• 专利附录
  • 专利说明
  • 权利要求
  • 类似技术
  • 同族专利
  • 引用文献
  • 法律状态
  • 优先权
    • 专利摘要:
    本發明係揭示一種殺死癌細胞之18β-甘草次酸衍生物、其製備方法及包含該18β-甘草次酸衍生物之醫藥組成物，其中，該18β-甘草次酸衍生物係選自由下列式(Ⅰ)或式(Ⅱ)所組成之群組。□
    公开号:TW201317254A
    申请号:TW100139104
    申请日:2011-10-27
    公开日:2013-05-01
    发明作者:Chun-Nan Lin；Kai-Wei Lin；a-mei Huang；Tzyh-Chyuan Hour；Shyh-Chyun Yang；Yeong-Shiau Pu；Jan-Gowth Chang
    申请人:Univ Kaohsiung Medical；
    IPC主号:A61K31-00
    专利说明:
    一種殺死癌細胞之18β-甘草次酸衍生物、其製備方法及包含18β-甘草次酸衍生物之醫藥組成物
    本發明係關於一種殺死癌細胞之化合物及其製備方法，特別係關於一種殺死癌細胞之18β-甘草次酸(18β-Glycyrrhetinic acid)衍生物及其製備方法。
    癌症的發生係由於細胞的基因發生改變，引起細胞不正常增生所形成的異常腫塊，並且該腫塊會壓迫到其他組織或器官，如該腫塊發生轉移，不正常增生的細胞藉由血管轉移到人體的其他部位即為惡性腫瘤，也就是俗稱的癌症。
    一般來說，引發癌症的相關基因可分為二：一類為致癌基因(Oncogene)，即該致癌基因發生活化表現時，會使正常細胞發生異常的增生現象，例如；另一類為抑癌基因(Tumor suppressor gene)，即該抑癌基因係於正常細胞中表現，當該抑癌基因發生缺失或失活，使得正常細胞發生異常的增生現象。
    目前殺死癌細胞可以經由抑制致癌基因的活化或促進抑癌基因的表現之機制達成，例如一種促凋亡蛋白p53，當細胞中的DNA損傷，藉由活化的p53調節細胞週期，使細胞能夠停留於G1期或G2期，以進行DNA修復，若無法修復DNA者，該細胞則發生細胞凋亡，以避免具有非正常遺傳資訊的細胞存活及生長。
    由於習用抗癌藥物必須抑制癌細胞的生長，因此，習用抗癌藥物通常會對生物體造成許多副作用，如阿樂癌注射液(Cisplatin，cis-diamminedichloroplatinum Ⅱ，簡稱CDDP)，常用於治療卵巢癌、生殖細胞癌、頭頸癌、食道癌、肺癌、膀胱癌、子宮頸癌或子宮內膜癌等，然而，該Cisplatin常使癌症患者無法承受而停用藥物，例如嘔吐、貧血、掉髮，免疫方面會使服用Cisplatin的癌症患者，其淋巴球減少、血小板下降，甚至在長期服用後會造成神經毒性、末梢神經病變及中度骨髓抑制現象，且服用Cisplatin的癌症患者容易使肝腎功能指數上升，甚至最後發生抗藥性的現象而失去抑制癌細胞成長及擴散的作用。
    因此，有必要提供一種與習用抗癌藥物具有協同作用的化合物，以製備成一種用以殺死癌細胞藥物之醫藥組合物，以改善該習用藥物對於生物體造成的肝腎毒性及抗藥性的問題。
    本發明之主要目的係提供一種殺死癌細胞之18β-甘草次酸衍生物，其係藉由提升癌細胞ROS，活化癌細胞之促凋亡蛋白p53，降低癌細胞之MMP，促癌細胞之凋亡。
    本發明之次一目的係提供一種殺死癌細胞之18β-甘草次酸衍生物的製備方法，其係利用化學反應合成而能夠大量生產。
    本發明之又一目的係提供一種用以殺死癌細胞之醫藥組合物，其係包含至少一種18β-甘草次酸衍生物及一醫藥上可接受載體所形成之醫藥組合物，係能夠提供一種有效殺死癌細胞之抗癌藥物。
    為達到前述發明目的，本發明所運用之技術內容包含有：一種殺死癌細胞之18β-甘草次酸衍生物，其係選自由式(Ⅰ)及式(Ⅱ)所組成之群組：
    其中R1選自CH3及CH2C6H5其中之一，R2選自COOCH3、COOCH2CH3、COOCH(CH3)2、CONHCH2CH3、CONHCH2CH2CH3及CONHCH2(CH3)2其中之一，R3選自COOCH2CH3、COOCH(CH3)2、CONHCH2CH3、CONHCH2CH2CH3及CONHCH2(CH3)2其中之一。
    一種用以殺死癌細胞之醫藥組合物，其係包含至少一種18β-甘草次酸衍生物，其係選自由式(Ⅰ)及式(Ⅱ)所組成之群組：
    其中R1選自CH3及CH2C6H5其中之一，R2選自COOCH3、COOCH2CH3、COOCH(CH3)2、CONHCH2CH3、CONHCH2CH2CH3及CONHCH2(CH3)2其中之一，R3選自COOCH2CH3、COOCH(CH3)2、CONHCH2CH3、CONHCH2CH2CH3及CONHCH2(CH3)2其中之一；及一醫藥上可接受載體所形成之醫藥組合物。
    本發明用以殺死癌細胞之醫藥組合物中，該癌細胞係膀胱癌細胞或前列腺癌細胞。
    一種殺死癌細胞之18β-甘草次酸衍生物的製備方法，係包含：以18β-甘草次酸作為一合成起始原料，氧化形成一第一化合物；及將該第一化合物進行一酯化反應，形成一第二化合物，其中，該第二化合物中C-30之官能基為烷基團或芳香基團。
    本發明殺死癌細胞之18β-甘草次酸衍生物的製備方法，進一步包含：將該第二化合物形成一內酯化的第三化合物。
    本發明殺死癌細胞之18β-甘草次酸衍生物的製備方法，進一步包含：將該第三化合物形成一變異型(seco-)的第四化合物。
    本發明殺死癌細胞之18β-甘草次酸衍生物的製備方法，進一步包含：將該第四化合物進行酯化或醯胺化反應，獲得一第五化合物，該第五化合物中C-3之官能基為烷基團或胺基團，其中，烷醇基團係由鹵化烷類化合物所提供，例如碘化乙烷或碘化異丙烷；該胺基團係由乙基胺、丙基胺或異丙基胺提供。
    本發明殺死癌細胞之18β-甘草次酸衍生物的製備方法，進一步包含：將該第三化合物與一胺類化合物進行酯化反應，形成一第六化合物，該第六化合物中C-30之官能基為胺基團或苯胺基團。
    本發明殺死癌細胞之18β-甘草次酸衍生物的製備方法，進一步包含：將該帶有一胺基團或苯胺基團的第六化合物，形成一變異型(seco-)且帶有胺基團或苯胺基團的第七化合物。
    本發明殺死癌細胞之18β-甘草次酸衍生物的製備方法，進一步包含：將該變異型且帶有胺基團或苯胺基團的第七化合物進行酯化或醯胺化反應，獲得一第八化合物，該第八化合物中C-3之官能基為烷基團或胺基團，其中，該烷基團係由鹵化烷類化合物所提供，例如碘化乙烷或碘化異丙烷；該胺基團係由乙基胺、丙基胺或異丙基胺提供。
    為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：本發明提供一種殺死癌細胞的18β-甘草次酸衍生物，其係選自由式(Ⅰ)及式(Ⅱ)所組成之群組：
    其中R1選自CH3及CH2C6H5其中之一，R2選自COOCH3、COOCH2CH3、COOCH(CH3)2、CONHCH2CH3、CONHCH2CH2CH3及CONHCH2(CH3)2其中之一，R3選自COOCH2CH3、COOCH(CH3)2、CONHCH2CH3、CONHCH2CH2CH3及CONHCH2(CH3)2其中之一。
    本發明又提供一種包含如上所述之18β-甘草次酸衍生物之醫藥組合物，該醫藥組合物係用以殺死癌細胞，該醫藥組合物係藉由該等18β-甘草次酸衍生物提升癌細胞中的ROS產生率，活化癌細胞的促凋亡蛋白p53後，使癌細胞的粒線體膜電位(Mitochondrial membrane potential，簡稱MMP)下降，促使癌細胞發生細胞凋亡，具有達到殺死癌細胞之功效，所述18β-甘草次酸衍生物的製備方法說明如下。
    第一實施例：化合物10及11之製備
    請參照第1圖，其係本發明中用於合成18β-甘草次酸衍生物之第一流程圖，其中每個數字代表不同的化合物。
    本發明係選擇但不限定以自天然植物中萃取或人工合成的18β-甘草次酸(化合物1)為合成起始原料，氧化形成一第一化合物。更詳言之，係以二甲基甲醯胺(dimethyl formamide，簡稱DMF)為溶媒，加入三氧化鉻(CrO3)在室溫下氧化12小時成為化合物2(步驟a)。
    本發明係將該第一化合物與一醇類化合物進行酯化反應，形成一第二化合物，其中，該第二化合物中C-30之官能基為烷基團；本實施例係將化合物2與含有硫酸(H2SO4)作為催化劑之過量甲醇(CH3OH)溶液進行冷凝迴流(reflux)反應48小時後，形成化合物3(步驟b)，更詳言之，係將該化合物2之C-30上的氫原子以甲基取代後，形成該化合物3。
    本發明將該第二化合物形成一內酯化的第三化合物；本實施例係將化合物3(1克，21毫莫耳)溶於30毫升二氯甲烷(CH2Cl2)中，加入間氯過氧苯甲酸(m-CPBA，3.6克21.3毫莫耳)，在室溫下避光反應12小時後，將該混合物溶液以氯仿稀釋，以5%碘化鉀及5%亞硫酸鈉溶液清洗後，以無水硫酸鈉乾燥，濃縮得到呈白色固體的化合物6(步驟d)。
    本發明將該第三化合物形成一變異型(seco-)的第四化合物；本實施例係將化合物6溶於一合適的溶劑，例如異丙醇(isopropyl alcohol)或二氯甲烷(CH2Cl2)中，加入甲苯磺酸(p-toluenesulfonic acid，簡稱p-TSA)處理，將化合物6的內酯環打開，獲得化合物8(步驟e)。
    本發明係將該第四化合物以不同基團(如烷基團或胺基團)進行酯化或醯胺化反應，而獲得一第五化合物，更詳言之，係將該第四化合物之C-3上的氫原子或氫氧基團，以烷基團或胺基團取代後，形成該第五化合物，例如以鹵化烷類化合物的烷基團合成化合物10(3,4-seco-11-Oxo-18β-olean-4(23),12-dien-3,30-dioic acid 3-isopropyl 30-methyl,ester)(步驟f)，其中，該鹵化烷類化合物例如碘化乙烷或碘化異丙烷；或以胺基團(amine moiety)合成化合物11(3-Isopropyl carbamoyl-11-oxo-18β-3,4-seco-olean-4(23),12-diene 30-methyl ester)(步驟g)。
    舉例而言，本實施例之化合物10係以80毫克(0.16毫莫耳)的化合物8與碘化異丙烷在丙酮與碳酸鉀的存在下，進行酯化反應，獲得一白色無結晶(amorphous)粉末(86.2毫克，0.16毫莫耳，產率100.0%)：8(c 0.1，氯仿)。IR(film on NaCl)1731、1657 cm-1。1H NMR(氘代氯仿)：δ 0.82(3H,s,Me-28)，1.15(3H,s,Me-29)，1.16(3H,s,Me-25)，1.17(3H,s,Me-26)，1.21(6H,d,J=6.4Hz,-CH(CH 3)2)，1.38(3H,s,Me-27)，1.76(3H,s,Me-24)，2.60(1H,td,J=13.4,6.0Hz,Hβ-18)，3.70(3H,s,-OCH3)，4.70(1H,br s,H-23)，4.90(1H,br s,H-23)，4.95(1H,m,-CH(CH3)2)，5.69(1H,s,H-12)。13C NMR(氘代氯仿)，請參照第1表。EI-MS(70 eV)m/z(% rel. int.)，540[M]+(63)。為C34H52O5計算HR-EI-MS m/z：540.3815。發現540.3814。
    本實施例之化合物11係以212毫克(0.43毫莫耳)的化合物8與提供胺基團的異丙基胺(isopropyl amine)進行酯化反應，其中，以1-乙基3-二甲基氨丙基碳代二亞胺(EDCI)為活化劑，以4-二甲氨基啶(DMAP)為催化劑反應後，獲得一白色無結晶粉末(201.6毫克，0.37毫莫耳，產率86.0%)：10(c 0.1，氯仿)。IR(film on NaCl)3299、1727、1661 cm-1。1H NMR(CDCl3)δ 0.81(3H,s,Me-28)，1.10(3H,d,J=6.8Hz,-CH(CH 3)(CH3))，1.11(3H,d,J=6.8Hz,-CH(CH3)(CH 3))，1.14(6H,s,Me-26及29)，1.17(3H,s,Me-25)，1.37(3H,s,Me-27)，1.77(3H,s,Me-24)，2.47(1H,td,J=13.2,6.0Hz,Hβ-18)，3.69(3H,s,-OCH3)，4.01(1H,m,-CH(CH3)2)，4.73(1H,br s,H-23)，4.90(1H,br s,H-23)，5.48(1H,d,J=7.6Hz,NH)，5.69(1H,s,H-12). 13C NMR(氘代氯仿)，請參照第1表。EI-MS(70eV)m/z(% rel. int.)，539[M]+(70)。為C34H53NO4計算HR-EI-MS m/z：539.3974，發現：539.3956。
    第二實施例：化合物13至17之製備
    請參照第1圖，本發明係選擇但不限定以第一實施例所獲得之化合物2為起始原料，將化合物2與一醇類芳香性化合物進行酯化反應，形成另一帶有芳香基團之第二化合物，特別係置換該化合物2中C-30之官能基；本實施例係將化合物2與含有二氯甲烷及4-二甲氨基啶(DMAP)的苯甲醇(C6H5CH2OH)溶液中，以1-乙基3-二甲基氨丙基碳代二亞胺(EDCI)為活化劑反應形成化合物4(步驟c)，更詳言之，係將該化合物2之C-30上的氫原子以苯甲基取代後，形成該化合物4。
    本發明將該帶有至少一芳香基團的第二化合物，形成另一內酯化的第三化合物；本實施例係將化合物4溶於二氯甲烷(CH2Cl2)中，加入間氯過氧苯甲酸(m-CPBA)作為內酯化之試劑，經過在室溫下反應12小時後，可得到另一具有芳香基團的第三化合物(化合物7)(步驟d)。
    本發明將該第三化合物形成另一變異型(seco-)的第四化合物；本實施例係將化合物7溶於一合適的溶劑中，例如異丙醇或二氯甲烷中，加入甲苯磺酸(p-TSA)處理，將化合物7的內酯環打開，獲得另一具有芳香基團的第四化合物(化合物9)(步驟e)。
    本發明係將該具有芳香基團的第四化合物進行酯化或醯胺化反應，而獲得另一具有芳香基團之第五化合物，更詳言之，係將該第五化合物之C-3上的氫原子以烷基團取代，或C-3上的氫氧基以胺基團取代後，形成該具有芳香基團之第五化合物，例如以鹵化烷基化合物之烷基團取代C-3以合成化合物12(3,4-seco-11-Oxo-18β-olean-4(23),12-dien-3,30-dioic acid 3-methyl-30-benzyl ester)、化合物13(3,4-seco-11-Oxo-18β-olean-4(23),12-dien-3,30-dioic acid 3-ethyl,30-benzyl ester)，及化合物14(3,4-seco-11-Oxo-18β-olean-4(23),12-dien-3,30. dioic acid 3-isopropyl-30-benzyl ester)(步驟f)，以胺基團取代C-3以合成化合物15(3-Ethyl carbamoyl-11-oxo-18β-3,4-seco-olean-4(23),12-diene-30-benzyl ester)、化合物16(3-Propylcarbamoyl-11-oxo-18β-3,4-seco-olean-4(23),12-diene 30-benzyl ester)及化合物17(3-Isopropylcarbamoyl-11-oxo-18β-3,4-seco-olean-4(23),12-diene 30-benzyl ester)(步驟g)。
    舉例而言，本實施例之化合物13係以112毫克(0.20毫莫耳)的化合物9與碘化乙烷(又稱乙基碘，ethyl iodide)在丙酮與碳酸鉀(K2CO3)的存在下進行酯化反應，獲得一白色無結晶粉末(81.6毫克，0.13毫莫耳，產率65.0%)：(c 0.5,CHCl3)。IR(film on NaCl)1727、1657、1579 cm-1。1H NMR(氘代氯仿)δ 0.74(3H,s,Me-28)，1.15(3H,s,Me-29)，1.16(6H,s,Me-25 and 26)，1.22(3H,t,J=7.2Hz,-CH2CH 3)，1.37(3H,s,Me-27)，1.75(3H,s,Me-24)，2.60(1H,td,J=13.2,6.0Hz,Hβ-18)，4.10(2H,q,J=7.2Hz,-CH 2CH3)，4.69(1H,br s,H-23)，4.90(1H,br s,H-23)，5.09(1H,d,J=12.4Hz,-OCHH-)，5.20(1H,d,J=12.0Hz,-OCHH-)，5.57(1H,s,H-12)，7.37(5H,m，芳香質子)。13C NMR(氘代氯仿)，請參照第1表。EI-MS(70eV)m/z(% rel. int.)，602[M]+(21)。為C39H54O5計算HR-EI-MS m/z：602.3971。發現602.3971。
    本實施例之化合物14係以100毫克(0.17毫莫耳)的化合物9與碘化異丙烷(又稱異丙基碘，isopropyl iodide)在丙酮與碳酸鉀(K2CO3)的存在下進行酯化反應，獲得一白色無結晶粉末(49.4毫克，0.08毫莫耳，產率47.1%)：16(c 0.05，氯仿)。IR(film on NaCl)1727、1657、1631 cm-1。1H NMR(氘代氯仿)δ 0.74(3H,s,Me-28)，1.15(3H,s,Me-29)，1.16(6H,s,Me-25及26)，1.19(6H,d,J=6.4Hz,-CH(CH 3)2)，1.39(3H,s,Me-27)，1.76(3H,s,Me-24)，2.58(1H,td,J=13.2,6.4Hz,Hβ-18)，4.69(1H,br s,H-23)，4.90(1H,br s,H-23)，4.95(1H,m,-CH(CH3)2)，5.09(1H,d,J=12.4Hz,-OCHH-)，5.20(1H,d,J=12.4Hz,-OCHH-)，5.57(1H,s,H-12)，7.38(5H,m，芳香質子)。13C NMR(氘代氯仿)，請參照第1表。EI-MS(70eV)m/z(% rel. int.)，616[M]+(33)。為C40H56O5計算HR-EI-MS m/z：616.4127。發現616.4136。
    本實施例之化合物15係以100毫克(0.17毫莫耳)的化合物9與提供胺基團的乙基胺(ethyl amine)進行酯化反應，其中，以1-乙基3-二甲基氨丙基碳代二亞胺(EDCI)為活化劑，以4-二甲氨基啶(DMAP)為催化劑，獲得一白色無結晶粉末(58.0毫克，0.097毫莫耳，產率57.1%)：11(c 0.35,CHCl3)。IR(film on NaCl)3299、1727、1657、1553 cm-1。1H NMR(CDCl3)δ 0.75(3H,s,Me-28)，1.10(3H,t,J=7.2Hz,-CH2CH 3)，1.14(3H,s,Me-29)，1.15(3H,s,Me-25)，1.16(3H,s,Me-26)，1.36(3H,s,Me-27)，1.77(3H,s,Me-24)，2.49(1H,td,J=13.2,6.0Hz,Hβ-18)，3.23(2H,m,-CH 2CH3)，4.74(1H,br s,H-23)，4.90(1H,br s,H-23)，5.09(1H,d,J=12.0Hz,-OCHH-)，5.20(1H,d,J=12.0Hz,-OCHH-)，5.58(1H,s,H-12)，5.67(1H,br s,NH)，7.36(5H,m，芳香質子)。13C NMR(CDCl3)，請參照第1表。EI-MS(70eV)m/z(% rel. int.)，601[M]+(36)。為C39H55NO4計算HR-EI-MS m/z：601.4131。發現601.4131。
    本實施例之化合物16係以125毫克(0.22毫莫耳)的化合物9與提供胺基團的丙基胺(propylamine)進行醯胺化反應，其中，以1-乙基3-二甲基氨丙基碳代二亞胺(EDCI)為活化劑，以4-二甲氨基啶(DMAP)為催化劑，獲得一白色無結晶粉末(58.0毫克，0.097毫莫耳，產率57.1%)：15(c 0.5,CHCl3)。IR(film on NaCl)3439、1724、1657、1513 cm-1。1H NMR(氘代氯仿)δ 0.75(3H,s,Me-28)，0.90(3H,t,J=7.6Hz,-CH2CH2CH 3)，1.14(3H,s,Me-29)，1.15(3H,s,Me-25)，1.16(3H,s,Me-26)，1.36(3H,s,Me-27)，1.49(2H,q,J=7.2Hz,-CH2CH 2CH3)，1.77(3H,s,Me-24)，2.49(1H,td,J=13.2,6.0Hz,Hβ-18)，3.16(2H,dd,J=13.6,6.0Hz,-CH 2CH2CH3)，4.74(1H,br s,H-23)，4.90(1H,br s,H-23)，5.09(1H,d,J=12.4Hz,-OCHH-)，5.20(1H,d,J=12.4Hz,-OCHH-)，5.73(1H,br s,NH)，5.58(1H,s,H-12)，7.36(5H,m，芳香質子)。13C NMR(氘代氯仿)，請參照第1表。EI-MS(70eV)m/z(% rel. int.)，615[M]+(36)。為C40H57NO4計算HR-EI-MS m/z：615.4287。發現615.4283。
    本實施例之化合物17係以100毫克(0.17毫莫耳)的化合物9與提供胺基團的異丙基胺(isopropyl amine)進行醯胺化反應，其中，以1-乙基3-二甲基氨丙基碳代二亞胺(EDCI)為活化劑，以4-二甲氨基啶(DMAP)為催化劑，獲得一白色無結晶粉末(58.0毫克，0.097毫莫耳，產率57.1%)：7(c 0.25,CHCl3)。IR(film on NaCl)3306、1727、1657、1535 cm-1。1H NMR(CDCl3)δ 0.75(3H,s,Me-28)，1.10(3H,d,J=6.8Hz,-CH(CH 3)(CH3))，1.12(3H,d,J=6.8Hz,-CH(CH3)(CH 3))，1.14(3H,s,Me-29)，1.15(3H,s,Me-25)，1.16(3H,s,Me-26)，1.36(3H,s,Me-27)，1.77(3H,s,Me-24)，2.46(1H,td,J=13.2,6.0Hz,Hβ-18)，4.00(1H,m,-CH(CH3)2)，4.74(1H,br s,H-23)，4.91(1H,br s,H-23)，5.09(1H,d,J=12.4Hz,-OCHH-)，5.20(1H,d,J=12.4Hz,-OCHH-)，5.56(1H,br s,NH)，5.58(1H,s,H-12)，7.36(5H,m，芳香質子)。13C NMR(CDCl3)，請參照第1表。EI-MS(70eV)m/z(% rel. int.)，615[M]+(42)。為C40H57NO4計算HR-EI-MS m/z：615.4288。發現615.4286。
    第三實施例：化合物21至27之製備
    請參照第2及3圖，分別係本發明中用於合成18β-甘草次酸衍生物之第二及第三流程圖，其中每個數字代表不同的化合物。本發明係選擇但不限定以第一實施例所獲得之內酯化的第三化合物(如化合物5)為起始原料，以二氯甲烷為溶媒，並與一胺類化合物所提供之胺基團或苯胺基團進行醯胺化反應，形成一第六化合物(化合物18、26)(步驟h)。
    本實施例係將化合物5與含有二氯甲烷及4-二甲氨基啶(DMAP)的異丙基胺溶液中，以1-乙基3-二甲基氨丙基碳代二亞胺(EDCI)為活化劑反應形成化合物18，更詳言之，係將該化合物5之C-30上的氫氧基以一胺基團取代後，形成該化合物18；本實施例另將化合物5與含有二氯甲烷及4-二甲氨基啶(DMAP)的苯胺溶液中，以1-乙基3-二甲基氨丙基碳代二亞胺(EDCI)為活化劑反應形成化合物26。
    請參照第2及3圖所示，本發明將該帶有一胺基團或苯胺基團的第六化合物，形成一變異型(seco-)且帶有胺基團或苯胺基團的第七化合物(步驟d)。
    舉例而言，本實施例係將化合物18(1克，2.01毫莫耳)溶於30毫升二氯甲烷(CH2Cl2)中，加入甲苯磺酸(p-TSA)處理，將該化合物18的內酯環打開，獲得化合物19；本實施例另將化合物26(1克，1.7毫莫耳)溶於30毫升二氯甲烷(CH2Cl2)中，加入甲苯磺酸(p-TSA)處理，將該化合物26的內酯環打開，獲得化合物27。
    請參照第2圖所示，本發明另將該變異型且帶有胺基團或苯胺基團的第七化合物(化合物19)C-3上進行酯化或醯胺化反應，而獲得另一帶有苯胺基團的第八化合物，其中，該帶有胺基團或苯胺基團的第八化合物之C-3上的官能基係烷基團或胺基團(步驟f或g)。
    舉例而言，本實施例將變異型(seco-)的化合物19溶於丙酮(acetone)，並與一溶於丙酮之適當的鹵化烷類化合物及碳酸鉀(K2CO3)溶液反應，形成化合物20、化合物21(30-Isopropylcarbamoyl-11-oxo-18β-3,4-seco-olean-4(23),12-diene 3-ethyl ester)及化合物22(30-Isopropyl carbamoyl-11-oxo-18β-3,4-seco-olean-4(23),12-diene 3-isopropyl ester)，或者與溶於EDCI及DMAP之胺類溶液反應，形成化合物23(30-Isopropylcarbamoyl-11-oxo-18β-3,4-seco-olean-4(23),12-diene 3-ethyl carbamate)、化合物24(30-Isopropyl carbamoyl-11-oxo-18β-3,4-seco-olean-4(23),12-diene 3-propyl carbamate)及化合物25(3,4-seco-11-Oxo-18β-olean-4(23),12-dien-3,30-diisopropyl carbamate)。
    本實施例之化合物21係取100毫克(0.19毫莫耳)的化合物19，以碳酸鉀(K2CO3)為催化劑，與碘化乙烷(ethyl iodide)進行反應，獲得一白色無結晶粉末(27.3毫克，0.049毫莫耳，產率25.8%)：9(c 0.25，氯仿)。IR(film on NaCl)3365、1735、1650 cm-1。1H NMR(氘代氯仿)：δ 0.82(3H,s,Me-28)，1.11(3H,s,Me-26)，1.14(3H,d,J=6.4Hz,-CH(CH3)(CH 3))，1.16(3H,s,Me-25)，1.16(3H,d,J=6.4Hz,-CH(CH 3)(CH3))，1.17(3H,s,Me-29)，1.23(3H,t,J=7.2Hz,-CH2CH 3)，1.39(3H,s,Me-27)，1.76(3H,s,Me-24)，2.61(1H,td,J=13.2,6.4Hz,Hβ-18)，4.08(2H,q,J=7.2Hz,-CH 2CH3)，4.12(1H,m,-CH(CH3)2)，4.70(1H,br s,H-23)，4.90(1H,br s,H-23)，5.33(1H,d,J=8.0Hz,NH)，5.65(1H,s,H-12)。13C NMR(氘代氯仿)，請參照第1表。EI-MS(70eV)m/z(% rel. int.)：553[M]+(62)。為C35H55NO4計算HR-EI-MS m/z：553.4131。發現553.4133。
    本實施例之化合物22係取80毫克(0.15毫莫耳)的化合物19與碘化異丙烷(isopropyl iodide)在丙酮與碳酸鉀(K2CO3)的存在下進行反應，獲得一白色無結晶粉末(73.3毫克，0.13毫莫耳，產率86.7%)：1(c 1.0，氯仿)。IR(film on NaCl)3373、1727、1661 cm-1。1H NMR(氘代氯仿)：δ 0.82(3H,s,Me-28)，1.11(3H,s,Me-29)，1.14(3H,d,J=6.8Hz,-CH(CH 3)(CH3))，1.16(3H,s,Me-25)，1.16(3H,d,J=6.8Hz,-CH(CH3)(CH 3))，1.17(3H,s,Me-26)，1.20(6H,d,J=6.4Hz,-CH(CH 3)2)，1.39(3H,s,Me-27)，1.76(3H,s,Me-24)，2.59(1H,td,J=13.2,6.4Hz,Hβ-18)，4.12(1H,m,-CH(CH3)2)，4.69(1H,br s,H-23)，4.90(1H,br s,H-23)，4.95(1H,m,-CH(CH3)2)，5.34(1H,d,J=8.0Hz,NH)，5.64(1H,s,H-12)。13C NMR(氘代氯仿)，請參照第1表。EI-MS(70eV)m/z(% rel. int.)，567[M]+(64)。為C36H57NO4計算HR-EI-MS m/z：567.4288。發現567.4269。
    本實施例之化合物23係取100毫克(0.19毫莫耳)的化合物19，與提供胺基團的乙基胺(ethyl amine)進行醯胺化反應，其中，以1-乙基3-二甲基氨丙基碳代二亞胺(EDCI)為活化劑，以4-二甲氨基啶(DMAP)為催化劑，獲得一白色無結晶粉末(59.3毫克，0.11毫莫耳，產率58.0%)：2(c 0.25,CHCl3). IR(film on NaCl)3292、1731、1653 cm-1。1H NMR(氘代氯仿)：δ 0.82(3H,s,Me-28)，1.10(3H,t,J=7.2Hz,-CH2CH 3)，1.11(3H,s,Me-26)，1.15(3H,d,J=6.8Hz,-CH(CH 3)(CH3))，1.16(3H,d,J=6.8Hz,-CH(CH3)(CH 3))，1.16(3H,s,Me-25)，1.17(3H,s,Me-29)，1.39(3H,s,Me-27)，2.51(1H,td,J=13.2,6.0Hz,Hβ-18)，3.23(2H,m,-CH 2CH3)，4.12(1H,m,-CH(CH3)2)，4.74(1H,br s,H-23)，4.90(1H,br s,H-23)，5.34(1H,t,J=8.4Hz,NH)，5.68(1H,t,J=4.0Hz,-NHCH2CH3)，5.68(1H,s,H-12)。13C NMR(氘代氯仿)，請參照第1表。EI-MS(70eV)m/z(% rel. int.)，552[M]+(47)為C35H36N2O3計算HR-EI-MS m/z：552.4291。發現552.4288。
    本實施例之化合物24係取100毫克(0.19毫莫耳)的化合物19，與提供胺基團的丙基胺(propyl amine)進行醯胺化反應，其中，以1-乙基3-二甲基氨丙基碳代二亞胺(EDCI)為活化劑，以4-二甲氨基啶(DMAP)為催化劑，獲得一白色無結晶粉末(46.1毫克，0.081毫莫耳，產率42.6%)：4(c 0.25，氯仿)。IR(film on NaCl)3424、1735、1653 cm-1。1H NMR(氘代氯仿)：δ 0.83(3H,s,Me-28)，0.91(3H,t,J=7.2Hz,-CH2CH2CH 3)，1.11(3H,s,Me-26)，1.15(3H,d,J=6.8Hz,-CH(CH 3)(CH3))，1.16(3H,d,J=6.8Hz,-CH(CH3)(CH 3))，1.16(3H,s,Me-25)，1.17(3H,s,Me-29)，1.38(3H,s,Me-27)，1.77(3H,s,Me-24)，2.23(2H,m,-CH2CH 2CH3)，2.51(1H,td,J=13.2,6.0Hz,Hβ-18)，3.16(2H,dd,J=13.2,6.4Hz,-CH 2CH2CH3)，4.12(1H,m,-CH(CH3)2)，4.74(1H,br s,H-23)，4.91(1H,br s,H-23)，5.33(1H,d,J=8.4Hz,NH)，5.67(1H,s,H-12)，5.68(1H,t,J=4.0Hz,-NHCH2CH2CH3)。13C NMR(氘代氯仿)，請參照第1表。EI-MS(70eV)m/z(% rel. int.)，566[M]+(95)。為C36H58N2O3計算HR-EI-MS m/z：566.4447。發現566.4439。
    本實施例之化合物25係取100毫克(0.19毫莫耳)的化合物19，與提供胺基團的異丙基胺(isopropylamine)進行醯胺化反應，其中，以1-乙基3-二甲基氨丙基碳代二亞胺(EDCI)為活化劑，以4-二甲氨基啶(DMAP)為催化劑，獲得一白色無結晶粉末(61.4毫克，0.11毫莫耳，產率58.0%)4(c 0.25，氯仿)。IR(film on NaCl)3439、1727、1650 cm-1。1H NMR(氘代氯仿)：δ 0.80(3H,s,Me-28)，1.11(3H,s,Me-26)，1.12(6H,d,J=6.8Hz,-CH(CH 3)2)，1.15(3H,s,Me-29)，1.15(6H,d,J=6.8Hz,-CH(CH 3)2)，1.17(3H,s,Me-25)，1.38(3H,s,Me-27)，1.79(3H,s,Me-24)，2.48(1H,td,J=13.2,6.4Hz,Hβ-18)，4.02(1H,m,-CH(CH3)2)，4.12(1H,m,-CH(CH3)2)，4.74(1H,br s,H-23)，4.90(1H,br s,H-23)，5.34(1H,d,J=7.6Hz,NH)，5.46(1H,d,J=7.6Hz,NH)，5.65(1H,s,H-12)。13C NMR(氘代氯仿)，請參照第1表。EI-MS(70eV)m/z(% rel. int.)，566[M]+(89)。為C36H58N2O3計算HR-EI-MS m/z：566.4447。發現566.4444。
    根據本發明所獲得之化合物10、11、化合物13至17及化合物21至25，其碳譜(13CNMR)測定的結果如第1表所示，而本發明所獲得之化合物2至9、12、18至20、26及27之碳譜之判定結果，乃參照Maitraie D等人於Bioorg. Med. Chem.期刊所發表的論文資料(2009,17,2785)。
    第1表：化合物10、11、13至17及21至25的質譜結果

    本發明之18β-甘草次酸衍生物係具有殺死癌細胞之作用，特別係藉由本發明18β-甘草次酸衍生物之製備方法係能夠用以大量生產該18β-甘草次酸衍生物，特別係指化合物10、11、13至17及21至25之製備方法，該等18β-甘草次酸衍生物係能夠藉由提升癌細胞中的ROS產生率，活化癌細胞的促凋亡蛋白p53後，使癌細胞的MMP下降，促使癌細胞發生細胞凋亡。
    本發明18β-甘草次酸衍生物之製備方法，係藉由化學反應合成，有助於大量生產該等18β-甘草次酸衍生物，該等18β-甘草次酸衍生物與習用抗癌藥物共同施用於生物體，能夠達到降低習用抗癌藥物之副作用的功效。
    為證實本發明之18β-甘草次酸衍生物係具有殺死癌細胞之作用，以購自美國菌種保存中心(American Type Culture Collection，簡稱ATCC)之人類膀胱癌細胞NTUB1(J. Formosan Med. Assoc. 1992;91:608-13)、人類前列腺癌細胞PC3(編號為CRL-1435)或人類膀胱上皮正常細胞SV-HUC1(編號為CRL-9520)進行以下試驗：(A)本發明18β-甘草次酸衍生物之半抑制濃度試驗、(B)本發明18β-甘草次酸衍生物之細胞存活率試驗、(C)本發明18β-甘草次酸衍生物與習用抗癌藥物之協同作用試驗、(D)本發明18β-甘草次酸衍生物之活性氧物質產生率測試、(E)本發明18β-甘草次酸衍生物與習用抗癌藥物之細胞凋亡率試驗、(F)本發明18β-甘草次酸衍生物之粒線體膜電位測試及(G)促凋亡蛋白p53活化試驗。
    本實施例係選用人類膀胱癌細胞NTUB1(後簡稱膀胱癌細胞)、人類前列腺癌細胞PC3(後簡稱前列腺癌細胞)及人類膀胱上皮正常細胞SV-HUC1(後簡稱正常細胞)進行後續試驗，該等細胞株培養於一適當培養基中，待該等細胞株數量增殖至培養容器之七至八成滿，取一緩衝液，將增殖培養之細胞由該培養容器之器壁沖刷至該緩衝液中，以方便進行該細胞株之細胞計數，及試驗(A)至(G)之分析。
    更詳言之，本實施例係選擇但不限定將該膀胱癌細胞或該前列腺癌細胞於含有10%胎牛血清蛋白(Fetal bovine serum，簡稱FBS)之RPMI 1640培養基(Roswell Park Memorial Institute medium，該RPMI 1640培養基包含100 unit/mL penicillin-G,100 μg/mL streptomycin,and 2 mM l-glutamine)中增殖培養；本實施例係選擇但不限定將該正常細胞於含有10% FBS之F12培養基(該F12培養基包含100 unit/mL penicillin-G,100 μg/mL streptomycin,and 2 mM l-glutamine)中增殖培養。該三細胞株之培養條件為5%二氧化碳氣體、溫度為37℃，待該等細胞株長至培養容器之七成滿，以一商用EDTA緩衝液(Ethylene diamine tetra-acetic acid；MERCK)重複沖洗該培養容器，以便將貼壁生長的該等細胞沖刷至該EDTA緩衝液，並進行細胞計數。
    (A)本發明18β-甘草次酸衍生物之半抑制濃度試驗
    為證實本發明18β-甘草次酸衍生物(化合物1至27)抑制癌細胞之作用，本實施例係取一習用抗癌藥物(Cisplatin)作為正控制組(第A0+組)、化合物1至27分別為實驗組(分別依序為第A1至A27組)，以及一組未與任何化合物或習用抗癌藥物共培養之組別為負控制組(第A0-組，以確認本實施例之癌細胞生長情況為正常)，進行癌細胞之半抑制濃度試驗(IC50)。更詳言之，本實施例係將膀胱癌細胞(各組細胞數量約為4×105 cells/ml)，以5%二氧化碳氣體、溫度為37℃之條件與不同濃度之化合物或習用抗癌藥物共培養，製作不同濃度之化合物或習用抗癌藥物對於各組細胞之半抑制濃度的線性迴歸，以計算各化合物或習用抗癌藥物的半抑制濃度。
    請參照第2表所示，係本實施例第A0+、A1至27組之半抑制濃度試驗結果，其中化合物9(2.34±0.28 μM)、化合物12(9.41±2.72 μM)、化合物21(19.44±19.20 μM)、化合物23(12.75±2.10 μM)、化合物25(4.76±1.15 μM)及化合物27(3.31±0.61 μM)之半抑制濃度為本實施例中較低者，因此，以下試驗係選擇本實施例中，半抑制濃度試驗所需濃度較低之化合物12、化合物20、化合物21、化合物23或/及化合物25進行試驗(B)至(G)。
    第2表：本實施例各組別之IC50試驗結果(單位：μM)

    由上表可知，本發明18β-甘草次酸衍生物中，化合物1至27皆具有抑制癌細胞生長之作用，其中，以化合物19、20及25為例，當C-3位置之官能基進行酯化反應(esterification)或醯胺化反應(amidation)後，而具有較長碳鏈之C-3取代基，其抑制癌細胞作用的效果越佳；當C-3及/或C-30位置以異丙基胺基取代後，亦具有更佳之癌細胞抑制作用；此外，本實施例中係以變異型的18β-甘草次酸衍生物具有較佳的癌細胞抑制作用。由此可知，本發明18β-甘草次酸衍生物係能夠有效抑制癌細胞之18β-甘草次酸衍生物，具有提供一種開發有效抑制癌細胞之抗癌藥物功效。
    (B)本發明18β-甘草次酸衍生物之細胞存活率試驗
    為證實本發明18β-甘草次酸衍生物(化合物1至27)具有殺死癌細胞之作用，且其對於正常細胞不會造成毒殺作用，本實施例係以MTT細胞活性染色法(MTT assay)分別測試本發明之化合物21、化合物23及化合物25與膀胱癌細胞、前列腺癌細胞及正常細胞共培養後的細胞存活率。更詳言之，MTT細胞活性染色法係利用活細胞粒線體中所含有之琥珀酸去氫酶(Dehydrogenase)可代謝溶於血癌細胞培養液中的黃色MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，購自Sigma Chemical Co.)化合物，將MTT化合物中的tetrazolium轉為一藍色產物formazan，該formazan會堆積在細胞中，另以一DMSO溶液將formazan溶解，測量該DMSO溶液於波長540 nm處之吸光值，代表各組細胞之存活率，當活細胞數越多，則540 nm之吸光值越高。
    本實施例分別取該三種細胞(各24組)與不同濃度之化合物21、23或25共培養，各組別細胞株分別與不同濃度之化合物進行培養72小時後，取50 μl之MTT溶液(2 mg MTT化合物溶於1毫升PB緩衝溶液)加入各組別中反應3小時，將各組別進行離心(1000g,10分鐘)後取其上清液，並分別加入150 μl之DMSO，以MRX分光光度計(MRX microplate reader,DYNEXCO)測量各組別之540 nm波長之吸光值，並以未與化合物共培養組別之吸光值為基準，換算成各組別之細胞存活率。
    請參照第4圖所示，係本實施例之化合物21分別與該三種細胞共培養的細胞存活率長條圖，其中，以未與化合物21共培養之組別的細胞存活率設為100%。該膀胱癌細胞與前列腺癌細胞之細胞存活率，係隨化合物21之濃度增加而具有負相關，而該正常細胞之細胞存活率，則係隨化合物21之濃度增加而具有正相關，其中，當該化合物21之濃度為10~30 μM，該膀胱癌細胞之細胞存活率係低於70%，該化合物21濃度為30~50 μM，其細胞存活率僅為30%左右，而該正常細胞與化合物21共培養，則具有促進細胞生長的作用。
    請參照第5圖所示，係本實施例之化合物23分別與該三種細胞共培養的細胞存活率長條圖，其中，以未與化合物23共培養之組別的細胞存活率設為100%。該膀胱癌細胞與前列腺癌細胞之細胞存活率，係隨化合物23之濃度增加而具有負相關，而該正常細胞之細胞存活率，則係隨化合物23之濃度增加而具有正相關，其中，當該化合物23之濃度為1~10 μM，該膀胱癌細胞之細胞存活率約為70%，該化合物23濃度為30~50 μM，其細胞存活率不到10%左右，而該正常細胞與化合物23共培養，則具有促進細胞生長的作用。
    請參照第6圖所示，係本實施例之化合物25分別與該三種細胞共培養的細胞存活率長條圖，其中，以未與化合物25共培養之組別的細胞存活率設為100%。該膀胱癌細胞與前列腺癌細胞之細胞存活率，係隨化合物25之濃度增加而具有負相關，而該正常細胞之細胞存活率，則係隨化合物25之濃度增加而具有正相關，其中，當該化合物25之濃度為0.3~5.0 μM，該膀胱癌細胞之細胞存活率為60~75%，該化合物25濃度為10 μM，其細胞存活率不到20%，該化合物25濃度為30~50 μM，其細胞存活率甚至接近0%，而該正常細胞與化合物25共培養，則具有促進細胞生長的作用。
    由上述可知，本發明18β-甘草次酸衍生物確實具有殺死癌細胞之作用，且對正常細胞不具有細胞毒性，係能夠有助於生物體抵抗癌細胞之生長，又不會傷害正常細胞，係具有幫助抗癌藥物開發之功效。
    (C)本發明18β-甘草次酸衍生物與習用抗癌藥物之協同作用試驗
    根據Ping等人於2010年Urol. Oncol:Semin. Orig. Invest.期刊所發表之論文中，曾說明習用抗癌藥物(Taxol)與數種抗氧化物質(如大豆異黃酮、維他命E、兒茶素或吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽等)具有協同作用之理論，本發明18β-甘草次酸衍生物係與一習用抗癌藥物-Cisplatin共同抑制並殺死癌細胞，並證實本發明18β-甘草次酸衍生物確實具有與習用抗癌藥物之協同作用，將該習用抗癌藥物與本發明18β-甘草次酸衍生物共同施用係能夠達到相當的癌細胞抑制效果，藉此能夠降低該習用抗癌藥物之施用劑量，以降低該習用抗癌藥物對於生物體造成的副作用(例如腎毒性、抗藥性等)。
    本實施例亦以MTT細胞活性染色法(MTT assay)測試本發明之化合物12、化合物20及Cisplatin與膀胱癌細胞共培養後的細胞存活率。更詳言之，本實施例取42組該膀胱癌細胞，與不同濃度之化合物12及Cisplatin或化合物20及Cisplatin共培養(各組別之共培養條件請參照第3表)，各組別細胞株分別與不同濃度之化合物進行培養72小時後，以試驗(A)所述之MTT細胞活性染色法計算成各組別之細胞存活率。
    第3表：本實施例各組別之共培養條件

    請參照第3表所示之培養條件，並配合第7及8圖之細胞存活率長條圖，以不同濃度之Cisplatin與膀胱癌細胞共培養的情況下，在0 μM之Cisplatin組別(與化合物12共培養的組別係以第C12-1-1組為基準，化合物20共培養的組別係以第C20-1-1組為基準)，其細胞存活率設為100%，5 μM Cisplatin組別(第C12-1-2組、第C20-1-2組)或10 μM Cisplatin組別(第C12-1-3組、第C20-1-3組)的細胞存活率降至30%以下，表示習用抗癌藥物確實對癌細胞具有毒殺作用。
    而在第C12-2-1組至第C12-5-3組中，單純以1~5 μM之化合物12之組別，其細胞存活率約為70~80%，表示其癌細胞抑制效果較弱，而濃度為1~5 μM之化合物12與5 μM或10 μM Cisplatin共培養，其細胞存活率便能達到50%以下，証實該化合物12確實能夠與Cisplatin發生協同作用，能降低Cisplatin的施用劑量，又能夠達到很好的癌細胞抑制作用；在第C12-6-1組至第C12-7-3組中，單以化合物12或者化合物12與Cisplatin共培養者，其細胞存活率皆能低於40%，更證明本發明之化合物12本身即具有抑制並殺死癌細胞之效果，且與該習用抗癌藥物Cisplatin之抑制效果相當。
    而在第C20-2-1組至第C20-5-3組中，單純以1~5 μM之化合物20之組別，其細胞存活率約為60~75%，表示其癌細胞抑制效果較弱，而濃度為1~5 μM之化合物20與5 μM或10 μM Cisplatin共培養，其細胞存活率便能達到40%以下，証實該化合物20確實能夠與Cisplatin發生協同作用，能降低Cisplatin的施用劑量，又能夠達到很好的癌細胞抑制作用；在第C20-6-1組至第C20-7-3組中，單以化合物20或者化合物20與Cisplatin共培養者，其細胞存活率皆能低於40%，更證明本發明之化合物20本身即具有抑制並殺死癌細胞之效果，且與該習用抗癌藥物Cisplatin之抑制效果相當。
    由上述可知，本發明18β-甘草次酸衍生物確實具有與習用抗癌藥物之協同作用，將該習用抗癌藥物與本發明18β-甘草次酸衍生物共同施用，不僅能夠具有抑制且殺死癌細胞之效果，又能夠降低該習用抗癌藥物之施用劑量，以降低該習用抗癌藥物對於生物體造成的副作用(例如腎毒性、抗藥性等)之功效。
    (D)本發明18β-甘草次酸衍生物之活性氧物質產生率測試
    活性氧物質(Reactive oxygen species，簡稱ROS)通常會造成細胞凋亡、調控部分基因的表現，或活化一連串的細胞訊息傳遞路徑。為證實本發明18β-甘草次酸衍生物的癌細胞抑制作用係以刺激癌細胞中的ROS含量而達到其抑制效果，本實施例係藉由流式細胞儀量測各組別細胞中的ROS產生率。
    更詳言之，本實施例係取5組膀胱癌細胞(各組細胞數量約為8×105 cells/ml)分別與如第4表所示之條件共同培養24小時，在各組細胞與本發明18β-甘草次酸衍生物共培養結束前30分鐘，添加10 μM的脂溶性染劑(2,7-dichlorofluorescein diacetate，簡稱H2DCFDA，購自Molecular Probes,Eugene,OR)，該脂溶性染劑進入到細胞內後，與脂酶(Esterase)反應後會分解成具有綠色螢光的DCF化合物(2,7-dichlorofluorescein)，再以一流式細胞儀(FACScan flow cytometer,Becton Dickinson)測量波長為525 nm之吸光值，特別係測量細胞週期M1期中的ROS產生率。
    第4表：本實施例各組別之共培養物及其ROS產生率
    請參照第4表所示之ROS產生率結果，第D1組之未經任何處理之對照組，其ROS產生率為47.4%，以20 μM之Cisplatin處理之第D2組，其ROS產生率增加到63.1%，第D3組則係以一種ROS抑制劑-N-acetylcysteine(NAC)處理之負控制組，其ROS產生率更低於該對照組，而以本發明之化合物25處理之第D4及D5組，其ROS產生率皆高於第D1組。
    由上述可知，本發明18β-甘草次酸衍生物殺死癌細胞的作用，確實係與其刺激癌細胞產生較多的ROS相關。
    (E)本發明18β-甘草次酸衍生物與習用抗癌藥物之細胞凋亡率試驗
    當癌細胞發生凋亡，通常係指癌細胞之細胞週期被停止在G1期到S期之間，為證實本發明18β-甘草次酸衍生物用以抑制癌細胞之作用是否與細胞週期的停滯(cell cycle arrest)有關，本實施例以流式細胞儀，測量各組別細胞與不同濃度之化合物25、Cisplatin或NAC之共培養後，各組別細胞週期的狀態。
    更詳言之，本實施例係取7組膀胱癌細胞(各組細胞數量約為8×105 cells/ml)分別與如第4表所示之條件共同培養24小時，收集各組別之細胞後，以1×PBS緩衝溶液沖洗後，以4℃乙醇溶液於溫度-20℃下固定各組細胞24小時後，再以PBS緩衝溶液清洗後，以50 μg/ml propidium iodide(簡稱PI，購自Sigma,Co)染劑與50 μg/ml RNase A(購自Sigma,Co)於室溫下共培養30分鍾，再以流式細胞儀(FACScan flow cytometer,Becton Dickinson)及分析軟體(Cell Quest software)計算各組別細胞之細胞週期。
    第5表：本實施例各組別之細胞週期(單位：%)
    請參照第5表所示可知，以NAC(負控制組)及過氧化氫(正控制組)處理之組別，其細胞週期並未發生停滯現象，以化合物25處理之組別亦不會引起細胞週期停滯，但本發明之化合物25與該負控制組及該正控制組相較，化合物25確實可以引起各組細胞趨向於Sub-G1期，且S期之細胞量下降，該化合物25之濃度增加而使Sub-G1期細胞遞增，且S期細胞遞減，代表各組細胞之凋亡係藉由各組Sub-G1期與化合物25有關。
    (F)本發明18β-甘草次酸衍生物之粒線體膜電位測試
    根據Martin等人於2009年Plos One期刊所發表之論文中，其推論當細胞中ROS產生過多會引起細胞中的粒線體膜電位(MMP)下降，造成粒線體功能失常(Mitochondrial dysfunction)。為證實本發明18β-甘草次酸衍生物係由於提高癌細胞之ROS產生率，進而造成癌細胞中的MMP下降，而達到抑制並殺死癌細胞之作用，本實施例係以一JC-1(5,5,6,6-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolo carbocyanine iodide，購自Molecular Probes,Eugene,OR,USA)螢光探針之聚集情形來判斷MMP的升降與否，特別係當MMP較高時，則該JC-1螢光探針將會發生聚集現象，而形成JC-1探針聚集物(JC-1 aggregates，以R1簡稱)而存在於細胞中，而MMP較低時，該JC-1螢光探針會以該JC-1探針單體(JC-1 monomer，以R2簡稱)存在於細胞中，並以一流式細胞儀測量該JC-1探針單體及JC-1探針聚集物之螢光量。
    第6表：本實施例各組別之共培養物及R1、R2百分率(%)
    請參照第6表所示，係本實施例各組別之共培養物及其R1及R2百分率，其中第F1組為未經任何處理之組別，其R1百分率為95.32%，R2百分率為4.48%，該組別之MMP係正常條件；第F2組為以CCCP(carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone)處理之正控制組，該組別之R1百分率為52.06%，R2百分率為48.42%，其係代表該組細胞之MMP受到破壞後的明顯下降趨勢；第F3至F5組係以化合物25處理之組別，其R1百分率係隨化合物25之濃度遞增而減少，而R2百分率則係隨化合物25之濃度遞增而增加，代表該化合物25確實具有誘發癌細胞之MMP下降之趨勢，藉此而抑制癌細胞生長。
    根據試驗(D)至(F)可之，本發明18β-甘草次酸衍生物確實能夠藉由提高癌細胞之ROS產生率，進而誘導癌細胞的MMP下降，使癌細胞生長受到抑制，因此，本發明18β-甘草次酸衍生物係有效抑制癌細胞生長並殺死癌細胞之活性成分，具有應用於製備抗癌藥物之功效。
    (G)促凋亡蛋白p53活化試驗
    根據Son等人於2010年Toxicol. Appl. Pharmacol.期刊所發表之論文中，說明當細胞ROS含量增加，會引起細胞中抑癌基因p53的表現，該抑癌基因p53係主要誘發細胞凋亡的基因之一。
    為證實本發明18β-甘草次酸衍生物殺死癌細胞之作用係與該抑癌基因p53有關，特別係由於細胞中ROS量增加而活化該抑癌基因p53，進而達到抑制癌細胞生長之作用，本實施例係以西方墨點法(Western blotting)測量各組細胞中抑癌基因p53之表現量。
    本實施例係將9組膀胱癌細胞請參照第7表所示，係以不同濃度之化合物25分別與9組膀胱癌細胞(各組細胞數量約為8×105 cells/ml)共培養24小時後之條件，分別自第G1-1至G1-5組及第G2-1至G2-4組中取出適量膀胱癌細胞，以一定比例(較佳係1:10)稀釋於一商用蛋白質抽取溶劑(Lysis buffer；Sigma)，進行均質處理，造成各組細胞溶解、破裂，以獲得細胞內的蛋白質；再由一商用蛋白質定量套組(Protein Assay Kit；Invitrogen)分析由第G1-1至G1-5組及第G2-1至G2-4組細胞所抽取的蛋白質總量，取等量蛋白質，利用商用抗磷酸化抑癌基因p53多株抗體(Ser 15(9284)，購自Cell Signaling,Beverly,MA,USA)、商用抗抑癌基因p53單株抗體(DO1，購自Santa Cruz Biotechnology,CA,USA)進行西方墨點法分析，另以一商用抗肌動蛋白(β-actin)多株抗體(NB660-501，購自Novus Biologicals,Littleton,CO,USA)偵測該肌動蛋白表現量作為對照組。
    第7表：本實施例各組別之共培養物
    請參照第9及10圖之西方墨點法之蛋白質染色結果所示，本實施例係以膀胱癌細胞中β-actin的表現量為定量標準，分別比較各組膀胱癌細胞中抑癌基因p53及磷酸化抑癌基因p53(簡稱p-p53)的表現情況。
    請參照第9圖所示，比較第G1-1至G1-5組之p-p53及p53之表現量，其中，第G1-1組係未經任何處理之組別；相較於第G1-1組，以Cisplatin處理之第G1-2組的p-p53明顯增加，而第G1-3至G1-5組的p-p53表現量係隨著化合物25之作用濃度增加而遞增，代表該化合物25確實能夠引發癌細胞之抑癌基因p53活化，而促使癌細胞凋亡。
    請參照第10圖所示，比較第G2-1至G2-4組之p-p53及p53之表現量，其中，第G2-1組係未經任何處理之組別；相較於第G2-1組，以濃度為50 μM之化合物25處理之第G2-2組，其p-p53表現量明顯增加，而以一ROS抑制劑(NAC)處理之第G2-3組，其p-p53表現量明顯被抑制，而第G2-4組係以濃度為50 μM之化合物25及NAC同時處理，該組別之p-p53則稍有恢復，代表化合物25係具有提升癌細胞內的ROS含量的作用，並藉由該ROS產生率的提升而達到抑制癌細胞的作用。
    由上述試驗(A)至(G)可知，本發明之18β-甘草次酸衍生物係藉由提升癌細胞中的ROS產生率，由ROS調控p-p53之活化，使癌細胞的MMP下降，促使癌細胞發生細胞凋亡，並且，本發明之18β-甘草次酸衍生物不會使癌細胞或正常細胞的細胞週期發生停滯，因此對於正常細胞不會具有毒殺作用；此外，本發明之18β-甘草次酸衍生物更可以與習用抗癌藥物發生協同作用，藉此降低習用抗癌藥物之使用劑量，降低習用抗癌藥物對於生物體所造成的腎毒性或抗藥性的副作用，同時具有同樣的癌細胞抑制作用。
    本發明之具有殺死癌細胞之18β-甘草次酸衍生物係能夠用以製備成一種抗癌藥物，特別係與醫藥學上可接受之載劑或賦形劑組合形成一醫藥組成物，其中，該18β-甘草次酸衍生物可以製備成任何方便施用於生物體之型式，如錠劑、膠囊、粉劑、粒劑或液劑等以供生物體服用或注射，該醫藥組成物另可以包含習用抗癌藥物-Cisplatin，以降低習用抗癌藥物之副作用。
    本發明殺死癌細胞之18β-甘草次酸衍生物係藉由提升癌細胞ROS，由ROS調控p-p53，降低癌細胞之MMP，造成癌細胞凋亡，具有抑制癌細胞生長之功效。
    本發明殺死癌細胞之18β-甘草次酸衍生物的製備方法，其係利用化學反應合成而能夠大量生產，具有成本低且有利於藥物製程開發之功效。
    本發明之殺死癌細胞之醫藥組合物，其係包含至少一種18β-甘草次酸衍生物及一醫藥上可接受載體所形成之醫藥組合物，係能夠提供一種有效抑制癌細胞之抗癌藥物。
    雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
    第1圖：本發明合成18β-甘草次酸衍生物之第一流程圖。
    第2圖：本發明合成18β-甘草次酸衍生物之第二流程圖。
    第3圖：本發明合成18β-甘草次酸衍生物之第三流程圖。
    第4圖：本實施例化合物21與三種細胞共培養之細胞存活率長條圖。
    第5圖：本實施例化合物23與三種細胞共培養之細胞存活率長條圖。
    第6圖：本實施例化合物25與三種細胞共培養之細胞存活率長條圖。
    第7圖：本實施例化合物12與Cisplatin協同抑制三種細胞之細胞存活率長條圖。
    第8圖：本實施例化合物20與Cisplatin協同抑制三種細胞之細胞存活率長條圖。
    第9圖：本實施例化合物25第G1-1至G1-5組之西方墨點法之蛋白質染色結果。
    第10圖：本實施例化合物25第G2-1至G2-4組之西方墨點法之蛋白質染色結果。
    权利要求:
    Claims (16)
    [1] 一種殺死癌細胞之18β-甘草次酸衍生物，其係選自由式(Ⅰ)及式(Ⅱ)所組成之群組： 其中R1選自CH3及CH2C6H5其中之一，R2選自COOCH3、COOCH2CH3、COOCH(CH3)2、CONHCH2CH3、CONHCH2CH2CH3及CONHCH2(CH3)2其中之一，R3選自COOCH2CH3、COOCH(CH3)2、CONHCH2CH3、CONHCH2CH2CH3及CONHCH2(CH3)2其中之一。
    [2] 一種殺死癌細胞之醫藥組合物，其係包含至少一種18β-甘草次酸衍生物，其係選自由式(Ⅰ)及式(Ⅱ)所組成之群組： 其中R1選自CH3及CH2C6H5其中之一，R2選自COOCH3、COOCH2CH3、COOCH(CH3)2、CONHCH2CH3、CONHCH2CH2CH3及CONHCH2(CH3)2其中之一，R3選自COOCH2CH3、COOCH(CH3)2、CONHCH2CH3、CONHCH2CH2CH3及CONHCH2(CH3)2其中之一；及一醫藥上可接受載體所形成之醫藥組合物。
    [3] 依申請專利範圍第2項所述之殺死癌細胞之醫藥組合物，其中，該癌細胞係膀胱癌細胞或前列腺癌細胞。
    [4] 一種殺死癌細胞之18β-甘草次酸衍生物的製備方法，係包含：以18β-甘草次酸作為一合成起始原料，氧化形成一第一化合物；及將該第一化合物進行一酯化反應，形成一第二化合物，其中，該第二化合物中C-30之官能基為烷基團或芳香基團。
    [5] 依申請專利範圍第4項所述之殺死癌細胞之18β-甘草次酸衍生物的製備方法，進一步包含：將該第二化合物形成一內酯化的第三化合物。
    [6] 依申請專利範圍第5項所述之殺死癌細胞之18β-甘草次酸衍生物的製備方法，進一步包含：將該第三化合物形成一變異型(seco-)的第四化合物。
    [7] 依申請專利範圍第6項所述之殺死癌細胞之18β-甘草次酸衍生物的製備方法，進一步包含：將該第四化合物進行酯化或醯胺化反應，獲得一第五化合物，該第五化合物中C-3之官能基為烷基團或胺基團。
    [8] 依申請專利範圍第7項所述之殺死癌細胞之18β-甘草次酸衍生物的製備方法，其中，該烷基團係由鹵化烷類化合物所提供。
    [9] 依申請專利範圍第8項所述之殺死癌細胞之18β-甘草次酸衍生物的製備方法，其中，該鹵化烷類化合物係碘化乙烷或碘化異丙烷。
    [10] 依申請專利範圍第7項所述之殺死癌細胞之18β-甘草次酸衍生物的製備方法，其中，該胺基團係由乙基胺、丙基胺或異丙基胺提供。
    [11] 依申請專利範圍第5項所述之殺死癌細胞之18β-甘草次酸衍生物的製備方法，進一步包含：將該第三化合物與一胺類化合物進行醯胺化反應，形成一第六化合物，該第六化合物中C-30之官能基為胺基團或苯胺基團。
    [12] 依申請專利範圍第11項所述之殺死癌細胞之18β-甘草次酸衍生物的製備方法，進一步包含：將該帶有一胺基團或苯胺基團的第六化合物，形成一變異型(seco-)且帶有胺基團或苯胺基團的第七化合物。
    [13] 依申請專利範圍第12項所述之殺死癌細胞之18β-甘草次酸衍生物的製備方法，進一步包含：將該變異型且帶有胺基團或苯胺基團的第七化合物以烷基團或胺基團進行酯化或醯胺化反應，獲得一第八化合物，該第八化合物中C-3之官能基為烷基團或胺基團。
    [14] 依申請專利範圍第13項所述之殺死癌細胞之18β-甘草次酸衍生物的製備方法，其中，該烷基團係由鹵化烷類化合物所提供。
    [15] 依申請專利範圍第14項所述之殺死癌細胞之18β-甘草次酸衍生物的製備方法，其中，該鹵化烷類化合物係碘化乙烷或碘化異丙烷。
    [16] 依申請專利範圍第13項所述之殺死癌細胞之18β-甘草次酸衍生物的製備方法，其中，該胺基團係由乙基胺、丙基胺或異丙基胺提供。
    类似技术:
    公开号 | 公开日 | 专利标题
    US10799594B2|2020-10-13|Drug delivery polymer and uses thereof
    CN104530417B|2017-09-08|一种多官能化h型聚乙二醇衍生物及其制备方法
    JP2019514884A|2019-06-06|Ｅｚｈ２インヒビターおよびそれらの使用
    CN106967005A|2017-07-21|一种能抑制ido的化合物、其制备方法及其用途
    CN107698492A|2018-02-16|一类2‑羟基查尔酮胺类化合物及其用途
    KR20180107261A|2018-10-01|Myc 조정제로서의 MAX 결합제 및 그의 용도
    WO2018068665A1|2018-04-19|微管蛋白抑制剂
    Gu et al.2012|Synthesis and biological evaluation of novel bifendate derivatives bearing 6, 7-dihydro-dibenzo [c, e] azepine scaffold as potent P-glycoprotein inhibitors
    KR100680584B1|2007-02-08|히드록시벤즈아미드 화합물 및 그 제조방법, 및 이를유효성분으로 함유하는 화장료 조성물
    TWI424839B|2014-02-01|18β－甘草次酸衍生物及其用途
    CN101475506B|2013-11-06|高级脂肪酸衍生物类化合物抗肿瘤制药用途
    CN106749478A|2017-05-31|pH敏感的1,4‑二取代酞菁锌配合物及其制备方法和在医药上的应用
    AU2014318748B2|2019-02-28|Novel anthranilic amides and the use thereof
    CN108640965B|2021-11-05|2-取代-18β-甘草次酸衍生物及其应用
    CN110526955A|2019-12-03|含异羟肟酸结构片段的18β-甘草次酸类化合物及其应用
    US9381260B2|2016-07-05|Hypoxia inducible factor-1 pathway inhibitors and uses as anticancer and imaging agents
    BRPI0804764A2|2010-07-27|inibidores da alfa-glicosidades, composições farmacêuticas compreendendo os mesmos e processo para sua preparação
    CN103012394A|2013-04-03|一种罗丹宁衍生物及其制备方法
    ES2452540T3|2014-04-01|Derivados de retinol, su uso en el tratamiento del cáncer y para potenciar la eficacia de otros agentes citotóxicos
    EP3833347A1|2021-06-16|Histone demethylase 5 inhibitors and uses thereof
    CN108586425A|2018-09-28|一种烷氧基联苯α,β-不饱和酰胺类化合物、其制备方法及医药用途
    Yang et al.2020|Improved antiproliferative activity of novel Pulsatilla saponin D/α-hederin derivatives containing nitric oxide donors
    TW201143765A|2011-12-16|Synthesis and biological evaluation of 2',5'-dimethoxychalcone derivatives as microtubule-targeted anticancer agents
    CN111825611A|2020-10-27|4|-奎诺酮衍生物及其用途
    CN108794358A|2018-11-13|取代苯磺酰基类化合物及其制备药物的用途
    同族专利:
    公开号 | 公开日
    US20130109752A1|2013-05-02|
    US8686178B2|2014-04-01|
    TWI424839B|2014-02-01|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    CN100488979C|2005-10-14|2009-05-20|天津药物研究院|甘草次酸-30-酰胺类衍生物及其用途|
    GB0604899D0|2006-03-10|2006-04-19|York Pharma Plc|Derivatives of 18-glycyrrhetinic acid|
    TWI370821B|2009-08-14|2012-08-21|Univ Kaohsiung Medical|18β-glycyrrhetinic acid derivatives and synthetic method thereof|US7280652B2|2004-09-13|2007-10-09|Research In Motion Limited|Handheld electronic device having improved phone call log, and associated method|
    CN104829681A|2015-05-08|2015-08-12|江苏天晟药业有限公司|一种甘草次酸的提纯方法|
    法律状态:
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    TW100139104A|TWI424839B|2011-10-27|2011-10-27|18β－甘草次酸衍生物及其用途|TW100139104A| TWI424839B|2011-10-27|2011-10-27|18β－甘草次酸衍生物及其用途|
    US13/420,177| US8686178B2|2011-10-27|2012-03-14|Derivative of 18β-glycyrrhetinic acid apt to suppress cancer cells|
    [返回顶部]