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    • 专利摘要:
    本發明提供一種藉由培養包含表現構築體之重組真核細胞系產生目標蛋白質(POI)的方法，該表現構築體包含可調節之啟動子及在該啟動子之轉錄控制下編碼POI的核酸分子，該方法包含以下步驟：a)用抑制該啟動子之基礎碳源培養該細胞系，b)用有限量之使該啟動子解除抑制之補充碳源培養該細胞系，從而以與天然pGAP啟動子相比至少15%之轉錄率誘導該POI產生，及c)產生並回收該POI；且本發明另外提供分離之可調節之啟動子及各別表現系統。
    公开号:TW201317350A
    申请号:TW101137171
    申请日:2012-10-05
    公开日:2013-05-01
    发明作者:Diethard Mattanovich；Brigitte Gasser；Michael Maurer；Roland Prielhofer；Joachim Klein；Jana Wenger
    申请人:Lonza Ag；
    IPC主号:C12N15-00
    专利说明:
    可調節之啟動子
    本發明係關於可調節之啟動子及在可調節之啟動子控制下在真核細胞培養物中產生目標蛋白質的方法。
    已利用真核宿主成功地製造重組蛋白質。最主要實例係如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、畢氏酵母(Pichia pastoris)或多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)等酵母、如泡盛麯黴(Aspergillus awamori)或裏氏木黴(Trichoderma reesei)等絲狀真菌或如(例如)CHO細胞等哺乳動物細胞。儘管易於以高比率產生一些蛋白質，但許多其他蛋白質僅係以相當低之程度獲得。
    宿主有機體中之基因之異源表現通常需要使宿主有機體穩定轉化之載體。載體可為基因提供毗鄰編碼序列之5'端之功能啟動子。藉此由此啟動子序列調節並開始轉錄。迄今為止使用之大多數啟動子係衍生自編碼通常以高濃度存於細胞中之蛋白質的基因。
    EP0103409A2揭示糖解途徑中與特定酶之表現相關的酵母啟動子(即參與丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構酶、磷酸葡萄糖異構酶、磷酸甘油酸酯變位酶、己糖激酶1及2、葡糖激酶、磷酸化果糖激酶、醛縮酶及糖解調節基因之表現之啟動子)之用途。
    WO 97/44470闡述針對適於異源表現酵母中之蛋白質之轉譯延伸因子1(TEF1)蛋白質及核糖體蛋白質S7的來自解脂耶式酵母(Yarrowia lipolytica)之酵母啟動子，且EP1951877A1闡述畢氏酵母TEF1啟動子用於產生異源蛋白質之用途。
    WO 2005003310提供使用來自油脂酵母解脂耶式酵母之甘油醛-3-磷酸脫氫酶或磷酸甘油酸酯變位酶的啟動子使目標編碼序列在酵母中表現的方法。
    衍生自參與畢氏酵母之甲醇代謝途徑之基因的啟動子序列揭示於US4808537及US4855231(醇氧化酶AOX1、AOX2)及US6730499B1(甲醛脫氫酶FLD1)中。US20080153126A1包括基於AOX1啟動子之突變啟動子序列。
    AOX1啟動子僅因應甲醇受誘導且受其他碳源(例如葡萄糖或乙醇)抑制。甲醇之缺點在於其不適用於產生某些產物，此乃因其因其毒性及可燃性而潛在性有害。因此，正尋求AOX1啟動子之替代物。
    US2008299616A1介紹用於畢氏酵母中之異源基因表現的蘋果酸合成酶(MLS1)基因之調節序列，該基因在含有葡萄糖之培養基中受抑制且在葡萄糖饑餓條件下或在存在乙酸鹽時解除抑制。然而，認為此系統並不適於有效產生方法，此乃因MLS1啟動子因在解除抑制條件下活性較低而較弱。
    Schöler及Schüller(Mol.Cell Biol.1994 14(6)：3613-22)闡述異檸檬酸裂解酶基因ICL1之控制區域，其在細胞自發酵生長條件轉移至非發酵生長條件後解除抑制。
    WO2008063302A2闡述衍生自畢氏酵母之ADH1(醇脫氫酶)、ENO1(烯醇化酶)及GUT1基因之新穎可誘導啟動子的用途，其用於表現異源蛋白質，CN1966688A闡述畢氏酵母ω 3-脂肪酸脫氫酶啟動子序列，且WO002007117062A1闡述畢氏酵母衍生之可自動誘導之NPS啟動子，其係由磷限制而誘導。
    WO2008128701A2闡述新穎啟動子之用途，其中衍生自畢氏酵母之THI3(硫胺素機制)基因的啟動子在含有硫胺素之培養基中受抑制，且在硫胺素耗盡時解除抑制。
    US2009325241A1闡述在酵母細胞中利用木糖可誘導啟動子(FAS2啟動子)產生乙醇之方法。
    期望提供改良之重組真核細胞系以產生可以高產率分離之發酵產物。因此，本發明之目的係提供適於重組產生方法之替代調節元件，該等方法簡單且有效。
    該目的係由如所主張之標的物解決。
    根據本發明，提供藉由培養包含表現構築體之重組真核細胞系產生目標蛋白質(POI)的方法，該表現構築體包含可調節之啟動子及在該啟動子之轉錄控制下編碼POI的核酸分子，該方法包含以下步驟：a)用抑制該啟動子之基礎碳源培養該細胞系，b)不用或用有限量之使該啟動子解除抑制之補充碳源培養該細胞系，從而以與細胞之天然pGAP啟動子相比至少15%之轉錄率誘導該POI產生，及c)產生並回收POI。
    該等培養步驟尤其包含在該等碳源存在下、由此在包含該等碳源之培養基中、或在步驟b)中亦在補充碳源不存在下培養細胞系。
    POI產生之該誘導尤其係指轉錄之誘導，尤其包括該POI之進一步轉譯及可選表現。
    該轉錄率尤其係指在完全誘導該啟動子時獲得之轉錄物之量。若培養條件在(例如)小於0.4 g/L，較佳小於0.04 g/L、尤其小於0.02 g/L之葡萄糖濃度下提供約最大誘導，則認為解除抑制並完全誘導該啟動子。完全誘導之啟動子較佳顯示與天然pGAP啟動子相比，轉錄率為至少15%，較佳至少20%、更佳至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%及至少100%或甚至至少150%或至少200%之更高轉錄率。轉錄率可由(例如)例如下文實例部分中所述之報告基因之轉錄物(例如eGFP)之量決定，該報告基因顯示在溶液中培養純系後，與天然pGAP啟動子相比，pG1啟動子具有至少50%之相對較高轉錄率。或者，轉錄率可由微陣列上之轉錄強度決定，其中微陣列數據顯示抑制狀態與解除抑制狀態之間之表現程度之差異及與天然pGAP啟動子相比完全誘導狀態中之高信號強度。該等微陣列數據尤其顯示pG1之轉錄率超過200%，pG3及pG4超過30%，pG6超過60%，pG7超過30%，pG8超過20%，每一值均係與天然pGAP相比。發現先前技術啟動子MLS1或ICL1太弱且因此不適於本發明之目的。
    該天然pGAP啟動子尤其在該重組真核細胞中以與相同物種或菌株之天然真核細胞(包括未經修飾之(非重組)或重組真核細胞)中類似之方式具有活性。該天然pGAP啟動子通常應理解為內源啟動子，因此與真核細胞同源，且用作標準或參照啟動子用於比較目的。
    舉例而言，畢氏酵母之天然pGAP啟動子係畢氏酵母中未經修飾之內源啟動子序列，如用於控制畢氏酵母中之GAPDH之表現，例如具有圖13中所示之序列：畢氏酵母(GS115)之天然pGAP啟動子序列(SEQ ID 13)。若畢氏酵母作為宿主用於產生本發明之POI，則比較本發明啟動子之轉錄強度或轉錄率與畢氏酵母之該天然pGAP啟動子。
    作為另一實例，釀酒酵母之天然pGAP啟動子係釀酒酵母中未經修飾之內源啟動子序列，如用於控制釀酒酵母中GAPDH之表現。若釀酒酵母作為宿主用於產生本發明之POI，則比較本發明啟動子之轉錄強度或轉錄率與釀酒酵母之該天然pGAP啟動子。
    因此，通常比較本發明啟動子之相對轉錄強度或轉錄率與作為宿主用於產生POI之相同物種或菌株之細胞之天然pGAP啟動子。
    根據特定實施例，基礎碳源不同於補充碳源，例如定量及/或定性不同。定量差異可提供不同條件以使啟動子活性受抑制或解除抑制。
    根據又一特定實施例，基礎及補充碳源包含相同類型之分子或碳水合物，較佳濃度不同。根據又一特定實施例，碳源係兩種或更多種不同碳源之混合物。
    可使用適用於真核細胞培養物之任一類型之有機碳。根據特定實施例，碳源係己糖(例如葡萄糖、果糖、半乳糖或甘露糖)、雙醣(例如蔗糖)、醇(例如甘油或乙醇)或其混合物。
    根據尤佳實施例，基礎碳源選自由葡萄糖、甘油、乙醇、或其混合物及複合營養物質組成之群。根據一較佳實施例，基礎碳源係甘油。
    根據又一特定實施例，補充碳源係己糖(例如葡萄糖、果糖、半乳糖及甘露糖)、雙醣(例如蔗糖)、醇(例如甘油或乙醇)或其混合物。根據一較佳實施例，補充碳源係葡萄糖。
    該方法尤其可採用甘油作為基礎碳源且採用葡萄糖作為補充碳源。
    解除抑制條件可適宜地藉由特定方式達成。步驟b)視情況採用不提供補充碳源或提供有限量之補充碳源的補料培養基。
    補料培養基尤其經化學定義且無甲醇。
    可將補料培養基以液體形式或者以替代形式(例如固體，例如以錠劑或其他持續持續釋放方式形式；或氣體，例如二氧化碳)添加至培養基中。仍根據一較佳實施例，添加至細胞培養基中之補充碳源之有限量可甚至為零。較佳地，培養基中之補充碳源之濃度係0-1 g/L，較佳小於0.6 g/L、更佳小於0.3 g/L、更佳小於0.1 g/L，較佳1-50 mg/L、更佳1-10 mg/L、尤佳1 mg/L或甚至更低，例如低於如利用適宜標準分析量測之檢測限值，例如測定為在由生長之細胞培養物消耗後培養基中之殘餘濃度。
    在較佳方法中，有限量之補充源在細胞培養物中提供殘餘量，其低於如在生產期結束時於發酵液中或較佳在收穫發酵產物後在發酵製程之輸出物中測定的檢測限值。
    較佳地，有限量之補充碳源限制生長以保持比生長速率在0.02 h-1至0.2 h-1，較佳0.02 h-1至0.15 h-1範圍內。
    根據本發明之特定態樣，啟動子係畢氏酵母啟動子或其功能活性變體。
    本發明啟動子在本文中應始終指本文所述序列及其功能活性變體。如下文詳細解釋，該等變體包括衍生自除畢氏酵母以外之物種之同系物及類似物。
    本發明方法可採用如下啟動子：其係例如能夠控制特定基因在野生型或重組真核細胞中之轉錄的畢氏酵母之野生型啟動子或其功能活性變體，例如針對選擇基因之野生型啟動子，該基因選自由以下組成之群：G1(SEQ ID 7)，例如編碼(高親和力)葡萄糖轉運蛋白；G3(SEQ ID 8)、G4(SEQ ID 9)，例如編碼線粒體醛脫氫酶；G6(SEQ ID 10)、G7(SEQ ID 11)，例如編碼主要促進劑糖轉運蛋白家族之成員；或G8(SEQ ID 12)，例如編碼Gti1_Pac2超家族之成員；或其功能活性變體。
    根據本發明，尤其提供可與野生型酵母細胞中之該等基因中之一者天然相關的啟動子或其功能活性變體。
    根據特定實施例，細胞系選自由哺乳動物、昆蟲、酵母、絲狀真菌及植物細胞系組成之群，較佳為酵母。
    酵母尤其選自由以下組成之群：畢氏酵母、假絲酵母(Candida)、球擬酵母(Torulopsis)、阿需拉屬(Arxula)、漢遜屬(Hensenula)、子囊菌酵母(Yarrowia)、克魯維酵母(Kluyveromyces)、釀酒酵母、克馬格特勒酵母(Komagataella)，較佳為甲基營養性酵母。
    尤佳酵母係畢氏酵母、巴斯德克馬格特勒酵母(Komagataella pastoris)、法夫克馬格特勒酵母(K.phaffii)或假巴斯德克馬格特勒酵母(K.pseudopastoris)。
    根據又一特定實施例，啟動子並不與編碼POI之核苷酸序列天然相關。
    POI尤其係真核蛋白，較佳哺乳動物蛋白。
    根據本發明產生之POI可為多聚體蛋白，較佳二聚體或四聚體。
    根據本發明之一個態樣，POI係重組或異源蛋白質，較佳選自治療性蛋白質(包括抗體或其片段)、酶及肽、蛋白質抗生素、毒素融合蛋白質、碳水化合物-蛋白質偶聯物、結構蛋白質、調節蛋白質、疫苗及疫苗樣蛋白質或粒子、過程酶、生長因子、激素及細胞介素或POI之代謝產物。
    特定POI係抗原結合分子，例如抗體或其片段。特定POI係抗體，例如單株抗體(mAb)、免疫球蛋白(Ig)或G類免疫球蛋白(IgG)、重鏈抗體(HcAb)或其片段，例如片段-抗原結合(Fab)、Fd、單鏈可變片段(scFv)、或其經改造變體(例如Fv二聚體(雙鏈抗體)、Fv三聚體(三鏈抗體)、Fv四聚體、或單鏈抗體)及單一結構域抗體，如VH或VHH或V-NAR。
    根據特定實施例，使用POI、其代謝產物或衍生物製造發酵產物。
    根據本發明之另一態樣，提供在碳源可調節之啟動子之轉錄控制下控制重組真核細胞中之POI之表現的方法，該可調節之啟動子與細胞之天然pGAP啟動子相比具有至少15%之轉錄強度，其中在限制碳源之條件下誘導表現。與參照pGAP啟動子相比，碳源可調節之啟動子較佳具有至少20%之轉錄強度，且尤其轉錄強度係如上文關於與天然pGAP啟動子相比之轉錄率所述。因此，與細胞之天然pGAP啟動子相比，完全誘導之啟動子較佳具有至少15%，較佳至少20%、更佳至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%及至少100%之轉錄強度或至少150%或至少200%之甚至更高轉錄強度，如針對產生POI選擇之真核細胞中所測定。
    在一較佳實施例中，使用在解除抑制狀態中具有轉錄活性或轉錄強度之該啟動子，該轉錄活性或轉錄強度在解除抑制狀態中係抑制狀態之至少2倍、更佳至少5倍、甚至更佳至少10倍、更佳至少20倍、更佳至少30、40、50或100倍。
    根據本發明之另一態樣，提供在碳源可調節之啟動子之轉錄控制下在重組真核細胞中產生POI的方法，其中該啟動子具有如上文所述轉錄強度，即與細胞之天然pGAP啟動子相比至少15%。碳源可調節之啟動子較佳具有與參照pGAP啟動子相比至少20%、更佳至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%及至少100%之轉錄強度或與細胞之天然pGAP啟動子相比至少150%或至少200%之甚至更高轉錄強度。在一較佳實施例中，使用在解除抑制狀態中具有轉錄活性之該啟動子，該轉錄活性在解除抑制狀態中係抑制狀態之至少2倍、更佳至少5倍、甚至更佳至少10倍、更佳至少20倍、更佳至少30、40、50或100倍。本發明之特定啟動子適宜地用於該方法中。
    在本發明之尤佳方法中，啟動子係包含選自由以下組成之群核酸序列的可調節之啟動子：a)pG1(SEQ ID 1)、pG3(SEQ ID 2)、pG4(SEQ ID 4)、pG6(SEQ ID 3)、pG7(SEQ ID 5)或pG8(SEQ ID 6)；b)與pG1(SEQ ID 1)、pG3(SEQ ID 2)、pG4(SEQ ID 4)、pG6(SEQ ID 3)、pG7(SEQ ID 5)或pG8(SEQ ID 6)具有至少60%同源性之序列；c)在嚴格條件下與pG1(SEQ ID 1)、pG3(SEQ ID 2)、pG4(SEQ ID 4)、pG6(SEQ ID 3)、pG7(SEQ ID 5)或pG8(SEQ ID 6)雜交之序列；及d)衍生自a)、b)或c)之片段或變體，其中該啟動子係功能活性啟動子，其係與細胞之天然pGAP啟動子相比能夠以至少15%之轉錄率表現重組真核細胞中之POI的碳源可調節之啟動子。
    pG1(SEQ ID 1)、pG3(SEQ ID 2)、pG4(SEQ ID 4)、pG6(SEQ ID 3)、pG7(SEQ ID 5)或pG8(SEQ ID 6)之變體尤其係選自由以下組成之群之功能活性變體：具有至少約60%核苷酸序列一致性之同系物、可藉由在母體核苷酸序列內或在該序列之一個或兩個遠端處插入、刪除或取代一或多個核苷酸來修飾該序列獲得的同系物及衍生自除畢氏酵母以外之物種之類似物，較佳地核苷酸序列為至少200 bp，較佳至少250 bp，較佳至少300 bp、更佳至少400 bp、至少500 bp、至少600 bp、至少700 bp、至少800 bp、至少900 bp或至少1000 bp。
    本發明啟動子之一些較佳功能活性變體係pG1、pG3、pG4、pG6、pG7或pG8啟動子核苷酸序列中之任一者之片段，較佳包括啟動子核苷酸序列之3'端之片段，例如衍生自具有特定長度且刪除5'末端區域(例如於5'端處切斷核苷酸序列，以便獲得3'端至變化5'端範圍內之特定長度)之啟動子核苷酸序列中之一者的核苷酸序列，例如核苷酸序列長度為至少200 bp，較佳至少250 bp，較佳至少300 bp、更佳至少400 bp、至少500 bp、至少600 bp、至少700 bp、至少800 bp、至少900 bp或至少1000 bp。
    已證明包含該等片段(例如特定長度在200 bp至1000 bp範圍內，較佳在250 bp至1000 bp範圍內、更佳在300 bp至1000 bp範圍內之片段，例如包括3'末端序列)或由該等片段組成的例示性變體具有功能活性。舉例而言，pG1之功能活性變體選自由以下組成之群：pG1a(SEQ ID 41)、pG1b(SEQ ID 42)、pG1c(SEQ ID 43)、pG1d(SEQ ID 44)、pG1e(SEQ ID 45)及pG1f(SEQ ID 46)，因此核苷酸序列在300-1000 bp範圍內，包括3'末端序列直至核苷酸1001。
    根據本發明之另一態樣，提供包含選自由以下組成之群之核酸序列的分離核酸：a)pG1(SEQ ID 1)、pG3(SEQ ID 2)、pG6(SEQ ID 3)、pG7(SEQ ID 5)或pG8(SEQ ID 6)，b)與pG1(SEQ ID 1)、pG3(SEQ ID 2)、pG6(SEQ ID 3)、pG7(SEQ ID 5)或pG8(SEQ ID 6)具有至少60%同源性之序列，c)在嚴格條件下與pG1(SEQ ID 1)、pG3(SEQ ID 2)、pG6(SEQ ID 3)、pG7(SEQ ID 5)或pG8(SEQ ID 6)雜交之序列，及d)衍生自a)、b)或c)之片段或變體，其中該核酸包含功能活性啟動子，其係與細胞之天然pGAP啟動子相比能夠以至少15%之轉錄率表現重組真核細胞中之POI的碳源可調節之啟動子。
    pG1(SEQ ID 1)、pG3(SEQ ID 2)、pG6(SEQ ID 3)、pG7(SEQ ID 5)或pG8(SEQ ID 6)之變體尤其係選自由以下組成之群之功能活性變體：具有至少約60%核苷酸序列一致性之同系物、可藉由在母體核苷酸序列中或在該序列之一個或兩個遠端處插入、刪除或取代一或多個核苷酸來修飾該序列獲得的同系物及衍生自除畢氏酵母以外之物種之類似物，較佳地核苷酸序列為至少200 bp，較佳至少250 bp，較佳至少300 bp、更佳至少400 bp、至少500 bp、至少600 bp、至少700 bp、至少800 bp、至少900 bp或至少1000 bp。
    本發明啟動子之一些較佳功能活性變體係pG1、pG3、pG6、pG7或pG8啟動子核苷酸序列中之任一者之片段，較佳包括啟動子核苷酸序列之3'端之片段，例如衍生自具有特定長度且刪除5'末端區域(例如於5'端處切斷核苷酸序列，以便獲得3'端至變化5'端範圍內之特定長度)之啟動子核苷酸序列中之一者的核苷酸序列，例如核苷酸序列長度為至少200 bp，較佳至少250 bp，較佳至少300 bp、更佳至少400 bp、至少500 bp、至少600 bp、至少700 bp、至少800 bp、至少900 bp或至少1000 bp。
    已證明包含該等片段(例如特定長度在200 bp至1000 bp範圍內，較佳在250 bp至1000 bp範圍內、更佳在300 bp至1000 bp範圍內之片段，例如包括3'末端序列)或由該等片段組成的例示性變體具有功能活性。舉例而言，pG1之功能活性變體選自由以下組成之群：pG1a(SEQ ID 41)、pG1b(SEQ ID 42)、pG1c(SEQ ID 43)、pG1d(SEQ ID 44)、pG1e(SEQ ID 45)及pG1f(SEQ ID 46)，因此核苷酸序列在300-1000 bp範圍內，包括3'末端序列直至核苷酸1001。
    碳源可調節之啟動子較佳具有如上文所闡述之轉錄強度，與參照pGAP啟動子相比較佳至少20%、更佳至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%及至少100%或與天然pGAP啟動子相比至少150%或至少200%之甚至更高轉錄強度。在一較佳實施例中，使用在解除抑制狀態中具有轉錄活性之該啟動子，該轉錄活性在解除抑制狀態中係抑制狀態之至少2倍、更佳至少5倍、甚至更佳至少10倍、更佳至少20倍、更佳至少30、40、50或100倍。本發明之特定啟動子適宜地用於該方法中。
    仍根據本發明之又一態樣，提供包含本發明啟動子之表現構築體，其在該啟動子之轉錄控制下以可操作方式連接至編碼POI之核苷酸序列，該啟動子並不與POI之編碼序列天然相關。
    本發明之又一態樣係指包含本發明構築體之載體。
    本發明之又一態樣係指包含本發明構築體或載體之重組真核細胞。
    細胞尤其選自由哺乳動物、昆蟲、酵母、絲狀真菌及植物細胞系組成之群，較佳為酵母。
    酵母可適宜地選自由以下組成之群：畢氏酵母、假絲酵母(Candida)、球擬酵母(Torulopsis)、阿需拉屬、漢遜屬、子囊菌酵母(Yarrowia)、克魯維酵母(Kluyveromyces)、釀酒酵母、克馬格特勒酵母，較佳為甲基營養性酵母。
    較佳地，酵母係畢氏酵母、巴斯德克馬格特勒酵母、法夫克馬格特勒酵母或假巴斯德克馬格特勒酵母。
    根據特定實施例，採用相對於限制碳源之條件在多餘碳源存在下具有較高比生長速率的細胞。
    本發明之又一態樣係指本發明重組真核細胞之用途，其用於產生POI。
    根據本發明之又一態樣，提供自真核細胞篩選或識別碳源可調節之啟動子的方法，其包含以下步驟：a)在細胞生長條件下在碳源存在下於分批培養中培養真核細胞，b)在有限量補充碳源存在下在分批補料培養中進一步培養細胞，c)提供步驟a)及b)之細胞培養物之試樣，及d)在該等試樣中實施轉錄分析以識別在步驟b)之細胞中比在步驟a)之細胞中顯示更高轉錄強度的可調節之啟動子。
    該較高轉錄強度可由完全誘導狀態中之轉錄強度決定，該轉錄強度係在(例如)葡萄糖限制恒化器培養之條件下獲得，其在解除抑制狀態中為抑制狀態之至少2倍、更佳至少5倍、甚至更佳至少10倍、更佳至少20倍、更佳至少30、40、50或100倍。
    較佳地，轉錄分析係定量或半定量分析，較佳採用DNA微陣列、RNA測序及轉錄組分析。
    如貫穿本說明書使用之特定術語具有以下含義。
    本文所用術語「碳源」應意指發酵性碳基質，通常來源碳水化合物，其適用作微生物之能源，例如彼等能夠由宿主有機體或生產細胞系代謝者，特定而言選自由以下組成之群之來源：單糖、寡糖、多糖、醇(包括甘油)，呈純化形式或提供於原材料(例如複合營養物質)中。根據本發明可以單一碳源形式或以不同碳源之混合物形式使用碳源。
    例如根據本發明使用之「基礎碳源」通常係適於細胞生長之碳源，例如用於真核細胞之營養物。基礎碳源可提供於培養基(例如基礎培養基或複合培養基)中，但亦可提供於含有純化碳源之經化學定義之培養基中。基礎碳源通常係以如下量提供：特定而言在生長期過程中在培養過程中使細胞生長，例如以獲得至少5 g/L細胞乾質量，較佳至少10 g/L細胞乾質量或至少15 g/L細胞乾質量之細胞密度，從而(例如)在標準子培養步驟中呈現超過90%，較佳超過95%之生存率。
    根據本發明，基礎碳源通常係以過量或多餘量使用，此應理解為過量提供能量以增加(例如)細胞系生長期過程中分批補料培養過程中之生物質。此多餘量特定而言超過補充碳源之有限量以在發酵液中達成殘餘濃度，其可量測且通常係補料有限量之補充碳源期間之至少10倍，較佳至少50倍或至少100倍。
    關於細胞培養基(例如分批補料過程中之補料培養基)之術語「經化學定義」應意指適於生產細胞系之活體外細胞培養的生長培養基，其中所有化學組份及肽均已知。經化學定義之培養基通常完全不含源自動物之組份且代表純的一致細胞培養環境。
    例如根據本發明使用之「補充碳源」通常係特定而言在培養過程之生產期過程中促進由生產細胞系產生發酵產物的補充基質。例如在分批、分批補料及連續培養過程中，生產期尤其在生長期之後。補充碳源尤其可包含於分批補料過程之補料中。
    碳源之「有限量」或「有限碳源」在本文中應理解為在生產期中或以生產模式保持生產細胞系所需之碳源之量。在分批補料過程中可採用該有限量，其中碳源包含於補料培養基中並以低補料速率供應至培養基以供持續能量遞送以產生POI，通常以低生長速率保持生物質。通常在細胞培養物生產期過程中向發酵液中添加補料培養基。
    補充碳源之有限量可由(例如)細胞培養液中之補充碳源之殘餘量決定，其低於預定臨限值或甚至低於如標準(碳水化合物)分析中量測之檢測限值。殘餘量通常可在收穫發酵產物後於發酵液中測定。
    補充碳源之有限量亦可藉由定義補充碳源至發酵罐之平均補料速率測定，如藉由在整個培養過程(例如分批補料期)中添加之量/培養時間以測定計算平均量/時間來測定。此平均補料速率保持較低以確保細胞培養物完全利用補充碳源，例如介於0.6 g L-1 h-1(g碳源/L初始發酵體積及h時間)與25 g L-1 h-1之間，較佳介於1.6 g L-1 h-1與20 g L-1 h-1之間。
    補充碳源之有限量亦可藉由在生產過程之前及期間量測比生長速率測定，該比生長速率在生產期保持較低，例如在預定範圍內，例如在0.02 h-1至0.20 h-1範圍內，較佳介於0.02 h-1與0.15 h-1之間。
    本文所用術語「細胞系」係指特定細胞類型之已確立純系，該細胞獲得在延長時間內增殖之能力。術語「宿主細胞系」係指如用於表現內源或重組基因或用於產生多肽之代謝途徑之產物或由該等多肽調介之細胞代謝產物的細胞系。「生產宿主細胞系」或「生產細胞系」通常應理解為在生物反應器中培養以獲得生產過程之產物(例如POI)的即用細胞系。術語「真核宿主」或「真核細胞系」應意指任何可經培養以產生POI或宿主細胞代謝產物之真核細胞或有機體。應充分瞭解，該術語不包括人類。
    術語「表現」或「表現系統」或「表現序列盒」係指可操作連接中含有期望編碼序列及控制序列之核酸分子，以便經該等序列轉化或轉染之宿主能夠產生經編碼蛋白或宿主細胞代謝產物。為實現轉化，載體中可包括表現系統；然而，亦可將相關DNA整合至宿主染色體中。表現可指分泌或未分泌表現產物，包括多肽或代謝產物。
    本文所用「表現構築體」或「載體」定義為適宜宿主有機體中經選殖重組核苷酸序列、即重組基因轉錄及其mRNA轉譯所需之DNA序列。表現載體通常包含在宿主細胞中自主複製之起點、可選標記(例如胺基酸合成基因或賦予抗生素(例如zeocin、卡那黴素(kanamycin)、G418或潮黴素(hygromycin)抗性之基因)、大量限制酶裂解位點、適宜啟動子序列及轉錄終止子，該等組份以可操作方式連接在一起。本文所用術語「質粒」及「載體」包括自主複製核苷酸序列以及基因組整合核苷酸序列。
    本文所用術語「變體」在本發明上下文中應指任何具有特異性同源性或類似性之序列。變體啟動子可(例如)藉由誘變以產生適用作重組細胞系中之啟動子的序列而衍生自啟動子序列pG1(SEQ ID 1)、pG3(SEQ ID 2)、pG4(SEQ ID 4)、pG6(SEQ ID 3)、pG7(SEQ ID 5)或pG8(SEQ ID 6)。該變體啟動子可自突變序列之文庫藉由選擇彼等具有特定性質之文庫成員來獲得。變體啟動子可具有相同或甚至改良性質，例如誘導POI產生改良，在抑制及解除抑制條件下具有增加差異效應。變體啟動子亦可衍生自類似序列，例如衍生自除畢氏酵母以外之真核物種或除畢氏酵母以外之屬，例如衍生自乳酸克魯維酵母(K.Lactis)、魯氏酵母(Z.rouxii)、樹幹畢赤酵母(P.stipitis)、多形漢遜酵母。與類似於相應畢氏酵母基因之基因天然相關之類似啟動子序列尤其可原樣使用或用作母體序列以產生其功能活性變體。尤其，- 類似於pG1之啟動子之特徵在於其與類似於G1(高親和力葡萄糖轉運蛋白；畢氏酵母GS115說明：假定轉運蛋白，糖轉運家族之成員；編碼序列SEQ ID 7)之基因天然相關；- 類似於pG3之啟動子之特徵在於其與類似於G3(編碼序列SEQ ID 8)之基因天然相關；- 類似於pG4之啟動子之特徵在於其與類似於G4(畢氏酵母GS115：預測線粒體醛脫氫酶；編碼序列SEQ ID 9)之基因天然相關；- 類似於pG6之啟動子之特徵在於其與類似於G6(編碼序列SEQ ID 10)之基因天然相關；- 類似於pG7之啟動子之特徵在於其與類似於G7(畢氏酵母GS115：主要促進劑糖轉運蛋白家族之成員；編碼序列SEQ ID 11)之基因天然相關；- 類似於pG8之啟動子之特徵在於其與類似於G8(畢氏酵母GS115：Gti1_Pac2超家族之成員；編碼序列SEQ ID 12)之基因天然相關。
    該等類似啟動子序列或其功能活性變體之性質可使用標準技術確定。
    如本文所用核苷酸或啟動子序列之「功能活性」變體意指因藉由在序列內或在序列之一個或兩個遠端處插入、刪除或取代一或多個核苷酸進行修飾而產生的序列，且該修飾不影響(特定而言損害)此序列之活性。
    本發明啟動子序列之功能活性變體尤其選自由以下組成之群：- 具有至少約60%核苷酸序列一致性之同系物，- 可藉由在序列內或在序列之一個或兩個遠端處插入、刪除或取代一或多個核苷酸來修飾母體核苷酸序列獲得之同系物，較佳具有(即包含或由其組成)至少200 bp，較佳至少300 bp、更佳至少400 bp、至少500 bp、至少600 bp、至少700 bp、至少800 bp、至少900 bp或至少1000 bp之核苷酸序列，及- 衍生自除畢氏酵母以外之物種之類似物。
    功能活性變體尤佳係彼等藉由修飾衍生自本發明啟動子者及/或啟動子序列之片段，具有(即包含或由其組成)至少200 bp，較佳至少250 bp，較佳至少300 bp、更佳至少400 bp、至少500 bp、至少600 bp、至少700 bp、至少800 bp、至少900 bp或至少1000 bp之核苷酸序列。
    本發明啟動子之一些較佳功能活性變體係pG1、pG3、pG4、pG6、pG7或pG8啟動子核苷酸序列中之任一者之片段，較佳包括啟動子核苷酸序列之3'端之片段，例如衍生自具有特定長度且刪除5'末端區域(例如於5'端處切斷核苷酸序列，以便獲得3'端至變化5'端範圍內之特定長度)之啟動子核苷酸序列中之一者的核苷酸序列，例如核苷酸序列長度為至少200 bp，較佳至少250 bp，較佳至少300 bp、更佳至少400 bp、至少500 bp、至少600 bp、至少700 bp、至少800 bp、至少900 bp或至少1000 bp。
    已證明包含該等片段(例如特定長度在200 bp至1000 bp範圍內，較佳在250 bp至1000 bp範圍內、更佳在300 bp至1000 bp範圍內之片段，例如包括3'末端序列)或由該等片段組成的例示性變體具有功能活性。舉例而言，pG1之功能活性變體選自由以下組成之群：pG1a(SEQ ID 41)、pG1b(SEQ ID 42)、pG1c(SEQ ID 43)、pG1d(SEQ ID 44)、pG1e(SEQ ID 45)及pG1f(SEQ ID 46)，因此核苷酸序列在300-1000 bp範圍內，包括3'末端序列直至核苷酸1001。
    關於本文所用啟動子之術語「可調節的」應指啟動子在過量碳源(營養基質)存在下在分批培養之生長期中在真核細胞中受抑制、且在生產細胞系之生產期中例如在碳之量減少後(例如在根據分批補料策略向培養物中補料生長限制碳源(營養基質)後)解除抑制以發揮強啟動子活性。就此而言，術語「可調節的」應理解為「碳源限制可調節的」或「葡萄糖限制可調節的」，其係指藉由碳消耗、減少、缺乏或耗盡、或藉由限制添加碳源以使其易於由細胞消耗而使啟動子解除抑制。
    本發明之功能活性啟動子係相對較強可調節之啟動子，其在細胞生長條件(生長期)下沉默或受抑制，且在生產條件(生產期)下被激活或解除抑制，且因此藉由限制碳源適於在生產細胞系中誘導POI產生。因此，啟動子之功能活性變體至少具有該等可調節之性質。
    本發明可調節之啟動子之強度係指其轉錄強度，由該啟動子處以高或低頻率發生之轉錄起始的效率代表。轉錄強度愈高，則該啟動子處愈頻繁地發生轉錄。啟動子強度係重要的，此乃因其決定轉錄給定mRNA序列之頻率，其有效地給予一些基因對於其他基因之較高轉錄優先權，從而產生較高濃度之轉錄物。舉例而言，編碼大量需要之蛋白質之基因通常具有相對較強啟動子。RNA聚合酶僅可一次實施一個轉錄任務且因此必須對其工作進行優先化以使其有效。啟動子強度差異經選擇以容許此優先化。根據本發明，可調節之啟動子在完全誘導狀態中相對較強，該完全誘導狀態通常理解為大約最大活性之狀態。相對強度通常係相對於標準啟動子(例如如用作宿主細胞之細胞之各別pGAP啟動子)測定。轉錄頻率通常理解為轉錄率，如(例如)由適宜分析(例如RT-PCR或北方印跡)中之轉錄物之量測定。舉例而言，本發明啟動子之轉錄強度係在宿主細胞(其係畢氏酵母)中測定且與畢氏酵母之天然pGAP啟動子進行比較。
    pGAP啟動子起始編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH之)gap基因(其係任何能夠在葡萄糖上生長之微生物中存在之組成型啟動子)的表現。GAPDH(EC 12112)(一種糖解之關鍵酶)在分解代謝及合成代謝碳水化合物代謝中起至關重要的作用。
    本發明可調節之啟動子發揮相對較高轉錄強度，反映為與宿主細胞中之天然pGAP啟動子(有時稱作「同源pGAP啟動子」)相比轉錄率或轉錄強度為至少15%。較佳地，與天然pGAP啟動子相比，轉錄率或強度係至少20%，在尤佳情形下至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%及至少100%或甚至更高，例如至少150%或至少200%，例如，選擇為用於產生POI之宿主細胞之真核細胞中所測定。
    在誘導狀態中至少具有pG1、pG3、PG4、pG6、pG7或pG8啟動子中之一者之轉錄強度的可調節之啟動子尤佳。採用pGAP啟動子作為參照之比較轉錄強度可藉由標準方式測定，例如藉由採用(例如)微陣列量測轉錄物之量或者在細胞培養物中藉由(例如)量測重組細胞中之各別基因表現產物之量。例示性測試闡釋於實例部分中。
    本發明啟動子尤其碳源可調節，其具有啟動子強度差異，如比較在葡萄糖及葡萄糖限制存在下其強度之測試中測定，此顯示其於相對較高葡萄糖濃度下，較佳於至少10 g/L，較佳至少20 g/L之濃度下仍受抑制。尤其在完全誘導啟動子之限制葡萄糖濃度及葡萄糖臨限值濃度下完全誘導本發明啟動子，該臨限值小於20 g/L，較佳小於10 g/L、小於1 g/L、甚至小於0,1 g/L或小於50 mg/L，較佳地於小於40 mg/L之葡萄糖濃度下完全轉錄強度為(例如)天然同源pGAP啟動子之至少50%。
    較佳地，差異啟動子強度係藉由在切換成低於預定碳源臨限值之誘導條件下起始POI產生來測定，且比較抑制狀態中之強度。轉錄強度通常理解為完全誘導狀態中之強度，即在解除抑制條件下顯示大約最大活性。差異啟動子強度係(例如)根據與抑制條件相比在解除抑制條件下重組宿主細胞系中POI產生之效率或產率或者藉由轉錄物之量測定。本發明可調節之啟動子在解除抑制狀態中之差異啟動子強度較佳為抑制狀態之至少2倍、更佳至少5倍、甚至更佳至少10倍、更佳至少20倍、更佳至少30、40、50或100倍，亦理解為倍數誘導。該差異啟動子強度可藉由如由隨附實例闡釋之測試測定。
    先前技術啟動子(MLS1啟動子或ICL1啟動子)結果是具有明顯小於2倍誘導之差異啟動子強度。該先前技術啟動子亦不用於工業POI產生，與pGAP啟動子標準相比啟動子強度為約5%。此已在與本發明啟動子之直接比較中得以證明。
    術語「同源性」指示兩個或更多個核苷酸序列在相應位置處具有相同或保守鹼基對至一定程度，高達接近100%之程度。同源序列通常具有至少約50%之核苷酸序列一致性，較佳至少約60%之一致性、更佳至少約70%之一致性、更佳至少約80%之一致性、更佳至少約90%之一致性、更佳至少約95%之一致性。
    本發明之同源啟動子序列較佳與畢氏酵母之pG1、pG3、pG4、pG6、pG7或pG8啟動子核苷酸序列中之任一者在核苷酸序列之至少特定部分中(例如包括各別啟動子核苷酸序列之3'區域，較佳具有直至各別啟動子核苷酸序列之3'端之特定長度的部分，例如具有至少200 bp，較佳至少250 bp，較佳至少300 bp、更佳至少400 bp、至少500 bp、至少600 bp、至少700 bp、至少800 bp、至少900 bp或至少1000 bp之長度之部分)及與衍生自除畢氏酵母以外之物種之類似物具有一定同源性。具體而言，至少彼等部分較佳在300-1000 bp範圍內、包括各別啟動子核苷酸序列之3'末端序列同源。
    類似序列通常衍生自其他物種或菌株。應明確瞭解，衍生自除畢氏酵母以外之物種之本發明之類似啟動子序列中之任一者可包含同源序列，即如本文所述具有一定同源性之序列。因此，術語「同源」亦可包括類似序列。另一方面，應瞭解，本發明亦係指包含一定同源性之類似序列及其同系物。
    關於基因之核苷酸序列之「一致性百分比(%)」定義為在(若需要)比對序列並引入空隙以達成最大序列一致性百分比後與DNA序列中之核苷酸一致之候選DNA序列中之核苷酸之百分比，且不考慮任何保守取代作為序列一致性之部分。出於測定核苷酸序列一致性百分比目的之比對可以業內熟知之各種方式(例如使用公開獲得之電腦軟體)達成。彼等熟習此項技術者可確定用於量測比對之適當參數，包括在所比較序列之全長範圍內達成最大比對所需要之任何演算法。
    本發明上下文中所用術語「誘變」應指經由(例如)插入、刪除及/或取代一或多個核苷酸使核苷酸序列突變，以便獲得在非編碼或編碼區域中具有至少一個變化之其變體的方法。誘變可經由隨機、半隨機或定點突變。大的隨機化基因文庫通常會產生高基因多樣性，其可根據明確需要之基因型或表現型加以選擇。
    本文所用術語「目標蛋白質(POI)」係指借助重組技術於宿主細胞中產生之多肽或蛋白質。更明確言之，蛋白質可為宿主細胞中非天然存在之多肽(即異源蛋白質)，或者可為宿主細胞之天然蛋白質(即與宿主細胞同源之蛋白質)，但係藉由以下方式產生：例如，藉由用含有編碼POI之核酸序列之自複製載體轉化，或藉由編碼POI之核酸序列之一或多個拷貝的重組技術整合至宿主細胞之基因組中，或藉由重組修飾例如啟動子序列之控制編碼POI之基因表現的一或多個可調節序列。在一些情形下，本文所用術語POI亦指由重組表現蛋白質調介之宿主細胞的任何代謝產物。
    本文所用術語「重組」應意指「係藉由遺傳改造製備或係遺傳改造之結果」。因此，「重組微生物」包含至少一種「重組核酸」。重組微生物明確言之包含表現載體或選殖載體，或其經遺傳改造以含有重組核酸序列。「重組蛋白質」係藉由在宿主中表現各別重組核酸產生。「重組啟動子」係適用作如本文所述功能活性啟動子之遺傳改造之非編碼核苷酸序列。
    令人驚奇之結果是，真核細胞能夠藉由限制碳源之可用性來誘導POI產生。發現碳饑餓條件可觸發誘導強力啟動子活性，其係相關技藝中尚未知者。如US2008299616A1中所述，欲在糖限制下解除抑制之畢氏酵母之MLS1啟動子對於POI之生產實際上係相當弱之可調節之啟動子。因此，令人驚奇的是，可以識別畢氏酵母之該強力可調節之啟動子且可用於真核生產細胞系中，特定而言用於重組POI之產生。
    儘管畢氏酵母之GS115菌株之9.43 Mbp基因組序列已經測得並揭示於US20110021378A1中，但尚未詳細研究個別序列(例如啟動子序列)之性質。舉例而言，如本文所述pG4序列(SEQ ID 4)在US20110021378A1中識別為啟動子序列，然而，在碳饑餓條件下其可調節之性質或其用途尚未知。甚至令人驚奇的是，該啟動子可有效地用於本發明方法中。例如用於工業規模之POI產生中的先前技術之調節啟動子主要衍生自甲醇代謝途徑且需要添加甲醇以誘導POI產生，此經常並不期望。本發明方法之優勢在於其可藉由增強表現使產生增加，且特定而言在使用不含甲醇鈉之經化學定義培養基時由於特定啟動子調節具有降低污染風險。
    結果是，本發明之可調節之啟動子可僅在使用適於確立啟動子抑制及解除抑制條件之極特定培養基時發揮其可調節之活性。作為實例，可在工業生產過程之條件下成功地培養畢氏酵母。首先採用基礎碳源(例如甘油)上之分批培養，之後在限制補料補充碳源(例如葡萄糖)下分批補料。在第一分批期結束時且在使用(例如)有限量之補充碳源之有效生長條件下取樣。利用DNA微陣列之轉錄組分析揭示對補充碳源具有強活性且在多餘碳存在下(即過量基礎碳源)活性較弱或無活性的特定基因。將至少六個啟動子序列識別為本發明之可調節之啟動子，即pG1(SEQ ID 1)、pG3(SEQ ID 2)、pG4(SEQ ID 4)、pG6(SEQ ID 3)、pG7(SEQ ID 5)及pG8(SEQ ID 6)。先前技術之比較MLS1或ICL1啟動子相當弱，小於pG1啟動子之強度之1/10，且無可檢測之調節。
    可在發酵製程中驗證抑制基礎碳源上之重組基因表現及限制補充碳源上之強表現(即由基質誘導)的特徵。
    可自多種來源獲得可用作本發明之調節序列(其可改良重組蛋白質產生)之核苷酸序列。本發明啟動子之來源較佳來自酵母細胞，最佳來自甲基營養性酵母，例如來自畢氏屬或來自畢氏酵母物種，該啟動子隨後可用作母體序列以產生適宜變體，例如突變體或類似物。
    預計特定而言畢氏菌株之一系列酵母細胞可適於獲得負責在碳饑餓條件下蛋白質產生的各別啟動子序列或不同物種之各別類似物。
    可採用標準技術產生經識別畢氏酵母啟動子之變體(包括功能活性變體，例如同系物及類似物)。啟動子可(例如)經修飾以產生具有改變表現程度及調節性質之啟動子變體。
    舉例而言，啟動子文庫可藉由誘變可用作母體分子之本發明之啟動子序列來製備，以(例如)藉由分析在不同發酵策略下變體之表現及選擇適宜變體來微調真核細胞中之基因表現。變體之合成文庫可用於(例如)選擇匹配產生選擇POI之需要的啟動子。該等變體在真核宿主細胞中可具有改良表現效率且在耗盡碳源時具有高表現。
    差異發酵策略可區分生長期(例如本發明之步驟a))與生產期(例如步驟b)。
    生長及/或生產可以分批模式、分批補料模式或連續模式適宜地發生。可使用任何適宜生物反應器，包括分批、分批補料、連續、攪拌罐反應器或氣升式反應器。
    有利地提供小規模或工業規模之發酵製程。工業製程規模可較佳採用至少10 L、尤其至少50 L，較佳至少1 m3，較佳至少10 m3、最佳至少100 m3之體積。
    工業規模之生產條件較佳，其係指(例如)在100 L至10 m3或更大反應器體積中採用若干天之典型製程時間的分批補料培養、或在約50-1000 L或更大發酵罐體積中之連續製程，稀釋速率為約0.02-0.15 h-1。
    適宜培養技術可涵蓋在生物反應器中以分批期開始、之後以高比生長速率短指數分批補料期、另外之後以低比生長速率分批補料期培養。另一適宜培養技術可涵蓋分批期、之後以低稀釋速率之連續培養期。
    本發明之較佳實施例包括分批培養以提供生物質，之後分批補料培養以高產率產生POI。
    舉例而言，細胞系可在本發明之步驟a)中在甘油或葡萄糖上生長以獲得生物質。
    較佳在生物反應器上在生長條件下培養本發明之宿主細胞系以獲得至少1 g/L細胞乾重、更佳至少10 g/L細胞乾重，較佳至少20 g/L細胞乾重之細胞密度。有利地以小規模或工業規模以該等產率產生生物質。
    可累積生物質之生長培養基(尤其基礎生長培養基)通常包含碳源、氮源、硫源及磷酸根來源。通常，此一培養基另外包含微量元素及維生素，且可另外包含胺基酸、蛋白腖或酵母提取物。
    較佳氮源包括NH4H2PO4或NH3或(NH4)2SO4；較佳硫源包括MgSO4或(NH4)2SO4或K2SO4；較佳磷酸根來源包括NH4H2PO4或H3PO4或NaH2PO4、KH2PO4、Na2HPO4或K2HPO4；其他典型培養基組份包括KCl、CaCl2及微量元素，例如：Fe、Co、Cu、Ni、Zn、Mo、Mn、I、B；較佳地，培養基補充有維生素B7；畢氏酵母之典型生長培養基包含甘油或葡萄糖、NH4H2PO4、MgSO4、KCl、CaCl2、生物素及微量元素。
    在生產期中，生產培養基尤其僅與有限量之補充碳源一起使用。
    較佳地，在具有適宜碳源之礦物培養基中培養宿主細胞系，藉此進一步顯著簡化分離過程。較佳礦物培養基之實例係含有以下用以(例如)補充營養缺陷者：可用碳源(例如葡萄糖、甘油或甲醇)、含有大量元素(鉀、鎂、鈣、銨、氯離子、硫酸根、磷酸根)及微量元素(銅、碘離子、錳、鉬酸根、鈷、鋅及鐵鹽及硼酸)之鹽及視情況維生素或胺基酸。
    端視表現系統及表現蛋白質(例如，蛋白質是否融合至信號肽及蛋白質是否可溶或膜結合)而定，在適於實現可自細胞或培養基純化之期望POI之表現的條件下培養細胞。如熟習此項技術者應瞭解，培養條件可根據包括宿主細胞類型及所用特定表現載體之因素而變。
    由本發明啟動子誘導POI產生較佳係藉由在作為碳及能量之唯一來源之有限量補充碳源上培養細胞加以控制。細胞在碳限制條件下生長極緩慢，但在可調節之啟動子控制下產生高產率之POI。
    與抑制狀態相比，解除抑制狀態中之啟動子活性差異尤其係至少2倍，較佳至少5倍、更佳至少10倍、更佳至少20倍、更佳至少30、40、50或100倍。
    藉由選擇本發明之適宜啟動子序列，視情況與進一步較佳調節序列組合，可在相當條件下提供至少相同、或至少約1.5倍、或至少約2倍、或至少約5倍、10倍、或至少高達約15倍之活性，如由啟動子活性或轉錄強度代表，或由相對於與產生細胞、天然pGAP同源之GAP啟動子的啟動子強度調節，或分離自畢氏酵母。
    典型生產培養基包含補充碳源及另外NH4H2PO4、MgSO4、KCl、CaCl2、生物素及微量元素。
    舉例而言，添加進行發酵之補充碳源之補料可包含具有高達50 wt%發酵性糖之碳源。補充培養基之低補料速率將限制產物抑制對細胞生長之效應，由此可基於基質提供產生高產率產物。
    發酵較佳係在3至7.5範圍內之pH下實施。
    典型發酵時間係約24至120小時，溫度在20℃至35℃，較佳22℃至30℃範圍內。
    一般而言，如本文中提及之重組核酸或有機體可藉由熟習此項技術者熟知之重組技術產生。根據本發明，可採用熟習此項技術者所熟知之習用分子生物學、微生物學及重組DNA技術。文獻中對該等技術進行了充分解釋。例如，參見Maniatis，Fritsch & Sambrook,Molecular Cloning：A Laboratory Manual(1982)。
    根據本發明之一較佳實施例，重組構築體係藉由將啟動子及相關基因連接至載體中獲得。可藉由使用該等載體轉化宿主細胞將該等基因穩定地整合至宿主細胞基因組中。
    表現載體可包括(但不限於)選殖載體、經修飾選殖載體及尤其經設計質粒。如本發明中使用之較佳表現載體可為任何適於重組基因在宿主細胞中表現之表現載體且根據宿主有機體進行選擇。重組表現載體可為任何能夠在宿主有機體(亦稱作宿主載體)之基因組中複製或整合於該基因組中之載體。
    在本發明中，較佳使用衍生自作為載體之pPUZZLE之質粒。
    適當表現載體通常另外包含適於表現真核宿主細胞中編碼POI之DNA的調節序列。調節序列之實例包括操作子、增強子、核糖體結合位點及控制轉錄及轉譯起始及終止之序列。調節序列可以可操作方式連接至欲表現DNA序列。
    為容許宿主細胞中之重組核苷酸序列表現，表現載體可毗鄰編碼序列之5'端(例如自信號肽基因上游)提供本發明啟動子。藉此由此啟動子序列調節並開始轉錄。
    信號肽可為異源信號肽或天然信號肽與異源信號肽之混合物，且尤其可與產生蛋白質之宿主有機體異源或同源。信號肽之功能係使欲分泌POI進入內質網膜系。其通常係引導蛋白質輸送至質膜外之短(3-60個胺基酸長)肽鏈，藉此使得易於分離並純化異源蛋白質。在輸送蛋白質後，自蛋白質藉由信號肽酶裂解一些信號肽。
    例示性信號肽係來自釀酒酵母α交配因子前體肽之信號序列及來自畢氏酵母酸性磷酸酶基因(PHO1)之信號肽。
    若啟動子控制編碼序列之轉錄，則啟動子序列應理解為以可操作方式連接至編碼序列。若啟動子序列並不與編碼序列天然相關，則其轉錄並不受天然(野生型)細胞中之啟動子控制或序列與不同連續序列重組。
    為證明相關序列之功能，包含一或多個調節元件之表現載體可經構築以驅動POI表現，且與具有習用調節元件之構築體比較表現產率。實驗程序之詳細說明可參見以下實例。經識別基因可藉由PCR自畢氏酵母使用特定核苷酸引子擴增，將其選殖至表現載體中並使用(例如)酵母載體及畢氏酵母菌株轉化至真核細胞系中，以高程度產生各種不同POI。為評估本發明啟動子對如此產生之重組POI之量的效應，可在振盪燒瓶實驗及分批補料或恒化器發酵中培養真核細胞系，與各別細胞中之包含習用、非碳源可調節之啟動子(例如標準pGAP啟動子)之菌株比較。特定而言，啟動子之選擇對重組蛋白質產生具有重大影響。
    由微生物攝取重組DNA片段之較佳轉化方法包括化學轉化、電穿孔或藉由原生質體化轉化。本發明之轉化體可藉由將該載體DNA(例如質粒DNA)引入宿主中並選擇以高產率表現相關蛋白質或宿主細胞代謝產物之轉化體來獲得。
    POI可使用重組宿主細胞系藉由以下方式來產生：培養適當培養基中由此獲得之轉化體、自培養物分離表現產物或代謝產物及視情況藉由適宜方法對其進行純化。
    本發明之轉化體可藉由將該載體DNA(例如質粒DNA)引入宿主中並選擇以高產率表現POI或宿主細胞代謝產物之轉化體來獲得。處理宿主細胞以使其能夠藉由通常用於真核細胞轉化之方法(例如電脈衝方法、原生質體方法、乙酸鋰方法及其經修飾方法)引入外來DNA。畢氏酵母較佳藉由電穿孔轉化。
    本發明之較佳宿主細胞系維持本發明採用之遺傳性質，且甚至在約20代，較佳至少30代、更佳至少40、最佳至少50代培養後仍保持較高產生量，例如於至少1 μg量下。在用於工業規模生產時，認為穩定重組宿主細胞具有顯著優勢。
    根據本發明方法產生POI之若干不同方法較佳。可藉由轉化真核宿主細胞與具有編碼相關蛋白質之重組DNA及上述調節元件中之至少一者的表現載體、製備轉化細胞之培養物、使培養物生長、誘導轉錄及POI產生及回收發酵過程之產物使物質表現、對其進行處理並視情況分泌。
    較佳採用用以產生以下產率之條件使POI表現：至少1 mg/L，較佳至少10 mg/L，較佳至少100 mg/L、最佳至少1 g/L。
    較佳藉由以下測試來測試本發明宿主細胞之表現能力或產率：ELISA、活性分析、HPLC或其他適宜測試。
    應瞭解，本文揭示之方法可另外包括在允許POI較佳以分泌形式或者以細胞內產物形式表現之條件下培養該等重組宿主細胞。隨後可自細胞培養基分離重組產生之POI或宿主細胞代謝產物並藉由彼等熟習此項技術者熟知之技術進一步純化。
    通常可使用先前技術之技術(包括增加期望POI之濃度及/或降低至少一種雜質之濃度)分離並純化本發明產生之POI。
    若POI係自細胞分泌，則可使用先前技術之技術將其自培養基分離並純化。出於包括促進純化製程之原因，重組表現產物自宿主細胞分泌通常有利，此乃因產物係自培養物上清液而非自破壞酵母細胞以釋放細胞內蛋白質時產生之蛋白質之複雜混合物回收。
    亦可以聲波或機械、酶或化學方式使經培養轉化體細胞破裂以獲得含有期望POI之細胞提取物，自其分離並純化POI。
    可使用以下方法作為獲得重組多肽或蛋白產物之分離及純化方法：例如，利用溶解度差異之方法(例如鹽析及溶劑沈澱)、利用分子量差異之方法(例如超濾及凝膠電泳)、利用電荷差異之方法(例如離子交換層析)、利用特異性親和力之方法(例如親和力層析)、利用疏水性差異之方法(例如反相高效液相層析)及利用等電點差異之方法(例如等電聚焦)。
    高度純化產物基本上不含污染蛋白質，且較佳純度為至少90%、更佳至少95%、或甚至至少98%、高達100%。純化產物可藉由純化細胞培養物上清液或者自細胞碎屑獲得。
    以下標準方法作為分離及純化方法較佳：細胞破壞(若POI係以細胞內方式獲得)、藉由微過濾或切向流過濾器(TFF)或離心之細胞(碎屑)分離及洗滌、藉由沈澱或熱處理之POI純化、藉由酶消解之POI激活、藉由層析(例如離子交換層析(IEX)、疏水相互作用層析(HIC)、親和力層析、尺寸排除層析(SEC)或HPLC層析)之POI純化、藉由超濾步驟進行濃縮及洗滌之POI沈澱。
    可藉由習用方法(例如西方印跡、HPLC、活性分析或ELISA)識別分離及純化之POI。
    POI可為任何真核、真核或合成多肽。其可為分泌蛋白質或細胞內蛋白質。本發明亦可重組產生天然蛋白質之功能同系物、功能等效變體、衍生物及生物活性片段。功能同系物較佳與序列之功能特徵一致或與其對應或具有該等功能特徵。
    本文中提及之POI可為與真核宿主細胞同源或較佳針對治療、預防、診斷、分析或工業用途異源的產物。
    POI較佳係真核細胞，較佳酵母細胞中產生之較佳呈分泌蛋白質形式之異源重組多肽或蛋白質。較佳產生之蛋白質之實例係免疫球蛋白、免疫球蛋白片段、抑肽酶、組織因子途徑抑制劑或其他蛋白酶抑制劑、及胰島素或胰島素前體、胰島素類似物、生長激素、介白素、織血纖蛋白溶酶原激活劑、轉化生長因子a或b、高血糖素、高血糖素樣肽1(GLP-1)、高血糖素樣肽2(GLP-2)、GRPP、因子VII、因子VIII、因子XIII、血小板源生長因子1、血清白蛋白、酶(例如脂肪酶或蛋白酶)、或與天然蛋白質具有類似功能之功能同系物、功能等效變體、衍生物及生物活性片段。POI可在結構上與天然蛋白質相似且可藉由以下方式衍生自天然蛋白質：向天然蛋白質之C末端及N末端中之任一者或二者或側鏈中添加一或多個胺基酸、在天然胺基酸序列中之一個或多個不同位點處取代一或多個胺基酸、在天然蛋白質之一端或兩端處或在胺基酸序列中之一或若干位點處刪除一或多個胺基酸或在天然胺基酸序列中之一或多個位點處插入一或多個胺基酸。該等修飾針對上述蛋白質中之若干已眾所周知。
    POI亦可選自在宿主細胞中提供生物化學反應之基質、酶、抑制劑或輔因子，目的係獲得該生物化學反應或若干反應之級聯之產物，例如獲得宿主細胞之代謝產物。例示性產物可為維生素(例如核黃素(riboflavin))、有機酸及醇，在本發明重組蛋白質或POI表現後其可以增加產率獲得。
    一般而言，表現重組產物之宿主細胞可為任何適於重組表現POI之真核細胞。
    較佳哺乳動物細胞之實例係BHK、CHO(CHO-DG44、CHO-DUXB11、CHO-DUKX、CHO-K1、CHOK1SV、CHO-S)、HeLa、HEK293、MDCK、NIH3T3、NS0、PER.C6、SP2/0及VERO細胞。
    用作本發明宿主細胞之較佳酵母細胞之實例包括(但不限於)釀酒酵母屬(例如釀酒酵母)、畢氏屬(例如畢氏酵母或醇畢氏酵母(P.methanolica))、克馬格特勒酵母屬(巴斯德克馬格特勒酵母、假巴斯德克馬格特勒酵母或法夫克馬格特勒酵母)、多形漢遜酵母或乳酸克魯維酵母。
    較新文獻將畢氏酵母分成並重命名成巴斯德克馬格特勒酵母、法夫克馬格特勒酵母及假巴斯德克馬格特勒酵母。本文中畢氏酵母對於所有巴斯德克馬格特勒酵母、法夫克馬格特勒酵母及假巴斯德克馬格特勒酵母均同義使用。
    較佳酵母宿主細胞係衍生自甲基營養性酵母，例如畢氏或克馬格特勒酵母，例如畢氏酵母、或巴斯德克馬格特勒酵母、或法夫克馬格特勒酵母、或假巴斯德克馬格特勒酵母。宿主包括諸如畢氏酵母等酵母。畢氏酵母菌株之實例包括CBS 704(=NRRL Y-1603=DSMZ 70382)、CBS 2612(=NRRL Y-7556)、CBS 7435(=NRRL Y-11430)、CBS 9173-9189(CBS菌株：CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre,Centraalbureau voor Schimmelcultures,Utrecht,The Netherlands)及DSMZ 70877(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)、以及來自Invitrogen之菌株(例如X-33、GS115、KM71及SMD1168)。釀酒酵母菌株之實例包括W303、CEN.PK及BY系列(EUROSCARF收藏)。所有上述菌株均成功地用於產生轉化體及表現異源基因。
    本發明之較佳酵母宿主細胞(例如畢氏酵母或釀酒酵母宿主細胞)含有異源或重組啟動子序列，其可衍生自不同於生產宿主之畢氏酵母或釀酒酵母菌株。在另一具體實施例中，本發明宿主細胞包含含有源自與宿主細胞相同之屬、物種或菌株之啟動子的本發明重組表現構築體。
    啟動子可為本發明啟動子或在宿主細胞中顯示轉錄活性之任何其他DNA序列且可衍生自編碼與宿主同源或異源之蛋白質的基因。啟動子較佳衍生自編碼與宿主細胞同源之蛋白質的基因。
    舉例而言，本發明啟動子可衍生自酵母(例如釀酒酵母菌株)且用於表現酵母中之POI。尤佳實施例係關於源自畢氏酵母之本發明啟動子，其用於在畢氏酵母產生宿主細胞系中產生重組POI之方法中。核苷酸序列之同源來源促進其納入相同屬或物種之宿主細胞中，由此使得能夠在工業製程中可能以增加產率穩定產生POI。亦可使用來自其他適宜酵母或其他真菌或其他有機體(例如脊椎動物或植物)之啟動子之功能活性變體。
    若POI係與宿主細胞同源之蛋白質(即宿主細胞中天然存在之蛋白質)，則POI於宿主細胞中之表現可藉由其天然啟動子序列與本發明啟動子序列交換得以調節。
    此目的可藉由(例如)用重組DNA分子轉化宿主細胞來達成，該重組DNA分子包含容許位點特異性重組之靶基因之同源序列、啟動子序列及適於宿主細胞之選擇性標記。應發生位點特異性重組從而以可操作方式連接啟動子序列與編碼POI之核苷酸序列。此可使來自本發明啟動子序列而非來自天然啟動子序列之POI表現。
    在本發明之尤佳實施例中，啟動子序列相對於POI之天然啟動子序列具有增加之啟動子活性。
    根據本發明，較佳提供包含以可操作方式連接至編碼POI之核苷酸序列之本發明啟動子序列的畢氏酵母宿主細胞系。
    根據本發明，亦可提供本發明之通配載體或宿主細胞，其包含本發明啟動子，且其易於納入編碼POI之目標基因。因此，通配細胞系係預形成之宿主細胞系，針對其表現能力對其進行表徵。此遵循例如使用位點特異性重組酶調介之序列盒交換用於生成生產細胞系、POI產生的創新「通配」平臺策略。此一新宿主細胞促進在數天內將目標基因(GOI)選殖至(例如)預定基因組表現熱點中以得到可重現之高效生產細胞系。
    根據一較佳實施例，本發明方法採用編碼POI之重組核苷酸序列，以單一拷貝或多個拷貝/細胞將其提供於適於整合至宿主細胞之基因組中的質粒上。亦可以單一拷貝或多個拷貝/細胞將編碼POI之重組核苷酸序列提供於自主複製之質粒上。
    本發明之較佳方法採用質粒，其係真核表現載體，較佳酵母表現載體。表現載體可包括(但不限於)選殖載體、經修飾選殖載體及尤其經設計質粒。如本發明中使用之較佳表現載體可為任何適於重組基因在宿主細胞中表現之表現載體且根據宿主有機體進行選擇。重組表現載體可為任何能夠在宿主有機體(亦稱作宿主載體，例如酵母載體，其載有本發明之DNA構築體)之基因組中複製或整合至該基因組中的載體。較佳酵母表現載體係在選自由以下組成之群之酵母中表現：由漢遜、畢氏、假絲酵母及球擬酵母屬代表之甲基營養性酵母。
    在本發明中，較佳使用衍生自作為載體之pPICZ、pGAPZ、pPIC9、pPICZalfa、pGAPZalfa、pPIC9K、pGAPHis或pPUZZLE之質粒。
    根據本發明之一較佳實施例，重組構築體係藉由將相關基因連接至載體中獲得。可藉由使用該等載體轉化宿主細胞將該等基因穩定地整合至宿主細胞基因組中。由基因編碼之多肽可使用重組宿主細胞系藉由以下方式產生：培養適當培養基中由此獲得之轉化體、自培養物分離表現POI及藉由適於表現產物、特定而言用於分離POI與污染蛋白質之方法對其進行純化。
    表現載體可包含一或多個表型可選標記，例如編碼賦予抗生素抗性或供應自養需要之蛋白質的基因。酵母載體通常含有來自酵母質粒之複製起點、自主複製序列(ARS)、或另一選擇為用於整合至宿主基因組中之序列、啟動子區域、聚腺苷酸化之序列、轉錄終止之序列及可選標記。
    用於分別連接(例如)編碼先行序列及/或POI之DNA序列、啟動子及終止子及將其插入含有整合或宿主複製所需之資訊之適宜載體中的程序已為彼等熟習此項技術者所熟知，例如，由J.Sambrook等人於「Molecular Cloning，第2版」，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)中所述。
    應瞭解，可藉由首先製備含有編碼調節元件及/或POI之整個DNA序列的DNA構築體及隨後將此片段插入適宜表現載體中、或藉由依序插入含有個別元件(例如信號、前導序列或異源蛋白質)之遺傳資訊的DNA片段、之後連接來構築使用本發明調節元件及/或POI作為整合靶標之載體。
    亦可根據本發明使用多選殖載體(其係具有多選殖位點之載體)，其中可在多選殖位點處納入期望異源基因以提供表現載體。在表現載體中，啟動子置於POI之基因之上游且調節基因之表現。在多選殖載體情形下，由於在多選殖位點處引入POI之基因，故啟動子置於多選殖位點之上游。
    如提供用以獲得本發明之重組宿主細胞之DNA構築體可藉由確立之標準方法(例如亞磷醯胺方法)以合成方式製備。DNA構築體亦可具有基因組或cDNA來源，例如藉由製備基因組或cDNA文庫及藉由使用合成寡核苷酸探針根據標準技術雜交篩選編碼本發明多肽之全部或部分之DNA序列獲得(Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratorv Manual,Cold Spring Harbor,1989)。最後，DNA構築體可為藉由根據標準技術使合成、基因組或cDNA來源之片段、(若適當)對應於整個DNA構築體之不同部分之片段退火製備之混合合成及基因組、混合合成及cDNA或混合基因組及cDNA來源。
    在另一較佳實施例中，酵母表現載體能夠穩定地在酵母基因組中藉由(例如)同源重組整合。
    可較佳首先在有效生長至大細胞數量而對表現異源蛋白質無負擔之條件下培養藉由將細胞與本發明調節元件及/或POI基因轉化獲得之本發明之轉化體宿主細胞。在細胞系係製備用於POI表現時，選擇培養技術以產生表現產物。
    將以下定義之標的物視為本發明之實施例：
    1.一種藉由培養包含表現構築體之重組真核細胞系產生目標蛋白質(POI)的方法，該表現構築體包含可調節之啟動子及在該啟動子之轉錄控制下編碼POI的核酸分子，該方法包含以下步驟：a)用抑制該啟動子之基礎碳源培養該細胞系，b)不用或用有限量之使該啟動子解除抑制之補充碳源培養該細胞系，從而誘導該POI產生，其與該細胞之天然pGAP啟動子相比為至少15%之轉錄率，及c)產生並回收該POI。
    2.如定義1之方法，其中該基礎碳源係選自由葡萄糖、甘油、乙醇及複合營養物質組成之群。
    3.如定義1或2之方法，其中該補充碳源係諸如葡萄糖、果糖、半乳糖或甘露糖等己糖、諸如蔗糖等雙醣、諸如甘油或乙醇等醇或其混合物。
    4.如定義1至3中任一項之方法，其中該基礎碳源係甘油，且該補充碳源係葡萄糖。
    5.如定義1至4中任一項之方法，其中步驟b)採用在培養基中不提供或提供有限量，較佳0 g/L至1 g/L補充碳源之補料培養基。
    6.如定義5之方法，其中該補料培養基經化學定義且不含甲醇。
    7.如定義1至6中任一項之方法，其中該有限量之補充碳源限制生長以保持比生長速率在0.02 h-1至0.2 h-1，較佳0.02 h-1至0.15 h-1範圍內。
    8.如定義7之方法，其中該有限量之補充源在該細胞培養物中提供低於檢測限值之殘餘量。
    9.如定義1至8中任一項之方法，其中該啟動子能夠控制野生型真核細胞中之基因轉錄，該基因係選自由G1(SEQ ID 7)、G3(SEQ ID 8)、G4(SEQ ID 9)、G6(SEQ ID 10)、G7(SEQ ID 11)或G8(SEQ ID 12)或其功能活性變體組成之群。
    10.如定義9之方法，其中該等功能活性變體係選自由以下組成之群：具有至少約60%核苷酸序列一致性之同系物、可藉由在母體核苷酸序列內或在該序列之一個或兩個遠端處插入、刪除或取代一或多個核苷酸來修飾該序列獲得的同系物及衍生自除畢氏酵母以外之物種之類似物，該序列較佳包含至少200 bp之核苷酸序列或由其組成。
    11.如定義9或10之方法，其中該pG1之功能活性變體係選自由以下組成之群：pG1a(SEQ ID 41)、pG1b(SEQ ID 42)、pG1c(SEQ ID 43)、pG1d(SEQ ID 44)、pG1e(SEQ ID 45)及pG1f(SEQ ID 46)。
    12.如定義1至11中任一項之方法，其中該啟動子係畢氏酵母啟動子或其功能活性變體。
    13.如定義1至12中任一項之方法，其中該細胞系選自由哺乳動物、昆蟲、酵母、絲狀真菌及植物細胞系組成之群，較佳為酵母。
    14.如定義13之方法，其中該酵母係選自由以下組成之群：畢氏酵母、假絲酵母、球擬酵母、阿需拉屬、漢遜屬、子囊菌酵母、克魯維酵母、釀酒酵母、克馬格特勒酵母，較佳為甲基營養性酵母。
    15.如定義14之方法，其中該酵母係畢氏酵母、巴斯德克馬格特勒酵母、法夫克馬格特勒酵母或假巴斯德克馬格特勒酵母。
    16.如定義1至15中任一項之方法，其中該啟動子並不與編碼該POI之該核苷酸序列天然相關。
    17.如定義1至16中任一項之方法，其中該POI係異源蛋白質，較佳選自包括抗體或其片段之治療性蛋白質、酶及肽、蛋白質抗生素、毒素融合蛋白質、碳水化合物-蛋白質偶聯物、結構蛋白質、調節蛋白質、疫苗及疫苗樣蛋白質或粒子、過程酶、生長因子、激素及細胞介素或POI之代謝產物。
    18.如定義1至17中任一項之方法，其中該POI係真核蛋白質，較佳哺乳動物蛋白質。
    19.如定義1至18中任一項之方法，其中該POI係多聚體蛋白質，較佳二聚體或四聚體。
    20.如定義1至19中任一項之方法，其中該POI係抗原結合分子，例如抗體或其片段。
    21.如定義1至20中任一項之方法，其中發酵產物係使用該POI、其代謝產物或衍生物製造。
    22.一種在碳源可調節之啟動子之轉錄控制下控制重組真核細胞中之POI之表現的方法，該可調節之啟動子與該細胞之天然pGAP啟動子相比具有至少15%之轉錄強度，其中在限制該碳源之條件下誘導該表現。
    23.一種在碳源可調節之啟動子之轉錄控制下在重組真核細胞中產生POI的方法，其中該啟動子與該細胞之天然pGAP啟動子相比具有至少15%之轉錄強度。
    24.如定義1至23中任一項之方法，其中該可調節之啟動子包含選自由以下組成之群之核酸序列：a)pG1(SEQ ID 1)、pG3(SEQ ID 2)、pG4(SEQ ID 4)、pG6(SEQ ID 3)、pG7(SEQ ID 5)或pG8(SEQ ID 6)；b)與pG1(SEQ ID 1)、pG3(SEQ ID 2)、pG4(SEQ ID 4)、pG6(SEQ ID 3)、pG7(SEQ ID 5)或pG8(SEQ ID 6)具有至少60%同源性之序列；c)在嚴格條件下與pG1(SEQ ID 1)、pG3(SEQ ID 2)、pG4(SEQ ID 4)、pG6(SEQ ID 3)、pG7(SEQ ID 5)或pG8(SEQ ID 6)雜交之序列；及d)衍生自a)、b)或c)之片段或變體，其中該啟動子係功能活性啟動子，其係與該細胞之天然pGAP啟動子相比能夠以至少15%之轉錄率表現重組真核細胞中之POI的碳源可調節之啟動子。
    25.如定義24之方法，其中該pG1(SEQ ID 1)、pG3(SEQ ID 2)、pG4(SEQ ID 4)、pG6(SEQ ID 3)、pG7(SEQ ID 5)或pG8(SEQ ID 6)之變體係選自由以下組成之群之功能活性變體：具有至少約60%核苷酸序列一致性之同系物、可藉由在母體核苷酸序列內或在該序列之一個或兩個遠端處插入、刪除或取代一或多個核苷酸來修飾該序列獲得的同系物及衍生自除畢氏酵母以外之物種之類似物，該序列較佳包含至少200 bp之核苷酸序列或由其組成。
    26.如定義24或25之方法，其中該pG1之功能活性變體係選自由以下組成之群：pG1a(SEQ ID 41)、pG1b(SEQ ID 42)、pG1c(SEQ ID 43)、pG1d(SEQ ID 44)、pG1e(SEQ ID 45)及pG1f(SEQ ID 46)。
    27.一種分離之核酸，其包含選自由以下組成之群之核酸序列：a)pG1(SEQ ID 1)、pG3(SEQ ID 2)、pG6(SEQ ID 3)、pG7(SEQ ID 5)或pG8(SEQ ID 6)；b)與pG1(SEQ ID 1)、pG3(SEQ ID 2)、pG6(SEQ ID 3)、pG7(SEQ ID 5)或pG8(SEQ ID 6)具有至少60%同源性之序列；c)在嚴格條件下與pG1(SEQ ID 1)、pG3(SEQ ID 2)、pG6(SEQ ID 3)、pG7(SEQ ID 5)或pG8(SEQ ID 6)雜交之序列；及d)衍生自a)、b)或c)之片段或變體，其中該核酸包含功能活性啟動子，其係與細胞之天然pGAP啟動子相比能夠以至少15%之轉錄率表現重組真核細胞中之POI的碳源可調節之啟動子。
    28.如定義27之核酸，其中該pG1(SEQ ID 1)、pG3(SEQ ID 2)、pG6(SEQ ID 3)、pG7(SEQ ID 5)或pG8(SEQ ID 6)之變體係選自由以下組成之群之功能活性變體：具有至少約60%核苷酸序列一致性之同系物、可藉由在母體核苷酸序列內或在該序列之一個或兩個遠端處插入、刪除或取代一或多個核苷酸來修飾該序列獲得的同系物及衍生自除畢氏酵母以外之物種之類似物，該序列較佳具有至少200 bp之核苷酸序列。
    29.如定義27或28之核酸，其中該pG1之功能活性變體係選自由以下組成之群：pG1a(SEQ ID 41)、pG1b(SEQ ID 42)、pG1c(SEQ ID 43)、pG1d(SEQ ID 44)、pG1e(SEQ ID 45)及pG1f(SEQ ID 46)。
    30.一種表現構築體，其包含如定義27至29中任一項之核酸，該核酸在該啟動子之轉錄控制下以可操作方式連接至編碼POI之核苷酸序列，該核酸並不與編碼該POI之核苷酸序列天然相連。
    31.一種載體，其包含如定義30之構築體。
    32.一種重組真核細胞，其包含如定義30之構築體或如定義31之載體。
    33.如定義31之細胞，其係選自由哺乳動物、昆蟲、酵母、絲狀真菌及植物細胞系組成之群，較佳為酵母。
    34.如定義32之細胞，其中該酵母係選自由以下組成之群：畢氏酵母、假絲酵母、球擬酵母、阿需拉屬、漢遜屬、子囊菌酵母、克魯維酵母、釀酒酵母、克馬格特勒酵母，較佳為甲基營養性酵母。
    35.如定義34之細胞，其中該酵母係畢氏酵母、巴斯德克馬格特勒酵母、法夫克馬格特勒酵母或假巴斯德克馬格特勒酵母。
    36.如定義32至35中任一項之細胞，其相對於限制碳源之條件在多餘碳源存在下具有較高比生長速率。
    37.一種自真核細胞識別碳源可調節之啟動子的方法，其包含以下步驟：a)在細胞生長條件下在碳源存在下於分批培養基中培養真核細胞，b)在有限量補充碳源存在下在分批補料培養物中進一步培養該等細胞，c)提供步驟a)及b)之該細胞培養物之試樣，及d)在該等試樣中實施轉錄分析以識別在步驟b)之細胞中比在步驟a)之細胞中顯示更高轉錄強度的可調節之啟動子。
    38.如定義37之方法，其中該轉錄分析係定量或半定量分析，較佳採用DNA微陣列、RNA測序及轉錄組分析。
    具體實例係關於採用甘油分批培養基及葡萄糖分批補料培養基使產生報告蛋白質之重組產生畢氏酵母細胞系分批補料發酵。比較啟動子活性研究已證明可成功地激活本發明之啟動子以誘導重組蛋白質產生。
    根據又一實例，在葡萄糖限制誘導之啟動子控制下產生人類血清白蛋白(HSA)作為POI，且測定HSA產率及及基因拷貝數。
    根據另一實例，實施在本發明啟動子控制下表現HSA之畢氏酵母菌株之分批補料培養。發現與抑制狀態相比，在葡萄糖限制條件下誘導啟動子活性利用pG1甚至超過120倍、且利用pG6超過20倍。
    其他實例係指在pG1及pG6啟動子轉錄控制下使作為模型蛋白質之豬羧基肽酶B表現。
    又一實例係指在pG1轉錄控制下使抗體片段表現。
    又一實例證明本發明啟動子之變體(例如長度在300 bp至1000 bp範圍內之pG1之片段)之功能活性。其他實驗已顯示pG1之甚至更短片段在類似設定下具有功能活性，例如介於200 bp與1000 bp間之範圍內的片段或介於250 bp與1000 bp間之範圍內的片段。
    參照以下實例可更全面地理解上述說明。然而，該等實例僅代表實踐本發明之一或多個實施例之方法且不應理解為限制本發明之範疇。
    實例
    以下實例闡釋用於識別新可調節之啟動子及分析其在畢氏酵母中之表現性質的材料及方法。
    實例1：葡萄糖限制條件中畢氏酵母中之強有效調節基因的識別
    為識別葡萄糖限制條件中畢氏酵母之強有效調節基因及其各別啟動子，使用微陣列進行基因表現型式之分析。比較在甘油批料(多餘碳源)中生長之畢氏酵母細胞與在如下條件下培養之細胞：其中葡萄糖生長限制(恒化器)，藉此模擬蛋白質生產過程之過程，其通常係以分批補料模式進行。
    a)菌株
    可使用野生型畢氏酵母菌株(CBS2612,CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre,Centraalbureau voor Schimmelcultures,Utrecht,The Netherlands)，其可在最少培養基上生長而無需補充物。
    b)畢氏酵母之培養
    利用最終工作體積為2.5 L之Minifors反應器(Infors-HT,Switzerland)實施發酵。
    使用以下培養基：每升PTM1痕量鹽儲備溶液含有6.0 g CuSO4‧5H2O、0.08 g NaI、3.36 g MnSO4‧H2O、0.2 g Na2MoO4‧2H2O、0.02 g H3BO3、0.82 g CoCl2、20.0 g ZnCl2、65.0 g FeSO4‧7H2O、0.2 g生物素及5.0 ml H2SO4(95%-98%)。
    每升甘油分批培養基含有2 g檸檬酸單水合物(C6H8O7‧H2O)、39.2 g甘油、20.8 g NH4H2PO4、0.5 g MgSO4‧7H2O、1.6 g KCl、0.022 g CaCl2‧2H2O、0.8 mg生物素及4.6 ml PTM1痕量鹽儲備溶液。添加HCl以將pH設定至5。
    每升甘油分批補料培養基含有632 g甘油、8 g MgSO4‧7H2O、22 g KCl及0.058 g CaCl2‧2H2O。
    每升恆化器培養基含有2 g檸檬酸單水合物(C6H8O7‧H2O)、99.42 g葡萄糖單水合物、22 g NH4H2PO4、1.3 g MgSO4‧7H2O、3.4 g KCl、0.02 g CaCl2‧2H2O、0.4 mg生物素及3.2 ml PTM1痕量鹽儲備溶液。添加HCl以將pH設定至5。
    以攪拌器速度(500-1250 rpm)將溶解氧控制於DO=20%下。通氣速率係60 L h-1空氣，將溫度控制於25℃下並在添加NH4OH(25%)下控制pH設定點為5。
    為開始發酵，將1.5 L分批培養基無菌過濾至發酵罐中並以1之開始光學密度(OD600)接種畢氏酵母(自YPG中之過夜預培養，180 rpm，28℃)。約25 h之分批期達成約20 g/L之乾生物質濃度，之後利用葡萄糖培養基進行10 h指數分批補料，從而產生約50 g/L之乾生物質濃度。隨後，將體積減少至1.5 L並以0.15 L h-1之補料/收穫速率開始恆化器培養，從而產生μ=0.1之恆定生長速率。在恆化器開始50 h後終止發酵。
    實施此發酵三次以獲得可靠微陣列分析所需之生物複製品。
    藉由培養物上清液之HPLC分析驗證恆化器培養期間之碳限制條件(無可檢測到之殘餘葡萄糖)。
    c)取樣
    在甘油分批期結束時及在葡萄糖恆化器之穩定狀態條件下取樣。在每一發酵期間一起進行如測定光學密度或酵母乾質量之常規取樣、定性顯微鏡檢查及細胞存活率分析。對於微陣列分析而言，取樣並如下處理：為最佳驟冷，即刻混合9 mL細胞培養液與4.5 mL冰冷5%酚(Sigma)溶液(存於無水乙醇中)並分成等分。在預冷卻收集管(GE healthcare,NJ)中離心(13200 rpm，1分鐘)各2 mL，完全移除上清液並將管儲存於-80℃下直至RNA純化為止。
    d)用於微陣列雜交之RNA純化及試樣製備
    根據供應商之說明書(Ambion,US)使用TRI試劑分離RNA。將細胞沈澱重新懸浮於TRI試劑中並用玻璃珠粒使用FastPrep 24(M.P.Biomedicals,CA)以5 m s-1均質化40秒。在添加氯仿後，對試樣進行離心並藉由添加異丙醇自水相沈澱總RNA。將沈澱用70%乙醇洗滌，乾燥並重新懸浮於不含RNAse之水中。藉由使用Nanodrop 1000分光光度計(NanoDrop產品，DE)量測OD260來測定RNA濃度。使用無DNA套組(Ambion,CA)移除試樣之剩餘DNA。將等於10 μg RNA之試樣體積於不含RNAse之水中稀釋至50 μL，隨後添加DNAse緩衝液I及rDNAse I並於37℃下培育30分鐘。在添加DNAse滅活試劑後，對試樣進行離心並將上清液轉移至新鮮管中。如上文所述再次測定RNA濃度。另外，使用RNA奈米晶片(Agilent)分析RNA完整性。為監測擴增及標記試樣之雜交之微陣列工作流程，使用Spike In套組(Agilent，產品編號：5188-5279)作為陽性對照。其含有來自腺病毒之10種不同聚腺苷酸化轉錄物，使其擴增、對其標記並使其與自身RNA試樣一起共雜交。使用Quick Amp標記套組(Agilent，產品編號：5190-0444)用Cy 3及Cy 5標記試樣。因此，將500 ng純化試樣RNA稀釋於8.3 μL不含RNAse之水中，添加2 μL Spike A或B及1.2 μL T7啟動子引子，使混合物於65℃下變性10分鐘並於冰上保持5分鐘。隨後添加8.5 μL cDNA標準混合物(每份試樣：4 μL 5×第一鏈緩衝液，2 μL 0.1 M DTT，1 μL 10 mM dNTP混合物，1 μL MMLV-RT，0.5 μL RNAse out)，於40℃下培育2小時，隨後轉移至65℃保持15分鐘並放置於冰上5分鐘。製備轉錄標準混合物(每份試樣：15.3 μL不含核酸酶之水、20 μL轉錄緩衝液，6 μL 0.1 M DTT，6.4 μL 50% PEG，0.5 μL RNAse抑制劑，0.6 μL無機磷酸酶，0.8 μL T7 RNA聚合酶，2.4 μL花青(Cyanin)3或花青5)並添加至每一管中並於40℃下培育2小時。為純化獲得之經標記cRNA，使用RNeasy Mini套組(Qiagen，目錄編號74104)。將試樣儲存於-80℃下。在Nanodrop分光光度計下進行cRNA濃度及標記效率之定量。
    e)微陣列分析
    為識別葡萄糖限制恒化器培養中之強有效調節基因，將其三個生物試樣複製品與相同參照進行比較且每一者進行一次染料交換。藉由組合相等量之甘油分批培養試樣生成參照試樣。
    使用基因表現雜交套組(Gene Expression Hybridisation Kit，Agilent，目錄號5188-5242)使經標記試樣cRNA雜交。為製備雜交試樣，將各300 ng cRNA(Cy 3及Cy 5)及6 μL 10倍封阻試劑使用不含核酸酶之水稀釋至24 μL之最終體積。在添加1 μL 25倍分段緩衝液後，將混合物於60℃下培育30分鐘。隨後添加25 μL GEx雜交緩衝液HI-RPM以停止反應。在以13,200 rpm離心1分鐘後，在冰上冷卻試樣並即刻用於雜交。使用自製設計之畢氏酵母特異性寡核苷酸陣列(AMAD-ID：026594,8×15K定製陣列，Agilent)。根據微陣列雜交箱使用指南(Microarray Hybridisation Chamber User Guide)(Agilent G2534A)進行微陣列雜交。首先，打開芯片墊圈(gasket slide)並將其放至箱底部上，Agilent標記面朝上。將試樣(40 μL/陣列)裝載於8個正方形中之每一者之中間。隨後將微陣列載玻片小心地放至芯片墊圈(Agilent標記面朝下)上，並放上箱蓋並用夾子固定。於65℃下在雜交箱中雜交17小時。在掃描之前，洗滌微陣列晶片。因此，打開箱子，且將夾層載玻片彼此分離，同時浸沒於洗滌緩衝液1中。將微陣列直接轉移至具有洗滌緩衝液1之另一盤中，洗滌1分鐘，轉移至洗滌緩衝液2(溫度為至少30℃)中並再洗滌1分鐘。在藉由用棉紙接觸載玻片邊緣來乾燥微陣列載玻片後，將其放至載玻片固持器(Agilent標記面朝上)中。將載玻片固持器放至旋轉盤上並開始掃描。
    f)微陣列數據之數據獲取及統計分析
    用G2565AA微陣列掃描儀(Agilent)以50 nm之解析度掃描影像並將其輸入Agilent Feature Extraction 9.5軟體中。使用Agilent Feature Extraction 9.5對光斑強度進行定量。隨後將原始平均光斑強度數據輸入開放源軟體R中，以進一步規度化及分析數據。
    數據之前處理及規度化係使用R套裝程式limma、vsn及marray。強度數據未經背景校正但經VSN規度化，在規度化後，將其轉化成Cy5通道相對Cy3通道之10g2比率。使用limma套裝程式之lmfit及eBayes函數計算差異表現。
    針對具有以下二者之條目來瀏覽微陣列數據以識別強表現之有效調節基因，即抑制至誘導狀態間表現程度之高差異(倍數變化)、以及誘導狀態中之高信號強度。所選基因之列表示於表1中，其中倍數變化意指誘導狀態中之信號強度除以抑制狀態中之信號強度。添加pGAP及pMLS1、pICL1之數據作為參照。
    實例2：使用eGFP作為細胞內表現之報告基因的畢氏酵母中之新識別之啟動子的比較啟動子活性研究
    為分析在葡萄糖限制條件下新識別之啟動子之性質，如下實施振盪燒瓶篩選：利用含有甘油作為碳源之富培養基預培養24小時-模擬該過程之分批期(啟動子之抑制狀態)，之後利用最少培養基及葡萄糖補料珠粒進行主要培養-模擬該過程之葡萄糖限制分批補料期(啟動子之誘導狀態)。
    a)菌株及表現載體
    使用畢氏酵母野生型菌株(CBS2612,CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre,Centraalbureau voor Schimmelcultures,Utrecht,The Netherlands)作為宿主菌株。利用命名為pPUZZLE之自製載體實施菌株轉化(Stadlmayr等人，J.Biotechnol 2010年12月；150(4)：519-29)，該載體包含大腸桿菌(pUC19)之複製起點、在大腸桿菌及酵母中選擇之抗生素抗性序列盒(Sh ble基因賦予Zeocin抗性)、由多重選殖位點及釀酒酵母CYC1轉錄終止子組成之目標基因(GOI)的表現序列盒及用於整合至畢氏酵母基因組(3'AOX1區域)中之基因座。
    b)新識別之啟動子pG1、pG3、pG4及pG6至含有eGFP作為GOI之pPUZZLE表現載體中的擴增及選殖
    新識別之啟動子序列及其各別基因(參見實例1)之列表示於表2中。藉由PCR(Phusion Polymerase,New England Biolabs)使用表2中所示引子作為啟動子序列使各別基因之1000 bp 5'-非編碼區域直至起始密碼子ATG擴增。將該等序列選殖至pPUZZLE表現載體pPM1aZ10_eGFP中，從而產生pPM1aZ10_pG1_eGFP、pPM1aZ10_pG3_eGFP、pPM1aZ10_pG4_eGFP及pPM1aZ10_pG6_eGFP。另外，使用含有甘油醛3-磷酸脫氫酶啟動子(畢氏酵母之pGAP，此處SEQ ID 25)之常用啟動子的載體pPM1aZ10_pGAP_eGFP作為參照。使用ApaI及SbfI限制位點將啟動子插入eGFP基因之起始密碼子之上游(參見表2及3)。藉由Sanger測序驗證啟動子序列之正確性。

    c)用於啟動子活性分析之畢氏酵母中之eGFP的表現
    用AscI在3'AOX基因組整合區域內將所有質粒線性化，之後電穿孔(2 kV，4 ms，GenePulser,BioRad)至電勝任(electrocompetent)畢氏酵母中。
    在YPD板(每升：10 g酵母提取物、20 g蛋白腖、20 g葡萄糖、20 g瓊脂)上實施陽性轉化體之選擇，板含有25 μg/mL Zeocin(Invivogen,CA)。使用菌落PCR以確保轉化質粒之存在。因此，藉由蒸煮並冷凍畢氏酵母菌落各5分鐘獲取基因組DNA並利用適當引子直接對其施加PCR。對於表現篩選，將單一菌落接種於液體YPG-Zeo培養基(每升：20 g蛋白腖、10 g酵母提取物、12.6 g甘油及25 mg Zeocin)中作為預培養物。約24 h後，使用預培養物以0.1之OD600在10 ml YP培養基(每升：20 g蛋白腖、10 g酵母提取物)及2個葡萄糖補料珠粒(Kuhner,CH)中對主要培養進行接種。由於該等補料珠粒之緩慢葡萄糖釋放動力學，達成葡萄糖限制生長條件，其由以下等式闡述：(葡萄糖)=1.63*t0.74[mg/Disc]。在預培養結束時及主要培養接種24小時及48小時後取樣。藉由量測OD600測定細胞密度，藉由流式細胞儀分析eGFP表現，如Stadlmayr等人(J.Biotechnology 2010年12月；150(4)：519-29)中所述。對於每一試樣，分析10,000個細胞。使用未轉化畢氏酵母野生型細胞量測畢氏酵母之自體螢光並將其自信號中減去。相對eGFP表現程度(與細胞大小有關之螢光強度)以在組成型pGAP啟動子控制下表現eGFP之純系之eGFP表現程度百分比顯示。
    利用啟動子pG7及pG8進行其他類似研究。如實例2b中所述進行選殖，只是使用野生型畢氏酵母菌株X-33(Invitrogen)轉化pPM1aZ10_pG7_eGFP及pPM1aZ10_pG8_eGFP。所用引子及選殖片段列舉於表2及3中。結果示於表4中。
    d)所選eGFP表現純系中eGFP基因拷貝數(GCN)之測定
    表現強度經常與整合至畢氏酵母基因組中之表現序列盒之數量有關。因此，測定eGFP之基因拷貝數。使用DNeasy Blood&Tissue套組(Quiagen，目錄編號69504)分離基因組DNA。使用定量PCR測定基因拷貝數。因此，使用SensiMix SYBR套組(Bioline,QT605-05)。混合Sensi Mix SYBR與引子及試樣並在實時PCR週期計(Rotor Gene,Qiagen)中施加實時分析。引子之列表示於表5中。一式三份或一式四份地分析所有試樣。使用Rotor Gene軟體進行數據分析。使用肌動蛋白基因ACT1作為校準物。結果示於表6中。

    e)一個eGFP純系之分批補料發酵中之pG1啟動子強度的分析
    在DASGIP反應器中以0.7 L之最終工作體積實施分批補料發酵。
    使用以下培養基：每升PTM1痕量鹽儲備溶液含有6.0 g CuSO4‧5H2O、0.08 g NaI、3.36 g MnSO4‧H2O、0.2 g Na2MoO4‧2H2O、0.02 g H3BO3、0.82 g CoCl2、20.0 g ZnCl2、65.0 g FeSO4‧7H2O、0.2 g生物素及5.0 ml H2SO4(95%-98%)。
    每升甘油分批培養基含有2 g檸檬酸單水合物(C6H8O7‧H2O)、39.2 g甘油、12.6 g NH4H2PO4、0.5 g MgSO4‧7H2O、0.9 g KCl、0.022 g CaCl2‧2H2O、0.4 mg生物素及4.6 ml PTM1痕量鹽儲備溶液。添加HCl以將pH設定至5。
    每升葡萄糖分批補料培養基含有464 g葡萄糖單水合物、5.2 g MgSO4‧7H2O、8.4 g KCl、0.28 g CaCl2‧2H2O、0.34 mg生物素及10.1 mL PTM1痕量鹽儲備溶液。
    以攪拌器速度(400-1200 rpm)將溶解氧控制於DO=20%下。通氣速率係24 L h-1空氣，將溫度控制於25℃下並在添加NH4OH(25%)下控制pH設定點為5。
    為開始發酵，將400 mL分批培養基無菌過濾至發酵罐中並以1之開始光學密度(OD600)接種畢氏酵母純系pG1_eGFP編號8(自預培養)。進行約25 h之分批期(達成約20 g/L之乾生物質濃度)，之後葡萄糖限制分批補料，以指數補料達7 h及15 g/L之恆定補料速率達13 h開始，從而產生約100 g/L之最終乾生物質濃度。在分批期及分批補料期過程中取樣，並使用板讀數器(Infinite 200,Tecan,CH)分析eGFP表現。因此，將試樣稀釋至光學密度(OD600)為5。結果以相對螢光/生物反應器(FL/r)形式示於表7中。
    實例3：使用人類血清白蛋白(HSA)作為細胞外表現之報告基因的畢氏酵母中之新識別之啟動子的比較啟動子活性研究
    為分析在葡萄糖限制條件下新識別之啟動子之性質，如下實施振盪燒瓶篩選：利用含有甘油作為碳源之富培養基預培養24小時-模擬該過程之分批期(啟動子之抑制狀態)，之後利用最少培養基及葡萄糖補料珠粒進行主要培養-模擬該過程之葡萄糖限制分批補料期(啟動子之誘導狀態)。
    a)菌株及表現載體
    使用畢氏酵母野生型菌株(CBS2612,CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre,Centraalbureau voor Schimmelcultures,Utrecht,The Netherlands)作為宿主菌株。利用命名為pPUZZLE之自製載體實施菌株轉化(Stadlmayr等人，J.Biotechnol 2010年12月；150(4)：519-29)，陽性轉化體之選擇係基於Zeocin抗性。對於人類血清白蛋白(HSA)之分泌表現，使用其天然分泌前導序列。
    b)新識別之啟動子pG1、pG3、pG4及pG6至自製表現載體之擴增及選殖
    將實例2b中擴增之四個啟動子選殖至pPUZZLE表現載體pPM1aZ10_HSA中，從而產生pPM1aZ10_pG1_HSA、pPM1aZ10_pG3_HSA、pPM1aZ10_pG4_HSA及pPM1aZ10_pG6_HSA。另外，使用含有甘油醛3-磷酸脫氫酶啟動子(pGAP)之常用啟動子的載體pPM1aZ10_pGAP_HSA作為參照。使用ApaI及SbfI限制位點將啟動子插入HSA基因之起始密碼子之上游(參見表3)。藉由Sanger測序驗證啟動子序列之正確性。
    c)在新識別之葡萄糖限制誘導啟動子控制下畢氏酵母中之HSA之表現
    使用AscI限制酶將所有質粒線性化，之後電穿孔(針對畢氏酵母使用標準轉化方案)至畢氏酵母中。在YPD板(每升：10 g酵母提取物、20 g蛋白腖、20 g葡萄糖、20 g瓊脂)上實施陽性轉化體之選擇，板含有25 μg/mL Zeocin。使用菌落PCR以確保如實例2c中所述轉化質粒之存在。
    對於HSA表現篩選，將單一菌落接種於液體YPG-Zeo培養基(每升：20 g蛋白腖、10 g酵母提取物、12.6 g甘油及25 mg Zeocin)中作為預培養物。約24 h後，使用預培養物以1之OD600在YP培養基(每升：20 g蛋白腖、10 g酵母提取物)及葡萄糖補料珠粒(Kuhner,CH)中對主要培養進行接種。由於該等補料珠粒之緩慢葡萄糖釋放動力學，達成葡萄糖限制生長條件，其由以下等式闡述：(葡萄糖)=1.63*t0.74[mg/Disc]。在預培養結束時及主要培養接種24小時及48小時後取樣。藉由量測OD600或濕細胞重量測定生物質濃度。藉由人類白蛋白ELISA Quantitation Set(目錄編號E80-129，Bethyl Laboratories,TX,USA)遵循供應商之說明書手冊對培養物上清液中之HSA濃度進行定量。以400 ng mL-1之起始濃度利用HSA標樣。因此將試樣稀釋於試樣稀釋劑(50 mM Tris-HCl，140 mM NaCl，1%(w/v)BSA，0.05%(v/v)Tween20，pH 8.0)中。自每一構築體之若干純系之篩選的HSA效價提供於表8中。
    d)HSA基因拷貝數之測定
    如實例2d中使用表9中給出之引子實施基因組DNA分離及qPCR量測。結果示於表10中。

    e)在pG1及pG6啟動子控制下表現HSA之畢氏酵母菌株之分批補料培養
    在DASGIP生物反應器中以0.7 L之最終工作體積實施發酵。菌株pG1_HSA編號23具有兩個HSA基因拷貝，菌株pG6_HSA編號36僅實施一個HSA基因拷貝。因此，培育在pGAP(pGAP_HSA編號3具有一個HSA基因拷貝，且pGAP_HSA編號4具有兩個HSA基因拷貝)控制下表現HSA之兩種不同畢氏酵母菌株作為參照。所有發酵均係一式兩份實施。
    使用以下培養基：每升PTM1痕量鹽儲備溶液含有6.0 g CuSO4‧5H2O、0.08 g NaI、3.36 g MnSO4‧H2O、0.2 g Na2MoO4‧2H2O、0.02 g H3BO3、0.82 g CoCl2、20.0 g ZnCl2、65.0 g FeSO4‧7H2O、0.2 g生物素及5.0 ml H2SO4(95%-98%)。
    每升甘油分批培養基含有39.2 g甘油、27.9 g H3PO4(85%)、7.8 g MgSO4‧7H2O、2.6 g KOH、9.5 g K2SO4、0.6 g CaSO4‧2H2O、0.4 mg生物素及4.6 ml PTM1痕量鹽儲備溶液。在無菌過濾至發酵罐後將pH調節至5.85。
    每升葡萄糖分批補料培養基含有550 g葡萄糖單水合物、6.5 g MgSO4‧7H2O、10 g KCl、0.35 g CaCl2‧2H2O、0.4 mg生物素及12 ml PTM1痕量鹽儲備溶液。
    以攪拌器速度(400-1200 rpm)將溶解氧控制於DO=20%下。通氣速率係24 l h-1空氣，將溫度控制於25℃下並在添加NH4OH(25%)下控制pH設定點為5.85。
    為開始發酵，將400 mL分批培養基無菌過濾至發酵罐中並以1之開始光學密度(OD600)接種畢氏酵母(自預培養)。約25 h之分批期達成約20 g/L之乾生物質濃度且之後利用葡萄糖培養基恆定分批補料(100小時)，從而產生約100 g/L之乾生物質濃度。在分批期間pH係5.85，且在整個發酵過程中保持於5.85下。在分批期及分批補料期過程中取樣。如實例3c中所述使用人類白蛋白ELISA Quantitation Set(Bethyl，目錄編號E80-129)對HSA濃度進行定量。生物質濃度及HSA效價示於表11中，表12中給出分批結束(對於pG1及pG6抑制條件)及分批補料結束(對於pG1及pG6誘導條件)時之產物產率(每生物質分泌之HSA之量，HSA/YDM)。藉此可驗證誘導策略。在碳源多餘(於甘油批料中)下pG1及pG6受抑制，此顯示與純系中驅動之pGAP相反，幾乎無可檢測到之HSA。在切換至C限制條件時隨分批補料期開始出現誘導pG1及pG6。pG1之誘導(HSA/YDM)與抑制狀態相比超過120倍，pG6之誘導與抑制狀態相比超過20倍，但pGAP幾乎未觀察到變化(與分批期相比HSA/YDM增加3倍)。

    實例4：使用eGFP作為細胞內表現之報告基因的畢氏酵母中之新識別之啟動子之不同葡萄糖濃度中的比較啟動子活性研究
    為分析不同葡萄糖濃度中之新鑒定之啟動子之性質，如下實施振盪燒瓶篩選：利用含有甘油作為碳源之富培養基預培養24小時(啟動子之抑制狀態)，之後利用最少培養基及葡萄糖作為碳源進行主要培養(啟動子之誘導狀態)；
    a)菌株及表現載體
    使用畢氏酵母野生型菌株(CBS2612,CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre,Centraalbureau voor Schimmelcultures,Utrecht,The Netherlands)作為宿主菌株。利用命名為pPUZZLE之自製載體實施菌株轉化(Stadlmayr等人，J.Biotechnol 2010年12月；150(4)：519-29)，陽性轉化體之選擇係基於Zeocin抗性。
    b)新識別之啟動子pG1、pG3、pG4及pG6至含有eGFP作為GOI之pPUZZLE表現載體中的擴增及選殖
    如實例2中所述進行擴增及選殖。
    c)用於啟動子活性分析之畢氏酵母中之eGFP的表現如實例2中所述進行轉化及純系選擇。
    對於表現篩選，將單一菌落接種於液體YPG-Zeo培養基(每升：20 g蛋白腖、10 g酵母提取物、12.6 g甘油及25 mgZeocin)中作為預培養物。約24 h後，使用預培養物以0.01之OD600在10 ml YP培養基(每升：20 g蛋白腖、10 g酵母提取物)及作為碳源之葡萄糖中接種主要培養。葡萄糖係以20 g L-1至0,001 g L-1之不同濃度使用。
    主要培養接種1-8小時後取樣。藉由流式細胞儀分析eGFP表現，如Stadlmayr等人(J.Biotechnology 2010年12月；150(4)：519-29)中所述，陽性轉化體之選擇係基於Zeocin抗性。對於每一試樣，分析10,000個細胞。使用未轉化之畢氏酵母野生型細胞量測畢氏酵母之自體螢光。
    實例5：使用豬羧基肽酶B(CpB)作為細胞外表現之報告基因的畢氏酵母中之新識別之啟動子的比較啟動子活性研究
    為分析在葡萄糖限制條件下新識別之啟動子之性質，如下實施振盪燒瓶篩選：利用含有甘油作為碳源之富培養基預培養24小時-模擬該過程之分批期(啟動子之抑制狀態)，之後利用最少培養基及葡萄糖補料珠粒進行主要培養-模擬該過程之葡萄糖限制分批補料期(啟動子之誘導狀態)；
    a)菌株及表現載體
    使用畢氏酵母野生型菌株(CBS2612,CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre,Centraalbureau voor Schimmelcultures,Utrecht,The Netherlands)作為宿主菌株。利用命名為pPUZZLE之自製載體實施菌株轉化(Stadlmayr等人，J.Biotechnol 2010年12月；150(4)：519-29)，陽性轉化體之選擇係基於Zeocin抗性。對於豬羧基肽酶B(CpB)之分泌表現，使用酵母α交配因子前導序列。
    b)新識別之啟動子pG1、pG3、pG4及pG6至自製表現載體之擴增及選殖
    將實例2b中擴增之兩種啟動子選殖至pPUZZLE表現載體pPM1aZ30_aMF_CpB中，從而產生pPM1aZ30_pG1_aMF_CpB及pPM1aZ30_pG6_aMF_CpB。另外，使用含有甘油醛3-磷酸脫氫酶啟動子(pGAP)之常用啟動子的載體pPM1dZ30_pGAP_CPB作為參照。使用ApaI及SbfI限制位點將啟動子插入CpB基因之起始密碼子之上游。藉由Sanger測序驗證啟動子序列之正確性。
    c)在新識別之葡萄糖限制誘導啟動子控制下畢氏酵母中之CpB之表現
    使用SpeI或SapI限制酶將質粒線性化，之後電穿孔(針對畢氏酵母使用標準轉化方案)至畢氏酵母中。在YPD板(每升：10 g酵母提取物、20 g蛋白腖、20 g葡萄糖、20 g瓊脂)上實施陽性轉化體之選擇，板含有25 μg/mL Zeocin。使用菌落PCR以確保如實例2c中所述轉化質粒之存在。
    對於CpB表現篩選，將單一菌落接種於液體YPG-Zeo培養基(每升：20 g蛋白腖、10 g酵母提取物、12.6 g甘油及25 mg Zeocin)中作為預培養物。約24 h後，使用預培養物以1之OD600在YP培養基(每升：20 g蛋白腖、10 g酵母提取物)及葡萄糖補料珠粒(Kuhner,CH)中對主要培養進行接種。由於該等補料珠粒之緩慢葡萄糖釋放動力學，達成葡萄糖限制生長條件，其由以下等式闡述：(葡萄糖)=1.63*t0.74[mg/Disc]。在預培養結束時及主要培養接種24小時及48小時後取樣。藉由量測OD600或濕細胞重量測定生物質濃度。藉由酶分析基於因CpB而使馬尿醯基-L-精胺酸轉化為馬尿酸對培養物上清液中之CpB濃度進行定量。在反應開始時，藉由使用Hitachi U-2910分光光度計監測25℃下254 nm處之吸光度量測反應動力學。將試樣及標樣用分析緩衝液(25 mM Tris，100 mM HCl，pH 7.65)緩衝處理並使用激活緩衝液(0.01 mgL-1胰蛋白酶，300 mM Tris，1 μM ZnCl2，pH 7.65)激活。使用無胰蛋白酶之激活緩衝液替代試樣作為陰性對照。藉由添加基質溶液(1 mM馬尿醯基-L-精胺酸，存於分析緩衝液中)開始反應。
    d)在pG6啟動子控制下表現CpB之畢氏酵母菌株之分批補料培養
    如實例3e中所述進行分批補料發酵。純系pPM1aZ10_pG6_CpB編號4在分批中不產生可檢測到之CpB且在分批補料結束時超過210 mg/L CpB。
    實例6：使用人類血清白蛋白(HSA)作為細胞外表現之報告基因的畢氏酵母多拷貝純系中之新識別之啟動子pG1及pG6的比較啟動子活性研究
    為分析在葡萄糖限制條件下新識別之啟動子之性質，如下實施振盪燒瓶篩選：利用含有甘油作為碳源之富培養基預培養24小時-模擬該過程之分批期(啟動子之抑制狀態)，之後利用最少培養基及葡萄糖補料珠粒進行主要培養-模擬該過程之葡萄糖限制分批補料期(啟動子之誘導狀態)；
    a)菌株及表現載體
    使用畢氏酵母野生型菌株(CBS2612,CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre,Centraalbureau voor Schimmelcultures,Utrecht,The Netherlands)作為宿主菌株。利用命名為pPUZZLE之自製載體實施菌株轉化(Stadlmayr等人，J.Biotechnol 2010年12月；150(4)：519-29)，陽性轉化體之選擇係基於Zeocin抗性。對於人類血清白蛋白(HSA)之分泌表現，使用其天然分泌前導序列。
    b)新識別之啟動子pG1及pG6至自製表現載體之擴增及選殖
    將實例2b中擴增之兩種啟動子選殖至pPUZZLE表現載體pPM1nZ30_HSA中，從而產生pPM1nZ30_pG1_HSA及pPM1nZ30_pG6_HSA。
    使用ApaI及SbfI限制位點將啟動子插入HSA基因之起始密碼子之上游。藉由Sanger測序驗證啟動子序列之正確性。
    c)在新鑒定之葡萄糖限制誘導啟動子控制下畢氏酵母中之HSA之表現
    使用AscI限制酶將所有質粒線性化，之後電穿孔(針對畢氏酵母使用標準轉化方案)至畢氏酵母中。在YPD板(每升：10 g酵母提取物、20 g蛋白腖、20 g葡萄糖、20 g瓊脂)上實施陽性轉化體之選擇，板含有25 μg/mL Zeocin。如Marx等人(FEMS Yeast Res.2009年12月；9(8)：1260-70)中所述進行基因拷貝數擴增。使用菌落PCR以確保如實例2c中所述轉化質粒之存在。
    對於HSA表現篩選，將單一菌落接種於液體YPG-Zeo培養基(每升：20 g蛋白腖、10 g酵母提取物、12.6 g甘油及25 mg Zeocin)中作為預培養物。約24 h後，使用預培養物以1之OD600在YP培養基(每升：20 g蛋白腖、10 g酵母提取物)及葡萄糖補料珠粒(Kuhner,CH)中對主要培養進行接種。由於該等補料珠粒之緩慢葡萄糖釋放動力學，達成葡萄糖限制生長條件，其由以下等式闡述：(葡萄糖)=1.63*t0.74[mg/Disc]。在預培養結束時及主要培養接種24小時及48小時後取樣。藉由量測OD600或濕細胞重量測定生物質濃度。藉由人類白蛋白ELISA Quantitation Set(目錄編號E80-129，Bethyl Laboratories,TX,USA)遵循供應商之說明書手冊對培養物上清液中之HSA濃度進行定量。以400 ng mL-1之起始濃度利用HSA標樣。因此將試樣稀釋於試樣稀釋劑(50 mM Tris-HCl，140 mM NaCl，1%(w/v)BSA，0.05%(v/v)Tween20，pH 8.0)中。實例3c之若干多拷貝純系及單一拷貝純系之篩選的HSA效價提供於表13中。
    d)HSA基因拷貝數之測定
    如實例2d中使用表9中給出之引子實施基因組DNA分離及qPCR量測。結果示於表14中。
    e)在pG1及pG6啟動子控制下表現HSA之多拷貝畢氏酵母菌株之分批補料培養
    如實例3e中所述進行分批補料發酵。純系pPM1nZ30_pG1_HSA編號4*1000及pPM1nZ30_pG6_HSA編號C6在分批補料結束時分別達到1060 mg/L HSA及728 mg/L HAS。
    實例7：使用抗體片段(Fab)作為細胞外表現之報告基因的畢氏酵母中之新識別之啟動子pG1的比較啟動子活性研究
    為分析在葡萄糖限制條件下新識別之啟動子之性質，如下實施振盪燒瓶篩選：利用含有甘油作為碳源之富培養基預培養24小時-模擬該過程之分批期(啟動子之抑制狀態)，之後利用最少培養基及葡萄糖補料珠粒進行主要培養-模擬該過程之葡萄糖限制分批補料期(啟動子之誘導狀態)；
    a)菌株及表現載體
    使用畢氏酵母野生型菌株(CBS2612,CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre,Centraalbureau voor Schimmelcultures,Utrecht,The Netherlands)作為宿主菌株。利用命名為pPUZZLE之自製載體實施菌株轉化(Stadlmayr等人，J.Biotechnol 2010年12月；150(4)：519-29)，陽性轉化體之選擇係基於Zeocin抗性。對於抗體片段Fab之分泌表現，使用酵母α交配因子前導序列。
    b)新識別之啟動子pG1至自製表現載體之擴增及選殖
    如實例5b中所述將實例2b中擴增之pG1啟動子選殖至含有Fab作為GOI之pPUZZLE表現載體中。使用ApaI及SbfI限制位點將啟動子插入Fab基因之起始密碼子之上游。藉由Sanger測序驗證啟動子序列之正確性。
    c)在新識別之葡萄糖限制誘導啟動子pG1控制下畢氏酵母中之Fab之表現
    使用SpeI或SapI限制酶將質粒線性化，之後電穿孔(針對畢氏酵母使用標準轉化方案)至畢氏酵母中。在YPD板(每升：10 g酵母提取物、20 g蛋白腖、20 g葡萄糖、20 g瓊脂)上實施陽性轉化體之選擇，板含有25 μg/mL Zeocin。使用菌落PCR以確保如實例2c中所述轉化質粒之存在。
    對於Fab表現篩選，將單一菌落接種於液體YPG-Zeo培養基(每升：20 g蛋白腖、10 g酵母提取物、12.6 g甘油及25 mg Zeocin)中作為預培養物。約24 h後，使用預培養物以1之OD600在YP培養基(每升：20 g蛋白腖、10 g酵母提取物)及葡萄糖補料珠粒(Kuhner,CH)中對主要培養進行接種。由於該等補料珠粒之緩慢葡萄糖釋放動力學，達成葡萄糖限制生長條件，其由以下等式闡述：(葡萄糖)=1.63*t0.74[mg/Disc]。在預培養結束時及主要培養接種24小時及48小時後取樣。藉由量測OD600或濕細胞重量測定生物質濃度。藉由ELISA使用抗人類κ輕鏈(結合及游離)-鹼性磷酸酶抗體產物對Fab表現程度進行定量。若干在pGAP及pG1控制下表現Fab之純系之篩選的Fab效價提供於表15中。

    d)在pG1啟動子控制下表現Fab之畢氏酵母菌株之分批補料培養
    類似於實例3e中所述進行分批補料發酵，但使用如實例2e中所述之葡萄糖分批補料。純系pPM1aZ30_pG1_Fab編號C4及pPM1aZ30_pG1_Fab編號C7在分批補料結束時分別達到165 mg/L Fab及131 mg/L Fab。
    實例8：用以於新識別之啟動子之最大容量生產力下控制比生長速率的指數分批補料發酵
    使用在新識別之啟動子下表現報告基因之畢氏酵母純系的恒化器培養測定不同生長速率下之比生產力及容量生產力。如由Maurer等人，(Microb Cell Fact.2006 Dec 11；5：37)所述，可使用指數分批補料發酵使畢氏酵母純系以特定生長速率生長，用以在整個補料期過程中改進生產。藉由可優化時空產率。施加優化補料且分批補料期之時空產率改良超過35%。
    實例9：啟動子/轉錄強度之測定：使用eGFP作為細胞內表現報告基因識別對不同葡萄糖濃度之啟動子調節的比較啟動子活性研究
    啟動子之調節性質係藉由篩選在該啟動子之控制下表現之eGFP之純系來分析。因此，將單一菌落接種於液體YPG-Zeo培養基(每升：20 g蛋白腖、10 g酵母提取物、12.6 g甘油及25 mg Zeocin)中作為預培養物。約24 h後，使用預培養物以0.01之OD600在10 ml YP培養基(每升：20 g蛋白腖、10 g酵母提取物)及不同濃度之葡萄糖(20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039、0.020、0.010、0.005及0.002 g/L)中接種主要培養。6小時後取樣並藉由流式細胞儀進行分析，如由Stadlmayr等人，(J Biotechnol.2010年12月；150(4)：519-29)所述。針對每一細胞/數據點計算與細胞大小有關之螢光(前向散射至1.5之功率)，並使用其幾何平均值比較不同葡萄糖濃度中產生之eGFP表現程度。使用在pGAP控制下表現eGFP之純系作為參照(畢氏酵母之pGAP，此處SEQ ID 25)。使用未轉化畢氏酵母野生型細胞量測畢氏酵母之自體螢光並將其自信號中減去。表16顯示於約40 mg/L葡萄糖或更小濃度下完全誘導pG1啟動子且顯示其與天然pGAP啟動子相比之轉錄強度。
    進行其他類似研究以比較解除抑制之啟動子pG1、pG3、pG4、pG6及pG7之相對轉錄強度。在YPG(20 g/L甘油，抑制狀態)中培養在該等啟動子中之一者控制下表現eGFP之純系且隨後將其接種於含有不同量之葡萄糖(20-0.002 g/L(D20、D10、...D0.002)，誘導狀態)之YP培養基中並培養5-6小時。藉由流式細胞儀分析細胞並如下分析結果：將每一細胞之螢光與細胞大小(前向散射至1.5之功率)聯繫起來，且使用其幾何平均值比較不同葡萄糖濃度。該等篩選之推斷結果示於圖14中，圖14即顯示對數葡萄糖濃度針對相對螢光之圖，其產生葡萄糖限制可調節之啟動子之誘導行為之良好圖片。圖14顯示於約40 mg/L葡萄糖或更小濃度下完全誘導pG1啟動子且於約4 g/L或更小濃度下完全誘導啟動子pG3、pG4及pG6，且顯示與天然pGAP啟動子相比之轉錄強度。pG7之誘導行為類似於pG1(數據未顯示)。基於利用pG8之先前結果，預計其誘導行為在其他啟動子之範圍內。
    實例10：葡萄糖濃度篩選分析中先前技術pICL1及pMLS1啟動子與pG1之比較
    根據實例9實施比較啟動子活性研究，採用pICL1及pMLS1啟動子作為參照以與本發明pG1啟動子進行比較。
    發現pICL1及pMLS1兩種啟動子之活性極弱，在高葡萄糖濃度(D20：20 g/L/抑制)或低葡萄糖濃度(D0.04：0.04 g/L誘導=解除抑制)下無顯著差異。在相同設定中，在任何情形下該活性均遠小於抑制pG1啟動子之活性。結果以相對於pGAP啟動子之啟動子活性(以%表示)形式示於表17中。
    實例11：pG1之變體之比較
    如實例2a中所述選殖pG1啟動子之較短變體且如實例2c中所述類似篩選，但在縮減規模設置中，使用24孔板(Whatman,UK,Art.Nr.7701-5110)及四分之一補料珠粒(12 mm,Kuhner,CH)代替完整補料珠粒。使用在pG1及pGAP控制下表現之純系作為對照。pG1及其變體之正向引子及長度列舉於表18中。在pG1及pG1變體a-f控制下表現eGFP之細胞的相對螢光無顯著差異。
    圖1：畢氏酵母之啟動子序列pG1(SEQ ID 1)。
    圖2：畢氏酵母之啟動子序列pG3(SEQ ID 2)。
    圖3：畢氏酵母之啟動子序列pG4(SEQ ID 4)。
    圖4：畢氏酵母之啟動子序列pG6(SEQ ID 3)。
    圖5：畢氏酵母之啟動子序列pG7(SEQ ID 5)。
    圖6：畢氏酵母之啟動子序列pG8(SEQ ID 6)。
    圖7：畢氏酵母之GS115基因組G1(SEQ ID 7)之基因的編碼序列。
    圖8：畢氏酵母之GS115基因組G3(SEQ ID 8)之基因的編碼序列。
    圖9：畢氏酵母之GS115基因組G4(SEQ ID 9)之基因的編碼序列。
    圖10：畢氏酵母之GS115基因組G6(SEQ ID 10)之基因的編碼序列。
    圖11：畢氏酵母之GS115基因組G7(SEQ ID 11)之基因的編碼序列。
    圖12：畢氏酵母之GS115基因組G8(SEQ ID 12)之基因的編碼序列。
    圖13：畢氏酵母(GS115)(SEQ ID 13)之天然pGAP啟動子序列。
    *PAS：畢氏酵母GS115中之ORF名稱；PIPA：畢氏酵母型菌株DSMZ70382之ORF名稱
    圖14：pG1(圓形)、pG3(三角形)、pG4(菱形)及pG6(正方形)啟動子之解除抑制性質：針對pG1於約0.04 g葡萄糖/L或更小下達成最大轉錄活性，而所有其他pG啟動子均已於約4 g/L或更小達成最大轉錄活性。為比較不同啟動子之相對誘導行為，將該等數據藉由用每一值除以各別啟動子構築體之D20值得以規度化。因此，該等數據係相對螢光值，且D20下之數據點係1.0。
    圖15：畢氏酵母之啟動子序列pG1的功能活性變體：pG1a-f(SEQ ID 41-46)。
    <110> 瑞士商隆查有限公司
    <120> 可調節之啟動子
    <130> LO001P
    <140> 101137029
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    <212> DNA
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    <223> 引子
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    <212> DNA
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    <223> 引子
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    <212> DNA
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    <223> 啟動子變體
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    <212> DNA
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    <223> 啟動子變體
    <400> 46
    权利要求:
    Claims (21)
    [1] 一種藉由培養包含表現構築體之重組真核細胞系產生目標蛋白質(POI)的方法，該表現構築體包含可調節之啟動子及在該啟動子之轉錄控制下編碼POI的核酸分子，該方法包含以下步驟：a)用抑制該啟動子之基礎碳源培養該細胞系，b)不用或用有限量之使該啟動子解除抑制之補充碳源培養該細胞系，從而誘導該POI產生，其與該細胞之天然pGAP啟動子相比為至少15%之轉錄率，及c)產生並回收該POI。
    [2] 如請求項1之方法，其中該基礎碳源係選自由葡萄糖、甘油、乙醇、其混合物及複合營養物質組成之群。
    [3] 如請求項1或2之方法，其中該補充碳源係諸如葡萄糖、果糖、半乳糖或甘露糖之己糖、諸如蔗糖之雙醣、諸如甘油或乙醇之醇類或其混合物。
    [4] 如請求項1至3中任一項之方法，其中步驟b)採用在培養基中不提供或提供有限量(較佳0 g/L至1 g/L)該補充碳源之補料培養基。
    [5] 如請求項1至4中任一項之方法，其中該有限量之該補充碳源會限制生長，使比生長速率保持在0.02 h-1至0.2 h-1，較佳0.02 h-1至0.15 h-1範圍內。
    [6] 如請求項1至5中任一項之方法，其中該啟動子能夠控制野生型真核細胞中之基因轉錄，該基因係選自由G1(SEQ ID 7)、G3(SEQ ID 8)、G4(SEQ ID 9)、G6(SEQ ID 10)、G7(SEQ ID 11)及G8(SEQ ID 12)或其功能活性變體組成之群。
    [7] 如請求項6之方法，其中該等功能活性變體係選自由以下組成之群：具有至少約60%核苷酸序列一致性之同系物、可藉由修飾母體核苷酸序列而獲得的同系物(其係在該序列內或在該序列之一個或兩個遠端處插入、刪除或取代一或多個核苷酸，該序列較佳具有至少200 bp之核苷酸序列)、及衍生自除畢氏酵母(Pichia pastoris)以外之物種之類似物。
    [8] 如請求項6或7之方法，其中該pG1之功能活性變體係選自由以下組成之群：pG1a(SEQ ID 41)、pG1b(SEQ ID 42)、pG1c(SEQ ID 43)、pG1d(SEQ ID 44)、pG1e(SEQ ID 45)及pG1f(SEQ ID 46)。
    [9] 如請求項1至8中任一項之方法，其中該細胞系選自由哺乳動物、昆蟲、酵母、絲狀真菌及植物細胞系組成之群，較佳為酵母。
    [10] 如請求項1至9中任一項之方法，其中該POI係異源蛋白質，較佳選自包括抗體或其片段之治療性蛋白質、酶及肽、蛋白質抗生素、毒素融合蛋白質、碳水化合物-蛋白質偶聯物、結構蛋白質、調節蛋白質、疫苗及疫苗樣蛋白質或粒子、過程酶、生長因子、激素及細胞介素或POI之代謝產物。
    [11] 一種在碳源可調節之啟動子之轉錄控制下控制重組真核細胞中之POI之表現的方法，該可調節之啟動子與該細胞之天然pGAP啟動子相比具有至少15%之轉錄強度，其中在限制該碳源之條件下誘導該表現。
    [12] 一種在碳源可調節之啟動子之轉錄控制下在重組真核細胞中產生POI的方法，其中該啟動子與該細胞之天然pGAP啟動子相比具有至少15%之轉錄強度。
    [13] 如請求項1至12中任一項之方法，其中該可調節之啟動子包含選自由以下組成之群之核酸序列a)pG1(SEQ ID 1)、pG3(SEQ ID 2)、pG4(SEQ ID 4)、pG6(SEQ ID 3)、pG7(SEQ ID 5)或pG8(SEQ ID 6)；b)與pG1(SEQ ID 1)、pG3(SEQ ID 2)、pG4(SEQ ID 4)、pG6(SEQ ID 3)、pG7(SEQ ID 5)或pG8(SEQ ID 6)具有至少60%同源性之序列；c)在嚴格條件下與pG1(SEQ ID 1)、pG3(SEQ ID 2)、pG4(SEQ ID 4)、pG6(SEQ ID 3)、pG7(SEQ ID 5)或pG8(SEQ ID 6)雜交之序列；及d)衍生自a)、b)或c)之片段或變體，其中該啟動子係功能活性啟動子，其係與該細胞之天然pGAP啟動子相比能夠以至少15%之轉錄率在重組真核細胞中表現POI的碳源可調節之啟動子。
    [14] 如請求項13之方法，其中該pG1(SEQ ID 1)、pG3(SEQ ID 2)、pG4(SEQ ID 4)、pG6(SEQ ID 3)、pG7(SEQ ID 5)或pG8(SEQ ID 6)之變體係選自由以下組成之群之功能活性變體：具有至少約60%核苷酸序列一致性之同系物、可藉由修飾母體核苷酸序列而獲得的同系物(其係在該序列內或在該序列之一個或兩個遠端處插入、刪除或取代一或多個核苷酸，該序列較佳具有至少200 bp之核苷酸序列)、及衍生自除畢氏酵母以外之物種之類似物。
    [15] 如請求項13或14之方法，其中該pG1之功能活性變體係選自由以下組成之群：pG1a(SEQ ID 41)、pG1b(SEQ ID 42)、pG1c(SEQ ID 43)、pG1d(SEQ ID 44)、pG1e(SEQ ID 45)及pG1f(SEQ ID 46)。
    [16] 一種分離之核酸，其包含選自由以下組成之群之核酸序列：a)pG1(SEQ ID 1)、pG3(SEQ ID 2)、pG6(SEQ ID 3)、pG7(SEQ ID 5)或pG8(SEQ ID 6)；b)與pG1(SEQ ID 1)、pG3(SEQ ID 2)、pG6(SEQ ID 3)、pG7(SEQ ID 5)或pG8(SEQ ID 6)具有至少60%同源性之序列；c)在嚴格條件下與pG1(SEQ ID 1)、pG3(SEQ ID 2)、pG6(SEQ ID 3)、pG7(SEQ ID 5)或pG8(SEQ ID 6)雜交之序列；及d)衍生自a)、b)或c)之片段或變體，其中該核酸包含功能活性啟動子，其係與細胞之天然pGAP啟動子相比能夠以至少15%之轉錄率在重組真核細胞中表現POI的碳源可調節之啟動子。
    [17] 如請求項16之核酸，其中該pG1(SEQ ID 1)、pG3(SEQ ID 2)、pG6(SEQ ID 3)、pG7(SEQ ID 5)或pG8(SEQ ID 6)之變體係選自由以下組成之群之功能活性變體：具有至少約60%核苷酸序列一致性之同系物、可藉由修飾母體核苷酸序列而獲得的同系物(其係在該序列內或在該序列之一個或兩個遠端處插入、刪除或取代一或多個核苷酸，該序列較佳具有至少200 bp之核苷酸序列)、及衍生自除畢氏酵母以外之物種之類似物。
    [18] 如請求項16或17之核酸，其中該pG1之功能活性變體係選自由以下組成之群：pG1a(SEQ ID 41)、pG1b(SEQ ID 42)、pG1c(SEQ ID 43)、pG1d(SEQ ID 44)、pG1e(SEQ ID 45)及pG1f(SEQ ID 46)。
    [19] 一種表現構築體，其包含如請求項16至18之核酸，該核酸在該啟動子之轉錄控制下以可操作方式連接至編碼POI之核苷酸序列，該核酸並不與編碼該POI之該核苷酸序列天然相連。
    [20] 一種重組真核細胞，其包含如請求項19之構築體。
    [21] 一種自真核細胞識別碳源可調節之啟動子的方法，其包含以下步驟：a)在細胞生長條件下，在碳源存在下，於分批培養中培養真核細胞，b)在有限量的補充碳源存在下在補料分批培養中進一步培養該等細胞，c)提供步驟a)及b)之細胞培養物之試樣，及d)在該等試樣中實施轉錄分析，以識別在步驟b)之細胞中比在步驟a)之細胞中顯示更高轉錄強度的可調節之啟動子。
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