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    • 专利摘要:
    本發明之課題係提供可一邊保持高度中和活性、同時對胎兒之影響或血栓形成等副作用風險降低之安全性優良的抗人類NGF抗體或其抗原結合片段；以及使用了該抗體或其抗原結合片段之人類NGF與病態形成相關之各種疾病的預防或治療手段。其解決手段為一種抗人類NGF抗體Fab’片段，其係包含由序列編號6所示之胺基酸序列所構成之重鏈可變區域、及由序列編號4所示之胺基酸序列所構成之輕鏈可變區域。
    公开号:TW201319086A
    申请号:TW101128963
    申请日:2012-08-10
    公开日:2013-05-16
    发明作者:Masazumi Kamohara；Hirotsugu Tanaka；Yukari Koya；Jun Takasaki；Atsuo Yonezawa；Eiji Yoshimi
    申请人:Astellas Pharma Inc；
    IPC主号:C07K16-00
    专利说明:
    新穎抗人類NGF抗體
    本發明係關於新穎之抗人類NGF抗體、更具體而言係關於抗人類NGF抗體之Fab’片段。
    神經成長因子(nerve growth factor；NGF)係總稱為神經營養因子(neurotrophic factor)之體液因子之一，於生體內係在神經元之發育、分化、功能維持上擔當著重要角色。作為NGF之受體，已知有高親和性之trkA受體(受體型酪胺酸激酶)與低親和性之p75NTR受體。其中p75NTR雖被報導與全部之神經營養因子結合，於神經元之發育過程中與細胞凋亡有所相關，但其角色尚未充分解明。另一方面，已知NGF與trkA受體之基因剔除小鼠會顯示同樣的表現型(非專利文獻1)，可認為NGF之生理作用主要係透過trkA受體而表現。
    1993年有報導藉由對大鼠投與NGF會誘發疼痛(非專利文獻2)，之後，報導了對人類之NGF的靜脈內投與會產生全身性的肌肉痛、且藉由局部投與，除了全身效果外，會誘發注射部位之痛覺過敏及異常性疼痛(非專利文獻3)。進一步地，於trkA受體之基因剔除小鼠被報導有痛覺喪失(非專利文獻4)，可認為NGF係與疼痛之表現強烈相關的分子。關於與人類疼痛病態之關聯性，已實證了於變形性關節症(osteoarthritis；OA)之關節軟骨中NGF/trkA的表現會亢進(非專利文獻6)、或者於風濕性關節炎(非專利文獻7)或間質性膀胱炎(非專利文獻8)之患者中NGF的量會上昇。
    由該等事實來看，若能夠開發與NGF特異地結合，而具有阻礙其作用之活性的單株抗體，則會被期待有用於以疼痛為首之與NGF相關聯的各種疾病的治療、預防、診斷。
    到現在為止臨床開發有進展之對人類NGF的抗體，被報導有人類化抗人類NGF抗體之Tanezumab(專利文獻1)及PG110(專利文獻2)、完全人類型抗人類NGF抗體之REGN475(專利文獻3)、Fulranumab(專利文獻4)、及MEDI-578(專利文獻5)。其中尤以Tanezumab之開發最為進展，由其臨床結果，報導了對於伴隨著變形性關節症之關節痛、慢性腰痛、伴隨著間質性膀胱炎之膀胱痛等疼痛，顯示了強力且廣範圍的鎮痛效果(非專利文獻9~11)。
    一般而言，規定抗體醫藥之有效投與量的主要重要因子，雖可列舉抗體所具有之對抗原的中和活性、或存在體內之抗原量，但提高中和活性係與投與量之降低有相關，結果可說是亦可達成患者經濟負擔或醫療成本之降低的極有益之改良。又，若能夠實現投與量之降低，則亦能夠進行皮下投與。皮下投與係聚有若滿足一定之條件則可在自宅自我注射之最大的優點，且一般而言，靜脈內投與在多數狀況時，相對於耗費一定時間進行點滴投與，皮下投與在能夠大量輸注(bolus)來投與之觀點亦為有用，對醫師與患者雙方來說，期望能夠選擇靜脈內投與製劑與皮下投與製劑。但是，一般而言，皮下投與中1次能夠投與之容量為1mL左右之少量，為了在此液量中表現藥效必須含有充分之抗體。又，與靜脈內投與不同地，亦必須考慮生物有效性。亦即，為了實現皮下投與之製劑，係要求製造溶解性優良、且於低用量亦可表現充分的藥效之抗體。因此，取得相較於以往的抗體，對NGF之中和活性更高之抗體，對於與NGF相關聯之疾病的治療及提高其便利性而言，係有用的。
    又，如前所述，NGF雖為神經元之生長之重要因子，在開發阻礙NGF功能之醫藥品當中，由安全性觀點來看亦必須充分地探討。特別是作為關於安全性應探討之事項之一，可列舉對胎兒之影響。至現在為止，關於NGF之功能阻礙，被報導了NGF突變為先天性無痛症之原因(非專利文獻5)、或於動物實驗中，使懷孕天竺鼠產生對NGF之自體抗體而阻礙生體內之NGF時，出生之新生天竺鼠會呈現無痛症狀(非專利文獻12)。又，由使用了NGF或trkA缺損小鼠之試驗，亦已實證了藉由NGF作用之欠缺，胚胎的感覺神經及交感神經之神經元生長會被阻礙(非專利文獻4及13)，由該等事實，亦理解了NGF係為發育初期之神經生長所必須因子。另一方面，NGF所關聯之疾病中，亦包含間質性膀胱炎(患者之半數以上為44歲以下、且患者之90%為女性(非專利文獻14))、慢性腰痛(平均年齡為40~50歲、且患者之50%強為女性(非專利文獻15~17))、偏頭痛(於15~40歲好發，且患者之80%為女性(非專利文獻18))等於懷孕適齡期之女性會以高比例產生之疾病。由如此狀況看來，開發抗NGF抗體作為醫藥品時，迴避對於懷孕中女性之胎兒之副作用風險極為重要。
    又，開發抗NGF抗體作為醫藥品時的別的風險重要因子，可列舉免疫複合體(IC)之形成。抗體與抗原結合之免疫複合體，通常係於脾臓或肝臓等網狀內皮系統處理，但免疫異常等之病態時、或所形成之IC的大小為大時，IC會喪失可溶性，提高血栓形成之風險，且會累積於腎絲球體，與腎炎的發病有相關聯。IgG為2價抗體，但抗原為多價時，IC會因晶格形成(lattice formation)而可為各種大小。IC之大小係依存於抗體與抗原之量的比、抗體之親和性等，例如，抗VEGF抗體Bevacizumab(商品名：癌思停、Avastin)為IgG1抗體，此係有報導與二聚體之VEGF結合形成IC，而誘發血栓形成。具體而言，係觀察到對人類FcγRIIα受體Tg小鼠投與癌思停與VEGF時會形成肺動脈血栓(非專利文獻19)。進一步地，有報導接受化學療法與癌思停之治療的轉移性癌之患者，相較於僅有化學療法之安慰劑群，動脈血栓之發生率更高(非專利文獻20)。由NGF亦於生體內形成二聚體而發揮生理作用來看，於抗NGF抗體之醫藥品開發中，亦希望迴避IC形成之風險，更提高安全性。
    由該等事實來看，取得一邊保持高度中和活性，同時對胎兒之影響或血栓形成等副作用風險降低之安全性優良的抗NGF抗體，於NGF相關聯之各種疾病的治療或預防係極為重要。
    [先前技術文獻]
    [專利文獻]
    [專利文獻1]WO2004/058184
    [專利文獻2]WO2005/061540
    [專利文獻3]WO2009/023540
    [專利文獻4]WO2005/019266
    [專利文獻5]WO2006/077441
    [非專利文獻]
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    本發明之課題為提供一邊保持高度中和活性，同時對胎兒之影響或血栓形成等副作用風險降低之安全性優良的抗人類NGF抗體或其抗原結合片段。
    本發明係包含以下發明，作為醫學上或產業上有用之物質/方法。
    [1]一種抗人類NGF抗體Fab’片段，其係包含由序列編號6所示之胺基酸序列所構成之重鏈可變區域、及由序列編號4所示胺基酸序列所構成之輕鏈可變區域。
    [2]如[1]之Fab’片段，其中前述Fab’片段之重鏈恆定區域為人類Igγ1恆定區域。
    [3]如[1]之Fab’片段，其中前述Fab’片段之輕鏈恆定區域為人類Igκ恆定區域。
    [4]如[1]之Fab’片段，其中前述Fab’片段之重鏈恆定區域為人類Igγ1恆定區域、且前述Fab’片段之輕鏈恆定區域為人類Igκ恆定區域。
    [5]如[1]之Fab’片段，其係包含由序列編號10、序列編號14、或序列編號16所示胺基酸序列所構成之重鏈片段、及由序列編號12所示胺基酸序列所構成之輕鏈。
    [6]如[1]~[5]中任一項之Fab’片段，其係與聚乙二醇結合。
    [7]一種聚核苷酸，其係包含編碼如[1]~[6]中任一項之Fab’片段之重鏈片段的序列。
    [8]一種聚核苷酸，其係包含編碼如[1]~[6]中任一項之Fab’片段之輕鏈的序列。
    [9]一種表現載體，其係包含如[7]及/或[8]之聚核苷酸。
    [10]一種宿主細胞，其係經如[9]之表現載體轉形。
    [11]如[10]之宿主細胞，其係由以下之(a)及(b)所構成群組中選擇：(a)經包含含有編碼如[1]~[6]中任一項之Fab’片段之重鏈片段之序列的聚核苷酸與含有編碼該Fab’片段之輕鏈之序列的聚核苷酸之表現載體轉形之宿主細胞；及(b)經包含含有編碼如[1]~[6]中任一項之Fab’片段之重鏈片段之序列的聚核苷酸之表現載體與包含含有編碼該Fab’片段之輕鏈之序列的聚核苷酸之表現載體轉形之宿主細胞。
    [12]一種生產如[1]~[6]中任一項之Fab’片段之方法，其係包含培養如[10]或[11]之宿主細胞，使抗人類NGF抗體Fab’片段表現之步驟。
    [13]一種疼痛治療藥，其係含有如[1]~[6]中任一項之Fab’片段。
    [14]如[13]之治療藥，其中前述疼痛係伴隨著變形性關節症之關節痛。
    [15]一種用以預防或處置疼痛之方法，其係包含投與如[1]~[6]中任一項之Fab’片段之步驟。
    [16]如[15]之方法，其中前述疼痛係伴隨著變形性關節症之關節痛。
    [17]如[1]~[6]中任一項之Fab’片段，其係使用於疼痛之預防或處置。
    [18]如[17]之Fab’片段，其中前述疼痛係伴隨著變形性關節症之關節痛。
    本發明之抗人類NGF抗體Fab’片段，係有用於人類NGF與病態形成相關之各種疾病的預防或治療。如此之本發明之抗人類NGF抗體Fab’片段，藉由其高度的中和活性，可帶來投與量之降低、投與間隔之擴大、投與方法之改善(例如、皮下注射劑)等在臨床應用中之優良的改善，而且係對胎兒之影響或血栓形成等副作用風險降低之安全性非常優良者，於人類NGF與病態形成相關之各種疾病的預防或治療帶來很大的貢獻。
    以下詳述本發明。
    本發明者等人，於製造抗人類NGF抗體或其抗原結合片段方面重複相當程度之創意探討，結果成功地製造了一邊保持高度中和活性的同時，對胎兒之影響或血栓形成等副作用風險降低之安全性優良的抗人類NGF抗體Fab’片段。
    抗體分子之基本構造，各類型共通地係由分子量5萬~7萬之重鏈與2~3萬之輕鏈所構成。重鏈通常係由含有約440個胺基酸之多肽鏈所構成，各類型具有特徵構造，對應於IgG、IgM、IgA、IgD、IgE而稱作γ、μ、α、δ、ε鏈。進一步地，IgG中存在有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，分別稱為γ1、γ2、γ3、γ4。輕鏈通常係由含有約220個胺基酸之多肽鏈所構成，已知有L型與K型2種，分別稱作λ、κ鏈。抗體分子之基本構造的胜肽構成，分別相同的2條重鏈及2條輕鏈係經由雙硫鍵(S-S鍵)及非共價鍵而鍵結，分子量為15萬~19萬。2種輕鏈不管與何種重鏈均可成對。個別的抗體分子，經常由相同的輕鏈2條與相同的重鏈2條所成。
    鏈內S-S鍵，重鏈有四個(μ、ε鏈有五個)、輕鏈有二個，於胺基酸每100~110個殘基形成一個環(loop)，此立體構造在各環間係類似，稱作構造單位或結構域(domain)。位於N端之結構域，在重鏈、輕鏈皆然，即使來自同種動物之同一類型(亞類型)之樣品，其胺基酸序列並非固定，而稱作可變區域，各結構域分別稱作重鏈可變區域(VH)及輕鏈可變區域(VL)。由此往C端側之胺基酸序列，在各個類型或亞類型中大致固定，而稱作恆定區域，各結構域分別以CH1、CH2、CH3或CL表示。
    抗體之抗原決定部位係由VH及VL構成，結合之特異性係依此部位之胺基酸序列而定。另一方面，與補體或各種細胞之結合等之生物學活性，係反映了各類型Ig之恆定區域構造的差別。重鏈與輕鏈之可變區域的可變性，已知大致侷限在於重輕鏈均存在之3個小的超可變區域，該等區域稱作互補性決定區域(CDR；由N端側起分別為CDR1、CDR2、CDR3)。可變區域之剩餘部分稱作框架區域(FR)，其較為固定。
    在抗體之重鏈恆定區域之CH1結構域與CH2結構域之間的區域稱為鉸鏈(hinge)區域，此區域係含有多數之脯胺酸殘基，且包含連結2條重鏈之複數個鏈間S-S鍵。例如，於人類之IgG1、IgG2、IgG3、IgG4之各鉸鏈區域，係包含構成重鏈間之S-S鍵的分別為2個、4個、11個、2個之半胱胺酸殘基。鉸鏈區域係對於木瓜酵素或胃蛋白酶等之蛋白質分解酵素的感受性高的區域。以木瓜酵素消化抗體時，重鏈會在比鉸鏈區域之重鏈間S-S鍵更靠N端側之位置被切斷，而分解為2個Fab片段與1個Fc片段。Fab片段係由輕鏈；與包含重鏈可變區域(VH)、CH1結構域與鉸鏈區域之一部分的重鏈片段所構成。以胃蛋白酶消化抗體時，重鏈會在比鉸鏈區域之重鏈間S-S鍵更靠C側之位置被切斷，生成F(ab’)2片段。F(ab’)2片段，係2個Fab’片段以鉸鏈區域中之重鏈間S-S鍵鍵結之二聚體構造的片段。Fab’片段係由輕鏈；與包含重鏈可變區域(VH)、CH1結構域與鉸鏈區域之一部分的重鏈片段所構成，此鉸鏈區域之部分係包含構成重鏈間S-S鍵之半胱胺酸殘基。Fab片段、F(ab’)2片段、Fab’片段，均包含可變區域，而具有抗原結合活性。
    本發明者等人製造成功之本發明之抗人類NGF抗體Fab’片段，係具有以下特徵之Fab’片段。
    包含由序列編號6所示胺基酸序列所構成之重鏈可變區域、及由序列編號4所示胺基酸序列所構成之輕鏈可變區域之抗人類NGF抗體Fab’片段。
    具體而言，本發明者等人，使用人類單株抗體開發技術「VelocImmune」(VelocImmune antibody technology；Regeneron公司(美國專利6596541號))小鼠來製造抗體，藉由使用了各種生物學活性試驗及物性試驗之抗體篩選，成功地鑑定本發明之抗人類NGF抗體Fab’片段。VelocImmune技術中，將內生性之免疫球蛋白重鏈及輕鏈之可變區域經所對應之人類可變區域置換之基因轉殖小鼠以目標抗原(例如、人類βNGF)誘發免疫後，取得表現抗體之小鼠淋巴系統細胞，藉由與小鼠骨髓瘤細胞進行細胞融合以製造融合瘤。接著，將此融合瘤細胞與目標之抗原特異地結合，對是否產生具有所期望之中和活性的抗體來篩選。此處所產生之抗體，係具有人類抗體之可變區域與小鼠抗體之恆定區域的抗體(本說明書中亦稱作嵌合抗體)。接著，若鑑定到與目標抗原特異地結合，具有所期望之中和活性的抗體時，即由該融合瘤細胞單離出編碼抗體之重鏈及輕鏈的可變區域之DNA，將該DNA與編碼所期望類型之人類抗體重鏈及輕鏈的恆定區域之DNA連結。使如此方式得到之編碼重鏈及輕鏈之基因於細胞內(例如、CHO細胞)表現，而產生抗體分子。藉由該方法製造的抗體之重鏈及輕鏈，係來自人類免疫球蛋白基因之「完全人類型」抗體之重鏈及輕鏈。
    本發明之抗人類NGF抗體Fab’片段，可基於本案說明書揭示之其重鏈可變區域及輕鏈可變區域之序列資訊，使用該領域公知之方法，由所屬技術領域中具有通常知識者輕易地製造。較佳為本發明之抗人類NGF抗體Fab’片段，其重鏈可變區域及輕鏈可變區域分別連結於人類抗體重鏈恆定區域之一部分(含有CH1結構域、與包含鉸鏈區域半胱胺酸之鉸鏈區域的一部分)及輕鏈恆定區域，而可作為完全人類型抗體Fab’片段被製造。具體而言，係製造具有編碼本發明之Fab’片段之重鏈可變區域胺基酸(序列編號6)之鹼基序列的重鏈可變區域基因片段、及具有編碼本發明之Fab’片段輕鏈可變區域胺基酸(序列編號4)之鹼基序列的輕鏈可變區域基因片段。進而，將此重鏈及輕鏈之可變區域基因與人類抗體之適當類型的重鏈恆定區域部分及輕鏈恆定區域之各基因連結，來製造完全人類型抗體Fab’片段之基因。接著，將此基因連結於適當的表現載體，導入培養細胞中。最後，培養此培養細胞，可由培養上清液中得到單株Fab’片段。
    編碼本發明之Fab’片段之重鏈可變區域及輕鏈可變區域的胺基酸之基因片段，可例如基於根據該重鏈可變區域及輕鏈可變區域之胺基酸序列而設計的鹼基序列，利用該領域公知之基因合成方法來合成。如此之基因合成方法，可使用WO90/07861記載之抗體基因之合成方法等所屬技術領域中具有通常知識者所公知之各種方法。
    接著，將上述可變區域基因片段與人類抗體之恆定區域基因連結而製造完全人類型抗體Fab’片段基因。人類抗體之恆定區域，不管何種亞類型之恆定區域(例如，重鏈為γ1、γ2、γ3或γ4；輕鏈為λ或κ鏈之恆定區域)均可選擇，但較佳為重鏈恆定區域可使用人類Igγ1；輕鏈恆定區域可使用人類Igκ。
    此完全人類型抗體Fab’片段基因之製造後，接著，關於該基因對表現載體之導入、表現載體對培養細胞之導入、培養細胞之培養、Fab’片段之純化等，可使用該領域公知之各種方法來進行。
    與以上述方式所得之基因連結的表現載體，可列舉例如GS載體pEE6.4或pEE12.4(Lonza Biologics公司)，但只要係可表現抗體基因者則無特殊限制。又，亦可利用AG-γ1或AG-κ(例如參照WO94/20632)等預先具有人類Ig恆定區域基因者。
    上述之表現載體係藉由例如磷酸鈣法、電穿孔法等而導入培養細胞中。
    導入表現載體之培養細胞，例如可使用CHO-K1SV細胞、CHO-DG44細胞、293細胞等之培養細胞，只要係藉由一般方法培養即可。
    上述培養後，累積於培養上清液中之Fab’片段，可藉由各種管柱層析來純化，例如可使用KappaSelect等之管柱層析。
    本發明之Fab’片段，雖亦可使用如前述之重組表現法來製造，然亦可一時以全長抗體之形式製造後，以胃蛋白酶消化，將所得到之F(ab’)2片段以如2-巰基乙醇之還原劑處理，而以Fab’片段的形式來製造。
    較佳為，使用該領域公知之方法，合成包含編碼序列編號6所示之重鏈可變區域胺基酸序列之鹼基序列的DNA、及包含編碼序列編號4所示之輕鏈可變區域胺基酸序列之鹼基序列的DNA，將該等與適當類型之人類抗體恆定區域基因---較佳為重鏈為人類Igγ1恆定區域基因、輕鏈為人類Igκ恆定區域基因連結，以構築完全人類型抗體Fab’片段基因，使用該領域公知之各種方法，將該基因導入表現載體，將該表現載體導入培養細胞來培養該培養細胞，藉由自所得之培養物中純化Fab’片段，而可容易地取得本發明之抗人類NGF抗體Fab’片段。較佳為，包含編碼序列編號6所示之重鏈可變區域胺基酸序列之鹼基序列的DNA，係包含序列編號5所示之鹼基序列。較佳為，包含編碼序列編號4所示之輕鏈可變區域胺基酸序列之鹼基序列的DNA，係包含序列編號3所示之鹼基序列。
    本說明書中，「Fab’片段」意指由輕鏈；與包含重鏈可變區域(VH)、CH1結構域與鉸鏈區域之一部分的重鏈片段所構成之1價的抗體片段，此鉸鏈區域之部分，係包含構成重鏈-輕鏈間之S-S鍵之半胱胺酸殘基以外的至少1個半胱胺酸殘基(本說明書中，亦稱作「鉸鏈區域半胱胺酸」)。鉸鏈區域半胱胺酸，可作為於後述之聚乙二醇的修飾部位來使用。Fab’片段中之鉸鏈區域半胱胺酸的數目，隨著所使用之抗體類型而可有1~數個之間的差異，但所屬技術領域中具有通常知識者可輕易調整。例如，製造人類之IgG1類型(通常，於鉸鏈區域具有2個之鉸鏈區域半胱胺酸)之Fab’片段時，於重鏈之鉸鏈區域，藉由於最初之鉸鏈區域半胱胺酸之編碼部位與第2之鉸鏈區域半胱胺酸之編碼部位之間插入停止密碼子，可製造鉸鏈區域中具有1個鉸鏈區域半胱胺酸之Fab’片段；藉由於第2之鉸鏈區域半胱胺酸之編碼部位之後插入停止密碼子，可製造鉸鏈區域中具有2個鉸鏈區域半胱胺酸之Fab’片段。
    包含由序列編號6所示之胺基酸序列所構成之重鏈可變區域與人類Igγ1恆定區域之部分的本發明之較佳抗人類NGF抗體Fab’片段之重鏈片段，係由序列編號10、序列編號14、或序列編號16所示胺基酸序列所構成之重鏈片段。較佳為，包含編碼由序列編號10、序列編號14、或序列編號16所示胺基酸序列所構成之抗人類NGF抗體Fab’片段之重鏈片段之鹼基序列的DNA，係包含序列編號9、序列編號13、或序列編號15所示之鹼基序列。包含由序列編號4所示之胺基酸序列所構成之輕鏈可變區域與人類Igκ恆定區域之本發明之較佳抗人類NGF抗體Fab’片段之輕鏈，係由序列編號12所示胺基酸序列所構成之輕鏈。較佳為，包含編碼由序列編號12所示胺基酸序列所構成之抗人類NGF抗體Fab’片段之輕鏈之鹼基序列的DNA，係包含序列編號11所示之鹼基序列。
    包含由序列編號10所示胺基酸序列所構成之重鏈片段、與序列編號12所示胺基酸序列所構成之輕鏈之本發明的較佳抗人類NGF抗體Fab’片段，可列舉後述實施例所記載之完全人類型1-15(N52D)抗體Fab’片段。包含序列編號14所示胺基酸序列所構成之重鏈片段、與序列編號12所示胺基酸序列所構成之輕鏈之本發明的較佳抗人類NGF抗體Fab’片段，可列舉後述實施例所記載之完全人類型1-15(N52D-A)抗體Fab’片段。包含序列編號16所示胺基酸序列所構成之重鏈片段、與序列編號12所示胺基酸序列所構成之輕鏈之本發明的較佳抗人類NGF抗體Fab’片段，可列舉後述實施例所記載之完全人類型1-15(N52D-P)抗體Fab’片段。
    本發明亦包含含有由序列編號6之第31~35號之胺基酸序列所構成之CDR1、由序列編號6之第50~65號之胺基酸序列所構成之CDR2、及由序列編號6之第98~110號之胺基酸序列所構成之CDR3的重鏈可變區域；以及含有由序列編號4之第24~39號之胺基酸序列所構成之CDR1、由序列編號4之第55~61號之胺基酸序列所構成之CDR2、及由序列編號4之第94~102號之胺基酸序列所構成之CDR3的輕鏈可變區域之抗人類NGF抗體Fab’片段。如此的Fab’片段，亦可遵照如前述之順序，由所屬技術領域中具有通常知識者輕易製造。
    本發明之抗人類NGF抗體Fab’片段，亦可透過其鉸鏈區域半胱胺酸，與聚乙二醇(PEG)結合而修飾。PEG對Fab’片段之結合，能夠使用該領域公知之方法來實施(例如，歐洲專利EP0948544)。本發明中，能夠使用直鏈或支鏈之任意平均分子量之PEG或其衍生物，可依照使用目的，由所屬技術領域中具有通常知識者輕易地選擇。例如，於腫瘤組織或發炎反應時，血管通透性相較於正常組織係顯著地亢進，到達之物質會有漏出於血管外，而累積於腫瘤或發炎組織之傾向(EPR效果)。又，亦已知分子量小之物質容易被血管再吸收，分子量大之物質不易被再吸收。因此，為了改善於Fab’片段之病灶組織的滯留性，可結合高平均分子量(例如約40000Da)之PEG，希望對體外快速排泄的情況時，可結合低平均分子量(例如約10000Da)之PEG。又，為了使PEG容易對鉸鏈區域半胱胺酸結合，亦可使用PEG之衍生物。例如，可如後述實施例記載般，使用結合有如馬來醯亞胺之硫醇反應基的PEG衍生物，使鉸鏈區域半胱胺酸之硫醇基與馬來醯亞胺基共價鍵結。一般而言，PEG之平均分子量為約500Da~約50000Da，較佳為約5000Da~約40000Da，更佳為約10000Da~約40000Da之範圍。
    本發明之抗人類NGF抗體Fab’片段，係結合於人類NGF。作為測定對所得之抗人類NGF抗體Fab’片段之人類NGF的結合活性之方法，係有ELISA或FACS等方法。例如，使用ELISA的情況時，係將人類βNGF固定於ELISA盤，對其添加Fab’片段而反應後，使以辣根過氧化酵素(HRP)等酵素標記之抗kappa抗體等二次抗體反應，洗淨後，藉由使用了檢測其活性之試藥(例如，HRP標記的情況時，為TMB顯色試藥)等之活性測定，來鑑定二次抗體之結合。又，本發明之抗人類NGF抗體Fab’片段中，除了人類NGF，亦包含亦會結合於來自其他動物之NGF(例如小鼠NGF)之Fab’片段，亦可測定對該等蛋白質之結合活性。
    本發明之抗人類NGF抗體Fab’片段，具有對人類NGF之中和活性。於本說明書中使用時，抗人類NGF抗體Fab’片段之「中和活性」，意指藉由對NGF之結合，來阻礙透過NGF帶來之任意之生物活性的活性，能夠以NGF之1個或複數個生物活性作為指標來評估。如此之中和活性，可列舉例如NGF與其受體之trkA的結合阻礙活性、NGF-trkA訊息媒介之細胞內鈣流入阻礙活性、NGF依存性之細胞生存訊息阻礙活性，可藉由使用如後述實施例記載之方法來評估。
    為了更詳細地評估本發明之抗人類NGF抗體Fab’片段之效果，亦可使用in vivo(體內)之試驗。例如，可如後述實施例所記載，使用使用了小鼠關節炎模式之鎮痛效果試驗等，來評估Fab’片段之in vivo的藥效，又，亦可使用病灶轉移性試驗，來評估該病灶組織滯留效果。
    進一步地，亦可對於本發明之抗人類NGF抗體Fab’片段來評估副作用風險。例如，可如後述實施例記載般，藉由使用懷孕中之動物之Fab’片段投與後的胎盤通過試驗，來評估本發明之抗人類NGF抗體Fab’片段對胎兒影響的可能性。又，可如後述實施例記載般，使用與NGF之免疫複合體(IC)形成試驗，測定本發明之抗人類NGF抗體Fab’片段與NGF之間所形成之IC的大小，來評估誘發血栓形成之可能性。
    其他評估本發明之抗人類NGF抗體Fab’片段之各種安定性(例如熱安定性、長期保存安定性、高濃度安定性)之方法，可列舉例如利用示差掃描熱量測定、或測定保存中之凝集體形成的方法。
    本發明之抗人類NGF抗體Fab’片段，可依需要純化後，遵照一般方法製劑化，而使用於伴隨變形性關節症之關節痛(OA疼痛)、伴隨風濕病之關節痛、癌性疼痛、神經因性疼痛、慢性腰痛、術後疼痛、帶狀疱疹後神經痛、有痛性糖尿病性神經障礙、骨折痛、膀胱痛症候群等之疼痛、或間質性膀胱炎、急性胰炎、慢性胰炎、子宮內膜症等之NGF與病態形成相關聯之疾病的治療。
    本發明之抗人類NGF抗體Fab’片段，較佳可作為疼痛治療劑；更佳可作為伴隨著變形性關節症之關節痛治療劑來使用。該等治療劑等之劑型的例子，可為注射劑、點滴用劑等之非經口劑，較佳為藉由靜脈內投與、皮下投與等來投與。又，製劑化之時，可在藥學所容許之範圍內，使用配合該等劑型之載持體(carrier)或添加劑。
    上述製劑化時之本發明之抗人類NGF抗體Fab’片段的添加量，雖隨著患者之症狀程度或年齡、使用之製劑的劑型、或抗體之結合力價等而相異，但只要例如使用0.001mg/kg至100mg/kg左右即可。
    本發明亦提供包含編碼本發明之抗人類NGF抗體Fab’片段之序列的聚核苷酸及含有其之表現載體。本發明亦提供包含編碼本發明之抗人類NGF抗體Fab’片段之重鏈可變區域的序列之聚核苷酸、及包含編碼本發明之抗人類NGF抗體Fab’片段之輕鏈可變區域的序列之聚核苷酸、以及包含該等之任一者或兩者之表現載體。本發明之表現載體，只要係可於原核細胞及/或真核細胞之各種宿主細胞中會表現編碼本發明之Fab’片段或其重鏈可變區域及/或輕鏈可變區域之基因，且可產生多肽者則無特殊限制。可列舉例如，質體載體、病毒載體(例如、腺病毒、反轉錄病毒)等。較佳為，本發明之表現載體係含有包含編碼前述本發明之Fab’片段之重鏈片段或輕鏈的序列之聚核苷酸；或含有包含編碼本發明之Fab’片段之重鏈片段的序列之聚核苷酸與包含編碼本發明之Fab’片段之輕鏈的序列之聚核苷酸。
    本發明之表現載體，可包含編碼本發明之抗人類NGF抗體Fab’片段的基因、或編碼本發明之抗人類NGF抗體Fab’片段之重鏈可變區域及/或輕鏈可變區域之基因、及可與該基因能發揮功能地連結之啟動子。作為用以於細菌中表現編碼本發明之Fab’片段或其重鏈可變區域及/或輕鏈可變區域之基因的啟動子，宿主為大腸桿菌屬菌的情況時，可列舉例如Trp啟動子、lac啟動子、recA啟動子、λPL啟動子、lpp啟動子、tac啟動子等。作為於酵母中之表現用啟動子，可列舉例如PH05啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子；作為於芽孢桿菌屬菌中之表現用啟動子，可列舉SL01啟動子、SP02啟動子、penP啟動子等。又，宿主為哺乳動物細胞等真核細胞時，可列舉來自SV40之啟動子、反轉錄病毒之啟動子、熱休克啟動子等。
    使用細菌、特別是大腸菌作為宿主細胞時，本發明之表現載體可進一步包含開始密碼子、終止密碼子、終止子區域及可複製單位。另一方面，使用酵母、動物細胞或昆蟲細胞作為宿主的情況時，本發明之表現載體可包含開始密碼子、終止密碼子。又，此時，亦可包含增強子(enhancer)序列、編碼本發明之Fab’片段或其重鏈可變區域或輕鏈可變區域之基因的5’側及3’側非轉譯區域、分泌訊息序列、剪接(splicing)接合部位、聚腺苷酸化部位、或可複製單位等。又，亦可依照目的而包含通常所使用之篩選標記(例如、四環黴素抗性基因、安比西林抗性基因、卡那黴素抗性基因、新黴素抗性基因、二氫葉酸還原酵素基因)。
    本發明亦提供經導入編碼本發明之抗人類NGF抗體Fab’片段之基因或編碼本發明之抗人類NGF抗體Fab’片段之重鏈可變區域及/或輕鏈可變區域之基因的轉形體。如此之轉形體例如可藉由以本發明之表現載體使宿主細胞轉形來製造。轉形體之製造所用之宿主細胞，只要係適合前述表現載體而可被轉形者則無特殊限定，可舉例本發明之技術領域中通常使用之天然細胞或人工建立之細胞等各種細胞(例如細菌(大腸桿菌屬菌、芽孢桿菌屬菌)、酵母(酵母菌屬、畢赤酵母菌屬等)、動物細胞或昆蟲細胞(例如、Sf9)等)。轉形可藉由本身公知之方法進行。
    較佳為，本發明之轉形體為經含有包含編碼本發明之Fab’片段之重鏈可變區域的序列之聚核苷酸與包含編碼該Fab’片段之輕鏈可變區域的序列之聚核苷酸之表現載體轉形之宿主細胞；或為經含有包含編碼本發明之Fab’片段之重鏈可變區域的序列之聚核苷酸的表現載體與含有包含編碼該Fab’片段之輕鏈可變區域的序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞。更佳為，本發明之轉形體為經含有包含編碼前述本發明之Fab’片段之重鏈片段的序列之聚核苷酸與包含編碼該Fab’片段之輕鏈的序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞；或為經含有包含編碼前述本發明之Fab’片段之重鏈片段的序列之聚核苷酸的表現載體與含有包含編碼該Fab’片段之輕鏈的序列之聚核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞。
    本發明亦提供本發明之抗人類NGF抗體Fab’片段之生產方法，該生產方法係包含使編碼本發明之抗人類NGF抗體Fab’片段之基因或編碼本發明之抗人類NGF抗體Fab’片段之重鏈可變區域及/或輕鏈可變區域之基因於宿主細胞中表現，亦即包含使用如此的轉形體。較佳為，該方法中使用的宿主細胞，為經前述本發明之表現載體轉形之宿主細胞，亦可個別地或同時地含有包含編碼本發明之Fab’片段之重鏈可變區域的序列之聚核苷酸；與包含編碼該Fab’片段之輕鏈可變區域的序列之聚核苷酸。
    本發明之抗人類NGF抗體Fab’片段之生產中，轉形體可於營養培養基中培養。營養培養基較佳為含有轉形體之生育所必須之碳源、無機氮源或有機氮源。碳源可舉例例如葡萄糖、聚葡萄糖、可溶性澱粉、蔗糖等；作為無機氮源或有機氮源，可舉例例如銨鹽類、硝酸鹽類、胺基酸、玉米浸液、蛋白腖、酪蛋白、肉萃取物、大豆餅、馬鈴薯萃取液等。又亦可依照期望而含有其他營養素(例如、無機鹽(例如、氯化鈣、磷酸二氫鈉、氯化鎂)、維生素類、抗生素(例如、四環黴素、新黴素、安比西林、卡那黴素等)等)。
    轉形體之培養係藉由本身公知之方法進行。培養條件，例如溫度、培養基之pH及培養時間係適當選擇。例如，宿主為動物細胞時，培養基可使用含約5~20%之胎牛血清的MEM培養基(Science,Vol.122,p.501,1952)、DMEM培養基(Virology,Vol.8,p.396,1959)、RPMI1640培養基(J.Am,Med.Assoc.,Vol.199,p.519,1967)、199培養基(proc.Soc.Exp.Biol.Med.,Vol.73,p.1,1950)等。培養基之pH較佳為約6~8，培養通常在約30~40℃進行約15~72小時，亦可依照需要進行通氣或攪拌。宿主為昆蟲細胞時，可列舉例如含胎牛血清之Grace’s培養基(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.82,p.8404,1985)等，其pH較佳為約5~8。培養通常在約20~40℃進行15~100小時，亦可依照需要進行通氣或攪拌。宿主為細菌、放線菌、酵母、絲狀菌時，例如，含有上述營養源之液體培養基為適當。較佳為pH為5~8之培養基。宿主為E.coli時，較佳之培養基可舉例LB培養基、M9培養基(Miller等人、Exp.Mol.Genet,Cold Spring Harbor Laboratory,p.431,1972)等。該情況時，培養可依照需要一邊通氣、攪拌，同時在通常14~43℃進行約3~24小時。宿主為Bacillus屬菌時，可依照需要一邊通氣、攪拌，同時在通常30~40℃進行約16~96小時。宿主為酵母時，培養基可列舉例如Burkholder最小培養基(Bostian,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.77,p.4505,1980)，pH較佳為5~8。培養通常係在約20~35℃進行約14~144小時，亦可依照需要進行通氣、攪拌。
    本發明之抗人類NGF抗體Fab’片段，係可培養如上述之轉形體，由該轉形體回收、較佳為單離、純化。單離、純化方法，可列舉例如鹽析、溶劑沈澱法等利用溶解度之方法；透析、超微過濾、膠體過濾、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺膠體電泳等利用分子量之差的方法；離子交換層析或羥磷灰石層析等利用電荷之方法；親和性層析等利用特異性親和性之方法；逆相高效液相層析等利用疏水性之差的方法；等電點電泳等利用等電點之差的方法等。
    關於本發明已概括記載，於此提供為了進一步理解而參照之特定實施例，但該等僅為舉例的目的，並非限定本發明。 [實施例]
    關於使用市售套組或試藥等之部分，若無特別指明，係遵照所附實驗流程(protocol)來進行實驗。 (實施例1：對VelocImmune小鼠誘發免疫)
    藉由對VelocImmune小鼠誘發免疫，取得對人類NGF之抗體。本發明者等人，為了提高所得之抗體的多樣性，探討了複數之免疫方法、投與路徑、佐劑、免疫期間等。免疫原係使用人類βNGF(R&D System公司)，探討溶解人類βNGF與佐劑混合後使用於誘發免疫之方法，與將人類βNGF熱變性(0.5%SDS溶液下、80℃、10分鐘處理)後與佐劑混合而誘發免疫之方法。投與路徑係探討足底投與與腹腔內投與。佐劑係探討TiterMax Gold(CytRx Corporation)、完全佛朗氏佐劑(Freund’s adjuvant)(Sigma公司)、不完全佛朗氏佐劑(Sigma公司)、及RIBI佐劑(Corixa Corporation)。作為進一步添加之免疫賦活劑，係探討CpG寡核苷酸與Aluminum Phosphate Gel(BRENNTAG公司)。免疫期間係探討了3週~14週。數次誘發免疫後，由小鼠尾靜脈進行採血，藉由監測力價，進行產生結合於人類NGF之抗體的VelocImmune小鼠之選擇。
    力價測定係使用以下之標準ELISA方法來測定。於Maxisorp384測定盤(Nunc公司)中每1孔添加人類βNGF 10ng，於4℃放置一晚使其固定。翌日，將測定盤以洗淨液(TBST：含有0.05% Tween-20之Tris緩衝液(TBS))洗淨1次後，添加阻斷劑(blocking agent)(含有20% Blocking One(Nacalai Tesque公司)之TBST)於室溫靜置1小時。以TBST洗淨液洗淨1次後，製造經採血之血液的稀釋系列而添加。於室溫放置1小時後，以TBST洗淨液洗淨3次，添加經含有5% Blocking One之TBST洗淨液稀釋2000倍之辣根過氧化酵素標記之山羊抗小鼠Ig抗體(HRP-goat anti-mouse Ig antibody；Zymed公司)。於室溫放置1小時後，以TBST洗淨液洗淨3次。添加TMB顯色試藥(住友Bakelite公司)於室溫靜置10分鐘後，添加停止液(2mol/L硫酸)使反應停止，測定450nm之吸光度。 (實施例2：產生抗人類NGF抗體之融合瘤之製造)
    確認抗體價之上昇，進行對所選擇小鼠之最終免疫誘發(抗原之靜脈內投與或腹腔內投與)。遵照固定方法，摘出經誘發免疫之小鼠脾臓或淋巴結等，收集淋巴球，將其與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0進行細胞融合以製造融合瘤。將融合瘤極限稀釋，成為單一殖株後，使用Protein A或Protein G管柱(GE Healthcare Japan公司)由上清液純化抗體。 (實施例3：NGF-trkA結合阻礙評估)
    使人類βNGF(R&D System公司)與EZ-LINK 5-(biotinamido)pentylamine(PIERCE公司)於室溫暗處反應30分鐘，進行生物素標記，以去鹽管柱去除過量之生物素，取得生物素標記之人類βNGF。再者，以以下實施例6及實施例7來對所製造之生物素標記之人類βNGF確認生物活性與原本之人類βNGF同等。
    阻礙活性係使用以下方法來測定。於白色Maxisorp384測定盤(Nunc公司)每1孔添加60ng之人類trkA(R&D Systems公司)，於4℃放置一晚以固定。翌日，將測定盤以TBST洗淨液洗淨1次後，添加阻斷劑(含有20% Blocking One(Nacalai Tesque公司)之TBST)於室溫靜置1小時。接著，將使上述製造之生物素標記之人類βNGF(0.2μg/ml)與實施例2中得到之抗體混合者，添加至阻斷後之trkA固定之測定盤。於室溫放置1小時後，以TBST洗淨液洗淨3次，添加鹼性磷酸酶標記之卵白素(streptavidin)(PIERCE公司)。於室溫放置1小時後，以TBST洗淨液洗淨3次，添加化學發光檢測試藥之APU4(BioFX公司)，以EnVision計數器(PerkinElmer公司)測定其化學發光量。 (實施例4：種交叉反應性評估)
    抗體對小鼠βNGF具有交叉反應性時，能夠使用該抗體進行於小鼠病態模式之藥效評估。因而，實施例3之方法中，藉由使用小鼠βNGF(R&D Systems公司)來製造生物素標記小鼠βNGF，以評估抗體對小鼠βNGF之交叉反應性。 (實施例5：結合特異性評估)
    使用實施例1記載之ELISA法，評估抗體對NGF之結合特異性。具體而言，使用與NGF相同性最高的同族分子之NT-3，於實施例1之方法中每1孔添加20ng之人類NT-3(PeproTech公司)固定於測定盤來評估。 (實施例6：NGF-trkA訊息阻礙評估)
    評估抗體之NGF-trkA訊息阻礙活性。NGF係透過其受體之trkA來引起細胞內鈣(Ca2+)濃度之上昇。通常，此Ca2+濃度變化，係在鈣指示藥存在下，使用細胞內Ca2+濃度測定系統(FLIPR；Molecular Device公司)即可評估。
    阻礙活性係使用以下方法來測定。將安定地表現人類trkA之HEK293細胞(WO2009/054468)，以於實驗前一日成為2×104細胞/孔的方式，分注於96孔之塗佈有聚-D-離胺酸的測定盤(日本Beckton Dickinson公司)，培養一晚。翌日，將培養基更換為含有鈣指示藥(Fluo4-AM；同仁堂公司)之DMEM培養基(3.6mM氫氧化鈉(NaOH)、含有2.5mM丙磺舒(Sigma公司))，於37℃靜置30分鐘。接著，以洗淨液(Hanks balance鹽溶液(HBSS)(20mM 2-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]乙烷磺酸(HEPES)、3.6mM氫氧化鈉、2.5mM丙磺舒(Sigma公司)、0.1%牛血清白蛋白))洗淨細胞2次，將培養基更換為此洗淨液150μl/孔。將細胞測定盤設定於FLIPR內。藉由FLIPR操作，將實施例2中得到之抗體與NGF之混合液添加50μl/孔(NGF最終濃度100ng/ml)，測定細胞內Ca2+濃度變化。算出細胞內Ca2+濃度變化之最大值與最小值之差，保存測定數據。 (實施例7：NGF依存性細胞生存訊息阻礙評估)
    以無血清條件培養會自然表現trkA及p75受體之PC12細胞時，NGF可維持細胞之生存數日。使用以下方法，評估抗體之對NGF依存性細胞生存訊息的阻礙活性。
    於96孔之塗佈有膠原蛋白之測定盤(旭Techno公司)中每1孔撥種PC12細胞1×104個細胞，於含有2.5%胎牛血清及15%馬非活化血清(Invitrogen公司)之F12K培養基(Invitrogen公司)中，在37℃、5% CO2放置培養一晚。翌日，將培養基更換為僅有F12K之無血清條件。1小時後，添加抗體及人類βNGF(最終濃度50ng/ml)，進行72小時培養。之後，以吸引器去除培養液，藉由細胞之內在性ATP定量試藥(CellTiter Glo；Promega公司)測定細胞之生存能力。 (實施例8：Fab片段之製造)
    使用Fab Preparation套組(Pierce公司)，於抗體1mg/ml中添加結合有消化酵素木瓜酵素之膠體，於37℃處理3小時。將經處理之反應液添加至Protein G管柱(GE Healthcare Japan公司)，將切斷之Fc及未反應之IgG吸附於管柱以去除，藉由回收溶出的部分而得到Fab片段。對所得之Fab片段，以如實施例3、實施例6、及實施例7記載之試驗進行評估。
    實施例3~8之評估結果，確認了命名為1-15之抗體(嵌合抗體)具有高度中和活性、種交叉反應性、結合特異性，而且作為1價抗體片段後亦會保持高度中和活性。 (實施例9：抗體基因序列之決定)
    對經鑑定之1-15抗體，本發明者等人由融合瘤選殖了編碼抗體之重鏈及輕鏈的基因。具體而言，係準備1×105以上之融合瘤殖株，以RNeasy Mini Kit(QIAGEN公司)所附之RLT buffer懸濁後，使用QIAshredder(QIAGEN公司)進行使細胞破碎。之後遵照實驗流程抽出RNA，以抽出之RNA為模板，使用DNA放大套組(SMARTer RACE cDNA Amplification kit；Clontech公司)進行cDNA合成。使用所得之cDNA進行PCR反應，伸長及放大重鏈及輕鏈之可變區域。將此PCR產物以直接定序器(ABI PRISM 3100；Applied Biosystems公司)進行序列解析。又，將PCR產物對pCR3.1-TOPO(Invitrogen公司)等之PCR產物次選殖用載體重組後，進行解析基因序列以決定序列。
    分別將經決定之1-15抗體之重鏈可變區域鹼基序列示於序列編號1、將胺基酸序列示於序列編號2、將該抗體之輕鏈可變區域鹼基序列示於序列編號3、將胺基酸序列示於序列編號4。1-15抗體之重鏈可變區域之CDR1、CDR2、及CDR3，分別為根據Kabat編號之重鏈可變區域之第31~35號、第50~65號、及第95~102號之區域，且分別由序列編號2之第31~35號、第50~65號、及第98~110號之胺基酸序列所構成；1-15抗體之輕鏈可變區域之CDR1、CDR2、及CDR3，分別為根據Kabat編號之輕鏈可變區域之第24~34號、第50~56號、及第89~97號之區域，且分別由序列編號4之第24~39號、第55~61號、及第94~102號之胺基酸序列所構成。 (實施例10：可變區域之糖鏈修飾部位的變異體製造)
    前述1-15抗體之重鏈可變區域胺基酸(序列編號2)中係包含N-X-(T/S)之N型糖鏈修飾主題(motif)序列。具體而言，於序列編號2所示重鏈可變區域中，根據Kabat編號之第52號之Asn(N52)係相當於糖鏈修飾部位。若糖鏈修飾部位存在時，於細胞培養當中會發生糖鏈對抗體之加成，已知糖鏈加成係依存於培養條件或表現之宿主。亦即，即使是所建立之同一抗體產生細胞，隨著培養條件(培養基、細胞密度等)不同，糖鏈加成的程度會有變化的可能性，可能難以取得均勻品質之抗體醫藥品。因而，本發明者等人，製造了於1-15抗體之重鏈可變區域中的N52導入變異之1-15(N52D)。
    分別將所製造之1-15(N52D)之重鏈可變區域之鹼基序列示於序列編號5、將胺基酸序列示於序列編號6。1-15(N52D)抗體之重鏈可變區域之CDR1、CDR2、及CDR3，分別為根據Kabat編號之重鏈可變區域之第31~35號、第50~65號、及第95~102號之區域，且分別由序列編號6之第31~35號、第50~65號、及第98~110號之胺基酸序列所構成。 (實施例11：完全人類型抗體Fab’片段之製造)
    使用前述之1-15及1-15(N52D)之重鏈可變區域與1-15之輕鏈可變區域，製造各自之完全人類型抗體Fab’片段。
    分別將訊息序列連結於1-15及1-15(N52D)之各重鏈可變區域基因的5’側；且將人類Igγ1之恆定區域基因(Man Sung Co等，(1992)J Immunol.Vol.148(4)：1149-1154)連結於3’側，將此重鏈片段基因插入GS載體pEE6.4(Lonza Biologics公司)。此處，為了表現Fab’片段，於重鏈恆定區域基因中，在根據EU index之第226號的Cys(對應於後述序列編號8及10之胺基酸序列中第230號之Cys)之密碼子之後插入停止密碼子。又，分別將訊息序列連結於1-15之輕鏈可變區域基因之5’側；且將人類κ鏈之恆定區域基因(Man Sung Co等，如前述)連結於3’側，將此輕鏈基因插入GS載體pEE12.4(Lonza Biologics公司)。
    以暫時性表現及恆定性表現之2種方法進行Fab’片段之表現。暫時性表現，係對於以FreeStyle 293 Exptession medium(Invitrogen公司)培養至約100萬個/mL之FreeStyle 293細胞(Invitrogen公司)，使用293 fectin(Invitrogen公司)轉染前述之重鏈片段及輕鏈之GS載體，培養7日。恆定性表現，係將前述兩GS載體以NotI與PvuI之限制酵素切斷，使用DNA接合套組(TakaraBio公司)進行接合，構築經插入重鏈片段與輕鏈之兩基因的GS載體。此表現載體係編碼重鏈片段及輕鏈與麩胺酸合成酵素(Glutamine synthetase)，藉由對CHO-K1SV細胞之轉染而表現。以各方法表現之後，使用KappaSelect(GE Healthcare Japan公司)將培養上清液純化，得到各Fab’片段。
    分別將所製造之完全人類型1-15抗體Fab’片段(亦稱為1-15-Fab’)之重鏈片段的鹼基序列示於序列編號7、將胺基酸序列示於序列編號8。
    分別將所製造之完全人類型1-15(N52D)抗體Fab’片段(亦稱為1-15(N52D)-Fab’)之重鏈片段的鹼基序列示於序列編號9、將胺基酸序列示於序列編號10。
    各Fab’片段之輕鏈，係共通而分別將其鹼基序列示於序列編號11、將胺基酸序列示於序列編號12。 (實施例12：完全人類型抗體Fab’片段之中和活性及表現量評估)
    對實施例11中取得之1-15-Fab’與1-15(N52D)-Fab’，以實施例3及實施例6所記載之試驗來評估。於實施例3之試驗中，1-15-Fab’及1-15(N52D)-Fab’之IC50分別為0.17μg/ml及0.18μg/ml。於實施例6之試驗中，1-15-Fab’及1-15(N52D)-Fab’之IC50分別為0.021μg/ml及0.018μg/ml。由該等結果，確認了1-15(N52D)-Fab’會保持與改變前之1-15-Fab’同樣程度之中和活性，即使導入變異，亦不會影響中和活性。
    又，進行各Fab’片段之恆定性表現，測定安定表現細胞共同培養之上清液中的抗體產生量。結果，1-15-Fab’及1-15(N52D)-Fab’之各培養上清液中之濃度分別為86mg/L及106mg/L，顯示了1-15(N52D)-Fab’係比改變前之1-15-Fab’以更高量產生之抗體。 (實施例13：PEG化Fab’片段之製造與中和活性評估)
    接著，本發明者等人對前述之1-15(N52D)-Fab’進行PEG之導入。以KappaSelect純化後，將Fab’片段藉由TCEP鹽酸鹽(Tris(2-carboxyethyl)phosphine HCl)進行還原反應，以成為能夠PEG化之構造體。
    具體而言，係於以20mM磷酸鈉緩衝液(pH6.8)調整為1.2mg/ml之Fab’片段溶液中，添加TCEP使成為1mM，於37℃反應2小時後，以20mM乙酸鈉緩衝液(pH5.0)稀釋而調整pH。將其吸附於陽離子交換樹脂(SP-5PW；Tosoh製)，以NaCl梯度溶出，回收主要波峰。將所得之Fab’片段以20mM磷酸鈉緩衝液(pH6.8)稀釋為1mg/ml，將pH調整為6.8後，於4℃靜置一晚以上使自然氧化。於其中添加40kDa PEG(SUNBRIGHT GL2-400MA；NOF CORPORATION)使得終濃度成為0.1mM，於室溫靜置2小時後，於4℃靜置一晚。同PEG係於末端具有馬來醯亞胺基，因此會與重鏈片段之羧基端的Cys(根據EUindex之C226；序列編號10之第230號之Cys)快速地反應。將其以20mM乙酸鈉緩衝液(pH4.5)稀釋來調整pH後，再度吸附於陽離子交換樹脂(SP-5PW；Tosoh製)，以NaCl梯度溶出，回收主要波峰。以如此方式而純化經PEG化之Fab’片段。此經PEG化之1-15(N52D)-Fab’亦稱為1-15(N52D)-Fab’-PEG。
    對PEG化前及PEG化後之1-15(N52D)-Fab’，以實施例3所示方法評估中和活性。其結果，1-15(N52D)-Fab’之IC50為0.15μg/ml，相對於此，1-15(N52D)-Fab’-PEG之IC50為0.12μg/ml(以Fab’片段濃度計)，確認了1-15(N52D)-Fab’即使因PEG之加成，對中和活性亦不影響。
    又，使用實施例6之方法，比較1-15(N52D)-Fab-PEG與習知抗人類NGF抗體Tanezumab之對人類及小鼠NGF的中和活性。結果，確認了1-15(N52D)-Fab’-PEG之IC50，對人類NGF為0.051μg/ml、對小鼠NGF為0.069μg/ml，相對於此，Tanezumab之IC50，對人類NGF為0.17μg/ml、對小鼠NGF為0.23μg/ml，1-15(N52D)-Fab’-PEG對人類及小鼠之兩者的NGF，均具有Tanezumab之3.3倍左右的強力中和活性。 (實施例14：小鼠佐劑誘發關節炎模式之鎮痛效果試驗)
    本發明者等人，對於前述1-15(N52D)-Fab’-PEG，評估了對小鼠佐劑誘發關節炎模式之鎮痛效果。
    將1-15(N52D)-Fab’-PEG投與至小鼠靜脈內，(0.03mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、投與容量為10mL/kg)，於後肢足底將佛朗氏完全佐劑(Sigma公司)1mg/mL投與25μL以誘發疼痛。於誘發24小時測定20分鐘之站立行動。具體而言，係使用Supermex自發運動量測定系統(室町機械)，以紅外線射束感測器自動計測小鼠之自發站立行動次數20分鐘(Matson等人、JPET 320：194-201,2007)。作為比較對照，係使用習知抗體Tanezumah。結果，Tanezumab之靜脈內投與中之鎮痛效果為ED50=0.27mg/kg，相對於此，1-15(N52D)-Fab’-PEG以ED50=0.11mg/kg會發揮鎮痛效果，顯示約3倍之有效性。 (實施例15：大鼠胎盤通過試驗)
    於雌性大鼠懷孕第17天，將1-15(N52D)-Fab’-PEG或Tanezumab對靜脈內投與(100mg/kg、投與容量10mL/kg)，測定3日後之母體及胎兒血液中的抗體濃度。
    抗體濃度之測定係如以下方式進行。於MULTI-ARRAY Plate(Standard)96測定盤(Meso Scale Discovery公司)中每1孔添加人類βNGF(R&D Systems公司)25ng，於室溫靜置1小時藉以固定。將測定盤以TBST洗淨液洗淨3次後，添加阻斷劑(1%酪蛋白TBS；Thermofisher公司)，於室溫靜置1小時。接著，將稀釋過經時採血之血液的血液樣品，添加於阻斷後之人類βNGF固相測定盤。於室溫一邊攪拌同時反應60分鐘後，以TBST洗淨液洗淨3次，添加生物素標記之抗人類kappa抗體(免疫生物研究所)。於室溫一邊攪拌同時反應60分鐘後，以TBST洗淨液洗淨3次，添加SULFO-TAG標記之卵白素(Meso Scale Discovery公司)。於室溫一邊攪拌同時反應60分鐘後，以TBST洗淨液洗淨3次，添加Read Buffer T(Meso Scale Discovery公司)，以SECTOR Imager 6000(Meso Scale Discovery公司)測定其電化學發光量。
    於3隻大鼠母體進行本試驗的結果，3日後之大鼠母體血中的1-15(N52D)-Fab’-PEG及Tanezumab之抗體濃度分別為平均12.1μg/ml及7.1μg/ml。另一方面，關於由各大鼠母體中各3例經摘出胎兒(合計9例)之胎兒血中的抗體濃度，1-15(N52D)-Fab’-PEG之血中濃度在全部例子中為定量極限的0.01μg/ml以下，相對於此，Tanezumab之血中濃度為平均5.39μg/ml。亦即，相對於Tanezumab之胎兒移行率為75.9%，1-15(N52D)-Fab’-PEG之胎兒移行率為檢測極限之0.08%以下的移行率。由此，暗示了1-15(N52D)-Fab’-PEG會迴避胎兒中因NGF阻礙而造成的副作用風險，為安全性優良的藥劑。 (實施例16：免疫複合體(IC)之形成)
    評估1-15(N52D)-Fab’-PEG是否形成IC；或所形成之IC的大小為何種程度。具體而言，係將1mg/ml之1-15(N52D)-Fab’-PEG與人類βNGF(R&D Systems公司)以莫耳比為1：1的方式混合，於室溫放置3小時以形成IC。使用測定動態光散射之機器Zetasizer Nano(Malvern公司)對此反應液測定IC之粒子徑與分布。解析係使用Zetasizar v6.01(Malvern公司)，粒子徑係以用Intensity(%)解析之值(d.nm)來表示。
    測定之粒子大小係如以下表1所示。此實驗中，NGF單獨之粒子徑平均為6.2nm。Tanezumab單獨時，係於11.7nm出現峰值直徑。測定將Tanezumab與NGF放置而形成IC者時，峰值直徑偏移至91.3nm。另一方面，使用不與NGF結合之抗體作為控制組抗體時，峰值直徑維持11.7nm。考慮偏移幅度時，推測Tanezumab與NGF分別成為與複數個分子結合之巨大分子，而形成巨大之IC。相對於此，測定1-15(N52D)-Fab’-PEG與NGF之IC形成的結果，峰值直徑由18.1nm偏移至24.4nm。考慮偏移幅度時，僅反映了1：1結合，暗示了1-15(N52D)-Fab’-PEG中不形成晶格。
    (實施例17：病灶組織移行性)
    於雄性DBA/1小鼠足關節，進行皮下投與膠原蛋白(來自牛關節之第2型膠原蛋白、10mg/mL；膠原蛋白技術研修會)及完全佛朗氏佐劑(0.5mg/mL；DIFCO公司)之1：1乳化液，製造膠原蛋白誘發關節炎模式。引發4週後再度投與乳化液，使關節炎發病。觀察後肢關節炎之發病程度(分數/腫脹之大小)，進行小鼠分群。對於1-15(N52D)-Fab’-PEG及Tanezumab之1mg/ml PBS溶液，使用SAIVITM Rapid Antibody Labeling Kit、Alexa Fluor(註冊商標)680(Life Technologies公司)進行螢光標記。分別以2mg/kg由尾靜脈進行投與(N=4)。使用IVIS Spectrum(Caliper/Xenogen公司)，由投與後1小時至50小時解析累積於腫脹之足底的螢光，將螢光強度數值化。
    圖1係顯示足底之抗體滯留量的經時變化。1-15(N52D)-Fab’-PEG相較於Tanezumab，係顯示了明顯的病灶組織滯留效果，其效果持續達48小時。由此結果，可認為1-15(N52D)-Fab’-PEG有效率地發揮了鎮痛效果，可期待以低用量達到藥效強度以上之鎮痛效果、且因選擇性地累積在病灶部位，故可期待成為安全性優良的藥劑。 (實施例18：Fab’片段之胺基酸加成體的製造)
    本發明者等人，為了於1-15(N52D)-Fab’中改善PEG之導入效率，製造了於重鏈片段之羧基端的Cys殘基之後加成2個丙胺酸(A)或脯胺酸(P)之Fab’片段，並表現及純化。於該等之Fab’片段的製造中，使用與實施例11同樣的方法，此處，係於1-15(N52D)-Fab’之重鏈片段的羧基端Cys殘基之密碼子之後插入2個丙胺酸或脯胺酸之密碼子，之後插入停止密碼子。
    分別將加成丙胺酸之1-15(N52D)-Fab’(完全人類型1-15(N52D-A)抗體Fab’片段；亦稱為1-15(N52D-A)-Fab’)之重鏈片段的鹼基序列示於序列編號13、將胺基酸序列示於序列編號14。分別將加成脯胺酸之1-15(N52D)-Fab’(完全人類型1-15(N52D-P)抗體Fab’片段；亦稱為1-15(N52D-P)-Fab’)之重鏈片段的鹼基序列示於序列編號15、將胺基酸序列示於序列編號16。再者，各Fab’片段之輕鏈，係與1-15(N52D)-Fab’之輕鏈相同，分別將其鹼基序列示於序列編號11、胺基酸序列示於序列編號12。 (實施例19：PEG化1-15(N52D-A)-Fab’之製造以及中和活性及藥理評估)
    對1-15(N52D-A)-Fab’，使用與實施例13同樣之方法使40kDa PEG結合，得到經PEG化之1-15(N52D-A)-Fab’(以下、亦稱為1-15(N52D-A)-Fab’-PEG)。
    對於1-15(N52D-A)-Fab’-PEG，使用實施例3所示方法評估中和活性。結果，1-15(N52D)-Fab’-PEG之IC50為0.081±0.034μg/ml，相對於此，1-15(N52D-A)-Fab’-PEG之IC50為0.074±0.021μg/ml。又，此時Tanezumab之IC50為0.410±0.099μg/ml。
    接著，使用實施例6所示之方法來比較中和活性。結果，1-15(N52D)-Fab’-PEG之IC50，對人類NGF為0.061±0.011μg/ml，相對於此1-15(N52D-A)-Fab’-PEG之IC50為0.064±0.028μg/ml。
    進一步地，使用實施例14所示方法，來評估佐劑誘發關節炎模式中之鎮痛效果。結果，1-15(N52D)-Fab’-PEG，於ED50=0.14mg/kg發揮鎮痛效果，相對於此，1-15(N52D-A)-Fab’-PEG於ED50=0.21mg/kg發揮鎮痛效果。
    由以上所述，確認了即使於羧基端之Cys殘基之後加成2個丙胺酸加成，亦不會對中和活性及藥理活性帶來影響。 (實施例20：1-15(N52D-A)-Fab’-PEG之結合親和性之評估)
    藉由等溫滴定型熱量測定(Isothermal titration calorimetry；ITC)來探討1-15(N52D-A)-Fab’-PEG及Tanezumab之對NGF抗原的結合熱力學(Scappaticci FA,J Natl CancerInst.2007,99：1232-9.Velazquez-Campoy,A.,et al,Curr Protoc Cell Biol.2004,Chapter 17,Unit 17-18)。全部之測定係使用GE healthcare公司製之Auto-iTC200進行。實驗中為了評估1價之Fab’片段與1分子之抗原間的結合，以以下的濃度進行試驗，試驗全部係在PBS溶劑中進行。具體而言，係將置入滴定用注射器之人類βNGF 44μM(R&D systems公司)一次1.4μL，共30次滴定於裝滿抗體試樣(3μM之1-15(N52D-A)-Fab’-PEG或1.5μM之Tanezumab)之熱量計測量槽中，檢測此時產生之熱量。將所得之數據使用裝置附屬之軟體，以Single site binding model解析，藉以估算伴隨抗原-抗體結合之結合親和力(Kd)、結合比(n)、結合自由能(△G)、結合焓(△H)、及結合熵(-T△S)。結果如表2所示。
    結果，Tanezumab之Kd值為20.41nM，相對於此，1-15(N52D-A)-Fab’-PEG之Kd值為149nM、1-15(N52D-A)-Fab’-PEG之結合親和性為比Tanezumab強10倍以上。
    (實施例21：各種PEG大小之PEG化1-15(N52D-A)-Fab’的製造及中和活性評估)
    對於實施例18製造之1-15(N52D-A)-Fab’，使用與實施例13同樣的順序，使5kDa PEG或10kDa PEG結合。具體而言，係以TCEP使經20mMTris鹽酸緩衝液(pH7.4)調製之Fab’片段溶液還原後，使用去鹽管柱回收Fab’片段。於所得之Fab’片段中添加PEG(SUNBRIGHT GL2-50MA或SUNBRIGHT GL2-100MA；均為NOF CORPORATION)，於4℃靜置一晚。將如此方式得到之結合有5kDa PEG或10kDa PEG之1-15(N52D-A)-Fab’分別稱作1-15(N52D-A)-Fab’-5kPEG、1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG。
    接著，使用實施例6所示方法，比較各PEG化Fab’片段之中和活性。作為比較對照，係使用實施例19中製造之1-15(N52D-A)-Fab’-PEG(結合40kDa PEG；以下，亦稱作1-15(N52D-A)-Fab’-40kPEG)。本次實驗中係以50 ng/ml之NGF最終濃度來實施。結果，1-15(N52D-A)-Fab’-5kPEG、1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG、及1-15(N52D-A)-Fab’-40kPEG之IC50，分別為0.030μg/ml、0.028μg/ml、及0.023μg/ml。由此結果可知，PEG大小，在由5kDa至40kDa之大小，對Fab’片段之中和活性無影響。 (實施例22：各種PEG大小之PEG化1-15(N52D-A)-Fab’之小鼠PK評估)
    進行各種PEG化1-15(N52D-A)-Fab’之小鼠PK評估。具體而言，係將0.3mg/kg之各種PEG化1-15(N52D-A)-Fab’對靜脈內投與，投與後分別在1、4、8、12、24、48、72、96、及168小時採血。使用三明治ELISA法測定所得之血液中之被測抗體量。具體而言，係將被測抗體添加至經固定有NGF之MSD測定盤(Meso Scale Discovery公司製)。以生物素標記之抗人類kappa抗體認識結合於測定盤之被測抗體，將其以SULFO-TAG標記之卵白素來檢測。由各標準品製作校準曲線求取來算出血中濃度。由算出之血中濃度來計算血中半衰期(T1/2：小時)。結果，1-15(N52D-A)-Fab’-5kPEG、1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG、及1-15(N52D-A)-Fab’-40kPEG之T1/2分別為13.8±2.2小時、17.7±0.4小時、及39.2±3.7小時。 (實施例23：大鼠腳底切開模式之鎮痛效果試驗)
    使用可反映臨床之術後痛的大鼠腳底切開後痛模式(Brennan et al.Current Protocols in Pharmacology 2004；5.34.1-5.34.8)，評估1-15(N52D-A)-Fab’-5kPEG及1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG對術後痛之鎮痛效果。
    具體而言，各群8隻，將1-15(N52D-A)-Fab’-5kPEG或-10kPEG對大鼠靜脈內投與(0.1mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg、投與容量為1mL/kg)，以由腳跟尖端起算5mm部分為起點，對朝腳尖方向10mm直線切開右後肢腳底，立即以耐綸線對2處進行褥式(Mattress)縫合以誘發疼痛。誘發後5小時、1日、2日、3日、4日、及5日測定手術部位附近之疼痛閥值。測定係使用Ugo Basile公司製Dynamic plantar anesthesiometer，來測定會顯示對於向大鼠腳底加壓之逃避行動的壓力。作為比較對照，係使用習知抗體Tanezumab。
    結果，術後1日之Tanezumab之靜脈內投與的鎮痛效果為ED50=0.26mg/kg，相對於此，1-15(N52D-A)-Fab’-5kPEG或-10kPEG均於ED50=0.15mg/kg發揮鎮痛效果，顯示了約2倍的有效性。又，1-15(N52D-A)-Fab’-5kPEG或-10kPEG之有顯著意義的鎮痛效果，分別至術後3日或4日為止被觀察到。 (實施例24：凝集安定性評估)
    將1-15(N52D-A)-Fab’-40kPEG於pH5、pH6、pH7.4、及pH9之各條件下溶解為1mg/ml及10mg/ml。將該等分別置於50℃之條件，針對2週後之凝集安定性進行評估。凝集性之評估係藉由大小篩除層析(Size exclusion chromatography)進行，使用Agilent公司製1100來測定。測定條件，使用0.1M磷酸鈉(含有0.2M精胺酸)(pH6.8)作為移動相之緩衝液，管柱係使用TSK gel Super Sw3000(TOSOH,2.0mmID×300mm)。檢測波長係在280nm進行。在1mg/ml之試驗中，係使用Tanezumab作為比較抗體，其結果示於表3。在10mg/ml之試驗中，係使用Tanezumab及REGN475作為比較抗體，其結果示於表4。
    結果，Tanezumab及REGN475係於2週後觀察到顯著的凝集體產生之上昇，相對於此1-15(N52D-A)-Fab’-40kPEG中幾乎無檢測到凝集體。由此結果，暗示了PEG化1-15(N52D-A)-Fab’，成為保存安定性優良之醫藥品的可能性高。
    [產業上之可利用性]
    本發明之抗人類NGF抗體、更具體而言係抗人類NGF抗體Fab’片段，係有用於人類NGF與病態形成相關之各種疾病的預防或治療。
    [圖1]顯示小鼠膠原蛋白誘發關節炎模式於足底之抗體滯留量的經時變化。
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    权利要求:
    Claims (12)
    [1] 一種抗人類NGF抗體Fab’片段，其係包含由序列編號6所示之胺基酸序列所構成之重鏈可變區域、及由序列編號4所示胺基酸序列所構成之輕鏈可變區域。
    [2] 如申請專利範圍第1項之Fab’片段，其中前述Fab’片段之重鏈恆定區域為人類Igγ1恆定區域。
    [3] 如申請專利範圍第1項之Fab’片段，其中前述Fab’片段之輕鏈恆定區域為人類Igκ恆定區域。
    [4] 如申請專利範圍第1項之Fab’片段，其中前述Fab’片段之重鏈恆定區域為人類Igγ1恆定區域、且前述Fab’片段之輕鏈恆定區域為人類Igκ恆定區域。
    [5] 如申請專利範圍第1項之Fab’片段，其係包含由序列編號10、序列編號14、或序列編號16所示胺基酸序列所構成之重鏈片段、及由序列編號12所示胺基酸序列所構成之輕鏈。
    [6] 如申請專利範圍第1~5項中任一項之Fab’片段，其係與聚乙二醇結合。
    [7] 一種聚核苷酸，其係包含編碼如申請專利範圍第1項之Fab’片段之重鏈片段的序列。
    [8] 一種聚核苷酸，其係包含編碼如申請專利範圍第1項之Fab’片段之輕鏈的序列。
    [9] 一種表現載體，其係包含如申請專利範圍第7及/或8項之聚核苷酸。
    [10] 一種宿主細胞，其係經如申請專利範圍第9項之表現載體轉形。
    [11] 如申請專利範圍第10項之宿主細胞，其係由以下之(a)及(b)所構成群組中選擇：(a)經包含含有編碼如申請專利範圍第1項之Fab’片段之重鏈片段之序列的聚核苷酸與含有編碼該Fab’片段之輕鏈之序列的聚核苷酸之表現載體轉形之宿主細胞；及(b)經包含含有編碼如申請專利範圍第1項之Fab’片段之重鏈片段之序列的聚核苷酸之表現載體與包含含有編碼該Fab’片段之輕鏈之序列的聚核苷酸之表現載體轉形之宿主細胞。
    [12] 一種生產如申請專利範圍第1項之抗人類NGF抗體Fab’片段之方法，其係包含培養如申請專利範圍第10或11項之宿主細胞，使抗人類NGF抗體Fab’片段表現之步驟。
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    法律状态:
    优先权:
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    JP2011269215||2011-12-08||
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