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    • 专利摘要:
    真核細胞的編碼蛋白質的傳訊核糖核酸以及非編碼微型核糖核酸係由第二型核糖核酸聚合酶(pol-2)而非原核的核糖核酸聚合酶自然轉錄而來。因此，現今係以融合瘤或哺乳細胞的真核第二型聚合酶啟動子(pol-2)或細菌細胞的原核啟動子來進行真核核糖核酸與蛋白質的製造。然而，由於原核細胞的核糖核酸轉譯係為傾向容錯(error-prone)的，因此頻繁的變異係成為重大的問題。另一方面，融合瘤或哺乳細胞的培養相對來說在人力與金錢上的支出較高。為克服上述問題，本發明提供一新穎的可誘導的組成物以及方法，以在生長快速的細菌內直接藉由第二型核糖核酸聚合酶驅動之基因表現來製造真核核糖核酸及/或其相關肽類/蛋白質，而無轉換成原核啟動子或培養融合瘤/哺乳細胞之需要。所獲得之該等核糖核酸與肽類/蛋白質可用於藥物開發、疾病治療、腫瘤/癌症治療、製造多能性幹(iPS)細胞、促進傷口癒合，以及食物的製造。
    公开号:TW201321507A
    申请号:TW101129191
    申请日:2012-08-13
    公开日:2013-06-01
    发明作者:Shi-Lung Lin；Donald C Chang
    申请人:Mello Biotechnology Inc；
    IPC主号:C12N15-00
    专利说明:
    用於在原核細胞內使用真核第二型聚合酶啟動子驅動之轉錄作用的可誘導之基因表現組成物及其應用
    本發明係有關於一組成物以及該組成物在原核細胞內藉由真核核糖核酸啟動子驅動之轉錄作用製造核酸(RNAs，即傳訊核糖核酸(messenger RNAs)與微型核糖核酸(microRNAs))及/或蛋白質/肽類(即抗體與酵素)的應用。具體而言，本發明教示一組成物以及使用該組成物在細菌細胞內藉由真核第二型(type II)核糖核酸聚合酶(pol-2)啟動子驅動之轉錄作用製造核糖核酸及/或蛋白質/肽類。另一方面，本發明亦包含一可誘導的基因表現組成物，使用化學媒介物而非抗生素以引發原核細胞內真核核糖核酸啟動子驅動之轉錄作用。本發明之新穎性在於誘導原核細胞發生快速的適應作用，以使用真核第二型聚合酶(pol-2)啟動子來直接表現想要的核糖核酸及/或蛋白質/肽類，而無轉換成傾向容錯(error-prone)的原核啟動子、或培養融合瘤或哺乳細胞的需要，其中融合瘤或哺乳細胞的培養需要較多的人力與金錢支出，以及在於增進原核細胞轉錄的閱讀保真性(reading fidelity)。所獲得的核酸與蛋白質/肽類可用於藥物開發、疾病治療、腫瘤/癌症治療、製造多能幹(iPS)細胞、促進傷口癒合，以及提供食物。
    本領域熟習技藝者由現今教科書之教示而清楚認識到原核與真核轉錄機制之間差異的存在，且彼此間具有不相容性。舉例來說，依據現有的了解，真核核糖核酸聚合酶(RNA polymerase)不會與啟動子序列直接結合，而需要附加的輔助蛋白質來起始轉錄；反之，原核核糖核酸聚合酶為一功能完全的酵素(全酶，holoenzyme)，其直接與啟動子序列結合以起始轉錄。本領域熟習技藝者亦通常知道真核的傳訊核糖核酸係由第二型核糖核酸聚合酶(type II RNA polymerase，pol-2)在細胞核內進行合成，接著並經處理及傳送至細胞質中供蛋白質合成；反之，原核的傳訊核糖核酸轉錄及蛋白質轉譯係在相同地點(in cytoplasm)在同樣的去氧核糖核酸部分同時進行。原核生物例如細菌以及古菌沒有似細胞核的結構。上述的差異使得一原核細胞難以或甚至不可能利用真核核糖核酸啟動子製造真核核糖核酸與肽類/蛋白質。
    先前技術如Buechler的美國專利No.7,959,926以及Mehta的美國專利No.7,968,311嘗試利用細菌或噬菌體的啟動子在細菌細胞內製造哺乳動物的肽類及/或蛋白質。一選擇的基因的互補去氧核糖核酸(cDNA)係克隆(選殖)至一質體載體內一細菌或噬菌體啟動子的後方以表現。由於細菌不具有用以處理內含子的核糖核酸剪接機構(RNA splicing machineries)，因此該所選基因的cDNA不得含有任何非編碼的內含子。接著，將所獲得之該載體導入一細菌如大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)的勝任菌株以表現所選基因的轉錄分子(傳訊核糖核酸)，以及進一步對該傳訊核糖核酸轉譯生成蛋白質。然而，該等細菌與噬菌體的啟動子如Tac、Lac、T3、T7，以及SP6核糖核酸啟動子並非第二型聚合酶(pol-2)啟動子，且其進行的轉錄作用係為傾向容錯的(error-prone)而易發生變異。另一方面，Mehta亦教示甘油可用於增加細菌轉型(transformation)的效率；然而，Mehta沒有作任何有關於增強啟動子驅動之核糖核酸轉錄，特別是第二型聚合酶(pol-2)啟動子驅動之核糖核酸轉錄的描述。真核與原核轉錄系統之間由於缺乏可能的相容性，前述的先前技術係受限於在原核細胞中僅能使用原核核糖核酸啟動子。
    習知如Gossen M.與Bujard H.(1992)以及Gossen的美國專利No.5,464,758所教示的誘導基因表現的方法，係需要使用抗生素(如四環素或去氧羥四環素)來誘發一四環素反應區域控制的人類巨細胞病毒啟動子(tetracycline-responsive-element(TRE)-controlled cytomegaloviral(CMV))或第三型聚合酶(pol-3，U6)啟動子，即Tet-On啟動子的活化與表現。然而，該等Tet-On啟動子非真核第二型聚合酶(pol-2)啟動子，此外，其功能也不曾在原核細胞內受到測試。因此，由於原核與真核轉錄機制上有差異，且先前使用抗生素的毒性誘導方法可能抑制原核細胞生長，發明人提供一種新穎的可誘導的基因表現系統，其中原核轉錄機構係可受誘導地發生適應作用以使用真核第二型聚合酶(pol-2)啟動子進行表現。
    本發明對於舊教科書中關於原核與真核轉錄系統間具不相容性的觀念係一新穎的突破性發展。藉著加入一些化學媒介物，現在吾人可誘導原核細胞發生快速的適應作用，藉此而可利用真核第二型聚合酶(pol-2)啟動子來製造想要的核糖核酸以及和其有關的肽類/蛋白質。其中的優點在於第一，製造上因細菌生長的快速而經濟實惠；第二，操作上由於無需費心培養融合瘤或哺乳細胞，因此更為簡易；第三，生產品質由於係相當為利用第二型聚合酶啟動子之轉錄(pol-2 promoter-like transcription)以及增進原核轉錄機制的閱讀保真性(reading fidelity)而提高；第四，僅透過細菌即可達成對想要的核糖核酸與和其有關的肽類/蛋白質、以及導入的質體載體的工業級別的大量生產；最後，想要的核糖核酸以及蛋白質可各自從細菌抽出物(extract)及/或溶菌產物(lysates)分離與純化而得以進一步應用的多工性。因此，總而言之，在原核細胞內利用真核核糖核酸啟動子驅動之轉錄的一可誘導的核糖核酸(即傳訊核糖核酸與微型核糖核酸)及/或肽類/蛋白質(即抗體、生長因子與酵素)的製造方法係能高度滿足需求。
    本發明之係基於原核與真核基因轉錄系統間的差異及不相容性。正常來說，原核核糖核酸聚合酶不會識別真核啟動子，反之亦然。然而，本發明確認了複數個化學媒介物，其係擔任轉錄誘導物，誘導及/或增強原核細胞內真核啟動子驅動之基因表現。相同的化學媒介物或其他媒介物亦可在真核細胞內擔任轉錄誘導物，誘導及/或增強原核啟動子驅動之基因表現。因此，本發明中教示的新穎現象與知識對於現今在原核與真核轉錄機制間差異的認知上提出了突破性的發展。
    本發明中發現的轉錄誘導物通常不是細胞培養的條件下所偏好的。3-嗎啉丙烷磺酸(3-morpholinopropane-1-sulfonic acid(或3-(N-morpholino)propanesulfonic acid，MOPS)、乙醇、及甘油三者為所有經過測試的化學媒介物中最有效的誘導物。該等化學媒介物的誘導能力係與其劑量有關(dose-dependent)，且與其濃度成比例。具有和MOPS、乙醇、及/或甘油相似之結構的一些化學物質可具有相同的功能。MOPS通常用來作為細菌溶裂與質體萃取的一緩衝劑，且因此不建議作為細菌細胞培養之用。乙醇係為已知的殺菌劑。甘油能使細菌細胞壁不穩定而增加轉型(transformation)的效率，且亦不建議用於細菌培養。此外，甘油及乙醇皆可作為防腐劑，其中甘油可抑菌，乙醇可殺菌。基於MOPS、乙醇、以及甘油具有的習知的功能，本領域所屬技藝者難以在知道本發明之前，預見以微量的(0.01%~1%體積濃度(v/v))該等化學物質用來在原核細胞內誘導真核啟動子驅動之基因表現。
    本發明係一可誘導的基因表現組成物，使用某些化學媒介物促使及/或提升原核細胞內真核啟動子驅動之核糖核酸轉錄及相關的肽類/蛋白質合成。該可誘導的基因表現組成物包含(a)至少一化學媒介物，含有一結構相似於3-嗎啉丙烷磺酸(3-morpholinopropane-1-sulfonic acid，MOPS)、乙醇、甘油，或其混合物；以及(b)複數個原核細胞，該等原核細胞含有至少一基因，該基因受到一真核第二型聚合酶(pol-2)啟動子驅動表現或一pol-2兼容性病毒啟動子(pol-2 compatible viral promoter)驅動表現之機制的調控；其中(a)與(b)係在一條件下混合，並誘發該基因的表現。本發明亦提供一新穎組成物及其應用，以誘導原核細胞發生快速的適應作用而使用真核第二型聚合酶(pol-2)啟動子來直接表現想要的核糖核酸及/或蛋白質/肽類，而無轉換成傾向容錯(error-prone)的原核啟動子、或者培養融合瘤或哺乳細胞的需要(其中融合瘤或哺乳細胞的培養需要較多的人力與金錢支出)，並且用來增進原核細胞的轉錄的閱讀保真性(reading fidelity)，即相當於提供一第二型聚合酶(pol-2)啟動子驅動之轉錄(pol-2-like transcription mechanism)。表現之核糖核酸較佳為真核核糖核酸(即傳訊核糖核酸及微型核糖核酸)，且該等蛋白質/肽類包含抗體與酵素。
    較佳來說，該原核細胞為細菌細胞，尤其是大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)細胞，且該化學媒介物為3-嗎啉丙烷磺酸(3-morpholinopropane-1-sulfonic acid，MOPS)、乙醇、甘油，或其混合物。並且，該真核核糖核酸啟動子較佳為真核第二型聚合酶(pol-2)啟動子(即EF1 α)或pol-2兼容性病毒啟動子(即人類巨細胞病毒啟動子(cytomegaloviral(CMV)promoter)或反轉錄病毒LTR啟動子(retroviral long terminal repeat promoter))。該真核核糖核酸啟動子調控之基因係編碼選自由微型核糖核酸(microRNA，miRNA)、小髮夾樣核糖核酸(small hairpin RNA，shRNA)、小干擾核糖核酸(small interfering RNA，siRNA)、傳訊核糖核酸(messenger RNA，mRNA)、其前驅物與同系物、及其組合所組成之群組的非編碼(non-coding)或蛋白質編碼(protein-coding)的核糖核酸轉錄分子，或兩者。本發明生成的肽類/蛋白質係轉譯自上述編碼蛋白質的傳訊核糖核酸轉錄分子，且係選自但不限於由酵素、生長因子、抗體、胰島素、肉毒桿菌毒素、任何功能蛋白、其同系物、及其組合所組成之群組。較佳而言，誘導該基因表現之該條件為37℃的LB培養基，再加入有該化學媒介物的一細菌培養條件。
    為示例該化學媒介物在原核細胞內誘導生產核糖核酸與蛋白質的能力，本發明採用並修飾一慢病毒質體載體，如林(Lin)的美國專利申請案No.12/149,725與No.12/318,806中的質體載體pSpRNAi-RGFP-miR302，並且採用紅螢光蛋白質(RGFP)，即將RGFP基因克隆(選殖)至載體，以作為量測核糖核酸轉錄及蛋白質轉譯的可視標誌，如圖1B所示。在本發明中，pSpRNAi-RGFP-miR302載體原本的CMV啟動子係由人類第二型聚合酶(pol-2)啟動子EF1α取代，並形成一新的質體載體，名為pLenti-EF1α-RGFP-miR302，如圖1A所示。此外，由於原核細胞無法處理閱讀框內(in-frame)內含子，因此移除RGFP基因中的SpRNAi內含子，並再移除原本內含子編碼(intron-encoded)的miR-302群集(miR-302 cluster)且將其改置於RGFP基因的五端非轉譯區(5’-untranslated region，5’-UTR)，形成一RGFP-miR302基因。概括來說，一基因的5’-UTR及3’-UTR可被視為內含子的延伸。如此一來，本發明所揭露之miR-302表現的表現機制係在先前美國專利申請案No.12/149,725與No.12/318,806中所描述的內含子微型核糖核酸的生成機制(intronic microRNA biogenesis mechanism)的範疇。好處在於，由於原核細胞內缺乏核糖核酸剪接(RNA splicing)，因此本發明中獲得之miR-302轉錄分子仍為髮夾樣(hairpin-like)的前驅微型核糖核酸(pre-miRNA或pri-miRNA)，其係可進一步經純化後，再傳送至真核細胞內，形成成熟的miR-302並引起作用(圖1B)。 原核細胞內真核啟動子驅動之蛋白質編碼基因的表現之誘導
    使用一z-勝任大腸桿菌轉型工具(z-competent E.coli transformation kit，Zymo Research，Irvine，CA)以pLenti-EF1α-RGFP-miR302質體載體之轉導進行大腸桿菌(E.coli)轉型，並培養於37℃的LB培養基，同時以170 rpm頻繁震盪。經隔夜培養後，大腸桿菌菌落在添加有0.1%(v/v)MOPS與0.05%(v/v)甘油的條件下大量表現紅螢光蛋白質RGFP，其係明顯將細菌的LB培養基染成紅色；相較之下，控制組菌落無法製造RGFP，如圖2所示。具指標功能的RGFP的呈現指出其核糖核酸與其本身皆成功地被製造出來。
    進一步使用兩個轉型的大腸桿菌菌株係來證實及體現所確認之化學媒介物如MOPS的蛋白質誘導特性，其中一菌株攜帶pLVX-Grn-miR302+367質體載體，該質體載體係有一由CMV啟動子驅動之綠螢光蛋白質(GFP)基因；另一菌株攜帶前述之pLenti-EF1α-RGFP-miR302載體。經過在0.1%(v/v)MOPS中隔夜培養後，以pLVX-Grn-miR302+367轉型之大腸桿菌產生綠色細胞，其他具有pLenti-EF1α-RGFP-miR302質體載體的E.coli則顯現紅色細胞，如圖3所示。此結果指出化學物質如MOPS能藉由一真核第二型聚合酶(pol-2)啟動子或一pol-2兼容性病毒啟動子誘導特定核糖核酸及其相關蛋白質的生產。並且，此誘導產生之核糖核酸與蛋白質係相當特定的，且能由該化學物質之加入所調節。其中，值得注意的是，該蛋白質之產量相當豐富，甚至可見到該等細菌細胞被分別染色。
    在本發明所有經測試的化學物質中，三種最有效的誘導物為MOPS、甘油、以及乙醇，如圖4所示。如圖5所示及實施例3所述，誘導產生的紅螢光蛋白質RGFP係進一步由西方墨點分析確認其量。利用細菌的RuvB蛋白質的常務性表現作為將RGFP表現正規化(normalize)的基準(house-keeping standard)。該等經確認之誘導物的誘導能力亦經發現為劑量相關(dose-dependent)，且與其濃度成比例。在未經任何處理下，負控制組的大腸桿菌細胞在無任何螢光染料的存在下僅顯現其原本的顏色。因此，依據所有該等結果，本發明清楚提供一新穎的化學可誘導的組成物及其在原核細胞內調節真核第二型聚合酶(pol-2)啟動子、或pol-2兼容性病毒啟動子驅動之基因表現的應用。該基因之產物可為核糖核酸或蛋白質/肽類，或兩者。依照上述示範說明，本領域所屬技藝者顯然能夠使用其他不含內含子(intron-free)的基因或相關的cDNA來取代RGFP基因，以在原核細胞內產生功能性的核糖核酸及/或蛋白質。 原核細胞內真核啟動子驅動之非編碼核糖核酸的表現之誘導
    如前所述，pLenti-EF1α-RGFP-miR302載體在RGFP基因的五端非轉譯區(5’-UTR)含有微型核糖核酸miR-302的群集(miR-302 cluster)(圖1A與1B)，該RGFP基因經誘導之表現亦將產生miR-302群集(miR-302s前驅物)，如圖1B所示之機制。原核細胞內由於缺乏核糖核酸剪接機構(例如剪接體，spliceosome)，在本發明中所得之miR-302群集係仍為髮夾樣前驅微型核糖核酸(pre-miR-302s或pri-miR-302s)，其係易/益於分離及傳送至真核細胞內。在真核細胞內，該等pre-miR-302s或pri-miR-302s能進一步被處理為成熟的miR-302s(即miR-302微型核糖核酸)並引起作用。同樣地，其他種微型核糖核酸與其相關前軀物亦能經由miR-302表現的相同步驟而產生。另外，一些非編碼核糖核酸(non-coding RNA)如短干擾核糖核酸(short interfering RNAs，siRNAs)及小髮夾型核糖核酸(small hairpin RNAs，shRNAs)能經設計而似前述微型核糖核酸般地表現。該等非編碼核糖核酸較佳含有至少一序列，該序列與一微型核糖核酸享有30%~100%的同源性。再者，該等shRNAs/siRNAs可在髮夾的主幹區域(stem regions)完全配對；哺乳動物的前驅微型核糖核酸(pre-miRNAs或pri-miRNAs)則經常含有失配(mismatched)的鹼基對。由於大部分的微型核糖核酸具有作為特定基因之靜默物(silencers)的功能，且在許多生理與病理機制中扮演包含但不限於生理發展(biological development)、幹細胞生成、細胞核重新編程(nuclear reprogramming)、細胞分化、細胞週期調節、腫瘤抑制、免疫防衛、細胞凋亡、再生作用(rejuvenation)、傷口癒合及其他許多等各種特殊角色，因此其在這些藥學與治療領域上的潛在應用係受到高度期待的。轉導的質體與非編碼核糖核酸(即微型核糖核酸/小髮夾型核糖核酸)皆能同時藉由原核細胞例如大腸桿菌來擴增。在擴增步驟後分離pLenti-EF1α-RGFP-miR302質體DNA與轉錄的pre-miR-302s/pri-miR302s的方法記載於實施例5與6。將擴增的非編碼核糖核酸(即pre-miR-302s/pri-miR-302s)及/或載體(即pLenti-EF1α-RGFP-miR302)傳送至真核細胞的方法可選自胞飲作用(endocytosis)、甘油注入(glycerol infusion)、肽類/脂質體(liposomal)/化學介導的轉染、電穿孔、基因槍穿透、微注射、轉位子/逆轉位子插入，以及腺病毒/反轉錄病毒/慢病毒感染。
    前揭之RGFP誘導實驗(圖4與5)也相當於量測在有或無化學誘導下，非編碼pre-miR-302s及其成熟miR-302產物在以pLenti-EF1α-RGFP-miR302轉型之細菌內的表現。如圖6及實施例4所示，由北方墨點分析確認誘導產生的pre-miR-302s的量。如同RGFP誘導實驗的結果(圖4與5)，可在經MOPS、甘油，以及乙醇處理之轉型細菌內，而非空白控制組(blank control)中測得pre-miR-302s的表現；顯示該等pol-2啟動子的化學誘導物亦能在原核細胞內引發非編碼核糖核酸的表現。由於所有的微型核糖核酸(microRNAs，miRNAs)以及小髮夾型核糖核酸(shRNAs)在結構上具有相似性，因此本領域熟習技藝者可知可以其他非編碼微型核糖核酸及/或小髮夾型核糖核酸取代該miR-302群集，並在原核細胞內產生功能性的微型核糖核酸、小髮夾型核糖核酸，及/或其前驅物/同系物。 本發明在生成幹細胞上的功能應用
    如美國專利申請案No.12/149,725與No.12/318,806之教示，微型核糖核酸miR-302可用於將哺乳動物體細胞重新編程(reprogram)為胚胎幹細胞樣(embryonic stem cell(ESC)-like)的誘導性多能幹細胞(induced pluripotent stem(iPS)cells)。許多幹細胞應用及治療的發展係有賴於這些ESC樣的iPS細胞。然而，miR-302僅在人類ESCs內，但不在其他已分化的組織細胞內大量生產。人類ESCs的分離係受到高度爭議的。人類ESCs的培養則相當耗費人力與金錢。雖然製造合成的miR-302之相似物(mimics)可作為另一種替代方式，繞過需要人類ESCs之步驟，然而亦是非常昂貴的且效率不佳。合成的與天然的miR-302之間的相似程度仍是不確定的。為解決這些問題，本發明可提供一簡單、便宜、快速，以及可誘導的組成物及方法，以在原核細胞內大量製造miR-302及/或其前軀物/同系物。再者，自原核細胞分離miR-302及/或其前驅物，如本發明圖6所示及實施例6之記載，相對來說係較簡單且合算的。
    發明人使用以pLenti-EF1α-RGFP-miR302轉型之大腸桿菌細胞來生產並分離出高質量的pLenti-EF1α-RGFP-miR302載體及pre-miR-302s，如實施例5與6之記載。依據美國專利申請案No.12/149,725與No.12/318,806之教示，本發明pLenti-EF1α-RGFP-miR302與pre-miR-302s在生成iPS細胞上之使用係可預期的。依照實施例2，當導入本發明產生的pre-miR-302s至人類皮膚初代角質細胞(primary keratinocytes)後，該轉染的角質細胞係重新編程為ESC樣的iPS細胞，且強烈表現ESC指標Oct4(圖7)。進一步如圖8所示及實施例8之記載，亞硫酸氫鹽DNA測序試驗(bisulfite DNA sequencing assay)亦顯示在Oct4與Sox2基因的啟動子區域發生整體的DNA的去甲基化(global DNA demethylation)，其中Oct4與Sox2係最重要的重新編程因子以及ESC指標。由於整體DMA的去甲基化及Oct4表現已知為細胞成功開始進行重新編程並獲得似ESC之多能性(pluripotency)的第一步(Simonsson and Gurdon,Nat Cell Biol.6：984-990，2004)，因此證實了分離自在MOPS誘導下之細菌抽出物(MOPS-induced bacterial extracts)在iPS細胞生成上的效用。此範例證實了本發明可用於製備足量含有miR-302及/或pre-miR-302的細菌抽出物或溶菌產物，供多能性幹細胞之生成。 微型核糖核酸抽出物在腫瘤/癌症治療上的應用
    發明人或本領域熟習技藝者可依本發明(實施例1、5、6)生產足量微型核糖核酸miR-302的前軀物(pre-miR-302s或pri-miR-302s)及相關的編碼miR-302(miR-302-encoding)之質體載體。miR-302在癌症治療上的功能與機制可參考美國專利申請案No.12/318,806與No.12/792,413。林(Lin)等人先前已教示此方法在治療人類黑色素瘤(melanoma)、前列腺癌(Lin等人，RNA 2008)、乳癌、肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma)、以及胚胎性畸胎癌細胞(embryonal teratocarcinoma)(Lin等人，Cancer Res.2010)上的可行性。如圖9A~9B所示，所有試驗的腫瘤/癌細胞在經miR-302及/或pre-miR-302的處理後，皆重新編程為正常iPS細胞，且形成胚胎體樣細胞群落(embryoid body-like cell colonoies)。經miR-302及/或pre-miR-302處理所得的細胞稱為mirPS細胞，即「miR302誘導之多能性幹細胞(miR302-induced pluripotent stem cells)」的簡稱。再者，miR-302亦經發現可誘導所有測試的腫瘤/癌細胞發生顯著的細胞凋亡(>95%)，但對於正常組織細胞則否(Lin等人，RNA 2008與Cancer Res.2010)。以流式細胞儀進一步分析細胞週期各時期的DNA含量，結果顯示在所有mirPS細胞中有絲分裂的細胞群顯著地減少(圖9C)。在mirPS-MCF7細胞中，有絲分裂的細胞群(M期)減少了78%：由49%±3%降低至11%±2%；在mirPS-HepG2細胞中減少了63%：由46%±4%降低至17%±2%；在mirPS-Tera2細胞中減少了62%：由50%±6%降低至19%±4%；反之，停滯/休眠的細胞群(G0/G1期)在mirPS-MCF7、mirPS-HepG2與mirPS-Tera2細胞中分別增加了80%、65%與72%：在mirPS-MCF7細胞中由41%±4%增加至74%±5%，在mirPS-HepG2細胞中由43%±3%增加至71%±4%；在mirPS-Tera2細胞中由40%±7%增加至69%±8%。這些結果指出miR-302能有效地減弱這些腫瘤/癌細胞快速的細胞週期速率，並導致顯著的細胞凋亡。
    細胞侵犯試驗(實施例9，使用Matrigel小室)以及細胞貼附試驗(實施例10，細胞貼附於人類骨髓內皮細胞(hBMEC)的單細胞層)等體外腫瘤發生能力試驗(In vitro tumorigenecity assays)顯示mir-302除了抗增生特性以外，另外兩種抗腫瘤生成的效應。細胞侵犯試驗(Cell invasion assay)顯示所有三種休眠的mirPS-腫瘤/癌細胞失去其遷移的能力(降低至<1%)，而原本的腫瘤/癌細胞侵略性地侵入補充有較高營養物的間隔區：在MCF7細胞中佔了超過9%±3%、在Hep G2細胞中佔了16%±4%、在Tera-2細胞中佔了3%±2%的細胞群(圖10A)。細胞貼附試驗(Cell adhesion assay)亦一致顯示該等mirPS-腫瘤/癌細胞不能貼附hBMECs單細胞層，然而原本的MCF7與Hep G2細胞在經過50分鐘的培養後，顯著的細胞群(MCF7 7%±3%、Hep G2 20%±2%)快速轉移至hBMEC單細胞層(圖10B)。總結來說，迄今所有的發現強烈且一再顯示miR-302及/或pre-miR-302是一人類腫瘤抑制子，能夠減弱細胞的快速生長、引起腫瘤/癌細胞細胞凋亡、以及抑制腫瘤/癌細胞侵入(invasion)及轉移(metastasis)。最重要的是，此新穎的miR-302及/或pre-miR-302的功能可以提供對抗多樣人類癌症/腫瘤的一普適性治療方式，包括但不限於治療惡性的皮膚癌、攝護腺癌、乳癌、以及肝癌、以及就胚胎性畸胎瘤包含各不同組織類型的觀點而言，對各種腫瘤的治療。
    在確認miR-302及/或pre-miR-302的腫瘤抑制功能，及其在正常與腫瘤/癌細胞中的不同效應後，發明人進一步以八週大雄性無胸腺小鼠(BALB/c nu/nu品系)測試miR-302及/或pre-miR-302作為治療衍生自Tera2之畸胎瘤的抗癌症藥物的可行用途(圖11A~11C與實施例11~12)。Tera-2細胞原本來自人類胚胎性畸胎癌且含有多種原始腫瘤組織細胞(primitive timorous tissue cells)。由於其多能性，Tera2衍生之畸胎瘤常作為多種體內腫瘤形態的治療模型。如圖11A所示，在miR-302及/或pre-miR-302治療(Tera2+mir-302s)三週後，吾人可測得相較於無處理組別(104±23mm3，n=4)，平均腫瘤大小(11±5mm3，n=6)顯著減少超過89%(>89%)。相反地，施予相同量的反義-mir-302d(Tera2+-miR302d＊)將使平均腫瘤大小增為原來的140%(250±73mm3，n=3)。北方墨點分析的結果亦顯示在這些受到不同處理的的畸胎瘤細胞中，miR-302的表現水平與腫瘤大小呈現負相關(圖11B)，亦即調控miR-302的表現能有效控制體內腫瘤的生長。為證實這些發現，吾人進一步以西方墨點分析來確認在經miR-302及/或pre-miR-302處理的畸胎瘤中，G1檢控點調節者CDK2、週期素-D1/D2、以及BMI-1的共同抑制以及腫瘤抑制子p16Ink4a、p14/p19Arf與核心重新編程因子Oct3/4、Sox2、與Nanog的共同活化(圖11B)。以免疫組織化學(immunohistochemical，IHC)染色分析畸胎瘤組織中的該些蛋白質，亦證實相同的結果(圖11C)。基於miR-302的腫瘤抑制功能以及體內與體外(in vitro，in vivo)的一致結果，可理解的是miR-302作為使用本發明製備癌症治療藥物的微型核糖核酸範例。 微型核糖核酸萃取物在傷口癒合處理上的應用
    發明人測試本發明生產之充足的微型核糖核酸miR-302的前驅物(pre-miR-302s)及相關的編碼miR-302之質體載體在動物傷口癒合上的使用(實施例13)。pre-miR-302s及相關的質體載體係透過描述於實施例1與5的方法擴增，且透過描述於實施例5與6的方法提取之。接著，分離的pre-miR-302s及相關的質體載體係與一預先準備的軟膏基劑混合；該軟膏基劑含有可可脂、棉籽油、橄欖油、丙酮酸鈉，以及白凡士林。miR-302的前軀物及載體在該預先準備的軟膏基劑內的濃度是10 μg/mL。由解剖刀割開皮膚來產生皮膚的開放性傷口。分別將含有或不含有miR-302及/或pre-miR-302的軟膏直接塗在傷口上；軟膏係覆蓋整個受傷區域。接著，進一步以液體繃帶(liquid bandage)將處理的區域封好。如圖12所示，兩週內清楚顯示miR-302及/或pre-miR-302的處理顯著增進傷口癒合的速度；該癒合速度為所有其他處理組與控制組之癒合速度的兩倍以上。再者，傷口經miR-302及/或pre-miR-302治療後的傷口癒合區域顯現正常的毛髮再生長，並且不留有疤痕；相較之下，其他處理組的結果是留有小疤痕且無毛髮生長(黑色箭頭所指)。 本發明的其他應用
    本發明的其中一較佳應用實施例係生產微型核糖核酸及/或小髮夾型核糖核酸用於生物醫學研究、藥學及治療上的應用例如基因調節以及基因治療。舉例來說，如美國專利申請案No.12/318,806的揭示，miR-302係為一人類細胞的腫瘤抑制子；但不限於此。本發明可用於製造充足的miR-302及/或其前軀物/同系物，用於癌症治療或藥物開發。具體而言，一治療性的、且分離自微生物、動物或植物的微型核糖核酸/小髮夾型核糖核酸(microRNA/shNA)之基因可選殖(克隆)至一質體載體，且由一真核第二型聚合酶(pol-2)或pol-2兼容性病毒啟動子控制；該質體載體可被傳送至非病原細菌內。當把含有此一microRNA/shNA的表現載體的細菌導入至病人細胞內，該病人可服用甘油或乙醇以啟動該治療性microRNA/shNA於該細菌內的產生以及釋出至細胞內，藉以治療失調及/或疾病。
    本發明的另一較佳應用實施例係生產功能性的蛋白質/肽類於生物醫學研究、藥學及治療上的應用。舉例來說，所得之蛋白質/肽類可以是但不限為治療糖尿病的胰島素、治療腫瘤/癌症的腫瘤抑制蛋白、促進正常身體發展的生長因子、用於生物醫學研究或疫苗/血清中的抗體、以及所有種類用於分子生物及生物醫學研究的生物酵素。具體而言，一治療性的、且分離自微生物、動物或植物的蛋白質/肽類之基因可選殖(克隆)至一質體載體，且由一真核第二型聚合酶(pol-2)或pol-2兼容性病毒啟動子控制；該質體載體可被傳送至非病原細菌內。當把含有此一基因表現載體的細菌導入至病人細胞內，該病人可服用甘油或乙醇以啟動該治療性蛋白質/肽類於該細菌內的產生以及釋出至細胞內，藉以治療失調及/或疾病。
    本發明的另一較佳應用實施例係為人類及/或動物提高蛋白質食物產量及藥物供給。細菌的快速生長帶來的蛋白質生產能減低維持代價較高的牲畜/動物所需要的時間與人力。並且，吾人可避免非必需的動物犧牲。本發明的好處在於能使用哺乳動物基因啟動子生產哺乳動物蛋白質，減低伴隨基因工程與基因修飾(modification)的風險。
    本發明的另一可能的應用實施例為製造生物武器。舉例來說，可將一分離自微生物、動物或植物的毒物/有毒蛋白的基因選殖(克隆)至一質體載體，且由一真核第二型聚合酶(pol-2)或pol-2兼容性病毒啟動子控制；該微生物、動物或植物包含但不限於炭疽桿菌(Bacillus anthracis)、毒藤、水母、昆蟲、魚類、兩生類、以及蛇類等。該質體載體可被傳送至非病原細菌內。當不存在有可誘導pol-2啟動子驅動之基因表現的化學媒介物時，攜帶有該些質體載體之細菌暗自擴增但無害。然而，一旦化學媒介物如MOPS、乙醇、甘油、或其混合物存在於環境中時，細菌內該毒物/有毒蛋白的基因係被活化並顯現其效果。 A.定義
    為促進對本發明的了解，以下列出一些用語之定義：核酸(Nucleic Acid)：去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的單股或雙股的聚合物。
    核苷酸(Nucleotide)：去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)之單體，包含：一糖部分體(戊糖pentose)、一磷酸根(phosphate)，及一含氮雜環鹼基(nitrogenous heterocyclic base)。該鹼基係經由糖苷碳(glycosidic carbon，該戊糖之一端(1’)碳)與該糖部分體鏈結，且該鹼基及糖的組合係一核苷(nucleoside)。核苷於該戊糖之三端與五端位置鍵結至少一個磷酸係成為一核苷酸(nucleotide)。去氧核糖核酸(DNA)與核糖核酸(RNA)係分別由不同類型之核苷酸單元，即去氧核糖核苷酸與核糖核苷酸所組成。
    寡核苷酸(Oligonucleotide)：含有兩個以上之去氧核糖核酸(DNA)及/或核糖核酸(RNA)之單體的一個分子，其中單體數量較佳超過3個，而通常為超過10個。含有超過13個單體的寡核苷酸通常也稱為多核苷酸(polynucleotide)。寡核苷酸確切的長度取決於許多因素，其並且依據該寡核苷酸之最佳功能或用途而定。寡核苷酸可用任何方式生成，包括：化學合成、DNA複製、RNA轉錄、反轉錄、或其組合。
    核苷酸相似物(Nucleotide Analog)：一嘌呤(purine)或嘧啶(pyrimidine)核苷酸，其結構上不同於A(腺嘌呤)、T(胸腺嘧啶)、G(鳥嘌呤)、C(胞嘧啶)或U(尿嘧啶)核苷酸但足夠相似，因此可取代核酸分子中的正常核苷酸。
    核酸組成物(Nucleic Acid Composition)：一核酸組成物係指寡核苷酸或多核苷酸例如具有單股或雙股分子結構的DNA或RNA序列、或DNA/RNA序列之混合。
    基因(Gene)：一核酸組成物，其中的寡核苷酸或多核苷酸的序列為一核糖核酸及/或一多肽(蛋白質)的代碼。一基因可以編碼一非編碼核糖核酸如小髮夾型核糖核酸(shRNA)、微型核糖核酸(microRNA，miRNA)、rRNA、tRNA、snoRNA、snRNA，以及其核糖核酸前驅物及衍生物。另一方面，一基因可編碼一編碼蛋白質的核糖核酸(protein-coding RNA)如傳訊核糖核酸(mRNA)及其前驅物與衍生物，供蛋白質/肽類合成。在一些情況下，一蛋白質編碼核糖核酸(protein-coding RNA)可含有至少一microRNA或shRNA序列。
    初級核糖核酸轉錄分子(Primary RNA Transcript)：一核糖核酸序列，其係直接由基因轉錄而來且未經RNA處理與修飾。
    前驅傳訊核糖核酸(Precursor messenger RNA，pre-mRNA)：蛋白質編碼基因透過真核細胞的真核第二型RNA聚合酶(Pol-II)，經由稱為轉錄作用的細胞內機制而產生的初級核糖核酸轉錄分子。一前驅傳訊核糖核酸的序列包含五端非轉譯區(5’-untranslated region,UTR)、三端非轉譯區(3’-UTR)、外顯子(exon)及內含子(intron)。
    內含子(Intron)：一基因轉錄分子序列編碼非蛋白質讀框之一部分或多個部分，例如同一讀框內含子(in-frame intron)、五端非轉譯區(5’-UTR)及三端非轉譯區(3’-UTR)。
    外顯子(Exon)：一基因轉錄分子序列編碼蛋白質讀框(cDNA)之一部分或多個部分，例如細胞基因、生長因子、胰島素、抗體及其類似物/同系物與衍生物的互補去氧核糖核酸(cDNA)。
    傳訊核糖核酸(Messenger RNA，mRNA)：前驅傳訊核糖核酸的外顯子之集合。傳訊核糖核酸係在細胞內的RNA剪接機制(intracellular RNA splicing machineries)例如剪接體(spliceosomes)移除內含子後形成，並且在肽類/蛋白質合成中為蛋白質編碼核糖核酸。該傳訊核糖核酸編碼的肽類/蛋白質包含但不限於酵素、生長因子、胰島素、抗體及其類似物/同系物與衍生物。
    互補去氧核糖核酸(Complementary DNA，cDNA)：一單股或雙股去氧核糖核酸(DNA)，其含有與一mRNA序列互補的序列，且不含任何內含子序列。
    正義核酸(Sense)：一核酸分子，其序列順序及組成與同源之mRNA相同。以「+」、「s」或「sense」符號來表示此正義核酸構造形態。
    反義核酸(Antisense)：與個別mRNA分子互補之一核酸分子。以「-」符號來表示此反義核酸構造形態，或是在DNA或RNA之前加上「a」或「antisense」，例如：「aDNA」或「aRNA」。
    鹼基對(Base Pair，bp)：存在一雙股DNA分子中之腺嘌呤(adenine，A)與胸腺嘧啶(thymine，T)之配對(partnership)，或胞嘧啶(cytosine，C)與鳥嘌呤(guanine，G)之配對。在RNA中，尿嘧啶(uracil，U)取代胸腺嘧啶(thymine，T)。一般來說，該配對透過氫鍵(hydrogen bonding)來達成。舉例而言，一正義核酸序列“5’-A-T-C-G-U-3’”能與其反義序列“5’A-C-G-A-T-3’”形成完全鹼基配對。
    五端(5’-end)：一連續核苷酸的一端，該端在五端位置沒有核苷酸。在該連續核苷酸中，一個核苷酸之五端氫氧基係以一磷酸二酯鍵與下一個核苷酸之三端氫氧基連接。在該端亦可以有其他官能基如一或多個磷酸根。
    三端(3’-end)：一連續核苷酸的一端，該端在三端位置沒有核苷酸。在該連續核苷酸中，一個核苷酸之五端氫氧基係以一磷酸二酯鏈與下一個核苷酸之三端氫氧基連接。在該端可以有其他官能基，通常為一氫氧基。
    模板(Template)：能以一核酸聚合酶複製之一核酸分子。依聚合酶的不同，一模板可為單股、雙股或部分雙股。合成後之複製物係與該模板、該雙股模板或部分雙股模板中之至少一股互補。RNA與DNA皆從五端往三端的方向合成。一核酸雙鏈體(duplex)之兩股總是排列在一起，使得該等兩股之五端係在該雙鏈體之相對端上(該等兩股之三端亦然)。
    核酸模板(Nucleic Acid Template)：一雙股DNA分子、雙股RNA分子、雜合分子(如：DNA-RNA或RNA-DNA雜合物)、或單股DNA或RNA分子。
    一致的(Conserved)：若一核苷酸序列與一預選(參考)序列之確切互補物(complement)非隨機地雜合，則該核苷酸序列與該預選序列是一致的。
    同源(Homologous或Homology)：意指一多核苷酸序列與一基因或傳訊核糖核酸(mRNA)序列相似。舉例而言，一核酸序列可與一特定基因或mRNA序列部分或完全同源。同源也可用相似核苷酸數在全部核苷酸數中所佔的的百分比表示。
    互補(Complemetary或Complementarity或Complementation)：依前述鹼基配對原則(“base pair”rule)發生鹼基配對之兩個多核苷酸(即mRNA與cDNA的序列)。例如：序列“5’-A-G-T-3’”與序列“5’-A-C-T-3’”及“5’-A-C-U-3’”互補。互補可以發生於兩股DNA之間、一股DNA與一股RNA之間、或是兩股RNA之間。互補可以是「部分」或「完全」或是「整體」的。當僅一些核酸鹼基根據該等鹼基配對原則相配對，則稱部分互補(partial complementarity或complementation)。當鹼基在該等核酸股之間完全相配時，則稱完全或整體互補(complete or total complementarity or complementation)。核酸股之間的互補程度對於核酸股間雜合的效率及強度有重要的影響。此對於倚賴核酸間之鍵合(binding)來達成的擴增(amplification)反應與偵測方法也特別重要。互補率(percent complementarity或complementation)係指在該核酸之一股中失配(mismatch)鹼基數在全部鹼基中所佔的比例。因此，50%的互補率意指一半的鹼基失配(mismatched)，而另一半的鹼基相配對。即使核酸之兩股具有不同鹼基數，核酸之兩股也能互補。在此情況下，互補發生於部分之較長股與較短股間，其中該較長股之該部分的鹼基與較短股之鹼基成對。
    互補鹼基(Complemetary base)：當DNA或RNA形成一雙股結構時正常配對之核苷酸。
    互補核苷酸序列(Complemetary Nucleotide Sequence)：一單股DNA或RNA分子的一核苷酸序列，其充分與另一單股分子之核苷酸序列互補，以致兩股之間藉由氫鍵而專一地雜合。
    雜合(Hybridize及Hybridization)：雙鏈體的形成，其係藉由鹼基配對在核苷酸序列之間充分地互補而形成。當一引子(或接續模板)與標的(模板)「雜合」，則雜合形成之複合體(或雜合物，hybrids)係充分穩定，提供一DNA聚合酶開始DNA合成需要的啟始功能。兩條互補多核苷酸之間有一競爭性抑制(competitively inhibited)的特殊(即非隨機)交互作用。
    後轉錄基因靜默(Posttranscriptional Gene Silencing)：一標的基因的效果在mRNA降解或轉譯抑制(translational inhibition)階段下的剔除(knockout)或減弱(knockdown)，其通常由外來/病毒DNA或RNA轉殖基因或小型抑制性RNAs任一者所觸發。
    核糖核酸干擾(RNA interference，RNAi)：一種真核細胞內的後轉錄基因靜默機制，可由小型抑制性RNA分子如微型核糖核酸(microRNA，miRNA)、小髮夾型核糖核酸(shRNA)及小干擾核糖核酸(siRNA)引發。該等小型RNA分子通常可作為基因靜默子，干擾細胞內與該等小型RNA完全或部分互補之基因的表現。
    基因靜默效應(Gene silencing effect)：一細胞在一基因功能被抑制後的反應，包含但不限於細胞週期減弱(cell cycle attenuation)、G0/G1檢控點停滯(G0/G1-checkpoint arrest)、腫瘤抑制、抗腫瘤生成、癌細胞凋亡，及其組合。
    非編碼核糖核酸(Non-coding RNA)：無法經由細胞內轉譯機制合成肽類或蛋白質的一RNA轉錄分子。非編碼核糖核酸包含長與短的調節性RNA分子如微型核糖核酸、小髮夾型核糖核酸、小干擾核糖核酸，以及雙股核糖核酸。這些調節性的RNA分子通常有作為基因靜默子的功能，干擾細胞內與該等非編碼核糖核酸完全或部分互補之基因的表現。
    微型核糖核酸(MicroRNA，miRNA)：單股核糖核酸，能夠與和該微型核糖核酸(miRNA)部分互補之標的基因的轉錄分子結合。MiRNA通常為長約17~27個核苷酸的寡核苷酸，並能依其與所標的的mRNA間的互補程度來直接降解細胞內之mRNA標的，或抑制所標的之mRNA的蛋白質轉譯。在幾乎所有的真核細胞內都能發現天然的miRNA，其具有例如對抗病毒感染的防衛功能，並能在動植物發育期間調節基因表現。
    前驅微型核糖核酸(Pre-miRNA)：髮夾樣單股核糖核酸，含有供與細胞內RNA內切酶RNaseIII作用，以產生一或多個微型核糖核酸(miRNAs)的幹臂(stem-arm)及幹環(stem-loop)區域，其中該等微型核糖核酸可靜默其標的基因，或序列與該(等)微型核糖核酸之序列互補的基因。前驅微型核糖核酸的幹臂區域可形成為一完全(100%)或部分(失配(mis-matched))之雜合雙鏈體，而其幹環區域係連接至該幹臂雙鏈體之一端而形成一圓形或一髮夾環的構造形態。在本發明中，前驅微型核糖核酸亦可包含初級微型核糖核酸(pri-miRNA)。
    小干擾核糖核酸(small interfering RNA，siRNA)：短雙股核糖核酸、長約18~27個核糖核苷酸完全鹼基對的雙鏈體，並可降解與其幾乎完全互補的標的基因之轉錄分子。
    小髮夾型或短髮夾型核糖核酸(small hairpin或short hairpin RNA，shRNA)：單股核糖核酸，包含一對部分或完全相配之幹臂核苷酸序列，其中該對序列由一無配(unmatched)寡核苷酸環隔開而形成一髮夾樣結構。許多天然微型核糖核酸(miRNAs)係衍生自髮夾樣核糖核酸前驅物，即前驅微核型糖核酸(pre-miRNA)。
    載體(Vector)：一重組核酸組成物，例如重組DNA(recombinant DNA，rDNA)，能於不同基因環境移動或滯留。一般來說，其係可操作地與另外的核酸分子連結。該載體能在一細胞內自動複製，其中該載體及所貼附之片段也會複製。較佳之載體的其中一類係一游離基因體(episome)，即可染色體外(extrachromosomal)複製的一核酸分子。較佳的載體為可自動複製並表現的核酸。能導引一或多個多肽之可編碼基因及/或非編碼(non-coding)核糖核酸基因之表現的載體在此稱為「表現載體(expression vector)」或「表現勝任載體(expression-competent vector)」。特別重要的載體能夠使用一反轉錄酶(reverse transcriptase)從mRNAs克隆(cloning)cDNA。一載體之成分可包含一病毒啟動子或第二型(type-II)RNA聚合酶(Pol-II或pol-2)啟動子或兩者、一Kozak一致性轉譯起始位(Kozak consensus translation initiation site)、聚腺苷酸化訊息(polyadenylation signals)、複數個限制/選殖位(restriction/cloning site)、一pUC複製起始點(pUC origin of replication)、一SV40早期啟動子(SV40 early promoter)供於複製勝任(replication-competent)的原核細胞內表現至少一抗生素抗藥性基因、一選擇性的SV40複製起始點(SV40 origin)供於哺乳動物細胞內的複製、及/或一四環素反應元件。載體的結構可以是線形或環形的單股或雙股DNA，且選自由質體、病毒載體、轉位子、逆轉位子、DNA轉基因、跳躍基因，及其組合所組成之群組。
    啟動子(Promoter)：一核酸，由一聚合酶分子所辨識(或與其結合)並啟始核糖核酸的合成。依據本發明，該啟動子可以是一已知的聚合酶結合位置、一增強子及類似物，以及任何可使用一所需聚合酶來啟始RNA轉錄分子之合成的序列。
    真核啟動子(Eukaryotic promoter)：核酸基序(motifs)，為基因轉錄所需，且能由真核第二型核糖核酸聚合酶(pol-2)、pol-2等效物、及/或pol-2兼容性病毒啟動子所辨識。
    第二型核糖核酸聚合酶(Pol-II或pol-2)啟動子(Type-IIRNA polymerase(Pol-II or pol-2)Promoter)：一核糖核酸啟動子，由真核第二型核糖核酸聚合酶(Pol-II或pol-2)辨識及與其結合；該聚合酶轉錄真核傳訊核糖核酸(mRNAs)及/或微型核糖核酸(miRNAs)。舉例來說，一pol-2啟動子可以是但不限於一哺乳動物的核糖核酸啟動子或一人類巨細胞病毒(cytomegaloviral，CMV)啟動子。
    第二型核糖核酸聚合酶(Pol-II或pol-2)等故物(Type-II RNA Polymerase(Pol-II or pol-2)Equivalent)：一真核轉錄機構，選自由哺乳動物第二型核糖核酸聚合酶(Pol-II或pol-2)及Pol-II兼容性病毒RNA聚合酶組成之群組。
    Pol-II兼容性病毒啟動子(Pol-II Compatible Viral Promoter)：一病毒的核糖核酸啟動子，能使用真核pol-2或其等效的轉錄機構於基因表現。舉例來說，一pol-2兼容性病毒啟動子可以是但不限於一人類巨細胞病毒啟動子或一反轉錄病毒LTR啟動子(retroviral long terminal repeat(LTR)promoter).
    順反子(Cistron)：一DNA分子內的一核苷酸序列，編碼一胺基酸殘基序列，且包含上游及下游的DNA表現控制元件。
    RNA處理(RNA processing)：一細胞內機制，負責RNA的成熟、修飾、與降解，包含RNA剪接、內含子切除、外泌體消化(exosome digestion)、無意義調節之衰退(nonsense-mediated decay，NMD)、RNA編輯、RNA處理及其組合。
    抗生素抗藥性基因(Antibiotic Resistance Gene)：一基因，該基因之表現具有降解抗生素的能力。該抗生素選自由盤尼西林G、鏈黴素、安比西林(Amp)、新黴素、G418、卡那黴素、紅黴素、巴龍黴素(paromycin)、霍火黴素、斯派克黴素、四環素(Tet)、去氧羥四環素(Dox)、利服平、兩性黴素B、健他黴素、氯黴素、先鋒黴素、泰黴素及其組合組成之群組。
    限制/選殖位(Restriction/Cloning Site)：一DNA基序(DNA motif)，供限制酶切割。該等限制/選殖位包含但不限於AatII、AccI、AflII/III、AgeI、ApaI/LI、AseI、Asp718I、BamHI、BbeI、BclI/II、BglII、BsmI、Bsp120I、BspHI/LU11I/120I、BsrI/BI/GI、BssHII/SI、BstBI/U1/XI、ClaI、Csp6I、DpnI、DraI/II、EagI、Ecl136II、EcoRI/RII/47III/RV、EheI、FspI、HaeIII、HhaI、HinPI、HindIII、HinfI、HpaI/II、KasI、KpnI、MaeII/III、MfeI、MluI、MscI、MseI、NaeI、NarI、NcoI、NdeI、NgoMI、NotI、NruI、NsiI、PmlI、Ppu10I、PstI、PvuI/II、RsaI、SacI/II、SalI、Sau3AI、SmaI、SnaBI、SphI、SspI、StuI、TaiI、TaqI、XbaI、XhoI、XmaI之切割位置。
    基因傳送(Gene Deliyery)：基因工程方法，選自由多聚體(polysomal)轉染、脂質體(liposomal)轉染、化學轉染、電穿孔、病毒感染、DNA重組、轉位子插入、跳躍基因插入、顯微注射、基因槍穿透，及其組合組成之群組。
    基因工程(Genetic Engineering)：DNA重組方法，選自由DNA限制酶反應與接合反應、同源重組、轉殖基因併入、轉位子插入、跳躍基因插入、反轉錄病毒感染，及其組合組成之群組。
    細胞週期調節者(Cell Cycle Regulator)：細胞基因，參與控制細胞分裂及細胞增生速率，包含但不限於週期素依賴性激酶2(CDK2)、週期素依賴性激酶4(CDK4)、週期素依賴性激酶6(CDK6)、週期素(cyclins)、BMI-1、p14/p19Arf、p15Ink4b、p16Ink4a、p18Ink4c、p21Cip1/Waf1和p27Kip1，及其組合。
    腫瘤抑制(Tumor Suppression)：細胞抗腫瘤及抗癌症的機制，包含但不限於細胞週期減弱、G0/G1檢控點停滯、腫瘤抑制、抗腫瘤發生、癌細胞凋亡，及其組合。
    標的細胞(Targeted Cell)：單一或複數個人類細胞，選自由一體細胞、一組織、一幹細胞、一生殖細胞、一畸胎瘤細胞、一腫瘤細胞、一癌細胞，及其組合組成之群組。
    癌組織(Cancerous Tissue)：一腫瘤組織，來自選自由皮膚癌、攝護腺癌、乳癌、肝癌、肺癌、腦瘤/癌、淋巴癌、血癌，及其組合組成之群組。
    轉錄誘導物(Transcription Inducer)：一化學媒介物，能促使及/或增強基因的核糖核酸轉錄作用。一轉錄誘導物含有但不限於與3-嗎啉丙烷磺酸(3-morpholinopropane-1-sulfonic acid，MOPS)、乙醇、甘油，或其混合物相似的化學結構。
    抗體(Antibody)：一肽類或蛋白質分子，具有一預選之保守區域結構，供一受體(receptor)與一預選之配位子(ligand)結合。
    藥學或治療應用(Pharmaceutical或therapeutic Application)：一生物醫學的應用及/或裝置，用於幹細胞生成如生成多能性幹細胞與幹細胞研究及/或治療發展、癌症治療、疾病處理、傷口癒合處理、提高藥物產量與食物供給、及其組合。 B.組成物和應用
    一組成物及其在原核細胞內誘導核糖核酸及/或蛋白質之表現的使用，該組成物包含：(a)至少一化學媒介物，含有一結構相似於3-嗎啉丙烷磺酸(3-morpholinopropane-1-sulfonic acid，MOPS)、乙醇、甘油，或其混合物；以及(b)複數個原核細胞，含有至少一基因，該基因受到由一真核第二型聚合酶(pol-2)啟動子驅動表現或由一pol-2兼容性病毒啟動子驅動表現之機制的調控；其中(a)與(b)係在一條件下混合，並誘發該基因之表現，藉以產生該基因之核糖核酸及/或蛋白質產物。
    本發明或為一可誘導的基因表現組成物，使用化學媒介物來在原核細胞內促使真核核糖核酸啟動子驅動之轉錄作用。一可誘導的基因表現組成物包含：(a)至少一化學媒介物，含有一結構相似於MOPS、乙醇、甘油，或其混合物；以及(b)複數個原核細胞，含有至少一基因，該基因受到由一真核第二型聚合酶(pol-2)啟動子驅動表現或由一pol-2兼容性病毒啟動子驅動表現之機制的調控；其中(a)與(b)係在一條件下混合，並誘發該基因的表現。
    本發明原則上提供一新穎的組成物之設計及其在誘導原核細胞發生快速的適應作用、利用真核第二型聚合酶(pol-2)啟動子來直接表現想要的核糖核酸及/或蛋白質，而無轉換成傾向容錯(error-prone)的原核啟動子或培養融合瘤或哺乳細胞的需要之適用性，其中融合瘤或哺乳細胞的培養需要較多的人力與金錢支出。
    較佳而言，該原核細胞為細菌細胞，具體而言為大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)，且該化學媒介物為3-嗎啉丙烷磺酸(3-morpholinopropane-1-sulfonic acid，MOPS)、乙醇、甘油，或其混合物。再者，該真核核糖核酸啟動子較佳為一真核第二型聚合酶(pol-2)啟動子如EF1α、pol-2兼容性病毒啟動子如人類巨細胞病毒(cytomegaloviral，CMV)啟動子、或反轉錄LTR(retroviral long terminal repeat)啟動子。由該真核核糖核酸啟動子調控之基因係編碼選自由微型核糖核酸、小髮夾型核糖核酸、小干擾核糖核酸、傳訊核糖核酸、其前驅物與同系物、以及上述之組合所組成之群組的一非編碼(non-coding)或一編碼蛋白質的(protein-coding)核糖核酸轉錄分子，或兩者。在本發明中產生之肽類/蛋白質係自上述蛋白質編碼(protein-coding)傳訊核糖核酸轉錄分子轉譯而來，且係選自但不限於由酵素、生長因子、抗體、胰島素、肉毒桿菌毒素(botox)、一功能性蛋白質及其同系物/類似物，及其組合組成之群組。較佳而言，誘發該基因表現之該條件為37℃的LB培養基，再加入有該化學媒介物的一細菌培養條件。 實施例1.細菌細胞培養與化學物質處理
    將自z-勝任大腸桿菌轉型工具(z-competent E.coli transformation kit，Zymo Research，Irvine，CA)取得之勝任大腸桿菌DH5α細胞株(competent E.coli DH5α)與所選之質體載體如pLVX-Grn-miR302+367或pLenti-EF1α-RGFP-miR302混合以進行轉型作用。非轉型之細菌細胞係正常生長於補充有10 mM硫酸鎂(MgSO4)與0.2 mM葡萄糖的37℃的LB(Luria-Bertani)培養基中，同時以170 rpm頻繁震盪之；該LB培養基並進一步添加100 μg/ml安比西林，培養轉型的細菌細胞。另一方面，在補充有10 mM硫酸鎂與0.2 mM葡萄糖、並添加有100 μg/ml安比西林的LB培養基中，再於每1公升該LB培養基中各加入0.5~2 ml的MOPS、甘油、乙醇、或其組合，用於化學誘導。此外，轉型的細菌細胞係培養於上述添加有安比西林、但無添加任何化學誘導物的LB培養基中，作為負控制組。 2.人類細胞培養以及微型核糖核酸轉染
    人類初代表皮細胞(human primary epidermal skin cells，hpESCs)係以在補充有20%胎牛血清(FBS)的新鮮RPMI 1640培養液中的4 mg/ml膠原蛋白酶I，在37℃自最少2 mm3體積分離35分鐘而得。分離的角質細胞(keratinocytes)係在37℃與5%二氧化碳的條件下培養於EpiLife不含血清(serum-free)的細胞培養液中，其中該培養基添加有人類角質細胞生長補充劑(HKGS，Invitrogen，Carlsbad，CA)以及抗生素。當細胞生長達50%~60%滿盤(confluency)時，則將細胞暴露在trypsin/EDTA溶液中1分鐘，並以不含酚紅之DMEM培養液(phenol red-free DMEM medium，Invitrogen)淋洗一次，再將該等分離之細胞以1：10稀釋後，以新鮮含HKGS補充劑之EpiLife培養液繼代培養。人類癌/腫瘤細胞株MCF7、HepG2、與Tera-2係自美國菌種培養中心(ATCC，Rockville，MD)取得，並依廠商建議條件培養。在microRNA的轉染中，將15 μg的分離miR-302及/或其前驅物溶於混合有50 μl轉染劑(X-tremeGENE HP DNA transfection reagent)的EpiLife培養液中。經10分鐘培養後，將該混合液分別加至在100 mm細胞培養皿內達50%~60%滿盤(confluency)的hpESCs或癌/腫瘤細胞上。在12~18小時後，以新鮮含HKGS補充劑之EpiLife培養液或ATCC建議的條件培養液更換原先的培養液。可每3~4天重複轉染步驟3~4次以增加轉染效率。當細胞形態轉變為球樣，則以補充有20%血清替代品(Knockout serum)、1% MEM非必需胺基酸、100 μM β-硫基乙醇、1mM GlutaMax、1mM丙酮酸鈉、10 ng/ml鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)、10 ng/ml FGF-4、5 ng/ml LIF、100 IU/ml盤尼西林/100 μg/ml鏈黴素、0.1 μM A83-01、以及0.1 μM丙戊酸(Stemgent，San Diego，CA)之knockout DMEM/F-12培養基以及37℃、5% CO2的條件培養與繼代該些細胞(mirPSCs)。 3.蛋白質萃取與西方墨點分析法
    以補充有蛋白酶抑制劑(protease inhibitor)、亮抑酶肽(Leupeptin)、TLCK、TAME及PMSF的CelLytic-M溶解/萃取試劑(CelLytic-M lysis/extraction reagent，Sigma)溶解細胞(1,000,000顆)，如製造商建議。接著以12,000 rpm於4℃離心該溶解液20分鐘，再取得離心後的上清液。然後以改良過之SOFTmax蛋白質測定套裝軟體在一E-max微量盤測讀儀(microplate reader，Molecular Devices，CA)上測量蛋白質濃度。在還原(reducing，+50 mM DTT)及非還原(non-reducing，無DTT)的條件下，各將30 μg之細胞溶解產物加至SDS-PAGE樣本緩衝液中，並在裝載到6%~8%聚丙烯醯胺凝膠上之前沸騰3分鐘。接著以SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)解析蛋白質，而後將蛋白質電轉漬至一硝酸纖維膜上(nitrocellulose membrane)，並將該膜培養於奧德塞阻斷試劑(Odyssey blocking reagent，Li-Cor Biosciences，Lincoln，NB)中，在室溫下存放2小時。然後，在該試劑中加入一初級抗體並存放該混合物於4℃下作用。使用的初級抗體包括：Oct3/4(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)、Sox2(Santa Cruz)、Nanog(Santa Cruz)、CDK2(Santa Cruz)、cyclin D1(Santa Cruz)、cyclin D2(Abcam)、BMI-1(Santa Cruz)、keratin 16(Abcam)、ß-actin(Chemicon，Temecula，CA)、RuvB(Santa Cruz)，以及RGFP(Clontech)。經過一夜後，以TBS-T漂洗該膜三次，然後將其暴露在羊抗小鼠IgG(goat anti-mouse IgG)二級抗體中室溫下1小時；其中該羊抗小鼠IgG和Alexa Fluor 680反應性染料(1：2,000；Invitrogen-Molecular Probes)結合形成二級抗體。再經三次TBS-T漂洗後，使用Li-Cor奧德塞紅外線影像儀(Li-Cor Odyssey Infrared Imager)及奧德塞軟體第10版(Li-Cor)來處理免疫轉漬之螢光掃描及影像分析。 4.蛋白質萃取與北方墨點分析法
    以mirVanaTM微型核糖核酸分離工具(Ambion，Austin，TX)分離總體核糖核酸(10 μg)。接著，以15% TBE-尿素聚丙烯醯胺凝膠或3.5%低熔點瓊脂凝膠電泳分餾該核糖核酸，並將該分餾後之核糖核酸電轉漬至尼龍膜(nylon membrane)上。接著以[LNA]-DNA探針(5’-[TCACTGAAAC]ATGGAAGCAC TTA-3’)(SEQ.ID.NO.1)偵測miR-302及/或pre-miR-302。該探針係經高效液相層析法(HPLC)純化，並且在[32P]-dATP(>3000 Ci/mM，Amersham International，Arlington Heights，IL)存在下以末端轉移酶(terminal transferase，20 units)進行20分鐘尾端標示。 5.質體擴增與質體DNA/總體RNA萃取
    將以質體轉型(實施例1)之勝任大腸桿菌DH5α細胞於37℃隔夜培養於補充有10 mM硫酸鎂及0.2 mM葡萄糖的LB培養基中，並以170 rpm頻繁震盪之。除了擴增作用以外，上述培養基之每1公升並另添加0.5~2 ml MOPS、甘油、及/或乙醇以誘發真核啟動子驅動之核糖核酸及/或蛋白質生產。使用質體純化工具(HiSpeed plasmid purification kit，Qiagen，Valencia，CA)將所有擴增的質體DNA及所表現的mRNA/microRNAs一起分離出來；其中分離步驟係依據製造商建議步驟但同時作些許調整，即不將核糖核酸酶RNase A加入至P1緩衝液內。包含質體及mRNAs/microRNAs兩者的最終萃取產物係溶解於經DEPC處理的二次水(ddH2O)中，並存放於-80℃直到使用。若僅要純化擴增的質體載體，則依據製造商建議步驟將核糖核酸酶RNase A加入至P1緩衝液內。 6. MicroRNA與mRNA分離/純化
    進一步使用mirVanaTM miRNA分離工具(Ambion，Austin，TX)純化以實施例5之方法分離出來的RNA總體，依據製造商建議。終產物係溶解於經DEPC處理的二次水(ddH2O)中，並存放於-80℃直到使用。由於細菌RNAs在自然情況下降解非常快速(幾小時)，但真核poly-A RNAs(mRNAs)及髮夾樣的microRNA前驅物(pre-miRNA或pri-miRNA)於4℃下相對穩定(半生期可至3~4天)，吾人可利用此差異性取得純的mRNAs及/或pre-miRNAs以供之後應用。舉例來說，RGFP的mRNA可用於轉染細胞的驗明，而pre-miR-302s可用於重新編程體細胞為胚胎幹細胞樣(ESC-like)的iPS細胞。能將純化後的pre-miR-302s加入至幹細胞培養液內以促進及維持該重新編程。 7.免液染色分析
    組織樣本的包埋、切片、及染色係如先前報導所描述(林(Lin)等人，RNA 2008)。初級抗體包括Oct3/4(Santa Cruz)、Sox2(Santa Cruz)、Nanog(Santa Cruz)，以及RGFP(Clontech)。使用以螢光染料標記的羊抗兔(goat anti-rabbit)或馬抗小鼠(horse anti-mouse)抗體作為二級抗體(Invitrogen-Molecular Probes)。使用螢光80i顯微鏡定量分析系統(fluorescent 80i microscopic quantitation system)及Metamorph影像處理程式(Nikon)在100×或200×之放大倍率下檢驗與分析結果。 8.亞硫酸氫鹽DNA定序
    使用DNA分離工具(DNA isolation kit，Roche)自約2,000,000顆細胞分離基因體DNAs。取1 μg分離的DNAs，並依據製造商建議之方式以亞硫酸氫鹽(CpGenome DNA modification kit，Chemicon，Temecula，CA)處理之。亞硫酸氫鹽之處理會將所有無甲基化之胞嘧啶轉變成尿嘧啶，而甲基化之胞嘧啶則仍維持為胞嘧啶。在亞硫酸氫鹽DNA定序分析方面，吾人以聚合酶連鎖反應(PCR)擴增Oct3/4及Nanog的啟動子區域。擴增Oct3/4啟動子區域使用的引子包含5’-GAGGCTGGAG CAGAAGGATT GCTTTGG-3’(SEQ.ID.NO.2)及5’-CCCTCCTGAC CCATCACCTC CACCACC-3’(SEQ.ID.NO.3)；擴增Nanog啟動子區域使用的引子包含5’-TGGTTAGGTT GGTTTTAAAT TTTTG-3’(SEQ.ID.NO.4)及5’-AACCCACCCT TATAAATTCT CAATTA-3’(SEQ.ID.NO.5)。首先，將經亞硫酸氫鹽修飾的DNAs(50 ng)與該等引子(總共100 pmole)在1倍PCR緩衝液中混合，加熱至94℃後持續2分鐘，然後立即於冰上冷卻。其後，進行25個如下之PCR循環：在94℃下進行1分鐘，在70℃下進行3分鐘，且使用一高準確度PCR工具(Expand High Fidelity PCR kit，Roche)。進一步以3%瓊脂凝膠電泳法分餾出具有正確長度之擴增的DNA產物，接著以膠體萃取工具(Qiagen)純化該DNA產物，然後進行DNA定序。藉由比較經亞硫酸氫鹽修飾之DNA序列中未改變的胞嘧啶與未經亞硫酸氫鹽修飾之DNA序列中未改變的胞嘧啶可獲得DNA甲基化位置之詳細圖譜。 9.細胞侵犯試驗
    單獨使用200 μg/ml Matrigel或使用補充有20% FBS及1%左旋麩醯胺酸(L-Glutamine)於不含酚紅DMEM培養液之Matrigel來塗覆插入腔(chamber inserts，孔徑12 μm，Chemicon)，並且將插入腔置於無菌環境下隔夜變乾。使用不含酚紅的DMEM培養液收集、淋洗、及懸浮細胞，並最終達100,000顆/ml的細胞密度。取500 μl該細胞懸浮液分配到上層腔(top chamber)內，而將1.5 ml DMEM條件培養液加入到下層腔當中以製造一趨化梯度(chemotactic gradient)。在37℃中隔夜培養16小時後，量測侵犯情況。以脫脂棉將上層腔擦乾，然後使用100%甲醇固定位在膜下側的侵犯細胞10分鐘、風乾，以甲酚紫(cresyl violet)染色20分鐘，再和緩地以水清洗。待其變乾之後，使用含1：1 100%乙醇及0.2 M檸檬酸鈉(NaCitrate)的洗液洗提膜上的甲酚紫染色20分鐘，並以Precision微量盤測讀儀(Precision Microplate Reader，Molecular Dynamics)讀取波長570 nm的吸光值。比較受測樣本的吸光值與在不擦乾插入腔膜層(總細胞數)下所得吸光值，以獲得侵犯細胞的百分比。結果表示於圖10A。 10.細胞貼附試驗
    細胞貼附試驗之進行如先前報導所描述(Lin等人，Cancer Res.2010)。將人類骨髓內皮細胞(hBMECs)以100,000顆/ml的密度種於96孔盤中，並且在進行試驗之前以貼附培養液(adhesion medium)[RPMI 1640/0.1% BSA/20 mM HEPES(pH7.4)]淋洗。使用胰蛋白酶(用於腫瘤/癌細胞)或膠原蛋白酶(用於mirPS細胞)將受測細胞分離下來，以無菌生理食鹽水淋洗細胞，然後讓細胞以1,000,000顆/ml的密度再懸浮於含有10 μM fura-4乙醯氧甲基酯(acetoxymethyl ester，fluorescent probe，Sigma)的PBS中，在37℃的黑暗環境下存放1小時。接著將該細胞離心並以含有1%(v/v)丙璜舒(probenecid，100 mM)的不含血清之培養液淋洗細胞，然後將該細胞培養於貼附培養液及37℃的黑暗環境20分鐘，以活化細胞內的螢光探針。之後，將該100,000顆細胞(在300 μl的細胞懸浮液/well)加至滿盤的(confluent)hBMEC內皮細胞單層上，並在37℃培養50分鐘。使用250 μl的貼附培養液淋洗兩次，將未貼附的細胞移走。使用一螢光盤測讀儀(fluorescent plate reader，Molecular Dynamics)在37℃下以激發波長485 nm及發射波長530 nm來讀取螢光。結果表示於圖10B。 11.移植與畸胎瘤形成
    將大約5~10個衍生自mirPS細胞的類胚胎體(4~8細胞階段)懸浮於50 μl的DMEM培養液與基底膜基質Matrigel之2：1混合液中，接著將該等衍生自mirPS細胞的類胚胎體移植到一六週大雌性假性懷孕免疫功能不足之SCID-beige小鼠的子宮中。產生該假性懷孕小鼠的方法為在腹膜內注射1 IU之人類停經後促性腺激素(human menopausal gonadotrophin，HMG)兩天，然後再注射人類絨毛膜性腺激素(human chorionic gonadotrophin，hCG)一天。在移植期間，使用2.5%的三溴乙醇(Avertin)溶液，以每隻小鼠0.4 ml的劑量麻醉小鼠。在移植後或者當該移植細胞團發展至超過100 mm3大小時，監看該異種移植團(xenografted masses)3~4週。將該囊腫/畸胎瘤切下之後，使用公式：(長×寬2)/2計算其體積，並且再對其進行計數、秤重及進一步的組織學分析。畸胎瘤樣組織囊腫的形成(teratoma-like tissue cysts)通常在移植後大約2.5週可觀察到。結果如圖11A所示。 12.活體內腫瘤發生試驗
    吾人將Tera-2細胞(在總體積100 μl之Matrigel-PBS中的2,000,000顆細胞)異種移植到八週大雄性小鼠(BALB/c nu/nu品系)的脅腹中(例如右後肢)。對該腫瘤進行每週監測，並且在異種移植Tera-2後一週，以原位注射將pre-miR-302s或編碼pre-miR-302的質體載體如pCMV-miR302s載體或pCMV-miR302d ＊載體導入其中。以2 μg(每克小鼠重)經由聚乙烯亞胺(PEI)製備的pCMV-miR302s或pCMV-miR302d ＊載體(總重10 μg)，進行5次處理(兩次處理間間隔三天)。依照製造商之使用建議，使用體內-jetPEI傳送試劑(Polyplus-transfection Inc.，New York，NY)。在注射完三週後，或當無經載體處理的腫瘤生長至大約100 mm3的平均大小後始收集樣本。取出主要器官像是血液、腦、心、肺、肝、腎和脾，以及異種移植瘤以進行腫瘤之組織學評估及免疫反應細胞毒性測試。其中，以觸診監測腫瘤的形成，並以(長×寬2)/2的公式計算腫瘤體積。此外，亦對腫瘤進行計數、解剖、與秤重，並以蘇木紫-伊紅染色(H&E)及免疫染色試驗進行組織學檢驗。組織學檢驗未顯示在腦、心、肺、肝、腎和脾中有偵測得到的組織病變。結果示於圖11A與11C。 13.活體傷口癒合試驗
    Pre-miR-302s及其相關質體載體係以描述於實施例1與5中的方法擴增，並以描述於實施例5與6中的方法萃取。接著，分離之pre-miR-302s其相關質體載體係與預先準備的含有可可脂、棉籽油、橄欖油、丙酮酸鈉、以及白凡士林的軟膏基劑混合。該miR-302前驅物在準備的軟膏基劑內的濃度為10 μg/mL。由解剖刀割開皮膚來產生皮膚的開放性傷口；產生大約0.5 cm的傷口作為控制組，且產生1.0 cm的傷口作為實驗組。將軟膏(約0.3 mL)直接塗在傷口上，覆蓋整個受傷區域。接著，進一步以液體繃帶(liquid bandage)將處理的區域封好。 14.統計分析
    在免疫染色、西方墨點以及北方墨點的分析上，任何大於75%的訊號強度變化即被視為一陽性結果，該等結果經分析後以平均值±標準差(mean±SE)表示之。資料之統計分析係以單因子變異數分析(one-way ANOVA)來計算。當主要效應顯著時，使用杜納的事後比較(Dunnett’s post-hoc test)來鑑別與控制組有顯著差異之群(組)。在兩處理組之間進行配對比較時，使用雙尾司徒頓t檢驗(two-tailed student t test)。對於包含超過兩處理組之實驗，則在ANOVA後進行一事後多變域測驗(post-hoc multiple range test)。機率值p<0.05被認為是具有統計上的意義。所有p值係由雙尾檢定來決定。
    明確言之，以下說明的圖示僅供舉例說明之用而非限制本發明：圖1A~1B所示為一可誘導的pol-2啟動子驅動之基因表現組成物(A)與其在原核或真核細胞內產生RNA轉錄分子與蛋白質、以及在真核細胞內產生微型核糖核酸的機制(B)。本發明使用pLenti-EF1α-RGFP-miR302組成物作為示範實例；以該組成物將E.coli DH5α細胞轉型，以在MOPS、甘油、及/或乙醇的誘導下生產RGFP的傳訊核糖核酸與蛋白質，以及miR-302微型核糖核酸及/或其前軀物。pLenti-EF1α-RGFP-miR302為一慢病毒(lentiviral)質體載體，其係設計來在原核與真核細胞內表現各種微型核糖核酸/小髮夾型核糖核酸、傳訊核糖核酸、及/或蛋白質/肽類。如本發明之教示，本領域所屬技藝者可依據(B)所揭示之機制，使用任何微型核糖核酸/小髮夾型核糖核酸取代miR-302，或使用任何傳訊核糖核酸/蛋白質取代RGFP。黑色箭頭表示該途徑發生於原核與真核細胞，空白箭頭表示該些步驟僅在真核細胞內發生。
    圖2所示為在經過(左)或未經(右)0.1%(v/v)MOPS與0.05%(v/v)甘油之混合的處理後，各細菌培養基的結果。大腸桿菌在處理前係以pLenti-EF1α-RGFP-miR302轉型。
    圖3所示為在經過0.1%(v/v)MOPS的處理後，所產生的不同細菌團塊(pellets)。大腸桿菌在經MOPS處理前係以pLVX-Grn-miR302+367(綠)或pLenti-EF1α-RGFP-miR302(紅)轉型。
    圖4所示為在勝任E.coli DH5α細胞內，不同化學物質誘導pol-2啟動子驅動之基因表現的能力。在本發明所有測試的化學物質當中，MOPS、乙醇、及甘油三者為最有效的誘導物。可用的化學物質的濃度範圍為0.001%~4%，較佳係自0.01%~1%。
    圖5所示為在MOPS、甘油，以及乙醇的分別誘導下，RGFP蛋白質的表現的西方墨點分析結果。細菌的RuvB蛋白質的常務性表現係作為將RGFP表現正規化(normalize)的基準(house-keeping standard)。來自空白(blank)E.coli DH5α細胞(即沒有以載體轉型)的蛋白質抽出物係作為負控制組。
    圖6所示為在MOPS、甘油，以及乙醇的分別誘導下，miR-302與其前軀微型核糖核酸群集(pre-miRNA cluster)的表現的北方墨點分析結果。來自空白(blank)E.coli DH5α細胞(即沒有以載體轉型)的核糖核酸抽出物係作為負控制組。
    圖7所示為使用分離自細菌抽出物(bacterial extracts，BE)的miR-302及/或pre-miR-302生成iPS細胞。該抽出物之北方墨點分析結果示於圖6。如先前的報導，miR-302重新編程之iPS細胞(mirPSCs)形成為球樣的細胞群落，並強烈表現Oct4，即標準的ESC指標。
    圖8所示為Oct4與Sox2基因的啟動子區域發生整體的DNA的去甲基化(global DNA demethylation)；該甲基化是由分離自細菌抽出物(BE)的miR-302及/或pre-miR-302(如圖6所示北方墨點分析)所誘導。如Simonsson與Gurdon(Nat Cell Biol.6，984-990，2004)之教示，整體DMA的去甲基化及Oct4表現係體細胞重新編程所需。
    圖9A~9C與10A~10B所示為經miR-302及/或pre-miR-302處理，各種腫瘤/癌細胞的體外腫瘤發生能力試驗的結果。經miR-302及/或pre-miR-302處理後所得細胞稱mirPS細胞，包含衍生自乳癌的mirPS-MCF7細胞、衍生自肝癌的mirPS-HepG2細胞、以及衍生自胚胎性畸胎癌(embryonal teratocarcinoma)的mir-PS-Tera2細胞。其中圖9A~9B所示為miR-302及/或pre-miR-302處理前後細胞形態與細胞週期速率之改變。各細胞週期階段對應的DNA含量之流式細胞儀分析結果以圖表表示於細胞形態學上方(n=3，p<0.01)。圖9C：流式細胞儀分析結果之長條圖顯示miR-302及/或pre-miR-302對於來自各種腫瘤/癌細胞之細胞群在有絲分裂(M期)及休眠(G0/G1期)變化上的劑量相關效應。圖10A：miR-302抑制腫瘤細胞在Matrigel小室中的侵犯行為的功能性分析(n=4，p<0.05)。圖10B：在miR-302及/或pre-miR-302處理前後比較細胞在人類骨髓內皮細胞(hBMEC)單層之貼附(n=4，p<0.05)。
    圖11A~11C所示為在miR-302家族群集(Tera2+mir-302s)或反義miR-302d(Tera2+mir-302d＊)處理下，胚胎性畸胎癌細胞(Tera-2)在活體內腫瘤發生試驗中的結果(n=3，p<0.05)。胚胎性畸胎癌常含有各種源自三個胚層(embryonic germ layer)即外胚層、中胚層、及內胚層的腫瘤/癌細胞；該混合型的腫瘤組織可用於抗腫瘤/癌症藥物的測試。(A)實施原位注射(post-is)後經過三週，對平均腫瘤大小進行型態學評估。所有的腫瘤皆位於原本植入的位置(黑色箭頭所指之處)。在所有受試小鼠中皆沒有觀察到惡病質或腫瘤轉移的症候。(B)北方墨點分析與西方墨點分析以及(C)免疫組織化學染色分析圖顯示體內miR-302對於核心重新編程因子Oct3/4-Sox2-Nanog與miR-302標的的G1檢控點調節者：週期素依賴性激酶2(CDK2)、週期素D1/D2(cyclins D1/D2)、BMI-1、以及p16Ink4a和p14Arf的表現型態之效應。
    圖12所示為使用含有微型核糖核酸miR-302及/或pre-miR-302的軟膏治療小鼠皮膚的開放性傷口的活體傷口癒合試驗。將要以miR-302及/或pre-miR-302治療的小鼠的皮膚傷口係為將要僅以空白軟膏或其他微型核糖核酸(miR-HA)治療的小鼠的皮膚傷口的至少兩倍大。此試驗清楚揭示miR-302及/或pre-miR-302的處理顯著增進傷口癒合速度，該癒合速度超過所有其他處理組與控制組之癒合速度的兩倍。再者，miR-302及/或pre-miR-302治療後的傷口癒合區域顯現正常的毛髮再生長，並且不留有疤痕；相較之下，其他組處理的結果是留有小疤痕且無毛髮生長(黑色箭頭所指)。
    <110> Lin,Shi-Lung林希龍Chang,Donald C.張欽次
    <120> 用於在原核細胞內使用真核第二型聚合酶啟動子驅動之轉錄作用的可誘導之基因表現組成物及其應用/An Inducible Gene Expression Composition for Using Eukaryotic Pol-2 Promoter-Driven Transcription in Prokaryotes and the Applications Thereof
    <130> 11P044002TWA
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    <160> 5
    <170> PatentIn version 3.5
    <210> 1
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    <220>
    <223> 化學合成寡核苷酸
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    <212> RNA
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    <223> 引子
    <400> 5
    权利要求:
    Claims (43)
    [1] 一種用於在原核細胞內調節真核啟動子驅動之基因表現的組成物，包含：一化學媒介物，含有一結構相似於3-嗎啉丙烷磺酸(3-morpholinopropane-1-sulfonic acid，MOPS)、乙醇、甘油，或其混合物。
    [2] 如申請專利範圍第1項所述之組成物，其中該化學媒介物為一基因表現的轉錄誘導物。
    [3] 如申請專利範圍第1項所述之組成物，其中該組成物進一步包含一細菌培養基。
    [4] 如申請專利範圍第3項所述之組成物，其中該化學媒介物具有在該細菌培養基內0.01%~1%的體積濃度(v/v)。
    [5] 如申請專利範圍第3項所述之組成物，其中該細菌培養基為LB培養基。
    [6] 如申請專利範圍第1項所述之組成物，其中該基因編碼至少一蛋白質或非編碼核糖核酸，或兩者，且係用於藥學上或治療上的應用。
    [7] 如申請專利範圍第6項所述之組成物，其中該非編碼核糖核酸係用於藥學上或治療上的應用。
    [8] 如申請專利範圍第6項所述之組成物，其中該非編碼核糖核酸為一miR-302同源物。
    [9] 如申請專利範圍第6項所述之組成物，其中該蛋白質係用於藥學上或治療上的應用。
    [10] 如申請專利範圍第6項所述之組成物，其中該藥學上或治療上的應用選自由生成多能性幹細胞、幹細胞研究與治療、癌症治療與疾病處理、傷口癒合處理、以及提高食物產量與藥物供給所組成之群組。
    [11] 一種用於在原核細胞內調節真核啟動子驅動之基因表現的組成物，包含：(a)至少一化學媒介物，能夠誘導或促進真核啟動子驅動之基因表現；以及(b)複數個原核細胞，該等原核細胞含有至少一基因，該基因受到由一真核啟動子驅動表現之機制的調控；其中(a)與(b)係在一條件下混合，並誘發該基因由真核啟動子驅動之基因表現。
    [12] 如申請專利範圍第11項所述之組成物，其中每一該原核細胞具有至少一可誘導的基因表現組成物。
    [13] 如申請專利範圍第12項所述之組成物，其中該可誘導的基因表現組成物為一載體，該載體含有一真核啟動子。
    [14] 如申請專利範圍第11項所述之組成物，其中該基因編碼至少一非編碼核糖核酸或蛋白質編碼核糖核酸，或兩者。
    [15] 如申請專利範圍第14項所述之組成物，其中該非編碼核糖核酸含有至少一序列，該序列與一微型核糖核酸具有30%~100%的同源性。
    [16] 如申請專利範圍第14項所述之組成物，其中該非編碼核糖核酸為一小髮夾樣核糖核酸。
    [17] 如申請專利範圍第14項所述之組成物，其中該蛋白質編碼核糖核酸含有至少一序列，該序列與一微型核糖核酸具有30%~100%的同源性。
    [18] 如申請專利範圍第14項所述之組成物，其中該蛋白質編碼核糖核酸與一真核基因的一互補去氧核糖核酸序列具有30%~100%的同源性。
    [19] 如申請專利範圍第14項所述之組成物，其中該非編碼核糖核酸或蛋白質編碼核糖核酸係自該原核細胞分離。
    [20] 如申請專利範圍第11項所述之組成物，其中該基因編碼至少一蛋白質或肽類，或兩者。
    [21] 如申請專利範圍第20項所述之組成物，其中該蛋白質含有至少一肽類序列。
    [22] 如申請專利範圍第20項所述之組成物，其中該蛋白質或肽類係自該原核細胞分離。
    [23] 如申請專利範圍第20項所述之組成物，其中該蛋白質為一酵素或一抗體。
    [24] 如申請專利範圍第20項所述之組成物，其中該蛋白質含有一相似於胰島素之肽類序列。
    [25] 如申請專利範圍第20項所述之組成物，其中該蛋白質含有一相似於生長因子之肽類序列。
    [26] 如申請專利範圍第11項所述之組成物，其中該原核細胞為細菌細胞。
    [27] 如申請專利範圍第11項所述之組成物，其中該原核細胞為大腸桿菌細胞(Escherichia coli，E.coli)。
    [28] 如申請專利範圍第11項所述之組成物，其中該化學媒介物為基因表現中的一轉錄誘導物。
    [29] 如申請專利範圍第11項所述之組成物，其中該化學媒介物含有一結構相似於3-嗎啉丙烷磺酸(3-morpholinopropane-1-sulfonic acid，MOPS)、乙醇、甘油，或其混合物。
    [30] 如申請專利範圍第11項所述之組成物，其中該真核啟動子為一第二型核糖核酸聚合酶(type II RNA polymerase，pol-2)的同等物或一pol-2兼容性病毒啟動子。
    [31] 如申請專利範圍第30項所述之組成物，其中該pol-2兼容性病毒啟動子為一人類巨細胞病毒啟動子(cytomegaloviral (CMV)promoter)或一反轉錄病毒LTR啟動子(retrovoral long terminal repeat(LTR)promoter)。
    [32] 如申請專利範圍第11項所述之組成物，其中該真核啟動子驅動之表現為一細胞內機制，該細胞內機制包含核糖核酸轉錄與蛋白質轉譯。
    [33] 如申請專利範圍第11項所述之組成物，其中該條件為37℃的LB培養基的一細菌培養條件。
    [34] 如申請專利範圍第11項所述之組成物，其中該化學媒介物在該條件下具有0.01%~1%的體積濃度(v/v)。
    [35] 如申請專利範圍第14項所述之組成物，其中該非編碼核糖核酸係用於藥學上或治療上的應用。
    [36] 如申請專利範圍第14項所述之組成物，其中該蛋白質編碼核糖核酸係用於藥學上或治療上的應用。
    [37] 如申請專利範圍第14項所述之組成物，其中該非編碼核糖核酸為一miR-302同源物。
    [38] 如申請專利範圍第15項所述之組成物，其中該微型核糖核酸為一miR-302同源物。
    [39] 如申請專利範圍第17項所述之組成物，其中該微型核糖核酸為一miR-302同源物。
    [40] 如申請專利範圍第20項所述之組成物，其中該蛋白質或肽類係用於藥學上或治療上的應用。
    [41] 如申請專利範圍第35項所述之組成物，其中該藥學上或治療上的應用選自由生成多能性幹細胞、幹細胞研究與治療、癌症治療與疾病處理、傷口癒合處理、以及提高食物產量與藥物供給所組成之群組。
    [42] 如申請專利範圍第36項所述之組成物，其中該藥學上或治療上的應用選自由生成多能性幹細胞、幹細胞研究與治療、癌症治療與疾病處理、傷口癒合處理、以及提高食物產量與藥物供給所組成之群組。
    [43] 如申請專利範圍第40項所述之組成物，其中該藥學上或治療上的應用選自由生成多能性幹細胞、幹細胞研究與治療、癌症治療與疾病處理、傷口癒合處理、以及提高食物產量與藥物供給所組成之群組。
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