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    本發明關於從牛樟芝萃取的化合物；本發明亦關於一種用於治療或預防C型肝炎病毒(HCV)或人類免疫缺乏病毒(HIV)感染的組合物或方法。
    公开号:TW201317210A
    申请号:TW101138315
    申请日:2012-10-17
    公开日:2013-05-01
    发明作者:Masao Hattori；Ali El-Halawany；Megumi Mizuno；Chia-Chin Sheu
    申请人:Simpson Biotech Co Ltd；
    IPC主号:C07D207-00
    专利说明:
    從牛樟芝萃取之化合物與其用途
    本發明關於來自牛樟芝的化合物；本發明亦關於一種用於治療或預防C型肝炎病毒(HCV)或人類免疫缺乏病毒(HIV)感染的組合物或方法。
    據估計，全世界約有3%的人口感染C型肝炎病毒。在開發中國家，慢性C型肝炎是造成肝硬化，肝癌和肝移植的主因。C型肝炎病毒之蛋白酶(protease)在成為成熟之病毒前，其需經過病毒非結構多蛋白之切割，故此為發展抗C型肝炎病毒藥劑中吸引人的治療標的之一(Liu et al.,2004；Hepatitis C NS3 protease inhibition by peptidyl-a-ketoamide inhibitors：kinetic mechanism and structure.Arch Biochem Biophys 421：207-216；Kakiuchi et al.,1999 A high throughput assay of the hepatitis C virus nonstructural protein 3 serine proteinase.J Virol 80：77-84)。
    人類免疫缺乏病毒(HIV)已知是會在人體引起後天免疫缺乏症候群(AIDS)的病毒，本發明即是為了解決AIDS對醫學界造成的問題。在沒有治療的情況下，免疫缺乏病毒感染有高度的致命性。事實上，AIDS是人類死亡的主因，在特定區域中，例如撒哈拉以南非洲，至少有10%的成人被認為感染了HIV，在多數都市中盛行率被認為有35%或更高。在美國，估計目前有800,000至900,000人感染HIV，每年約新增40,000例感染。截至2000年12月，美國有超過700,000人感染HIV，58%已死亡。
    中國草藥治療與民俗醫學已有數千年的歷史，事實上，草藥之使用紀錄可追朔至西方聖經的時間；然而，直到近年才有科學家開始探討草藥在病毒感染治療中可能的角色，例如噴瓜(Ecballium elaterium)根之萃取物，已被用來治療C型肝炎與B型肝炎(EP 0793964及U.S.Pat.No.5,648,089)；目前草藥醫學領域之研究已增加，然許多關於這些草藥療法的效用仍有待去了解。
    在台灣，牛樟芝的子實體有著很高的價值，其被用來當作解毒劑，以及在腹瀉、腹部疼痛、高血壓、皮膚癢與肝癌時用；一些牛樟芝子實體中的生物活性內含物已被分離出，且已被辨識為一系列的多醣體、類固醇、三萜與倍半萜內酯(Lin et al.,2007,Factors affecting mycelial biomass and exopolysacharide production in submerged cultivation of Antrodia cinnamomea using complex media.Bioresource Technology 98：2511-2517)。先前之研究已從牛樟芝菌絲體分離出五個新的順丁烯二酸與丁烯二酸衍生物(化合物1-5)(Nakamura et al.,2004,Five new maleic and succinic acid derivatives from the mycelium of Antrodia comphorata and their cytotoxic effects on LLC tumor cell line.J Nat Prod 67：46-48)。
    美國專利第7109232號揭露5個由牛樟芝萃取之化合物1-5，以及其用途(如保護肝、抗發炎與抗腫瘤之活性)與製備。PCT公開號第WO 2009/094807揭露10個由牛樟芝萃取之化合物，以及其治療或預防C型肝炎病毒感染的用途。
    傳統上，牛樟芝的子實體已被用在肝癌上(Lin ES,Chen YH.2007.Factors affecting mycelial biomass and exopolysacharide production in submerged cultivation of Antrodia cinnamomea using complex media.Bioresource Technology 98：2511-2517)。牛樟芝的多醣體已被發現具有保護肝之作用(Han et al.,2006b,Protective effects of a neutral polysaccharide isolated from the mycelium of Antrodia cinnamomea on Propionibacterium acnes and lipopolysaccharide induced hepatic injury in mice.Chem Pharm Bull 54：496-500)與抗B型肝炎病毒的活性(Lee et.al.,2002,Antrodia camphorate polysaccharides exhibit anti-hepatitis B virus effects.FEMS Microbiol Lett 209：63-67)；在順丁烯二酸與丁烯二酸衍生物中，antrodin C(化合物3)在以瘡皰丙酸桿菌(Propionibacterium acnes)與脂多醣(lipopolysaccharide)處理之小鼠上，其顯示具有保護之活性(Nakamura et al.,2004,Five new maleic and succinic acid derivatives from the mycelium of Antrodia comphorata and their cytotoxic effects on LLC tumor cell line.J Nat Prod 67：46-48)。定量分析顯示化合物3為在子實體中，其為此類化學物中最豐富之化合物，其佔子實體乾重的約5%(Han et al.,2006a,Protective effects of a neutral polysaccharide isolated from the mycelium of Antrodia cinnamomea on Propionibacterium acnes and lipopolysaccharide induced hepatic injury in mice.Chem Pharm Bull 54：496-500)
    在研究來自天然資源的抗HCV藥物時，從牛樟芝分離出的化合物顯示有不同的活性(PCT公開號WO 2009/094807)。活性最高的是化合物1(0.9 μg/mL)、化合物3(2.9 μg/mL)，雖然化合物2與其他化合物主要核心結構相同，但化合物2的活性較低，因此本發明以一系列針對抗HCV蛋白酶活性的藥物的化合物2衍生物進行測試。同時亦測試一種由牛樟芝新分離出的化合物抗HCV或HIV-1蛋白酶藥物。
    一種式(I)化合物 其中R1係或H；R2係選自以下群組：群組(A)： 群組(B)： 群組(C)：群組(D)： 群組(E)： R3係C1-10烷基、C2-10烯基、芐基(benzyl)或4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基，表示連接的位置，或其醫藥上可接受的鹽類或前藥。
    在一較佳實施例中，R1係；R2係選自以下群組：群組(A)： 群組(B)： 群組(C)： 群組(D)： 群組(E)： R3係異丁基，其中表示連接的位置。
    在一更佳實施例中，R1係H；R2係選自以下群組：群組(A)： 群組(B)： 群組(C)： 群組(D)： 群組(E)： R3係異丁基，其中表示連接的位置。
    本發明亦提供一種式(XIV)化合物 其中R係其中表示連接的位置，或其醫藥上可接受的鹽類或前藥。
    在一較佳實施例中，R係 其中表示連接的位置。
    在另一較佳實施例中，R係
    在一更佳實施例中，R係
    本發明亦提供一種式(II)化合物 其中R1係C1-10烷氧基、C2-10烯氧基或C2-10炔氧基；且R2係C1-10烷基或C2-10烯基，或其醫藥上可接受的鹽類或前藥。
    在一較佳實施例中，該化合物係式(XIII)化合物，
    這些化合物以一種或更多種特殊幾何、光學、鏡像、非對應形、立體異構形(stereoisomeric)、互變異構形(tautomeric)、構形(conformational)或變旋異構(anomeric)等之形式存在，包含但不限制於正與反式、E與Z形式、c、t與r形式、內與外形式、R、S與內消旋型、D與L式、d與l式、(+)或(-)式、酮、烯醇與烯醇鹽(酯)形式、順與反式、順錯(synclinal)與反錯式(anticlinal)、α與β式、垂直與水平式、船形、椅形、扭曲與半椅形式，與其組合物，以下稱之為異構物(isomers)或異構形式(isomeric forms)。
    若化合物為結晶形態，其可能存在為數種不同之多形態的形式。
    除非特別指明，本發明的化合物包含所有上述異構物形式，包括(全部或部份)消旋及其他混合物。這些異構物形式的製備(如：非對稱合成)及分離(如：分步結晶與色譜方式)方法係本領域習知或調整本發明教示的方法而可輕易獲得，或已知的方法。
    除非特別指明，本發明的化合物亦包含離子、鹽、水合物及其保護的形式。其可方便的製備、純化及/或處理該活性化合物的相對應鹽，例如，醫藥上可接受鹽。醫藥上可接受鹽類的實例係討論於Berge et al.,1977,"Pharmaceutically Acceptable Salts," J.Pharm.Sci.,Vol.66,pp.1-19。
    化合物之醫藥上可接受鹽類係根據本領域習知的技藝製備。
    本發明亦提供一種用於治療或預防C型肝炎病毒(HCV)感染之醫藥組合物，其包含一有效劑量之活性成份選自：(1)一選自表9或表10所示之化合物；或(2)一式(II)化合物 其中R1係C1-10烷氧基、C2-10烯氧基或C2-10炔氧基；及R2係C1-10烷基或C2-10烯基，及一醫藥上可接受載體。
    在一較佳實施例中，該活性成份為式(XIV)化合物 其中R係 表示連接的位置。
    在一更佳實施例中，R係
    在另一較佳實施例中，該醫藥組合物給予的個體為哺乳動物，在一更佳實施例中，該醫藥組合物給予的個體為人。
    在另一較佳實施例中，該活性成份為式(XIII)化合物
    本發明亦提供一種用於治療或預防人類免疫缺乏病毒(HIV)感染之醫藥組合物，其包含一有效劑量之活性成份選自(1)一式(II)化合物 其中R1係C1-10烷氧基、C2-10烯氧基或C2-10炔氧基；及R2係C1-10烷基或C2-10烯基；或(2)一式(III)化合物 其中代表一單鍵或雙鍵；X係N或O；R1係C1-10烷氧基、C2-10烯氧基或C2-10炔氧基；R2係H、C1-10烷基、C2-10烯基或C2-10炔基；及R3係不存在、H或羥基；其限制條件為若X係O，R3係不存在，及一醫藥上可接受載體。
    在一較佳實施例中，該活性成份係式(XIII)化合物
    在另一較佳實施例中，該活性成份為3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2,5-二酮；3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮；3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2,5-二酮；(3R*,4S*)-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮；或(3R*,4R*)-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮。
    在另一較佳實施例中，該醫藥組合物給予的個體為哺乳動物，在一更佳實施例中，該醫藥組合物給予的個體為人。
    本發明之組合物可以製備成不同投藥之形式，包含藥片、藥錠、藥丸或糖衣錠，亦可填至適合之容器(如：囊劑)或懸浮體，可裝入瓶中。
    在本發明所述之醫藥上可接受載體其包含任何與所有之溶劑、稀釋劑、其他液體媒介、分散或懸浮輔助劑、固體黏合劑、潤滑劑等，且適合特定所需藥量，在Remington's Pharmaceutical Sciences,Fifteenth Edition,E.W.Martin(Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1975)中已揭露用在製備醫藥組合物上的許多不同載劑，其製備為已知的技術。除了目前不適用的任何傳統的載劑基質外，例如：產生任何不欲產生之生物作用或與本發明之醫藥組合物的其他化合物產生有害的交互作用，其他載劑之使用皆屬本發明之範圍。
    本發明之醫藥組合物中，其活性藥劑占組合物總重量0.5到90%，其包含載劑基質與/或輔助的藥劑。該活性藥劑占此組合物之總重較佳為5%-50%，醫藥有機或無機、固體或液體之載劑基質，適合口服或非口服的皆可用在組成此組合物。明膠、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、滑石、植物與動物油脂、樹膠、聚烯烴基二醇，或其它已知的用於藥物的賦形劑或稀釋劑皆是適合作為載體介質。
    本發明另提供一種治療或預防C型肝炎病毒(HCV)感染之方法，其包含給予一需要之個體有效劑量之活性成份選自：(1)一選自表9或表10所示之化合物；或(2)一式(II)化合物 其中R1係C1-10烷氧基、C2-10烯氧基或C2-10炔氧基；及R2係C1-10烷基或C2-10烯基，及一醫藥上可接受載體。
    在一較佳實施例中，該活性成份係
    在另一較佳實施例中，該活性成份為式(XIV)化合物 其中R係其中表示連接的位置。
    在一較佳實施例中，R係 表示連接的位置。
    在一更佳實施例中，R係
    在另一較佳實施例中，該醫藥組合物給予的個體為哺乳動物，在一更佳實施例中，該醫藥組合物給予的個體為人。
    本發明亦提供一種用於治療或預防人類免疫缺乏病毒(HIV)感染之方法，其包含給予一需要之個體有效劑量之活性成份選自：(1)一式(II)化合物 其中R1係C1-10烷氧基、C2-10烯氧基或C2-10炔氧基；及R2係C1-10烷基或C2-10烯基；或(2)一式(III)化合物 其中代表一單鍵或雙鍵；X係N或O；R1係C1-10烷氧基、C2-10烯氧基或C2-10炔氧基；R2係H、C1-10烷基、C2-10烯基或C2-10炔基；及R3係不存在、H或羥基；其限制條件為若X係O，R3係不存在。
    在一較佳實施例中，該活性成份為
    在另一較佳實施例中，該活性成份為3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2,5-二酮；3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮；3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2,5-二酮；(3R*,4S*)-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮；或(3R*,4R*)-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮。
    本發明之化合物可被以任何數量與任何投予方式，以降低C型肝炎病毒或人類免疫缺乏病毒的感染力，本發明所述之「有效量」係指非毒性的，但在所欲治療的病毒感染上提供足夠量之可抗病毒藥物，此確切之用量會隨對象而不同，取決於對象的人種、年紀、一般條件、感染的嚴重性、特殊之抗病毒藥物、投予的方式等因素。
    此抗C型肝炎化合物可以服用的單位配置，可易於投予與統一藥量；「藥量單位」在此係指適合患者治療之抗病毒藥物的有形分離單位(physically discrete unit)，每個藥量應包含活性物質之量計算至可產生所欲達到之治療效果，亦或是選擇的藥物載體基質(carrier medium)。
    本發明之化合物投予方式可用口服、非口服(如：肌肉注射、腹膜注射、靜脈注射等)，取決於治療時感染的嚴重程度。
    從本發明之化合物對酵素活性之抑制作用的角度來看，可預期這些化合物亦適用於預防上，而不只是在感染的治療處理。上述之藥量不論是用在治療或預防C型肝炎或人類免疫缺乏病毒之感染上，藥量皆相同。
    下述之實施例提供本發明更進一步細節之說明，這些實施例為本發明最佳之實施例，其用以說明此發明，然非限制本發明之範圍。
    下列實施例僅代表本發明之各種態樣與特徵，並非限制本發明之範圍。 實例1：本發明化合物製備之一般方法儀器：
    利用光譜儀(Varian Unity Plus 500 1H,500 MHz；13C,125 MHz)測量NMR光譜；利用電灑法質譜儀測量MS光譜(ESI-MS,Esquire 3000Plus,Bruker Daltonik GmbH,Bremen,Germany)。 (1)製備衍生物A1~A9、KA、KB及KC之一般方法
    在0.01 mol之式(IV)化合物於無水DMF(2 mL)中加入0.011 mol之相對應的胺基酸並將混合物回流在140℃下回流10分鐘。加入5 mL水終止反應並以乙酸乙酯(3 x 5 mL)萃取。合併的乙酸乙酯餾份，以鹽水沖洗(1 x 5 mL)，以MgSO4乾燥並在真空下蒸發。利用矽膠管柱CHCl3：MeOH 9.5/0.5 v/v純化殘渣。
    2-(3-異丁基-4-(4-(3-甲基丁-2-烯氧基)苯基)-2,5-二氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-4-甲基戊酸(A1)：黃色油狀物。
    1H NMR(CDCl3,400MHz)δ 0.89(d,J=6.8 Hz,6H),0.94(d,J=6.4 Hz,6H),1.75(s,3H),1.80(s,3H),1.90(m,1H),2.06(m,1H),2.3(m,1H),2.52(d,J=7.2 Hz,2H),4.80(dd,J=4,11.6 Hz,1H),4.55(d,J=7.2 Hz,2H),5.49(m,1H),6.97(d,J=8.4 Hz,2H),7.53(d,J=8.4 Hz,2H)；13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ 18.1,20.9,22.6,22.6,23.1,25.2,25.8,28.0,31.6,32.8,36.7,37.1,50.7,64.8,114.6,119.2,121.3,130.9,137.5,138.1,138.5,159.8,163.2,170.8,171.6,173.4.ESI-MS m/z 428[M+H] + 。 2-(3-異丁基-4-(4-(3-甲基丁-2-烯氧基)苯基)-2,5-二氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3-苯基丙酸(A2)：黃色油狀物。
    1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ 0.78(d,J=6.4 Hz,6H),0.76(d,J=6.4 Hz,6H),1.76(s,3H),1.80(s,3H),1.9(m,1H),2.40(d,J=7.2 Hz,2H),3.50(m,2H),4.52(d,J=6.8 Hz,2H),5.06(t,J=7.2,16.4,1H),5.49(m,1H),6.93(d,J=8.4 Hz,2H),7.15(m,3H),7.22(d,J=6.8Hz,2H),7.39(d,J=8.4 Hz,2H).13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ18.2,22.5,22.6,25.8,27.9,32.7,34.4,53.0,64.8,114.7,119.2,121.1,126.8,128.5,128.9,130.8,136.6,137.5,138.0,138.6,159.9,170.3,171.1,174.0.ESI-MS m/z 462[M+H]+。 3-羥基-2-(3-異丁基-4-(4-(3-甲基丁-2-烯氧基)苯基)-2,5-二氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙酸(A3)：黃色油狀物。
    1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ 0.89(d,J=6.4 Hz,6H),1.75(s,3H),1.81(s,3H),2.04(m,1H),2.54(d,J=8 Hz,2H),4.12(dd,J=3.6,8.4 Hz,1H),4.23(dd,J=5.2,12 Hz,1H),4.56(d,J=6.8 Hz,2H),4.90(m,1H),5.49(t,J=6.8,13.6 Hz,1H),6.96(d,J=8.6 Hz,2H),7.50(d,J=8.8 Hz,2H).13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ18.2,22.7,25.8,27.9,28.1,32.9,33.6,54.9,61.1,64.8,64.9,114.8,115.1,118.8,119.1,120.9,130.9,131.1,138.2,138.6,138.7,160.0,,171.0,171.3,172.1.ESI-MS m/z 402[M+H]+。 3-(4-羥苯基)-2-(3-異丁基-4-(4-(3-甲基丁-2-烯氧基)-苯基)-2,5-二氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙酸(A4)：黃色油狀物。
    1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ δ 0.78(d,J=6.8 Hz,3H),0.80(d,J=6.8 Hz,3H),1.75(s,1H),1.80(s,1H),1.92(m,1H),2.41(d,J=7.2 Hz,2H),3.43(d,J=12.8 Hz,2H),4.53(d,J=6.8 Hz,2H),5.00(t,J=8.4,17.2 Hz,1H),5.48(t,J=6.8,13.6 Hz,1H),6.67(d,J=8.4 Hz,2H),6.94(d,J=9.2 Hz,2H),7.00(d,J=9.2 Hz,2H),7.40(d,J=8.4 Hz,2H)；13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ 18.2,22.5,22.6,25.8,28.0,32.7,33.6,53.1,64.8,71.1,114.7,115.4,119.2,121.1,128.6,130.1,130.9,137.6,138.1,138.7,154.4,159.9,170.4,171.2,173.7.ESI-MS m/z 478[M+H]+。 2-(3-異丁基-4-(4-(3-甲基丁-2-烯氧基)苯基)-2,5-二氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-4-(甲硫基)丁酸(A5)：黃色油狀物。
    1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ 0.89(d,J=6.8 Hz,6H),1.75(s,1H),1.81(s,1H),2.03(m,1H),2.05(s,3H),2.45(m,4H),2.50(d,J=8 Hz,2H),4.53(d,J=7.4 Hz,2H),5.00(m,1H),5.49(t,J=7.2,16.4 Hz,1H),6.97(d,J=8.8 Hz,2H),7.53(d,J=8.8 Hz,2H)；13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ 15.3,18.2,22.7,25.8,27.7,28.1,30.9,32.9,50.7,64.8,114.7,119.1,121.1,130.9,137.9,138.3,138.7,159.9,170.6,171.4,174.7.ESI-MS m/z 446[M+H]+。 3-羥基-2-(3-異丁基-4-(4-(3-甲基丁-2-烯氧基)苯基)-2,5-二氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丁酸(A6)：黃色油狀物。
    1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ 0.89(d,J=6.8 Hz,6H),1.21(d,J=6.4 Hz,3H),1.76(s,3H),1.81(s,3H),2.06(m,1H),2.55(d,J=7.6 Hz,2H),4.55(d,J=6.4 Hz,2H),4.67(dd,J=4,6.4 Hz,1H),4.88(d,J=4 Hz,1H),5.49(t,J=5.2,13.2 Hz,1H),6.99(d,J=8.4 Hz,2H),7.54(d,J=8.4 Hz,2H)；13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ 18.2,20.1,22.7,25.8,28.2,32.9,59.2,64.9,66.7,114.8,119.1,120.8,131.1,138.4,138.7,160.2,170.5,171.8,172.8.ESI-MS m/z 416[M+H]+。 2-(3-異丁基-4-(4-(3-甲基丁-2-烯氧基)苯基)-2,5-二氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3-甲基丁酸(A7)：黃色油狀物。
    1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ 0.89(d,J=6.4 Hz,6H),0.92(d,J=6.4 Hz,3H),1.12(d,J=6.4 Hz,3H),1.76(s,3H),1.80(s,3H),2.04(m,1H),2.45(m,1H),2.53(d,J=7.2 Hz,2H),2.67(m,1H),4.48(d,J=8.0 Hz,1H),4.55(d,J=6.8 Hz,1H),5.48(t,J=7.2,16.4 Hz,1H),6.97(d,J=8.4 Hz,2H),7.54(d,J=8.4 Hz,2H)；13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ 18.2,19.4,20.7,22.7,25.8,28.1,28.4,32.9,57.8,64.9,114.8,119.2,121.2,131.0,137.6,138.1,138.7,160.0,170.8,171.6,173.6.ESI-MS m/z 414[M+H]+. 2-(3-異丁基-4-(4-(3-甲基丁-2-烯氧基)苯基)-2,5-二氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯(A8)：黃色油狀物。
    1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ 0.89(d,J=6.4 Hz,6H),1.66(d,J=7.2 Hz,3H),1.76(s,3H),1.81(s,3H),2.05(m,1H),2.51(d,J=7.2 Hz,2H),4.55(d,J=6.8 Hz,2H),4.85(m,1H),5.49(m,1H),6.97(d,J=8.4 Hz,2H),7.52(d,J=8.4 Hz,2H)；13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ 15.2,18.2,22.7,25.8,28.1,32.9,47.4,64.8,114.7,119.2,121.3,131.0,137.8,138.3,138.6,159.9,170.3,171.3,173.7；ESI-MS m/z 386[M+H]+。 2-(3-異丁基-4-(4-(3-甲基丁-2-烯氧基)苯基)-2,5-二氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)戊二酸(A9)：得到黃色油狀物。
    1H NMR(CDCl3,400MHz)δ 0.88(d,J=6.8 Hz,6H),1.75(s,3H),1.80(s,3H),2.04(m,1H),2.43(br s,4H),2.52(d,J=7.2 Hz,2H),4.55(d,6.8 Hz,2H),4.84(dd,J=5.2,9.2 Hz,1H),5.49(t,J=7.2,16.4 Hz,1H),6.96(d,J=8.8 Hz,2H),7.51(d,J=8.8 Hz,2H)；13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ 18.2,22.7,23.8,25.8,28.1,30.5,32.9,50.9,64.9,114.8,119.2,121.1,131.0,137.9,138.4,138.7,160.0,170.6,171.4,174.3,177.9；ESI-MS m/z 444[M+H]+。 2-羥基-3-(3-異丁基-4-(4-(3-甲基丁-2-烯氧基)苯基)-2,5-二氧-2,5-二氫 -1H-吡咯-1-基)丙酸(KA)：黃色油狀物。
    1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ 0.87(d,J=7.2 Hz,6H),1.75(s,3H),1.81(s,3H),1.99(m,1H),2.51(d,J=7.2 Hz,2H),3.82(m,2H),4.39(dd,J=6,7.2 Hz,1H),5.49(t,J=7.2,16.4 Hz,1H),6.98(d,J=8.8 Hz,2H),7.49(d,J=8.8 Hz,2H)；13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ 18.2,22.8,25.9,28.2,32.9,33.9,64.9,114.8,119.1,121.0,130.9,138.0,138.2,138.8,145.1,151.1,160.1,170.6,171.9,172.7；ESI-MS m/z 402[M+H]+. 2-羥基-4-(3-異丁基-4-(4-(3-甲基丁-2-烯氧基)苯基)-2,5-二氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丁酸(KB)：黃色油狀物。
    1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ 0.89(d,J=6.4 Hz,6H),1.75(s,3H),1.81(s,3H),2.02(m,1H),2.20(br s,1H),2.51(d,J=7.6 Hz,2H),3.75(m,2H),4.18(br s,1H),4.55(d,J=6.8 Hz,2H),5.49(t,J=7.2,16.4 Hz,1H),6.98(d,J=8.8 Hz,2H),7.49(d,J=8.8 Hz,2H)；13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ 18.2,22.8,25.9,28.2,32.9,33.9,64.9,114.8,119.1,121.0,130.9,138.0,138.2,138.8,145.1,151.1,160.1,170.6,171.9,172.7；ESI-MS m/z 416[M+H]+。 2-羥基-3-(3-異丁基-4-(4-(3-甲基丁-2-烯氧基)苯基)-2,5-二氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3-苯基丙酸(KC)：黃色油狀物。
    1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ 0.88(d,J=6.8 Hz,6H),1.75(s,3H),1.81(s,3H),2.03(m,1H),2.53(d,J=7.2 Hz,2H),4.55(d,J=6.8 Hz,2H),4.98(d,J=4.8 Hz,1H),5.49(t,J=6.4,15.2 Hz,1H),5.85(d,J=4.8 Hz,1H),6.97(d,J=8.4 Hz,2H),7.32(m,5H),7.51(d,J=8.4 Hz,2H)；13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ 18.2,22.7,25.8,28.2,32.9,57.0,64.9,114.8,115.1,119.1,120.7,127.4,128.3,128.9,131.1,135.5,138.1,138.4,138.8,160.3,171.7,172.9,173.1；ESI-MS m/z 478[M+H]+。 (2)製備化合物A1-1~A1-6及A2-1~A2~5之一般方法
    將個別羧酸衍生物(A1-A9)(31 mmol)、胺基酸酯衍生物(34.9 mmol)及1-羥基苯并三唑水合物(38.5 mmol)之混合物溶於二甲基甲醯胺(60 mL)，接著將生成的溶液置於0℃水浴並以三乙胺(14 mL)處理，然後攪拌10分鐘。在生成的混合物中加入1-(3-(二甲基-胺基)丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(38.5 mmol)。移除水浴後，將混合物在室溫下攪拌18小時。反應物以水(200 mL)稀釋，以乙酸乙酯萃取，以無水硫酸鈉乾燥，於減壓下濃縮並利用矽膠管柱層析術純化，以己烷：乙酸乙酯9：1(v/v)沖提。 2-(2-(3-異丁基-4-(4-(3-甲基丁-2-烯氧基)苯基)-2,5-二氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-4-甲基戊醯胺基)-3-甲基-丁酸甲酯(A1-1)：黃色油狀物。
    1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ 0.87(d,J=6.4 Hz,6H),0.94(d,J=6.4 Hz,6H),1.45(m,1H),1.76(s,3H),1.81(s,3H),1.87(m,1H),2.06(m,1H),2.17(m,1H),2.90(m,1H),2.54(d,J=7.2 Hz,2H),3.72(s,3H),4.54(d,J=8 Hz,1H),4.55(d,J=6.8 Hz,2H),4.80(dd,J=4.8,10.8 Hz,1H),5.49(m,1H),6.98(d,J=8.8 Hz,2H),7.53(d,J=8.8 Hz,2H)；13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ 17.7,18.2,18.9,21.3,22.7,23.0,25.3,25.8,28.1,31.3,32.8,37.6,52.1,53.6,57.2,64.8,114.8,119.1,121.1,130.9,137.8,138.2,138.7,160.0,169.6,171.1,172.0,172.1.ESI-MS m/z 541[M+H]+。 3-(4-羥苯基)-2-(2-(3-異丁基-4-(4-(3-甲基丁-2-烯氧基)苯基)-2,5-二氧-2,5-二氫-1H-1-基)-4-甲基戊醯胺基)丙酸乙酯(A1-2)：黃色油狀物。
    1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ 0.88(d,J=6.8 Hz,9H),0.9(d,J=6.8 Hz,3H),1.28(t,J=7.2,14.4 Hz,3H),1.39(m,1H),1.76(s,3H),1.81(s,3H),2.03(m,1H),2.33(m,1H),2.51(d,J=8 Hz,2H),2.98(dd,J=6.4,14.4 Hz,1H),3.07(dd,J=6.6,14 Hz,1H),4.15(m,2H),4.55(d,J=6.4 Hz,2H),4.75(m,2H),5.49(m,1H),6.66(d,J=8.8 Hz,2H),6.93(d,J=8.8 Hz,2H),6.98(d,J=8.8 Hz,2H),7.51(d,J=8.8 Hz,2H)；13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ 14.1,18.2,21.4,22.7,22.9,25.3,25.8,28.1,32.8,37.1,37.3,53.3,53.6,61.6,64.9,114.8,115.4,119.1,121.1,127.3,130.4,131.0,137.7,138.2,138.7,154.9,160.0,169.4,171.1,171.4,171.9.ESI-MS m/z 619[M+H]+。 3-羥基-2-(2-(3-異丁基-4-(4-(3-甲基丁-2-烯氧基)-苯基)-2,5-二氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-4-甲基戊醯胺基)-丙酸甲酯(A1-3)：黃色油狀物。
    1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ 0.89(d,J=6.8 Hz,6H),0.93(d,J=6.8 Hz,6H)1.45(m,1H),1.76(s,3H),1.81(s,3H),1.88(m,1H),2.04(m,1H),2.24(m,1H),2.54(d,J=7.2Hz,2H),3.77(s,3H),3.98(m,2H),4.55(d,J=6.8 Hz,2H),4.64(m,1H),4.82(dd,J=4.4,11.2 Hz,1H),5.49(m,1H),6.98(d,J=8.8 Hz,2H),7.53(d,J=8.8 Hz,2H)；13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ 18.2,21.2,22.7,23.2,25.3,25.8,28.1,32.8,37.6,52.8,55.1,62.8,64.9,114.8,119.1,121.0,131.0,137.9,138.3,138.7,160.1,169.7,170.6,171.2,172.1.ESI-MS m/z 529[M+H]+。 1-(2-(3-異丁基-4-(4-(3-甲基丁-2-烯氧基)苯基)-2,5-二氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-4-甲基戊醯基)吡咯啶-2-羧酸甲酯(A1-4)：黃色油狀物。
    1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ 0.89(d,J=6.4 Hz,6H),0.93(d,J=6.4 Hz,6H),1.27(t,J=7.2,14 Hz,3H),1.41(d,J=6.8 Hz,3H),1.44(m,1H),1.76(s,3H),1.79(m,1H),1.81(s,3H),2.04(m,1H),2.30(m,1H),2.53(d,J=7.2 Hz,2H),4.16(q,2H),4.53(m,1H),4.55(dd,J=7.2,13.6 Hz,3H),4.77(dd,J=5.2,11.6 Hz,1H),5.49(m,1H),6.98(d,J=8.8 Hz,2H),7.53(d,J=8.8 Hz,2H)；13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ 14.1,18.2,18.4,21.3,22.7,23.1,25.4,25.8,28.0,32.9,37.6,48.4,53.3,61.5,64.9,114.8,119.2,121.2,131.0,137.7,138.2,138.7,160.0,169.1,171.2,172.0,172.7.ESI-MS m/z 539[M+H]+。 2-(2-(3-異丁基-4-(4-(3-甲基丁-2-烯氧基)苯基)-2,5-二氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-4-甲基戊醯胺基)丙酸乙酯(A1-5)：黃色油狀物。
    1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ 0.89(d,J=6.4 Hz,6H),0.96(d,J=6.4 Hz,6H),1.28(t,J=14 Hz,3H),1.46(d,J=7.2 Hz,3H)1.56(m,1H),1.71(br s,1H),1.72(s,3H),1.81(s,3H),1.98(m,2H),2.06(m,2H),2.53(d,J=7.2 Hz,2H),2.58(m,1H),3.57(m,2H),4.50(dd,J=7.2,13.6 Hz,1H),4.55(d,6.8 Hz,2H),4.91(dd,J=5.2,11.6 Hz,1H),5.49(m,1H),6.96(d,J=8.4 Hz,2H),7.51(d,J=8.4 Hz,2H)；13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ 18.2,21.3,22.7,22.7,23.2,25.1,25.2,25.8,28.1,28.8,32.9,36.4,46.8,51.6,52.3,64.8,114.7,119.2,121.3,131.0,137.5,138.0,138.6,159.9,168.6,171.1,171.8,172.4.ESI-MS m/z 527[M+H]+。N-環丙基-2-(3-異丁基-4-(4-(3-甲基丁-2-烯氧基)苯基)-2,5-二氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-4-甲基戊醯胺(A1-6)：黃色油狀物。
    1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ 0.49(br s,2H),0.75(d,J=6.8 Hz,2H),0.90(d,J=6.4 Hz,6H),0.91(d,J=6.4 Hz,6H),1.71(m,1H),1.76(s,3H),1.81(s,3H),2.02(m,1H),2.22(m,1H),2.53(d,J=7.2 Hz,2H),2.71(m,1H),4.55(d,J=6.8 Hz,2H),4.72(dd,J=5.2,7.6 Hz,1H),5.49(m,1H),6.97(d,J=8.4 Hz,2H),7.52(d,J=8.4 Hz,2H)；13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ 6.6,18.3,21.3,22.7,23.1,25.4,25.8,28.2,32.9,37.7,53.7,64.9,114.8,119.1,121.3,131.0,137.7,138.2,138.7,160.1,171.0,171.2,172.1.ESI-MS m/z 467[M+H]+。 2-(2-(3-異丁基-4-(4-(3-甲基丁-2-烯氧基)苯基)-2,5-二氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3-苯基丙醯胺基)-4-甲基-戊酸甲酯(A2-1)：黃色油狀物。
    1H NMR(CDCl3,400 MHz)(異構物的混合物)δ 0.75(d,J=6.8 Hz,3H),0.77(d,J=6.8 Hz,3H),0.94(d,J=6 Hz,6H),1.54(m,1H),1.64(m,1H),1.75(s,3H),1.77(m,1H),1.81(s,3H),1.87(m,1H),2.39(d,J=7.2 Hz,2H),3.47(m,2H),3.71(s,3H),4.53(d,J=6.4 Hz,2H),4.65(m,1H),5.02(dd,J=6.4,10.4 Hz,1H),5.48(t,J=7.6,16.7 Hz,1H),6.94(d,J=8.8 Hz,2H),7.23(d,J=8 Hz,2H),7.34(d,J=8 Hz,2H),7.36(d,J=8.8 Hz,2H).13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ 18.2,21.9,22.5,22.7,22.8,24.8,25.8,28.0,32.7,34.9,41.5,50.9,52.3,55.9,64.8,114.7,119.1,120.9,126.9,128.5,128.9,130.8,136.6,137.8,138.2,138.7,159.9,168.6,170.9,171.7,173.1；ESI-MS m/z 589[M+H]+。 2-(2-(3-異丁基-4-(4-(3-甲基丁-2-烯氧基)苯基)-2,5-二氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3-苯基丙醯胺基)-3-苯基丙酸乙酯(A2-2)：黃色油狀物。
    1H NMR(CDCl3,400 MHz)(異構物的混合物)δ 0.76(d,J=6.4 Hz,3H),0.74(d,J=6.4 Hz,3H),1.22(t,J=14Hz,3H),1.76(s,3H),1.81(s,3H),1.87(m,1H),2.38(d,J=7.2 Hz,2H),3.18(m,2H),3.40(m,2H),4.14(q,2H),4.54(d,J=6.8 Hz,2H),4.85(q,1H),4.95(dd,J=6.8,10.4 Hz,1H),5.49(t,J=7.2,16.7 Hz,1H),6.94(d,J=8.8 Hz,2H),7.09(d,J=8.4 Hz,2H),7.19(m,3H),7.34(d,J=8.8 Hz,2H),7.36(d,J=8.8 Hz,2H).13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ 14.1,18.2,22.5,22.6,25.8,27.9,32.7,34.5,37.9,53.5,55.8,61.5,64.8,114.7,119.1,120.9,126.8,12.9,128.4,128.5,128.9,129.3,130.8,135.6,136.6,137.6,138.1,138.7,159.9,168.3,170.8,171.1,171.5；ESI-MS m/z 637[M+H]+。 3-(4-羥苯基)-2-(2-(3-異丁基-4-(4-(3-甲基丁-2-烯氧基)苯基)-2,5-二氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3-苯基丙醯胺基)丙酸乙酯(A2-3)：黃色油狀物。
    1H NMR(CDCl3,400MHz)(異構物的混合物)δ 0.72(d,J=6.8 Hz,3H),0.74(d,J=6.8 Hz,3H),1.23(t,J=14 Hz,3H),1.75(s,3H),1.80(s,3H),1.85(m,1H),2.37(d,J=7.2 Hz,2H),2.90(dd,J=6.4,11.0 Hz,1H),3.08(dd,J=5.6,14 Hz,1H),3.40(m,2H),4.14(q,2H),4.54(d,J=6.4 Hz,2H),4.82(q,1H),4.95(dd,J=6.4,10.8 Hz,1H),5.49(t,J=7.2,16.7 Hz,1H),6.65(d,J=8.8 Hz,2H),6.93(d,J=8 Hz,2H),6.95(d,J=8 Hz,2H),7.15(m,3H),7.36(d,J=8.4 Hz,2H),7.36(d,J=Hz,2H).13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ 14.1,18.2,22.5,22.6,25.8,27.9,32.7,34.5,37.1,53.6,55.8,61.6,64.9,114.7,115.4,119.1,120.9,126.9,127.4,128.5,128.9,130.5,130.9,136.5,137.6,138.1,138.7,154.8,159.9,168.5,170.8,171.2,171.5；ESI-MS m/z 653[M+H]+。 1-(2-(3-異丁基-4-(4-(3-甲基丁-2-烯氧基)苯基)-2,5-二氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3-苯基丙醯基)吡咯啶-2-羧酸甲酯(A2-4)：黃色油狀物。
    1H NMR(CDCl3,400MHz)δ 0.78(d,J=6.4 Hz,3H),0.82(d,J=6.4 Hz,6H),1.75(s,3H),1.80(s,3H),1.91(m,2H),2.06(m,2H),2.41(d,J=7.2 Hz,2H),3.37(m,2H),3.58(m,2H),3.71(s,3H),4.50(dd,J=Hz,1H),4.54(d,J=6.4 Hz,2H),5.07(dd,J=Hz,1H),5.48(m,1H),6.92(d,J=8.4 Hz,2H),7.12~7.24(m,5H),7.39(d,J=8.4 Hz,2H)；13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ 18.2,22.5,22.7,24.9,25.8,27.9,28.7,32.7,34.3,46.9,52.3,53.9,59.4,64.8,114.7,119.2,121.1,126.7,128.7,129.3,130.9,137.2,137.3,137.8,138.7,159.9,167.4,170.5,171.2,172.6.ESI-MS m/z 573[M+H]。N-環丙基-2-(3-異丁基-4-(4-(3-甲基丁-2-烯氧基)苯基)-2,5-二氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3-苯基丙醯胺基(A2-5)：黃色油狀物。
    1H NMR(CDCl3,400MHz)δ 0.49(br s,2H),0.72(d,J=6.8 Hz,2H),0.76(d,J=6.8 Hz,12H),1.75(s,3H),1.81(s,3H),1.85(m,2H),2.66(d,J=7.6 Hz,2H),2.72(m,1H),3.45(m,2H),4.53(d,J=7.2 Hz,2H),4.94(dd,J=5.2,10.8 Hz,1H),5.49(m,1H),6.94(d,J=8.4 Hz,2H),7.14(m,3H),7.20(d,J=8 Hz,2H),7.35(d,J=8.4 Hz,2H)；13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ 6.5,6.6,18.2,22.5,22.6,22.8,25.8,27.9,32.7,34.9,56.3,64.8,114.8,119.1,120.9,126.9,128.6,128.9,130.8,136.6,137.7,138.1,138.7,159.9,170.2,171.1,171.7.ESI-MS m/z 501[M+H]+。 (3)製備化合物KA-1~KA-4、KB-1及KC-1~KC-3之一般方法
    第一步驟係使用與製備化合物A1-1相同方法以得到化合物KA-1~KA-4、KB-1及KC-1~KC-3。不經純化，在前述步驟產物(1.6 mmol)於無水二氯甲烷(70 mL)中加入戴斯-馬丁氧化劑(Dess-Martin periodinane，2.4 mmol)並將混合物攪拌18小時。加入10%硫代硫酸鈉(35 mL)與飽和碳酸氫鈉水溶液(35 mL)並攪拌30分鐘以終止反應。分離氯仿層並以鹽水(1x10 mL)清洗並於真空中蒸發。生成的化合物利用己烷：乙酸乙酯9.5：0.5(v/v)以矽膠管柱純化。 2-(3-(3-異丁基-4-(4-(3-甲基丁-2-烯氧基)苯基)-2,5-二氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2-氧代丙醯胺基)-3-甲基丁酸甲酯(KA-1)：黃色油狀物。
    1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ 0.90(d,J=6.4 Hz,6H),0.96(d,J=6.4 Hz,6H),1.76(s,3H),1.81(s,3H),2.07(m,1H),2.24(m,1H),2.55(d,J=7.2 Hz,2H),3.8(s,3H),4.50(dd,J=4.8,8.8 Hz,1H),4.55(d,J=6.8 Hz,1H),4.96(s,2H),5.49(t,J=7.2,16 Hz,1H),6.98(d,J=9.2 Hz,2H),7.53(d,J=8.8 Hz,2H)；13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ 17.7,18.2,18.9,22.7,25.8,28.1,31.4,32.9,43.9,52.4,57.2,64.9,114.8,119.2,121.2,130.9,138.2,138.6,138.7,158.5,160.0,170.5,170.9,171.3,190.3.ESI-MS m/z 513[M+H]+。 2-(3-(3-異丁基-4-(4-(3-甲基丁-2-烯氧基)苯基)-2,5-二氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2-氧代丙醯胺基)-3-苯基丙酸乙酯(KA-2)：黃色油狀物。
    1H NMR(CDCl3,400MHz)δ 0.90(d,J=6.4 Hz,6H),1.23(t,J=6.8,14 Hz,3H),1.76(s,3H),1.81(s,3H),2.06(m,1H),2.54(d,J=7.2 Hz,2H),3.15(d,J=6 Hz,2H),4.18(m,2H),4.55(d,J=6.4 Hz,1H),4.82(m,1H),4.92(s,2H),5.49(m,1H),6.98(d,J=8.8 Hz,2H),7.12(d,J=8 Hz,2H),7.26(m,3H),7.53(d,J=8.8 Hz,2H)；13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ 14.1,18.3,22.7,25.8,28.1,32.9,38.0,43.8,53.2,61.9,64.9,114.8,119.2,121.2,127.4,128.7,129.2,130.9,135.0,138.3,138.6,138.7,158.2,160.0,170.1,170.5,171.2,190.1.ESI-MS m/z 575[M+H]+。 2-(3-(3-異丁基-4-(4-(3-甲基丁-2-烯氧基)苯基)-2,5-二氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2-氧代丙醯胺基)丙酸乙酯(KA-3)：黃色油狀物。
    1H NMR(CDCl3,400MHz)δ 0.91(d,J=6.8 Hz,6H),1.28(t,J=7.2,14 Hz,3H),1.46(d,J=7.2 Hz,3H),1.76(s,3H),1.81(s,3H),2.07(m,1H),2.54(d,J=7.6 Hz,2H),4.23(q,2H),4.56(d,J=6.4 Hz,2H),4.92(s,2H),5.49(t,J=7.2,16.7 Hz,1H),6.99(d,J=8.4 Hz,2H),7.53(d,J=8.4 Hz,2H)；13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ 14.1,18.1,18.3,22.7,25.8,28.1,32.9,43.8,48.1,61.9,64.9,114.8,119.2,121.2,130.9,138.2,138.6,138.7,158.1,160.0,170.5,171.3,171.5,190.3.ESI-MS m/z 499[M+H]+。N-環丙基-3-(3-異丁基-4-(4-(3-甲基丁-2-烯氧基)苯基)-2,5-二氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2-氧代丙醯胺(KA-4)：黃色油狀物。
    1H NMR(CDCl3,400MHz)δ 0.62(br s,2H),0.85(d,J=5.6 Hz,2H),0.91(d,J=6.4 Hz,6H),1.76(s,3H),1.81(s,3H),2.07(m,1H),2.55(d,J=7.2 Hz,2H),2.78(m,1H),4.55(d,J=6.8 Hz,2H),4.96(s,2H),5.49(t,J=7.2,16 Hz,1H),6.98(d,J=8.8 Hz,2H),7.52(d,J=8.8 Hz,2H)；13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ 6.5,18.2,22.4,22.7,25.8,28.1,32.9,43.8,64.9,114.8,119.2,121.2,130.9,138.2,138.5,138.7,160.0,160.1,171.3,190.9.ESI-MS m/z 439[M+H]+。N-環丙基-4-(3-異丁基-4-(4-(3-甲基丁-2-烯氧基)苯基)-2,5-二氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2-氧代丁醯胺(KB-1)：黃色油狀物。
    1H NMR(CDCl3,400MHz)δ 0.59(br s,2H),0.83(d,J=5.6 Hz,2H),0.89(d,J=6.4 Hz,6H),1.76(s,3H),1.81(s,3H),2.03(m,1H),2.49(d,J=7.6 Hz,2H),2.76(m,1H),3.2(t,J=6.8,13.6 Hz,2H),3.9(t,J=6.8,13.6 Hz,2H),4.55(d,J=6.8 Hz,2H),5.49(t,J=7.2,16 Hz,1H),6.97(d,J=8.8 Hz,2H),7.49(d,J=8.8 Hz,2H)；13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ 6.5,18.2,22.4,22.7,25.8,28.1,32.8,32.9,35.8,64.8,114.7,119.2,121.3,130.9,137.9,138.2,138.7,159.9,160.9,171.0,171.7,196.6.ESI-MS m/z 453[M+H]+。 2-(3-(3-異丁基-4-(4-(3-甲基丁-2-烯氧基)苯基)-2,5-二氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2-氧基-3-苯基丙醯胺基)-3-苯基丙酸乙酯(KC-1)：黃色油狀物。
    1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ 0.88(d,J=6.4 Hz,3H),0.91(d,J=6.4 Hz,3H),1.20(t,J=7.2,14 Hz,3H),1.76(s,3H),1.80(s,3H),2.04(m,1H),2.51(d,J=7.2 Hz,2H),3.11(m,2H),4.14(q,J=Hz,2H),4.53(d,J=6.8 Hz,2H),4.72(m,1H),5.49(t,J=7.2,16 Hz,1H),6.30(s,1H),6.35(s,1H),6.95(d,J=8.8 Hz,2H),7.28(br s,5H),7.36(br s,5H),7.51(d,J=8.8 Hz,2H)；ESI-MS m/z 651[M+H]+。 2-(3-(3-異丁基-4-(4-(3-甲基丁-2-烯氧基)苯基)-2,5-二氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2-氧基-3-苯基丙醯胺基)丙酸乙酯(KC-2)：黃色油狀物。
    1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ 0.88(d,J=6.4 Hz,6H),1.25(t,J=7.2,14 Hz,3H),1.41(d,J=6.8 Hz,3H),1.76(s,3H),1.80(s,3H),2.04(m,1H),2.51(d,J=7.2 Hz,2H),4.19(m,2H),4.44(m,1H),4.53(d,J=6.8 Hz,2H),5.49(t,J=7.2,16 Hz,1H),6.3(s,1H),6.32(s,1H),6.95(d,J=8.8 Hz,2H),7.36(br s,5H),7.51(d,J=8.4 Hz,2H)；13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ 14.1,17.9,17.9,18.2,22.7,25.8,28.1,32.9,48.2,48.3,58.6,61.7,61.8,64.9,114.8,119.2,121.1,121.2,128.7,128.9,129.2,129.3,130.9,131.0,133.7,138.1,138.4,138.5,138.7,158.9,159.1,159.9,171.3,171.5,191.4.ESI-MS m/z 575[M+H]+。 (4)化合物A1~A9、A1-1~A1-5及A2-1~A2-4係根據方案1概述的流程製備如下：方案1
    反應條件：(a)胺基酸，DMF，1400℃；(b)胺基酸酯，DMF，HOBT，三乙胺，0℃，EDC，室溫，18小時。
    方案1之代表化合物係如下表1、2所列。
    (5)化合物KA~KC、KA-1~KA-3及KC-1~KC-2係根據方案2概述的流程製備如下：方案2
    反應條件：(a)胺基酸，DMF，140℃；(b)胺基酸酯，DMF，HOBT，三乙胺，0℃，EDC，室溫，18小時；(c)戴斯-馬丁氧化劑，CH2Cl2，室溫，18小時。
    方案2之代表化合物係如下表3-5所列。

    (6)化合物KB-1、KC-3、A1-6及A2-5係根據方案2概述的流程製備如下：方案3
    反應條件：(b)胺基酸酯，DMF，HOBT，三乙胺，0℃，EDC，室溫，18小時；(c)戴斯-馬丁氧化劑(Dess-martin periodinane)，CH2Cl2，室溫，18小時。
    方案3之代表化合物係如下表6-8所列。

    (7)關於式(I)化合物中R3取代基，可根據Stewart et al.,2007,A concise synthesis of maleic anhydride and maleimide natural products found in Antrodia camphorate.Tetrahedron Letters,48,2241-2244及Cheng et al.,2008,Total synthesis of(±)-camphorataimides and(±)-himanimides by NaBH4/Ni(OAc)2 or Zn/AcOH stereoselective reduction.Tetrahedron,64,4347-4353所述之方法製備而得。 實例2：HCV蛋白酶分析
    此處使用HCV蛋白酶分析以研究上述製備的化合物之HCV蛋白酶抑制活性，方法詳見D.T.Phuong,C.M.Ma,M.Hattori and J.S.Jin：Inhibitory Effects of Antrodins A-E from Antrodia cinnamomea and Their Metabolites on Hepatitis C Virus Protease.Phytotherapy Research,23,582-584,2009。將2毫升化合物溶液(使用DMSO作為溶液)置於384孔盤中，接著將8毫升重組HCV NS3/4A蛋白酶(0.5 μg/mL)加入含有樣本的孔中並搖晃該盤。最後加入10毫升新鮮製備的基質(Ac-Asp-Glu-Dap(QXLTM520)-Glu-Glu-Abu-COO-Ala-Ser-Cys(5-FAMsp)-NH2)(DMSO原液稀釋100x)並連續的旋轉震盪。將反應混合物在37℃下培養30分鐘，於自動化測光儀(TECAN GENios plate reader)進行螢光分析，用485nm波長激發偵測化合物發出之530nm螢光波長。每個測試化合物進行三重複試驗，利用下列公式計算HCV-PR抑制百分比(%)：抑制百分比=(F載體控制組-F基質控制組)x100/F載體控制組
    其中F為載體控制組或樣本的螢光值減掉基質控制組的螢光值，結果如下方表9所示。
    另外，亦使用二肽基肽酶IV(dipeptidyl peptidase-IV，DPPIV)分析以研究上述製備的化合物之二肽基肽酶IV抑制活性，方法詳見Lin et al.,1998,Inhibition of dipeptidyl peptidase IV by fluoroolefin-containing N-peptidyl-O-hydroxylamine peptidomimetics.Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.95,pp.14020-14024。抑制百分比(%)係以下列公式計算：抑制百分比=[(1-vi/v0)]x 100
    其中vi與v0分別為加入與不加待測化合物之Vmax值，結果如表10所示。

    註：1. 表示連接的位置；2.正控制組(HCV蛋白酶抑制劑I(Anaspec)為1.5 μM)；3. *代表相同化合物兩個獨立實驗的值。
    根據表9及表10的結果，化合物A1至A9及KA至KC大部分對HCV蛋白酶與DPPIV有顯著的抑制，IC50值從5 μM到27 μM。其他化合物則抑制活性較低，不過這些化合物只要劑量足夠多，仍可用於治療或預防HCV感染。 實例3：分離自牛樟芝菌絲體之新化合物(式(XIII)化合物)
    由牛樟芝菌絲體製備酒精萃取物(450 g)，利用矽膠管柱層析術分離萃取物並區分為Fr.1-Fr.10。此外，含有化合物4的Fr.9係以矽膠管柱層析術分離以得到Fr.12，利用LC-MS分析Fr.12。新化合物伴隨著已知的化合物4及5經由HPLC分離後確認(圖1-3)。
    分離出的新化合物為黃色油狀化合物，聚有分子式：C19H23O4N([M]+ m/z 329.16271，HR-EI-MS)，比旋光度：[α]23 D±0°(c 0.276,CHCl3)。UV光譜顯示最大吸收波長為280 nm，表示分子中有苯環存在。此外，根據IR光譜分析，預測有羥基(3019 cm-1)與羰基(1714 cm-1)存在。
    最後以1H-NMR、13C-NMR(表11)以及HMBC、HMQC光譜測定新化合物的結構(圖4)。
    表11、CDCl 3中新化合物之 1H-NMR與 13C-NMR光譜數據(分別為300 MHz及75MHz)
    新化合物的結構係如式(XIII)所示。
    根據具有掌性管柱的HPLC分析，式(XIII)化合物具有兩個滯留時間非常接近的波峰(圖5)。MS2光譜圖在m/z 330於MS(MS1)光譜兩者幾乎相同(圖6)。
    根據旋光值±0°，式(XIII)化合物確認為消旋形式，因此曲線表示式(XIII)化合物為(4S)-與(4R)-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]衍生物比例1：1的消旋混合物。此外，在H-1'及H-4之間發現可測得的核歐佛豪瑟效應(Nuclear Overhauser Effect，NOE)，顯示在C-1'與C-3具有Z型的環外雙鍵(exo-cyclic double bond)。
    以酒精萃取樟芝菌絲體分離出新的式(XIII)化合物在側鏈具有雙鍵，該結構係由光譜方式測定。為了進一步確認，將樟芝菌絲體粉末以不同的有機溶劑CHCl3萃取並利用LC-MS以相同方式分析，確認具有相同的波峰，這些結果顯示式(XIII)化合物可以被兩種溶劑萃取而得，CHCl3與酒精萃取之間並無重大差異。 實例4：以NS3/4A HCV蛋白酶抑制分析測定式(XIII)化合物的抑制活性
    當敏感的細胞被HCV病毒感染，一些前體蛋白質(precursor proteins)在細胞質中會被未包覆的病毒RNA轉譯出來，蛋白酶會將這些前體蛋白質修飾成不同的病毒蛋白，在這些病毒蛋白中，NS3(一種絲胺酸蛋白酶及RNA解旋酶)是一種重要的非結構蛋白，與病毒蛋白成熟及病毒基因體複製相關。
    在此分析中，製備蛋白質(FRET)並以螢光蛋白5-FAM修飾作為基質而QXLTM520作為淬火劑(quencher)，將基質與NS3/4A HCV蛋白酶及測試樣本一起培養，並依據圖7所示的機制(C.M.Ma,Y.Wei,Z.G.Wang and M.Hattori：Triterpenes from Cynomorium Songaricium-analysis of HCV Protease Inhibitory Activity,Quantification and Content Change Under the Influence of Heating.J.Nat.Med.,63,9-14,2009)測量螢光強度。在此分析中，使用HCV NS3蛋白酶抑制劑2作為正控制組， 結果：
    針對式(XIII)化合物，50% NS3/4A HCV蛋白酶抑制濃度係顯示於表12。
    實例5：以HIV-1蛋白酶抑制分析測定式(XIII)化合物與化合物1-5之抑制活性。
    HIV為一種具有單股RNA基因體的反轉錄病毒，HIV蛋白酶是複製的重要酵素，宿主細胞中的轉譯蛋白質藉由酵素切成適當地形狀。HIV蛋白酶係一種由99個胺基酸組成的蛋白質二聚體，其活性中心為Asp殘基。
    在本分析中，具有增強吸光度的寡肽(His-Lys-Ala-Arg-Val-Leu-Phe(NO2)-Glu-Ala-NLe-Ser-NH2)係製備為基質，其Asp殘基之對位係修飾為硝基。將基質與HIV-1蛋白酶及測試樣品一起培養，水解產物(Phe(NO2)-Glu-Ala-NLe-Ser-NH2)的產生比例係由HPLC分析，並偵測測試樣品的HIV-1抑制活性(Y.Wei,C.M.Ma,D.Y.Chen and M.Hattori：Anti-HIV-1 Protease Triterpenoids from Stauntonia Obovatifoloala Hayata Subsp.Phytochemistry,69,1875-1879,2008)。在本分析中，使用抑肽素(pepsatatin A)作為正控制組。 結果：
    式(XIII)化合物與化合物1-5(樟芝菌絲體的成份，US專利號：7109232)之抑制活性係以抗HIV-1蛋白酶之50%抑制濃度(IC50)表示(表13)。
    化合物4有最高的抑制活性，接著是化合物3、然後是式(XIII)化合物及化合物2。化合物5為化合物4的結構異構物，但兩者具有不同的活性。雖然化合物1的活性最低，不過只要劑量足夠多，仍可用於治療或預防HIV感染。
    圖1、由牛樟芝菌絲體酒精萃取物中分離出的成份。
    圖2、Fr.12之HPLC圖譜。
    圖3、式(XIII)化合物之MS光譜。
    圖4、式(XIII)化合物之2D NMR相關性。粗線：1H-1H COSY；單向箭號：HMB相關；雙向箭號：NOE相關。曲線表示式(XIII)化合物為(4S)-與(4R)-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]衍生物1：1之外消旋混合物，這部份經過旋光值[α]D=0確認。
    圖5、式(XIII)化合物之掌性管柱色譜。管柱：SHISEIDO FINE CHEMICALS Chiral CD-Ph Packed Column(4.6 i.d.×250 mm)溫度：30℃；轉移層：CH3CN-0.1%醋酸=20：80→100：0；流速：0.5 mL/min，偵測：ESI-MS(+)。
    圖6、兩個波峰之MS2光譜。
    圖7、NS3/4A HCV蛋白酶抑制分析之原理。當5-FAMsp分開時產生螢光而偵測其螢光強度。
    权利要求:
    Claims (12)
    [1] 一種式(I)化合物 其中R1係或H；R2係選自以下群組：群組(A)： 群組(B)： 群組(C)： 群組(D)：群組(E)： R3係C1-10烷基、C2-10烯基、芐基(benzyl)或4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基，表示連接的位置，或其醫藥上可接受的鹽類或前藥。
    [2] 如申請專利範圍第1項所述之化合物，其R1係；R2係選自以下群組：群組(A)： 群組(B)： 群組(C)： 群組(D)： 群組(E)： R3係異丁基，其中表示連接的位置。
    [3] 如申請專利範圍第1項所述之化合物，其R1係H；R2係選自以下群組：群組(A)： 群組(B)： 群組(C)： 群組(D)： 群組(E)： R3係異丁基，其中表示連接的位置。
    [4] 一種式(II)化合物 其中R1係C1-10烷氧基、C2-10烯氧基或C2-10炔氧基；及R2係C1-10烷基或C2-10烯基，或其醫藥上可接受的鹽類或前藥。
    [5] 如申請專利範圍第4項所述之化合物，其中該化合物係
    [6] 一種用於治療或預防C型肝炎病毒(HCV)感染之醫藥組合物，其包含一有效劑量之活性成份選自：(1)一如申請專利範圍第1項之化合物；或(2)一式(II)化合物 其中R1係C1-10烷氧基、C2-10烯氧基或C2-10炔氧基；及R2係C1-10烷基或C2-10烯基，及一醫藥上可接受載體。
    [7] 如申請專利範圍第6項之醫藥組合物，其中該活性成份係
    [8] 如申請專利範圍第6項之醫藥組合物，其中該活性成份為式(XIV)化合物 其中R係 其中表示連接的位置。
    [9] 如申請專利範圍第8項之醫藥組合物，其中R係
    [10] 一種用於治療或預防人類免疫缺乏病毒(HIV)感染之醫藥組合物，其包含一有效劑量之活性成份選自：(1)一式(II)化合物 其中R1係C1-10烷氧基、C2-10烯氧基或C2-10炔氧基；及R2係C1-10烷基或C2-10烯基；或(2)一式(III)化合物 其中代表一單鍵或雙鍵；X係N或O；R1係C1-10烷氧基、C2-10烯氧基或C2-10炔氧基；R2係H、C1-10烷基、C2-10烯基或C2-10炔基；及R3係不存在、H或羥基；其限制條件為若X係O，R3係不存在，及一醫藥上可接受載體。
    [11] 如申請專利範圍第10項之醫藥組合物，其中該活性成份為
    [12] 如申請專利範圍第10項之醫藥組合物，其中該活性成份為3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2,5-二酮；3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮；3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2,5-二酮；(3R*,4S*)-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮；或(3R*,4R*)-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮。
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    法律状态:
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    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    US201161547891P| true| 2011-10-17|2011-10-17||
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