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    公开号:WO1986000932A1
    申请号:PCT/JP1985/000408
    申请日:1985-07-19
    公开日:1986-02-13
    发明作者:Hajime Yoshizumi；Teruo Amachi；Takaharu Tanaka；Kyoichi Ogura；Sumio Asami；Hiroshi Ishigooka；Masahiro Nakao
    申请人:Suntory Limited；
    IPC主号:C12P7-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書
    [0002] 発酵法による脂肪酸の製造方法 技 術 分 野
    [0003] 本発明は、 工業製品、 医薬、 香料、 化粧品の製造等、. 広範 な化学工業において使用されている脂肪酸の製造方法に関す る。 背 景 技 術
    [0004] 現在、 工業原料として用いられている脂肪酸の製造方法と して、 バラフィ ン類を酸化して高級脂肪酸を合成する方法、 精製した天然油脂を高圧分解法、 ト イ ッチュル分解法等非酵 素的方法により分解する方法、 及び天然油 旨をリパーゼ製品 により酵素的に分解する方法等が知られている。
    [0005] しかしながらバラフ ィ ン類を酸化して合成する方法には製 品品質上の問題がある。 天然油脂を非酵素的に分解して脂肪 酸を製造する方法においては、 一旦生成した脂肪酸や原料油 脂中に含まれていた不純物が分解し、 又はこれらが相互に反 応して種々の不純物が生成し、 このために製品脂肪酸が毒性. 刺激性、 着色、 臭気等を有し、 従ってこれを医薬、 化粧品等 の製造に安全に使用することはできない。 他方、 油脂をリバ —ゼで分解して脂肪酸を製造する方法においては、 反応が穩 和な条件で行われ、 しかも油脂のみが特異的に分解され、 従 つて反応中に有害不純物が生成しな _いので、 高純度の脂肪酸 を製造するのに有利な方法であると考えられる。 wweo/ua ^
    [0006] しかしながら、 リバーゼ製品は比較的高価であり、 しかも 従来のリバーゼを使用した場合油脂が完全に加水分解されず. その結果モノ グリ セ リ ド及びジグリ セ リ ドが残留して脂肪酸 収率が低いため、 リ バーゼ分解法は経済的不利益を有してい た。 このよう な経済的欠点を解决する手段の 1 つと してリバ ーゼを用いて油脂類を分解する際に、 分解反応系に水に不溶 性の有機瑢媒を添加する こ とにより リパーゼの使用量を低減 せしめる方法が提案されている （特開昭 59-91889) 。 しかし ながら、 この方法は必ずしも実用的とは言えない。
    [0007] 10
    [0008] 発明の開示
    [0009] この発明は、 従来技術の リパーゼ分解法が有する上記のよ う な欠点を有しないリパーゼ分解法による脂肪酸の製造方法 を提供する ものであり、 特に、 モノ グリ セリ ドゃジグリ セ リ
    [0010] 15 ドを残留せしめる こ とな く ト リ グリ セ リ ドを実質上完全に脂 肪酸とグリ セ リ ンとに分解する酵素を使用する こ と、 及び該 酵素を最も柽済的な方法で使用するこ とに向けられる。
    [0011] 上記の問題点は、 スタフ ィ ロコ ッカス (Staphylococcus )属 に属し、 リパーゼを生産する こ とができる細菌を油脂類を舍
    [0012] 20 有する培地に培養し、 又は該細菌を培地に培養しその中途に おいて油脂類を添加し、 そして培養液から脂肪酸を採取する こ とを特徴とする脂肪酸の製造方法により解決される。
    [0013] 本発明の方法によれば、 油脂類が実質上完全に加水分解さ れモノ ダリ セラ.ィ ド及びジグリ セライ ドが残留しないため、
    [0014] 25 常用の方法に比べて経済的に脂肪酸を製造する こ とができる 図面の簡単な説明
    [0015] 第 1図はこの発明の方法 （実施例 1 ) により製造された脂 肪酸のガスク ロマ トグラムであり、 図中 1 はォ レイ ン酸、 2 はパルミチン酸、 そして 3 はリ ノ ール酸のビークをそれぞれ 示す。
    [0016] 第 2図はこの発明の方法 （実施例 2 ) により製造された脂 肪酸のガスク ロマ トグラムであり、 図中 1、 2 、 及び 3 はそ れぞれ第 1図の場合と同じである。
    [0017] 第 3図及び第 4図はスタ フ ィ 口コ ッカ ス · キ ヤ ビテイ スの 各種の菌株を用いてこ の発明の方法によりオ リ一ブ油を加水 分解した場合の分解生成物を示す薄層ク ロマ トグラムである < 第 5図はスタフ ィ ロコ ッ カス · ェビデルミデイ スの各種の 菌株を用いてこの発明の方法によりオリ ーブ油を加水分解し た場合の分解生成物を示す薄層ク ロマ トグラムである。
    [0018] 第 6 図はスタフ イ ロコ ッカス · ァウ レウスの各種の菌株を 用いてこの発明の方法により オ リ一ブ油を分解した場合の分 解生成物を示す薄層ク ロマ トグラムである。
    [0019] 第 7図及び第 8図はスタ フ ィ ロコ ッカ ス · キ ヤ ピテ イ スの 各種の菌株由来のリパーゼを用いて ト リ オ レイ ンを分解した 場合の生成物を示す薄層ク ロマ トグラムである。
    [0020] 第 9図は各種の市販リバーゼを用いて ト リ オ レ イ ンを分解 した場合の生成物を示す薄層ク ロマ トグラムである。 発明を実施するための最良の形態
    [0021] 微生物
    [0022] この発明の方法においては、 スタフィ ロコ ッカス属に属し リパーゼを生産するこ とができる細菌を使用する。 このよう な細菌と して、 例えばスタ フ イ ロコ ッ カス · キヤ ビテイ ス staphylococcus capitis) 、 スタ フ イ ロ コ ッ カ ス ' ェ ビデ ノレミ テ ィ ス (Staphylococcus epidermidis)ヽ スタ フ ィ πコ ッ カス · ァ ゥ レウ ス (Staph lococcus aureus) 等を使用する こ とができる。 シユー ドモナス (Pseudonionus) 属の細菌由来の リ 'ーゼ、 リ ゾプス（Bhizopus)属の糸状菌由来のリ バーゼ、 キ ャ ンデ ィ ダ (Candida) 属の酵母由来のリパーゼ等を使用し て ト リ グリ セ リ ドを分解した場合、 分解物と してかなり の量 のモノ グリ セ リ ド及びジグリ セ リ ドが生成し、 このために脂 肪酸の収率が低下する。 これに対してスタフ イ ロコ ッカス属 の細菌に由来する リパーゼにより ト リ ダリ セ リ ドを分解した 場合、 ジグリ セ リ ドはほとんど生成せず、 モノ グリ セ リ ドは 生成するとしてもその量は極めて少ない。 特に、 スタフ イ ロ コ ッカス ' キヤ ピチ イ ス由来の ーゼで ト リ グリ セ リ ドを 分解した場合、 モノ グリ セ リ ド及びジグリ セ リ ドは実質上全 く生成しない。 従って、 この発明の方法に使用する微生物と してはスタフ イ ロコ ッカス · キ ヤ ビテイ スが最も好ま しい。 この発明の方法に使用する こ とができるスタフ ィ ロコ カ ス ♦ ァ ゥ レウスの菌株と しては例えば IAM 1011株、 IAM 1098 株、 IAM 12082 株等を挙げる こ とができる。 また、 スタフ ィ ロコ ッカス ' キヤ ビテイ スの菌株と しては例えば ATCC 27840 株、 ATCC 27841株、 ATCC 27842株、 ATCC 27843株、 T-l-1株 (SAM 0001)等を挙げるこ とができ る。 これらの微生物の内、 符号 " IAM - を有する微生物は東京大学応用微生物研究所 ： 東京都文教区弥生 1 — 1 — 1 (Institute of Applied Micro- biogy, the University of Tokyo ; 1 - 1 ayo i 1 - chome , Bunkyo -ku, Tokyo, JAPAN)に保存されており容易に入手する こ とが できる。 また符号 " ATCC " を有する微生物はァメ リ カ ン ' タ ィ プ · カノレチユア · コ レク シ ョ ン（American Type Culture Collection) 〔12301 パー ク ラ ウ ン · ドラ イ ブ · ロ ッ ク ビル ' メ リ ー ラ ン ド 20852 · 米国 ； （12301 Parklawn Drive,
    [0023] Rockville, Maryland 20852, U.S.A.) 〕 に保存されており容 易に入手する こ とができる。
    [0024] 前記のスタ フ ィ ロ コ ッ カ ス · キ ヤ ビテ イ ス T-1-1株（SAM 0001) は本発明者等がヒ トの頭皮から分離した新菌株であつ て次のよう な性質を有する。
    [0025] ( A) 形 態
    [0026] (1) 大きさ ； 直径 0. 8 〜 1. 2 mの球菌、 2 〜 4偭集つ て存在。
    [0027] (2) 運動性 ； なし。
    [0028] (3) 胞子形成 ； 観察されず。
    [0029] (4) グラム染色性 ； 陽性。
    [0030] (5) 抗酸性 ； なし。
    [0031] ( B ) 生育状態
    [0032] (1) 肉汁寒天平板培養 ； やや凸状、 円形、 表面平滑、 不 透明白色のコ ロ ニーを形成。 コ ロニーは小さ く 、 径 1 〜 3 m/m である。
    [0033] (2) 肉汁液体培養 ； 生育良好、 液全体が混濁。
    [0034] (3) 肉汁ゼラチン穿剌培養 ； ゼラチンを液化せず、 線状 に生育。
    [0035] (4) 肉汁寒天斜面培養 ； やや凸状、 表面平滑。 不透明白 色。 生育良好。
    [0036] (5) リ ト マス ミ ルク ； 色調変化せず。 凝固又は液化を認 めず。
    [0037] (6) メ チルレ ッ ド （MR) テス ト ； 陽性。
    [0038] (7) フォ ーゲス ' プロスカ ウ エル （VP) テス ト ； 陽性。
    [0039] (8) イ ン ドール生成 ； なし。
    [0040] (9) 硫化水素生成 ； なし。
    [0041] (10) デンプン分解能 ； な し。
    [0042] (11) ク ェ ン酸利用能 ； コ ーザ一 · ク リ ステ ンセ ン反応陽 性。
    [0043] (12) 無機窒素源利用能 ； 硝酸塩を利用するが、 ア ンモニ ゥム塩を利用せず。
    [0044] (13) 色素産生能 ； なし。
    [0045] (14) ゥレアーゼ反応 ； 陰性。
    [0046] (15) ォキシダーゼ反応 ； 陰性。
    [0047] (16) カ タ ラ ーゼ反応 ； 陽性。
    [0048] (17) 生育範囲 ； PH 5〜 9、 温度 20'c〜40て最適生育温度
    [0049] 32で 〜 35で 。
    [0050] (18) 酸素要求性 ； 通性嫌気性。
    [0051] (19) 糖利用能 ； 酸生成 （ + ) ； D —グルコ ース、 D — フ ラ ク ト ース、 D —マ ンノ ース、 シユ ーク ロ ース、 グ リ セ リ ン
    [0052] 酸、 ガス生成 （一） ； D —ガラ ク ト ース、 D —キ シ ロ ース、 L ーァ ラ ビノ ース、 マル ト ース、 ラ ク ト ース、 ト レノヽロ —ス、 D — ソノレビ ッ ト、 イ ノ シ ッ ト、 デンプン。
    [0053] D— グルコ ースから乳酸を生成。
    [0054] (20) 耐塩性 ； あり （10〜20%の食塩水中生育） 。
    [0055] (21) リパーゼ活性 ； あり。
    [0056] (22) レシチナーゼ活性 ； あり。
    [0057] (23) コアグラ一ゼ活性 ； なし。
    [0058] (24) フ ォ スフ ァ ターゼ活性 ； なし。
    [0059] (25) デォキ シ リ ボヌ ク レアーゼ活性 ； あり 。
    [0060] こ の微生物スタ フィ ロコ ッカ ス · キ ヤ ピテ イ ス T- 1-1 (SAM 0001) は通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所 （茨城 県筑波郡谷田部町東 1 丁目 1番 3号） 〔 Fermentation
    [0061] Research Institute Agency of Indus rial Science and' Technology Ministry of International Trade and Industry l-1 - 3Ya tabe- cho H i gash i , Tsukuba- gun, Ibaraki -ken, Japan) に微ェ研菌寄 第 7723号 （FERM P-7723)として 寄託されている。 なお、 この微生物は、 1985年 7月 1 1 日に 微ェ研条寄第 834号（FERM BP-834) としてブタぺス ト条約に 基く国際寄託に移誉された。 培養および反応
    [0062] この発明に従えば、 前記の細菌が生産する リバ―ゼによつ て油脂類を分解して脂肪酸を生成せしめる.。 分解方法の態様 として例えば次の方法を使用することができる。
    [0063] ( 1 ) 前記の細菌が増殖することができる培地に原料となる 油脂をまず導入し、 こ の培地に前記の細菌を接種して、 そし て細菌の増殖と併行して油脂の分解を行う。
    [0064] (2) 前記の細菌が增殖することができる培地に前記の細菌 をまず增殖せしめ、 次にこの培地に原料油脂を添加し、 引き 繞き培養を行い、 そして培養と併行して油脂の分解を行う。 前記（1 ) の方法においては、 原料油脂のすべてを最初に培 地に加えることができるが、 まず最初に油脂の一部分を培地 に加えて培養を開始し、 その後細菌の増殖とすでに加えた油 脂の分解の程度を監視しながら残りの油脂を連続的又は段階 的に加えることができる。
    [0065] '前記（2) の方法においても、 前記（1 ) の場合と同様、 原料 油脂を 1度に添加することもでき、 又は段階的もしく は連繞 的に添加することもできる。 これらの場合において、 油脂を 添加する （又は添加を開始する） 時期としては、 例えば細菌 が增殖を開始した培養初期でもよ く、 又細菌の増殖がほぼ終 了した時期でもよ く 、 これらの中間の任意の時期であっても よい。
    [0066] この発明の方法においては、 前記の細菌が増殖し、 そして リパーゼを生産することができる任意の培地を使用すること ができる。 培地中の炭素源として例えばグルコ ース、 フ ラ ク トース、 シユーク ロース、 又はグリ セロールなどを単独で又 は組合わせて使用することができ、 窒素源としてはカゼィ ン - 大豆などに由来する種々のペプ ト ン、 又は酵母エキスなどを 単独で又は組合わせて使用することができる。 リ ン酸塩、 マ グネシゥ ム塩、 マ ンガン塩や食塩などの無機塩類、 あるいは 各種ビタ ミ ン類など菌の生育を促す化合物をさ らに添加して もよい。
    [0067] 培養にあたっては、 あらかじめ油脂を舍まない液体培地を 用いてこの発明の細菌を前培養した接種培養物を、 油脂を舍 有するか又は舍有しない本培養用培地に接種して本培養を行 なう。
    [0068] 培養及び反応の条件は、 使用する菌株によって異なるが、 20 'c〜40て、 好ましく は 30 'c〜37 'C の温度、 培地中 PH 5. 0〜 9. 0、 好ましく は 6. 0〜 7. 0 とし、 通気 ' 攪拌 · 振とう等に よる好気的条件下で、 液体培養するのが好ましい。
    [0069] 培養時間は、 最初から油脂を加えて培養を行う場合は約 20 〜70時間であり、 培養の中途において油脂を加える場合は、 油脂の添加が終了した後さ らに油脂が完全に分解するまで培 養を继続し、 又は培養と同様な条件で反応を継铙する。
    [0070] こ の発明の方法に使用する油脂は、 グリ セライ ドを含有す るものであれば、 なんでもよ く、 植物性油脂、 例えばオリ ー ブ油、 ヤ シ油もし く はヒマ シ油、 動物性油脂、 例えば牛脂も しく は鲸油又はこれらの混合物を使用することができる。 油 脂の添加量は、 培地中に生成されるリバ一ゼのカ価等により 異なるがおよそ 0. 5〜 5. 0 (v / v) %とするのが好ま しい。
    [0071] 10 脂肪酸の採取
    [0072] 本発明によって、 脂肪酸は培養液中に蓄積する。 この脂肪 酸は培養液を濾過あるいは遠心分離して除菌した後得られる 培養液上澄より常法に従い、 例えば抽出、 分別結晶法、 カ ラ
    [0073] 5 ムク ロマ トグラフ ィ ー等により簡単に精製できる。
    [0074] 遊離脂肪酸の培養上澄からの抽出は酢酸ェチル、 ク ロ ロホ ルム、 ベンゼン等極性が低く 水と混ざり合わない有機溶媒を 用いて行なう。 抽出後溶媒を減圧溜去し、 残渣をメ タノ ール 等のアルコ ールと混合撹拌するこ とによ り脂肪酸はアルコ ー 10 ル層に移行するが、 油脂は残留する。 このよう にして得られ た未分解の油脂を含有しないアルコ ール可溶性画分からの脂 肪酸の精製は圧搾法、 分別結晶法、 液 · 液抽出法等によつて 行なう事ができる。 さ らに、 シ リ カゲル等を用いた順相カ ラ ムク ロマ ト グラフ ィ ーあるいは RP— 18等を用いた逆相カ ラム 15 ク ロマ トグラフィ ーによっても锖製を行なう事ができる。
    [0075] 次に、 実施例によ り こ の発明をさ らに具体的に説明する。 実施例 1. スタ フ ィ ロ コ ッ カ ス · キ ヤ ビチ イ スを用いる脂肪 酸の製造 ； 油脂を最初に添加する変法
    [0076] 200ηιί .の Ρ培地 〔酵母エキス 0. 5 % (w/v)、 ボ リ ペプ ト ン 20 (ペプ ト ン ： 武田薬品製） 1 % (w/v)、 グルコ ース 0. 1 %
    [0077] (w/v)、 NaCi 0. % ( /v) . pH 6. 3 ] を 500m 容のフ ラ ス コに入れ、 120でにて 1 5分間殺菌した。 このよう にして調 製した 3本のフ ラスコ にスタ フ イ ロ コ ッ カ ス . キ ヤ ビテ イ ス T-1-1 を接種し、 3 0 'Cにて 2 4時間 240rpmにて回転振と う 25 培養を行い接種用培養物を得た。 AFFペプ ト ン （大豆蛋白質加水分解物、 味の素製） 5 % ( w/ v)、 NaC i 0. 5 % ( w/ v)、 PH 6. 3を含有する培地 3 0 £ を 5 0 ί容ジャ ーフ ァ ーメ ンタ ーに入れ 120 *c にて 2 0分間 殺菌した。 この培地に前記の接種用培養物を加え、 さ らにあ らかじめ 120 'C にて 1 5分間殺菌しておいたォリ ーブ油 300 πι £ を加えた。 3 0 'C にて 3 0時間、 300 rpmの攪拌及び 1. 0 vvm の通気の下で培養を行った。
    [0078] 得られた培養物は遠心分離により除菌した。 上澄液に 3 0 の酢酸ェチルを加え、 1時間攬拌した。 攪拌後 1時間静置し て相分離した。 酢酸ェチル層を取り、 減圧濃縮乾固して残渣 を得た。 この残渣に 3 のメ タノ ールを加え、 5 ででー晚攪 拌した。 これを遠心分離してメ タノ ール層を得、 このメ タノ 一ル相を減圧濃縮乾固し、 残渣を 2 の n -へキサ ンに溶解 した。 n -へキサ ン溶液を減圧濃縮乾固し、 残渣を 100 m の ベンゼンに溶解し、 シ リ カゲルカ ラム（5 X 55 on ) の上にのせ た。 カ ラムを 1 のベンゼンで洗い、 2 のベンゼン · ク ロ πホルム 1 ： 1混合溶液で溶出した。 次に 3 のク ロ口ホル ムで溶出し、 この画分より混合脂肪酸 100 gが得られた。 上記方法で得られた本混合脂肪酸のガスク ロマ トグラムを 図 1 に示す。
    [0079] 上記方法で得られた本発明物をシリ 力ゲルク ロマ トグラフ ィ 一に上記と同条件で再度付し、 ォ レイ ン酸画分を集めるこ とにより、 ォレイ ン酸 7 6 gが得られた。 実施例 2. スタフ ィ ロ コ ッ カス · キヤ ピテ イ スを用いる脂肪 酸の製造 ； 油脂を培養後に添加する変法 スタ フイ ロコ ッカ ス · キ ヤ ビテ イ ス （ATCC-27840) を、 実 施例 1 と同様に 200πι£ の Ρ培地で回転振盪培養した。 1 4 容ジャ ーフ ァ ーメ ンタ一中に実施例 1 と同様の本培養用培地 7 &を入れ、 あらかじめ 120で、 1 5分間加圧滅菌した。 こ の培地中へ、 前記の前培養液を加え、 3 0 て にて 2 4時間、 300rpm、 2. 0 vvm で攪拌通気培養を行なった。 得られた培養 液に 100 のオリ —ブ油を加えて、 3 0 でにて 1 2時間、 300rpmで攪拌を行なった。 得られた結果物を実施例 1 に準ず る方法で精製を行ない、 混合遊離脂肪酸 3 8 gが得られた。 上記方法で得られた本発明物質のガスク ロマ トグラムを図 2 に示す。
    [0080] 実施例 3. スタフイ ロコ ッカス属の各種の菌株を用いるオ リ ーブ油の分解
    [0081] 1 0 % AFFぺブト ン培地（AFFぺプ ト ン 1 0 %及び NaC 0.5 %) に 1 %のオリ ーブ油を加え、 これに次の菌株を接種して 3 0 'c にて、 3 日間振とう培養した。
    [0082] (1) スタ フ イ ロ コ ッ カ ス（St. ) ' キ ヤ ビテ イ ス ATCC 27840 (2) St. キ ヤ ビテ ィ ス. ATCC 27841
    [0083] (3) St. キ ヤ ピテ イ ス ATCC 27842
    [0084] (4) St. キ ヤ ビテ イ ス ATCC 27843
    [0085] (5) St. キ ヤ ビテ イ ス T-1-1 (FERM P-7723)
    [0086] (6) St. ァゥ レウス IAM 1011
    [0087] (7) St. ァゥ レウス IAM 1098 (8) St. ァゥ レウ ス IAM 12082
    [0088] (9) St. ェ ビデルミ デ イ ス Να 2
    [0089] (10) St. ェ ビデルミ ディ ス Να 3
    [0090] (11) St. ェ ビデルミ デ イ ス Να 5
    [0091] (12) St. ェ ビデル ミ デ イ ス α 8
    [0092] (13) St. ェ ビデル ミ デ イ ス Να 1 1
    [0093] 培養 2 日目及び 3 日目にサ ンプルを採り、 ク ロロホルムで 脂肪酸を抽出し薄層クロマ トグラフィ ーによ り脂肪酸組成を 調べた。 薄層ク ロマ トグラフ系は次の通り とした。
    [0094] 溶媒系 ： ク σ 口ホルム アセ ト ン （96 ： 4 ) 。
    [0095] 発 色 ： 1 % C e(S04) 2 / 1 0 % HzS04. 加熱。
    [0096] 薄層板 ： シリ カゲル Kieselgel 60 F 254
    [0097] (Merk 社製） 。
    [0098] この結果を第 3図〜第 6図に示す。 この図から明らかな通 り、 いずれの菌株においてもジグリセリ ド （ 1 , 3 —ジォレ イ ン及び 1 , 2 — ( 2 , 3 —） ジォレイ ン》 は検出されず、 モノ グリ セリ ド （モノォレイ ン） もほとんど検出されず、 脂 肪酸 （ォレイ ン酸） が主とし生成した。
    [0099] 実施例 4. スタフ ィ ロ コ フ カス属の各種の菌株からのリ パー ゼ及びその他の微生物由来リバーゼによる ト リオ レィ ンの分解
    [0100] 例 3 に記載したのと同様にして （但し培地にオリ —ブ油を 加えない） 、 例 3 に記載したスタフイ ロコ ッカ ス属細菌を培 養し、 培養後遠心分離により菌体を除去し、 上清液を得、 こ れを酵素液として使用した。 この酵素液のリバ—ゼカ価は次 の通りであった α 株 リバーゼ活性
    [0101] ( U / m£ ) スタ フ イ ロ コ ッ カ ス ' キ ヤ ビテ イ ス
    [0102] 1 A T C C 2 7 8 4 0 1 1. 7
    [0103] 2 A T C C 2 7 8 4 1 1 3. 5
    [0104] 3 A T C C 2 7 8 4 2 4. 6
    [0105] 4 A T C C 2 7 8 4 3 1 2. 4
    [0106] 5 T一 1 — 1 6. 1
    [0107] スタ フ イ ロ コ ッ カ ス · ァ ゥ レウス
    [0108] 6 I A Μ 1 0 1 1 3. 2
    [0109] 7 I A M 1 0 9 8 1. 0
    [0110] 8 I A M 1 2 0 8 2 2. 1
    [0111] スタ フ イ ロ コ ッ カ ス · ェ ピデルミ デ ィ ス
    [0112] 9 Να 2 2 1. 0
    [0113] 1 0 Να 3 9. 4
    [0114] 1 1 Να 5 2 1. 9
    [0115] 1 2 Να 8 1 0. 1
    [0116] 上記のリパーゼカ価は次のようにして測定した。
    [0117] 試験管 （ ø 25 X 200mra)中に 2 5 tn Tris-HC^ 锾衝液 （ pH 8. 0 ) / 1 0 mM CaC ί 2 5m の反応媒体にォリ ーブ油 lm JZ を 添加し、 ミキサーで激し く撹拌し、 酵素液 0.5m を加える。 この試験管を毎分 300回転の速度で往復振とう しながら 30で にて 3 0分間反応を行う。 その後、 2 Ο ι ^ のエタノ ールを 加えて反応を止め、 生成脂肪酸を 0.05 N水酸化ナ ト リ ウム水 溶液で滴定する。 比較値は上記組成の反応液にエタノ ールを 加えた後に酵素液を加えたものを同様に滴定して求める。 リ パーゼ活性の単位（Uni t)は、 国際生化学連合（I . U. B) の酵素 委員会の提案に従い、 上記の反応条件で 1分間に 1 moleの 脂肪酸を遊離する活性を 1 Unitと定める。
    [0118] 次に、 各酵素液につき、 リパーゼカ価が 3 Uni t以下のもの を除き、 力価が 3 となるように稀釈した。
    [0119] 他方、 比較のため市販の酵素橒品 （ベーリ ンガーマ ンハイ ム社） を用いて、 これを力価が 3. 0 Uノ mi となるように溶 解して酵素液を調製した。 酵素標品と しての次の 3種類を用 いた。
    [0120] (1) リ ゾブス · アルヒズス (Rhizopus arrhizus)由来のリ' ノヾ ゼ
    [0121] (2) キ ャ ンディダ . シ リ ン ド ラ セ一（Candida cy 1 indracea) 由来のリパーゼ
    [0122] (3) シュー ドモナス sp. (Pseudomonas s p . )由来のリノヾ ー ゼ。
    [0123] 酵素液の調製にあたっては、 前記の酵素標品（1) および（2) については 0.1 MOPS - HCi 缓衝液 （pH 6. 0 ) を使用し、 （3) については 2 5 mM Tris-HCi 缓衝液 （pH 8. 0 , lOmM CaC SL 2) を使用した。
    [0124] こ の発明の培養液から得た酵素液については、 3 U / H の リ パーゼを舎有する酵素液 1 mjg に ト リ オ レイ ン 1
    [0125] を加えて 3 0 でにて振とう し、 0分、 10分、 30分、 60分、 及 r KJ οο/υυ^ J 85/00408
    [0126] 16 び 120分後にサンプリ ングし、 これをク ロ口ホルムで抽出し、 ク ロ口ホルム相 2 & を例 3 に記載した薄層ク ロマ トグラフ ィ 一により分折した。 市販酵素標品については、 3. 0 U / m £ の酵素液 1 πι £ を使用したほか、 上記と同様とした。
    [0127] 結果を第 7図〜第 9図に示す。 この図から明らかな通り、 巿販酵素により ト リ オレイ ンを分解した場合、 かなりの量の モノ ォ レイ ン及びジォ レイ ンが生成したが、 この発明のスタ フイ ロコ ッカス由来の酵素を使用した場合、 これらの生成が 極めて少なく 、 特にスタフィ ロコ ッカス · キヤビテイ ス由来
    [0128] 10 の酵素を使用した場合には、 モノォレイ ン及びジォレイ ンが 全く検出されなかつた。 産業上の利用可能性
    [0129] この発明は、 純度の高い脂肪酸を工業的規模で経済的に製
    [0130] 15 造するために有用である。
    权利要求:
    Claims請 求 の 範 囲
    1. スタ フ イ ロ コ ッ カ ス (Staphylococcus)属に属し、 リ ノヾ ーゼを生産することができる細菌を油脂類を舍有する培地に 培養じ、 又は該細菌を油脂類を舍有しない培地にて培養を開 始しその中途において油脂類を添加し、 こう して培養液中に 脂肪酸を生成せしめ、 そして培養液から脂肪酸を採取するこ とを特徴とする脂肪酸の製造方法
    2. スタ フ イ ロ コ ッ カ ス属の細菌がスタ フ イ ロ コ ッ カ ス ' 千 ャ ピティ ス （Staphylococcus capitis)である請求の範囲第 1項記載の方法。
    3. スタ フ イ ロ コ ッ カ ス ' キ ヤ ビテ イ ス (Staphylococcus capi tis)細菌がスタ フ ィ ロ コ ッ カ ス · キ ヤ ピテ イ ス
    (Staphylococcus capi tis) T-l-1 (SAM 0001) (FERM P-7723) (FERM BP-834) である請求の範囲第 2項記載の方法。
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
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    JPH0527383B2|1993-04-21|
    EP0188628A1|1986-07-30|
    JPS6128397A|1986-02-08|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1986-02-13| AK| Designated states|Designated state(s): US |
    1986-02-13| AL| Designated countries for regional patents|Designated state(s): AT BE CH DE FR GB IT LU NL SE |
    1986-03-14| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1985903697 Country of ref document: EP |
    1986-07-30| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1985903697 Country of ref document: EP |
    1990-11-15| WWW| Wipo information: withdrawn in national office|Ref document number: 1985903697 Country of ref document: EP |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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