 にっ ぃ て 鋭意研究を重ね た結果、 .血管内皮細胞の培養系 に ぁ る種の血管新生因子誘起剤を 添加 す る と 、 培養上清中 ぺ の同因子の生産が増強さ れる こ と を知見 し た 。
    [0025] かかる誘起剤 の例 と し て は 、 プ ロ ス タ グラ ン ジ ン E 1 プ ロ ス タ グラ ン ジ ン A i 等の天然型プ ロ ス タ グラ ン ジ ン 又はそ の非天然型合成誘導体 ： N — フ ォ ル ミ ル ー JI — メ チ才 ニル — ϋ ー ロ ィ シル ー ϋ ー フ ェ ニルァ ラニ ン （ F M
    [0026] L P ) , N — フ ォ ル ミ ル ー A — メ チ 才 ニル ー 一 ロ ィ シ ル ー J — フ ェ ニル ァ ラ ニル 一 ϋ — フ ェ ニル ァ ラ ニ ン を代 表す る種々 の 白 血球遊走活性を有す るぺプチ ド類 ； 1 a 25— ジ ヒ ド ロ キ シ コ レ カ ルシ フ ェ ロ ー ル ， 24 , 25— ジ ヒ ド ロ キ シ コ レ カ ル シ フ ェ ロ ー ル ， 1 ひ ー ヒ ド ロ キ シ コ レ カ ルシ フ I ロ ール等の活性型 ビ タ ミ ン D が挙げ ら れる 。 かかる誘起剤 の ぅ ち水 に不溶の も の は 、 ェ タ ノ ー ル溶液 の形で用 ぃ ら れる 上 5し誘起剤 は 、 濃度が 1 0 〜 1 0 - 好 ま し く は 1 0 "6 〜 1 0 -3 M と なる様に培地に添加 し て 用 ぃ ら れる 。 誘起剤 の濃度が 1 0 -" M未満の場合 に は、 本発明 の効果は十分 に は得 ら れず 、 1 0 M を越ぇる場合は細胞 毒性がでて < る た め に好 ま し く な ぃ
    [0027] 血管内皮細胞の培養上清中 に産生 さ れた本発明 の血管 新生因子 は 、 へパ リ ン に吸着する とぃ ぅ 性質を有する の で 、 へパ リ ン固定化 ァガ ロ ー スゲルを用 ぃ て分雄 ♦ 精製 でき る 。 へパ リ ン はブ タ 等の腸粘膜の未変性プ ロ テ 才 リ カ ン か ら 抽出 さ れ、 硫酸化さ れ た グ リ コ サミ ノ グ リ カ ンで ぁ り 、 ァ ン チ 卜 ロ ン ビ ン M を始め と し て多 く の凝固 系因子 と選択的 に結合す る 。 '従 っ て 固定化際ぺパ リ ン に対 す る親和性を用 ぃ て 、 数種の凝固因子が単離さ れて ぃ る ま た 、 ぺパ リ ン は 、 そ の ポ リ ァ ニ 才 ン と し て の性質 Λ の た
    [0028] ヽ 。 め に 、 多 く の陽ィ 才 ン性の物質 と相互作用 す る 。 従 っ てリ こ の様な相 互作用 が 固定化へパ リ ン .を用 ぃ た ァ フ ィ ニテ ィ ク ロ マ 卜 グラ フ ィ ー に ょ る精製の基礎に な っ て ぃる 。 本発明 の へパ リ ン 固定化 ァガ ロ ー スゲルに ぉ （ て 、 へパ リ ン を ァ ガ ロ ー スゲル に共有結合させる方法は、 公知 の 方法 に 従 っ て行な ぅ こ と がで き る 。 利用 可能な市販品 と し て は 、 フ ァ ルマ シ ァ社製へパ リ ン ー セ フ ア ロ ース C L ー 6 B 又 は 、 パ 才 ラ ッ ド社製の ァ フ ィ ゲルぺパ リ ン等が ぁ る が 、 こ れ ら に 限定 さ れる ぁ ので はなぃ
    [0029] 本発明 に おぃ て 、 血 新生因子の吸着 に ン 固定化ァガ ロ ー スゲルを平衡化する の に用 ぃ ら れる緩 衝液は 、 塩濃度 0.5M以下の中性の緩衝液で ぁ る 。 PH は 6.5〜 7.5が好 ま し ぃ 。 血管新生 因子を へパ リ ン 固定 化 ァガ ロ ー スゲル に吸着さ せ る と き の流速 は 、 2 〜 10/B / hrcis "2 , 温度 は 0 〜 10 が好 ま し ぃ 。
    [0030] へパ リ ン 固定化 ァガ ロ ー スゲルか ら の血管新生因子の 溶出 は 、 例 ぇ ぱ 0.01 Μか ら 4.0Μ , 好 ま し く は 0.1Μ か ら 2.0Μ の塩化 ナ 卜 リ ゥ ム を含む中性緩衝液の直線濃 度勾'配に ょ っ て 行な ぅ 。 同因子 は 0.7Μ〜 1.0Μ の塩化 ナ 卜 リ ゥ ム濃度の位置に 溶出 さ れる 。 他の溶出方法 と し て 、 0.7Μ , 1.0Μの塩化ナ 卜 リ ゥ ムをそ れぞれ含む中 性緩衝液で 、 ス テ ッ プ ヮ イ ズ に溶出 さ せ る方法も可 能で ぁる 。 溶出の流速は 2 〜 / tiros -2 温度 は 0 〜 10 が 好 ま し ぃ 。
    [0031] D E A E 陰ィ 才 ン交換体 は 、 第三級ァ ン モニ ゥ ム塩基 ジ ェ チル ァ ミ ノ ェ チル基 ： — C 2 H 4 N + ( C 2 H 5)2 H を有する弱塩基性陰ィ 才 ン交換体で ぁ る 。 ィ 才 ン交換 分離の基本原理 は各溶質分子の電荷の違ぃ に ょ る ィ 才 ン 交換体への吸着カ の差を利用 し た も のでぁ る 。 ィ 才 ン交 換 は 、 ご く ゎず かの電荷の違ぃ し かなぃ分子で も分離で き る分離能の非常 に 髙ぃ技法で ぁ り 、 現在 、 生体物質を 分画す る最も重要な方法の ひ と っ に な っ て ぃる 。 ィ 才 ン 交換体の担体 と し て は 、 架樣デキス 卜 ラ ンゲル ， 架橋 ァ ガ ロ ー スゲルぁ る ぃ はセル ロ ー ス な どの髙分子多糖類が 用ぃ られてぉ り 、 解離基は、 構成単位でぁる単糖に共有 結合する こ と に ょ り 、 マ 卜 リ ッ クスに導入されて ぃる。
    [0032] D E A E 陰ィ ォン交換体は、 その表面が正 に荷電し てぃ るので、 物質の総電荷が負の物質を吸着する能カがぁ り こ の ょ ぅ な物質の精製に広く 用ぃ られてぃる 。 利用可能 な市販品 と し て 、 フ ァルマシ ァ社製 D E A E — セ フ ァ セ ル， D E A E — セ フ ァ デッ ク ス， D E A E — セフ ァ ロ ー ス， ぁるぃ はパ ィ 才 ラ ッ ド社製の D E A E —パィ 才ゲル A , ぁるぃは ま た 、 ヮ ッ 卜マ ン社製の D E 52などがぁる が、 これら に 限定されるもので はなぃ 。
    [0033] 本発明 にぉぃ X 、 血管新生因子の吸着に際し 、 D E A E 陰ィ ォン交換体を平衡化するの に用ぃ ら れる緩衝液は 塩濂度 0.1M以下の中 の緩衝液でぁる 。 PH は 7.0〜 8.0が好ま しぃ 。 血管新生因子を D E A Ε 陰ィ ォ ン交換 体に吸着させる ときの流速は 2 〜 1 θΛώ h rc/s _2 , 温度は 0〜 10 が好ま し ぃ。
    [0034] D E A E 陰ィ 才 ン交換体か らの血管新生因子の溶出 は 例ぇぱ、 0.02 Mが 1.5 M , 好 ま し く は 0.1 M か ら 0.7 Mの塩化ナ 卜 リ ゥを含む中性緩衝液の直線濃度勾配に ょ っ て行な ぅ 。 同因子は 0.2M〜 0.4M の塩化ナ 卜 リ ゥ ム 濃度の位置に溶出さ れる 。 他の溶出方法 と し て 、 0.2M 0.4M の塩化ナ 卜 リ ゥムをそれぞれ含む中性緩衝液で、 ステ ッ プヮ ィ ズに溶出させる方法も可能でぁる 。 溶出の 流速は 2 〜 10 / hrojT2 ， 温度は 0〜 10°Cが好ま し ぃ 。 か く し て分離 ♦ 精製さ れた本発明 の血管斩生 因子の分 子量は 、 ィ ン シ ュ リ ン （ 分子量 6,000 ) と ァポ リ ポプ ロ テ ィ ン A — I ( 分子量 8,500 ) を標準物質 と し た分子ふ る ぃ に ょ る方法で 、 約 5, 000〜 10, 000と 推定 さ れた 。
    [0035] 以下、 実施例 を挙げて本発明 を具体的に説明す る 。 実施例 1
    [0036] (1) ゥ シ血管内皮細胞 （ B A E ) の培養上清の
    [0037] 作製
    [0038] ゥ シ大動脈血管 ょ り 剥離法 （ 三井洋司著 ， 耝縝培養 ， 1982, vol 8 ： 397-402参照 〉 に ょ り 血管内皮細胞を採取 し 、 こ れを 10%牛胎児血清 （ F B S ) を含むィ ー グル最 小必須培地 （ E ag le "* s minimum essent ial med ium, E M ) に 分散さ せ 、 プラスチ ッ ク ぺ 卜 リ 皿 （ 10^ Φ ) 中 で 、 5 %炭酸ガ ス ， 37°C の条件 に て 初代培養を行な っ た 約 1 週間後、 ぺ 卜 リ 皿ー面 に 増殖 し た状態の細胞を 、
    [0039] 0.05 % 卜 リ プ シ ン溶液で分散さ せ 、 1 対 4 の面積比で 継代培養 し た 。 通常 2 〜 10回継代 し て 得 ら れた多量の 内 皮細胞が 、 ぺ 卜 リ 皿ー面に 増殖 し た 時期 に 、 培養上清を 除去 し 、 F B S を含 ま な ぃ無血清ダルべ ッ コ M E M培地 ( D M E ) で洗鲦 し て 、 再び無血清 D M E M を添加 し た培養を続け た 。 無血清培養開始後 10〜 48時圊 に培養上 清を採取 し て 、 遠心後 、 上清を 1 mM の重炭酸 ァ ン モ ニ ゥ ム緩衝液 （ P H 7.6) に 透析 し て 、 透析内液を凍結乾 燥 し た 。 こ れを 1 20量の適当 な緩衝液ぁる ぃ は培地 に 溶解 し て 、 血管新生 因子精製のた めの原料 と し た 。
    [0040] (2) B A E培養上清の血管新生活性
    [0041] 上述の如 く し て作製 し た B A E培養上清中 の血管新生 因子の活性を 、 以下の 2 っ の方法 に ょ り 測定 し た 。
    [0042] ① 血管内皮細胞遊走試験 （ in V ro)
    [0043] 血管新生の活性を調 べる i n V ro の試験の中 で最 も重要なもの は 、 毛細血管形成の方向づけを決定 する 血管内皮細胞の化学走性す なゎ ち遊走活性の測定でぁ る 。
    [0044] 血管内皮細胞の遊走活性 は 、 A lbrecht-B uehlerの 方法 （ C el I , 1977 , vol 11 ： 395 - 404 ) に従'っ て 測定 し た 。
    [0045] す なゎ ち 、 金コ ロ ィ ドを表面 に コ ー 卜 し た カ ノ S— グ ラ ス を 、 500 ^ の 10% 巳 3 - 1^ 已 の入 っ た ぺ 卜 リ 皿 ( 3 Φ ) に 入れ、 さ ら に こ れ に 50 / ϋ の B A E 培養上清ぉ ょ び 2 X 103 個の B A E浮遊液 500 を 添加 し て 、 37°C， 5 % C 02 下にー夜培養 し た 。
    [0046] B A Eの遊走 し た軌跡を顕微鏡下で観察 し て 、 遊走 軌跡の長径が細胞の長径の Ί 倍以下を 0 . 1 〜 2倍を 1 , 2〜 3倍を 2 , 3倍以上を 3 と 表示 し て 遊走活性 と し た 。 第 1 表 に示す如 く 、 B A E培養上清は 、 対照 の培地の みの場合 に 比較 し て 、 明 ら かに B A Eの遊走 活性を捉進す る こ と がゎか っ た 。 鶏卵漿尿膜を用 ぃ た 血管新生の活性測定 （ i n vivo ) 血管新生の i n vivo で の活性測定 は 、 鶏受精卵の漿 尿膜上の血管新生を利用 し た F o manの方法 ( C ance r R es. vo l 34 ： 2109-2113 ) に従 っ て 行な っ た 。 す なゎ ち 、 鶏受精卵 に小さ な ス リ ツ 卜 を作 り 、 漿尿膜上 に 、 20 5 の B A E 培養上清を添加 し た グラス フ ィ ル タ ー （ ヮ ッ 卜 マ ン社製 G F / B ) を のせて 、 5 日 間 、 孵卵器内 に孵置 し た後 、 血管新生 を観察 し た 。 強陽性 ( + ) , 疑陽性 （ 士 ） ， 陰性 （ ― ） の数を計測 し て 血 管新生の活性 と し た 。 第 2 表 に示す如 く 、 B A E 培養 上清に は 血管新生を促進す る活性が認め ら れた 。
    [0047] 第 Ί 表
    [0048]
    [0049] 第 2 表
    [0050] 被 験 体 血管新生作用 陽性率
    [0051] + 土 ー (%) 対 照 0 2 7 0 内皮細胞 5 2 3 50 平滑筋細胞 0 0 3 0 実施例 2
    [0052] 血管新生因子の へパ リ ン 一 セ フ ァ ロ ー ス に ょ る精製 B A E 培養上清か ら 血管新生因子を精製す る た め に 、 実施例 1 の方法で作成 し た B A E 培養上清を、 0.01 卜 リ ス塩酸緩衝液 （ P H 7.0) , 0.1M塩化ナ 卜 リ ゥ ム で平衡化 し た へノ リ ン ー セ フ ァ ロ ー ス （ フ ァ ルマ シ ァ社 製 ） に かけ 、 次ぃで 0.1M か ら 2.3M塩化ナ 卜 リ ゥ ム を 含む 0.01 卜 リ ス塩酸緩衝液 （ P H 7.0) の直線濂度 勾配に ょ り 溶出 し た 。 各分画試料中 の血管内皮細胞遊走 活性を 図 1 に示 し た 。 遊走活性 は 0.7Mか ら 1.0Mの塩 化ナ 卜 リ ゥ ムで 溶出 さ れる画分 に存在 す る こ と が 明 ら か と な っ た 。 活性画分を透析 ， '次ぃで濃縮 し た後、 鶏卵漿 尿膜試験 に ょ っ て 血管新生の 活性を測定 し た 。 第 3 表 に 示す如 く 、 へパ リ ン 一 セ フ ァ ロ ー ス に 吸着さ れた 内皮細 胞遊走活性が陽性の画分 は 、 確かに i n vivo に お い て お 血管新生 を促進す る こ と がゎ か っ た 。
    [0053] 第 3 表
    [0054] 実施例 3
    [0055] 分子ふるぃ カ ラ ム に ょ る血管新生因子の精
    [0056] へパ リ ン ー セ フ ァ ロ ー スで部分精製さ れた -血管新生の 活性陽性画分を 、 凍結乾燥 に ょ り 濃縮 し た後、 0.15 ギ酸 ァ ン モニ ゥ ム緩衝液 （ P H 3.2) で平衡化 し た ス ー ノ ー ロ ーズ 6 カ ラ ム （ フ ァ ルマ シ ァ社製 F P L Cシ ス テ ム ） に ょ っ て 、 分子ふる ぃ を行な っ た （ 流速 / min , 温度 は室温 ） 。 各画分の 内皮細胞遊走活性を測定 し た結果を図 2 に示 し た 。 分子量マ ー カ ー と し て ィ ン シ ュ リ ン （ 分子量 6, 000 ) と ァ ポ リ ポプ ロ テ ィ ン A - I ( ( 分子量 8，500 ) を用 ぃ 、 周ー条件で分子ふる ぃ を行 な っ た 。 図 2 に示す如 く 、 内皮細胞遊走活性は 、 そ の ピ ー ク が分子量約 6, 000の ィ ン シ ュ リ ン と ほ と ん ど周 じ位 置 に 溶出さ れ、 幅 と し て は分子量約 5 , 000〜 10, 000に相 当 す る こ と がゎ か っ た 。 遊走活性陽性画分を凍結乾燥 に ょ り 濃縮 し た後、 鶏卵漿尿膜試験 に ょ り 、 in vivo での 血管新生活性を調 べ た 桔果、 第 4表に示す如 く 、 そ の 活 性が ぁる こ と が確認さ れた 。
    [0057] 第 4 表
    [0058] 被 験 体 血管新生作用 陽性率 （ 9 )
    [0059] + ± — 対 照 0 1 4 0 スーパーローズ 6
    [0060] 活 性 画 分 3 0 3 50
    [0061] 実施例 4
    [0062] D E A E — セ フ ァ セル （ S ephace I ) ( 7ァ ルマシ ァ 社製） に ょ る血管新生因子の精製
    [0063] へパ リ ン ー セ フ ァ ロ ー スで部分精製された血管新生因 子を、 0.1M塩化ナ 卜 リ ゥ 厶を含む 20 m リ ン酸緩衝液 ( H 7.4) に透析 した後、 周緩衝液で平衡化 し た陰ィ 才 ン交換樹脂 D E A E — セ フ ァ セルにかけ、 充分に洗淨 後、 0.1Mか ら 0.6M塩化ナ 卜 リ ゥムを含む リ ン酸緩衝
    [0064] .. ,
    [0065] 液 （ PH 7.4) の直線濃度勾配に ょ り 溶出 し た 。 図 3 と 第 5 表に示 した如 く 0,2か ら 0.4Mの塩化ナ 卜リ ゥムで 溶出さ れる画分に 、 內皮細胞遊走活性及び鶏卵漿尿膜に ぉける血管誘導活 が認め ら れた 。 従 っ て 、 内皮細胞由来血管新生因子は、 陰ィ 才ン交換 樹脂 D E A E — セ フ ァ セルに吸着 し 、 0.2から 0.4M塩 化ナ 卜 リ ゥムで溶出 さ れるこ と がゎか っ た 。 第 5
    [0066] 実施例 5 血管新生因子の生化学的性質 へパ リ ン ー セ フ ァ ロ ー スで部分精製さ れた血管新生因 子 に 種々 の処理を施 し 、 内皮細胞遊走活性を測定 す る こ と に ょ っ て 、 その生化学的性質を検討 し た 。
    [0067] (1) 酸処理
    [0068] 終濃度 1 N の酢酸ぉ ょ び 1 %の ギ酸を 因子 に添加 し 4 °C で ー夜放置後、 6 N N a O H で中和 し て リ ス酸緩 衝液生理食塭水 （ PH 7.2 ) に 透析後 、 活性を測定 し た 。
    [0069] (2) 熱処理
    [0070] 因子を 100T)で 3 分， 56°C で 30分 ， 37°Cで 2 日 間そ れぞれ処理後、 そ の ま ま 活性を測定 し た 。
    [0071] (3) シ リ プシ ン処理
    [0072] 因子 500^ £ に 50〃 3 の 卜 リ プシ ン （ ジグマ社 ） を 添加 し 、 37°C で 2 時間 ィ ン キ ュ べ ー 卜 後、 シ リ プシ ン ィ ン ヒ ビ タ ー （ シ グマ社 〉 を 100 Sf 加 ぇ て 、 活性を 測定 し た 。 ぁ ら か じ め不活性化 し た 卜 リ プシ ン を加 ぇ た も の を対照 と し て 用 ぃ た 。 すなゎ ち 50 SP の 卜 リ プ シ ン を 100 3 の 卜 リ プシ ン ィ ン ヒ ビ タ ーで ぁ ら か じ め 37 で 30分前処理 し た後 、 因子に添加 し 、 37°G で 2 時間 ィ ン キ ュ べ ー 卜 後活性を測定 し た 。
    [0073] (4) C M — セ フ ァ デ ッ ク ス
    [0074] 0.15 M 塩化 ナ 卜 リ ゥ ム を含む因子を 0.1M リ ン酸 緩衝液 （ PH 6.0 ) に 透析 し 、 同緩衝液で平衡化 し た 陽 ィ 才 ン交換樹脂 C M — セ フ ァ デ ッ ク ス （ フ ァ ルマ.シ ァ社 ） に かけ 、 素通 り 画分 と 1 M 溶出画分 と を採取 し こ れを凍桔乾燥に ょ り 簾縮 し て 、 リ ン酸緩衝液生理食 塩水 ( P H 7. 2 ) に 溶解後 , 活性を測定 し た o
    [0075] (5) 抗酸性 F G F ( 纖維芽細胞成長因子 ） 抗体処理
    [0076] 内皮細胞由来血管新生 因子 は 、 へパ リ ン ー セ フ ァ ロ ー ス か ら の溶出塩濃度が酸性 F G F に類似 し て ぃる可 能性が示唆さ れた ので 、 この物 に対する抗体を作製 し こ の抗体 に ょ っ て 因子の活性が中和 さ れるか否かを検 討 し た 。 すなゎ ち 、 酸性 F G F の ァ ミ ノ 末端 1 5個の ぺ プチ ド を合成 し 、 こ の ぺプチ ドを ゥ シ血清 ァルプ ミ ン に 水溶性カ ルポジィ ミ ドを用 ぃて結合さ せ 、 こ れを家 兎に免疫 し て 抗血清を得た 。 本抗血清を ゥ シ血清 ァル プ ミ ノ TO □ セ フ ァ ロ ー ス に通 し て 、 ゥ シ血清ァルプ ミ ン に対す る抗体を吸収 し た 。 こ の ょ ぅ に し た得 ら れ た in血清は 、 酸性 F G F の ぺプチ ド に の み特異的 に反応 す る こ と を E し I S A 法 （ 酸素抗体法 ） に ょ り 確認 し た 。 抗血清 は 50 %飽和硫酸ァ ンモニ ゥ ム沈殿処理を し て 、 ガ ンマグ ロ ブ リ ン 画分を得た 。 こ れを ァ フ ィ ゲル 1 0 ( パ ィ 才 ラ ッ ド社 ） に結合させ 、 抗体 カ ラ ムを作製 し 、 本 カ ラ ム に 血管新生因子を通過さ せ活性を測定 し た 。 対照 と し て正常家兎ガ ンマ グ ロ ブ リ ンを、 ァフ ィ ゲル 1 0に結合さ せた カ ラ ム を用 ぃた
    [0077] 結果は 図 4 に示す ょ に 、 内皮細胞由来の血管新生 因子 は酸 ， 熟 に 比較的安定な 、 卜 リ プシ ン感受性の ぺ プチ ド性の物質でぁ る こ と がゎか っ た 。 また 、 こ の 因 子 は C M - セ フ ァ デ ッ ク ス （ PH 6.0) に吸着 し な ぃ こ と 、 酸性 F G F の抗体で 中和さ れなぃ こ と が 明 ら か と な っ た 。 以上の桔果 は 、 こ の因子が既知 の 因子 と は 異な る物質でぁる こ と を強 く 示唆す る 。 実施例 6
    [0078] 中性条件下でのゲルろ過 に ょ る血管新生 因子の精製 D E A E— セ フ ァ セ ルで部分精製 し た 血管新生 因子 を 1.0M塩化ナ 卜 リ ゥ ムを 含む 50 mM リ ン酸緩衝液 （ PH 7.0) で平衡化 し た ス ー パ ー ロ ー ズ 12カ ラ ム （ フ ァ ルマ シ ァ社製 F P L C シス テ ム ） に ょ っ て 、 中性条件下で の 分子ふる ぃ を行な っ た 。 各画分の内皮細胞遊走活性を測 定 し た 結果、 図 5 に 示 し た如 く 活性 は分子量 30〜 70万の 髙分子頜域 に ぁ る と かゎ か っ た 。 PH 3.5の酸性条件下 で は 、 分子量 5 , 000〜 10 , 000の低分子域 に 活性が認め ら れる こ と ら 、 中性条件で は 、 こ の 因子 は結合タ ンパ ク と 複合体を形成 し て ぃ る可能性が示唆さ れた 。 実施例 7
    [0079] B A E培養上清に ょ る 肉芽形成促進
    [0080] ま ず 、 B A E培養上清の 20倍 S縮液を 、 等量の徐放性 ポ リ マ ー溶液 （ 10%ハ ィ ド ロ キ シプ ロ ピルセル ロ ー ス ） に 混和 し た 。 次 に 混合液 200 を 、 歯科用 綿球 （ 白 + Να 3 ) に 含浸さ せ風乾 し た 。 風乾 し た 綿球を 、 7 週令の ゥ ィ ス タ ー系雌性ラ ッ 卜 の肩甲骨皮下に 移植 し た 。 ー週 間後に綿球を取 り 出 し 、 綿球周囲 に 形成さ れた肉芽の重 量を測定 し た 。 対照 と し て 、 B A E 培養上清の代 り に M E M培養液を使用 し た綿球の重量を測定 し た 。 第 6 表に 示す ょ ぅ に 、 B A E 培養上清含浸綿球に は 、 対照綿球 に 比べ て 有意の 肉芽形成促進作用 が認め ら れた 。
    [0081] 第 6 表
    [0082] 実施例 8
    [0083] B A Ε 培養上清に ょ る創傷治瘛促進
    [0084] 親水軟膂 50 に対 し て 、 B A E 培養上清の 1 00倍濃縮 液 1 0 を練合 し て、 B A E 軟脔を作製 し た 。 創傷 は次 の ょ ぅ に し て作製 し た 。 7 週令の雌性 ゥ ィ ス タ ー 系ラィ 卜 の背部皮膚を脱毛 し 、 平ノ ミ で表皮を打ち抜 く 事に ょ り 長径 1 . 5 の切開創 を作製 し た 。 切開創の中央を 1 ケ 所縫合 し た 。 切 開創周辺に 50fl¾f の B A E 軟裔を塗布 し 、 3 日 後 と 6 日 後に 切 開創周迈の皮 «を 、 切開創 を中央に 短冊形 に 切 り 出 し た 。 創傷治瘛度 は 、 短冊片を上下か ら 引 っ ぱ っ た場合の 、 切開部が際解離す る ま で の 引 っ ぱ り 強度で ぁ らゎ し た 。 第 7 表 に B A E 軟育 に ょ る創傷治通 度を ΤΓί し た 。 B A E 軟育は 、 対照 に 比べて 明 ら か に 創傷 治應を促進 し た 。
    [0085] 実施例 7 と 8 の桔果は 、 内皮細胞培養上清 に創傷治癍 を促進す る因子が含 ま れて ぃ る こ と を示 し 、 血管新生 因 子が創傷治癒剤 と し て 開発可能な こ と を裏づける も ので ぁ る 。
    [0086] 第 7 表
    [0087] 実施例 9
    [0088] 各種誘起剤 に ょ る血管新生因子の誘導
    [0089] 実施例 1 と周様 に し て 、 但 し無血清 D M E M を添加 し て 再び培養を ¾cけ に際 し 、 各種の血管新生因子誘起剤 を含む無血清 D M E M を用 ぃ て 、 B A E の培養を行 っ た そ し て 血管新生 因子の誘導活性を 、 血管内皮細胞遊走試 験 に ょ り 測定 し た 。 第 8 表 に 示 す 50 < 、 こ れ ら の誘起剤 で血管内皮細胞を刺激す る こ と に ょ り 遊走活性が 、 無処 理の培養上清の みの ち の に 比較 し て 促進さ れる こ と がゎ か っ た 。 N - フ ォ ル ミ ル — ー メ チ 才 ニル 一 Δ — ロ ィ シ ル ー JI ー フ ェ ニル ァ ラ ニ ン に っ ぃ て は 、 i n v i v o の鶏卵 漿尿膜の試験 にっ ぃ て も検討 し た 結果 、 第 9 表 に示す如
    [0090] < F M L P 処理培養上清で は 、 血管新生因子 と し て の活 増強さ れて ぃ る こ と がゎか っ た 第 8 表
    [0091]
    [0092] 1. プロスタグランジン Ei
    [0093] 2. N—フォルミルー J —メチ才ニルー J —ロィシルー ilーフェニルァ ラニン
    [0094] 3. , 25—ジヒドロキシコレカルシフェロール
    [0095] 第 9 表 被 験 体 血管新生作用 陽性率 （％)
    [0096] + 土 ー 対 照 0 2 2 0
    [0097] FMLPのみ 2 3 33 培養上清 3 2 2 - 43
    [0098] FMLP+培養上清 2 1 '3 33
    [0099] FM LP処理培養上清 5 0 1 83 産業上の利用 可 能性
    [0100] 本発明の血管新生因子 は 、 血管の新生 を誘導する と ぃ ぅ 作用 が ぁ る 。 血管斩生 は 、 血栓形成部位ゃ動脈硬化部 位な ど の耝耰修復， 再生 に ぉ ぃ て 、 特 に重要な役割 を果 し て ぃ る 。 従 っ て 、 本発明 の血管新生因子 は 、 多 く の毛 細血管 に作用 し 、 虚血性疾患等の有効な治療薬 と な る可 能性が示唆れさ る 。 他方 、 臓器移植を は じ め と す る外科 的大手術での傷ロ の嫁復ゃ移植臟器の生着は 、 その部位 で の血管新生能 に依存 し て ぉ り 、 本発明の血管新生 因子 は 、 こ の ょ ぅ な創傷治療薬 と し て の可 能性も考ぇ ら れる
    权利要求:
    Claims請 求 の 範 囲
    1 . 血管内皮綑胞に ょ っ て 産生 さ れ得る 、 そ し て へパ リ ン固定化 ァガ ロ ー スゲルに吸着 し かっ 0.7M 〜 1.0M の塩化ナ 卜 リ ゥ ムで溶出さ れる 、 ま た ジ ェ チル ァ ミ ノ ェ チル陰ィ 才 ン交換体 に吸着 し かっ 0.2M 〜 0.4M 塩 化ナ 卜 リ ゥ ムで溶出 さ れる と ぃ ぅ 性質を有する 、 分子 量が約 5 , 000〜 10, 000の血管新生因子 。
    2 . 卜 リ プシ ン感受性のぺプチ ド と し て の性質を有す る 請求の範囲第 1 項記載の血管新生因子。
    ' 3 . 血管内皮細胞を無血清培養 し た培養上清を へパ リ ン 固定化 ァガ ロ ー スゲル に かけ 、 そ の吸着画分を 0.7M 〜 1.0M の塩化ナ 卜 リ ゥ ムで溶出 さ せる こ と を特徴 と す る血管新生 因子の製造方法。
    4 . 血管内皮細胞を無血清培養 し た培養上清を ぺパ リ ン 固定化 ァガ ロ ー スゲル に かけ 、 そ の吸着画分を 0.7M 〜 1.0 M の塩化ナ 卜 リ ゥ ムで溶出さ せ 、 次ぃで該溶出 物 を ジ ェ チル ァ ミ ノ ェ チル陰ィ ォ ン交換体に かけ 、 そ の吸着画分を 0.2M〜 0.4M塩化ナ 卜 リ ゥ ムで溶出 さ せる こ と を特徴 と す る血管新生因子の製造方法 。
    5 . 無血清培地に 、 血管新生 因子の産生を誘導する誘起 剤 を 10 〜 10— 11 M 添加 す る こ と を特徴 とす る 、 請求の 範囲第 3 項又は 4 項記載の血管新生因子の製造方法 。
    6 . 誘起剤 がプ ロ ス タ グラ ン ジ ン又はそ の誘導体で ぁ る 請求の範囲第 5 項記載の血管新生 因子の製造方法 。. 誘起剤が 白 血球遊走活性を有する細菌由来ぺ プチ ド で ぁ る 、 請求の範囲第 5 項記載の血管新生 因子の製造 . 誘起剤が活性型 ビ タ ミ ン D で ぁ る 、 請求の範囲第 5 項記載の 血管斩生因子の 製造方法 。
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    EP0248088A1|1987-12-09|
    AU597323B2|1990-05-31|
    EP0248088A4|1988-05-03|
    AU6731887A|1987-07-01|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1987-06-04| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AU JP US |
    1987-06-04| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CH DE FR GB IT NL SE |
    1987-07-10| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1986906937 Country of ref document: EP |
    1987-12-09| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1986906937 Country of ref document: EP |
    1990-06-07| WWW| Wipo information: withdrawn in national office|Ref document number: 1986906937 Country of ref document: EP |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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