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    一種式(I)喹啉衍生物：□其中，R1為視需要經取代之苯基；R2為鹵素；以及R3為視需要經取代之苯基，且該苯基之苯環可視需要含一N雜原子。該喹啉衍生物可有效抑制癌細胞增生，可用於治療癌症，尤其可用於治療與Janus激酶-轉錄訊息轉換子及活化子(JAK-STAT)途徑及/或有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑有關之癌症。
    公开号:TW201316988A
    申请号:TW100137676
    申请日:2011-10-18
    公开日:2013-05-01
    发明作者:Kuo-Yuan Hwa；Yu-May Lee；Yeh-Long Chen；Cherng-Chyi Tzeng；Hsin-Yuan Cho
    申请人:Univ Nat Taipei Technology；
    IPC主号:C07D215-00
    专利说明:
    喹啉衍生物及其應用
    本發明係關於一種喹啉衍生物及其應用，尤其關於一種可使用於癌症治療之喹啉衍生物及其應用。
    癌症可於任何年齡在各種器官及組織中發生，且每年造成全世界約六百萬人死亡。所有癌症類型均始於細胞異常且不受控制地生長，其病程包括異常或贅生性細胞形成腫瘤且數目增多，該腫瘤接著侵入鄰近組織，並經由血液或淋巴系統散布至區域性淋巴結，最終經由轉移過程散布至體內遠處。癌症的病因迄今仍不明確，但已知諸如遺傳、染色體斷裂、病毒、環境及免疫疾病等因素，均與腫瘤細胞生長及轉移有關。
    關於癌症治療，業已開發出各種治療手段，包括外科手術、放射線治療與化學藥物治療等。使用外科手術以移除癌變組織為一種激烈的手段，除可能造成嚴重後果外，亦可能無法根除癌細胞。舉例言之，子宮頸癌及膀胱癌之手術治療可能導致不孕症或性功能障礙；胰腺癌之手術程序須部分或全部移除胰腺，對患者代謝功能造成嚴重破壞；前列腺癌之手術具有造成尿失禁的風險；肺癌手術治療則因為須切開患者之肋骨以移除癌性肺組織，故通常會有顯著之術後疼痛等問題。
    放射線治療係利用具有穿透力的高能波光束或粒子光束作用於腫瘤部位，以殺死癌細胞或阻止其成長及增殖。然而，正常細胞在放射線治療同時亦會受到影響、甚至死亡，進而產生如疲倦、落髮、免疫系統異常、及食慾不振等副作用。
    目前已開發出許多抗癌藥物(例如5-氟尿嘧啶、賀癌平和泰嘉錠等)以用於進行化學藥物治療，這些藥物經由口服、肌肉注射、或靜脈點滴注射等方式投藥而達到治療目的。惟，目前臨床上之抗癌藥物仍無法達到令人滿意之專一性程度，患者於進行化療時，體內的正常細胞往往一併被毒殺，因而嚴重影響生理機能，並產生許多副作用。
    鑒於目前習知之癌症療法仍具有如上述之諸多限制與缺點，因此，仍須要研發更有效之癌症治療方法或藥物。本發明即係針對上述需求所為之研究。本案發明人開發出一種可有效抑制癌細胞增生之喹啉衍生物，其可應用於治療癌症。
    本發明之一目的在於提供一種式(I)喹啉衍生物：
    其中，R1為視需要經取代之苯基；R2為鹵素；以及R3為視需要經取代之苯基，且該苯基之苯環可視需要含一N雜原子。
    本發明之另一目的在於提供一種醫藥組合物，其係包含一醫藥可接受載劑及治療有效量之式(I)喹啉衍生物及其醫藥可接受之鹽類及酯類。
    本發明之又一目的在於提供一種使用式(I)喹啉衍生物及其醫藥可接受之鹽類與酯類於製造治療癌症之藥劑之用途。
    本發明之詳細技術及較佳實施態樣，將描述於以下內容中，以供本發明所屬領域具通常知識者據以明瞭本發明之特徵。
    於本文中(尤其後附申請專利範圍中)，除非另外說明，所使用之「一」、「該」及類似用語應理解為包含單數及複數形式。
    本發明係提供一種式(I)喹啉衍生物：
    其中，R1為視需要經取代之苯基；R2為鹵素；以及R3為視需要經取代之苯基，且該苯基之苯環可視需要含一N雜原子。
    於本發明式(I)喹啉衍生物中，較佳地，R1為視需要經取代之；R3為視需要經取代之，且R4為氫、烷氧基或鹵素。該烷氧基可為例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、或芳氧基等。
    本發明喹啉衍生物之具體態樣，包括選自以下群組者：

    本發明喹啉衍生物，可由6,7-二氟-1-(4-硝基苯基)-4-側氧基-1,4-二氫喹啉-3-羧酸或6,7-二氟-1-(2-氟-4-硝基苯基)-4-側氧基-1,4-二氫喹啉-3-羧酸作為起始物，並經由氫化、聯胺化、以及與對應之芳基醛類反應而製得本發明化合物。舉例言之，可將上述起始物溶於二氯甲烷中，再於常溫常壓下之氫氣氛圍中以鈀/碳作為催化劑而進行氫化。氫化反應完成並進行純化後，將所得產物與溶於吡啶中之聯胺單水合物混合，並加熱混合物以進行聯胺化。聯胺化反應完成並進行純化後，將產物溶於乙醇中並添加對應之芳基醛類，再將所得混合物進行加熱一段時間後進行純化，即可製得本發明喹啉衍生物。
    本發明喹啉衍生物可有效抑制癌細胞增生，故可用於治療癌症。如後附實施例所示，本發明喹啉衍生物具有與臨床上使用之抗癌藥物雷帕黴素(Rapamycin)相近、甚至更為優異之抑制人類癌細胞的活性，且本發明喹啉衍生物之分子量較小，有助於生物體吸收並到達癌細胞部位，故可開發為新一代之抗癌藥物或標靶藥物。
    因此，本發明亦提供一種醫藥組合物，其係包含一醫藥可接受載劑及治療有效量之式(I)喹啉衍生物及其醫藥可接受之鹽類及酯類。所謂「治療有效量之式(I)喹啉衍生物及其醫藥可接受之鹽類及酯類」，係指式(I)喹啉衍生物及其醫藥可接受之鹽類及酯類之總量達可提供所欲治療效果者，包括由式(I)喹啉衍生物及其醫藥可接受之鹽類及酯類之一或多種所提供之態樣。該式(I)喹啉衍生物係如上文所述。
    式(I)喹啉衍生物具有至少一可解雜質子(例如羧酸基之質子)，使其可與一合適的有機或無機鹼形成一醫藥可接受之鹼加成鹽類。該無機鹼之例子包括：銨、鹼金屬或鹼土金屬之氫氧化物(如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨)、碳酸化物(如碳酸鉀)、重碳酸化物或其他類似物等；該有機鹼之例子包括：烷氧化物、烷醯胺、烷基與芳香基胺及其他類似物等。
    式(I)喹啉衍生物之醫藥可接受酯類，係指式(I)喹啉衍生物在官能基(例如羧酸基)上酯化而提供可在體內轉化回原化合物之酯類衍生物，包括任何生理可接受或易代謝之酯類衍生物。
    本發明醫藥組合物可使用於獸醫與人類醫藥上，且可呈任何形式，並以任何合宜之方式施用。舉例言之，但不以此為限，該醫藥組合物可以口服、皮下、或靜脈內注射等投藥方式施用之。視使用形式及用途而定，可於本發明醫藥組合物中包含一醫藥可接受載劑。
    以製備適於口服投藥之藥劑形式為例，可於本發明醫藥組合物中含有不會不利影響所使用之式(I)喹啉衍生物或其鹽類或酯類之醫藥可接受載劑，例如：溶劑、油性溶劑、稀釋劑、安定劑、吸收延遲劑、崩散劑、乳化劑、抗氧化劑、黏合劑、潤滑劑、吸濕劑等。可利用任何合宜之方法，將該組合物製成適於口服投藥的形式，例如：錠劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、流浸膏劑、溶液劑、糖漿劑、懸液劑、乳劑、及酊劑等等。
    至於適於皮下或靜脈內注射之藥劑形式，則可於本發明醫藥組合物中含有一或多種例如pH值調整劑、等滲透壓劑或安定劑等添加劑，以及如等張溶液、注射用水、生理食鹽水或鹽類緩衝液(如磷酸鹽緩衝液或檸檬酸鹽緩衝液)等溶劑，以製成如靜脈輸注液、乳劑靜脈輸注液、乾粉注射劑、懸液注射劑、或乾粉懸液注射劑等。
    本發明醫藥組合物可視需要另含有調味劑、調色劑、著色劑等添加劑，以提高所得藥劑服用時的口適感及視覺感受；另可添加適當之保存劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑等，以改善所得藥劑的儲存性。
    視需要地，可於本發明醫藥組合物中併含一或多種其他活性成分，以進一步加強組合物之功效或增加製劑配方的運用靈活性與調配度。舉例言之，可於本發明醫藥組合物中含有一或多種抗癌成分，只要該抗癌成分對所使用之式(I)喹啉衍生物或其鹽類或酯類之效益沒有不利的影響即可。
    基於式(I)喹啉衍生物之抗癌活性，本發明醫藥組合物可用於治療癌症，例如用於治療大腸癌與乳癌。可以一日一次、一日多次、或數日一次等不同投藥頻率施用本發明醫藥組合物，端視投予標的之需求而異。
    有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑是引導細胞回應的重要細胞訊息傳遞系統，其參與細胞生長、發育、分裂、死亡、以及細胞間的功能同步等多種生理反應，並在細胞發生惡性轉化(例如癌細胞之產生)的病理過程中扮演重要角色。有絲分裂原活化蛋白激酶是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，包括細胞外訊息調節蛋白激酶(ERK)、C-Jun N端激酶(JNK)與p38。另一種與細胞生理反應及病理機制有關之訊息傳遞系統為傑納斯激酶-轉錄訊息轉換子及活化子(JAK-STAT)途徑，其主要是由各種細胞因子與受體結合而二聚體化，傑納斯激酶接著靠近二聚體並磷酸化，使受體上的酪氨酸殘基磷酸化，再透過轉錄訊息轉換子及活化子形成二聚體後與受體分離，並轉移到細胞核內結合至DNA序列，從而調控基因表現。
    於不受任何理論之限制下，咸信本發明組合物可透過傑納斯激酶-轉錄訊息轉換子及活化子途徑及/或有絲分裂原活化蛋白激酶途徑達成抑制癌細胞之效果。因此，本發明醫藥組合物可用於治療與傑納斯激酶-轉錄訊息轉換子及活化子途徑及有絲分裂原活化蛋白激酶途徑之至少一者有關之癌症。
    本發明亦關於一種使用式(I)喹啉衍生物及其醫藥可接受之鹽類與酯類於製造治療癌症之藥劑之用途。其中，式(I)喹啉衍生物係如上文所述。於一實施態樣中，該藥劑係用於治療大腸癌與乳癌。於另一實施態樣中，該藥劑係用於治療與傑納斯激酶-轉錄訊息轉換子及活化子途徑及有絲分裂原活化蛋白激酶途徑之至少一者有關之癌症。
    茲以下列具體實施態樣以進一步例示說明本發明。其中該些實施態樣僅提供作為說明，而非用以限制本發明之範疇。 實施例[化合物分析方法]
    以Electrothermal IA9100熔點分析儀(購自Clarkson Laboratory公司)測定化合物熔點。核磁共振(NMR)光譜(1H及13C)係以Varian Gemini 200光譜儀或Varian-Unity-400光譜儀(購自Varian公司)測量與記錄。化學位移以「δ」表示，並以四甲基矽烷(TMS)作為內標準。薄層色層分析係於矽膠60 F-254板(購自E. Merck and Co.公司)上進行。使用台灣國立成功大學內的行政院國家科學委員會儀器中心及台灣國立中興大學的Heraeus CHN-O Rapid元素分析儀(購自Heraeus公司)進行元素分析，所有數值皆於±0.4%的理論組成(theoretical composition)內。 [製備例]
    本發明化合物係以如下流程圖所示之方法而製備，下文將詳細說明化合物之製備方法：
    A.　製備1-(4-胺基苯基)-6,7-二氟-4-側氧基-1,4-二氫喹啉-3-羧酸(化合物3)或1-(4-胺基-2-氟苯基)-6,7-二氟-4-側氧基-1,4-二氫喹啉-3-羧酸(化合物4)
    將0.69公克(2毫莫耳)之6,7-二氟-1-(4-硝基苯基)-4-側氧基-1,4-二氫喹啉-3-羧酸(化合物1)或6,7-二氟-1-(2-氟-4-硝基苯基)-4-側氧基-1,4-二氫喹啉-3-羧酸(化合物2)溶於二氯甲烷(100毫升)(化合物1及2之製備方法可參見Chen et al.,J. Med. Chem.,2001,44,2374-2377，該文獻全文併於此處以供參考)中，於常溫常壓下，在氫氣氛圍中以鈀/碳(0.23公克)進行氫化歷時4小時(以薄層色層分析監控)。過濾反應混合物，並於真空中濃縮過濾物，得到一殘餘固體，再以驟沸管柱色層分析(FC，矽膠，甲醇：二氯甲烷=1：50)進行純化，並自乙醇中再結晶，製得1-(4-胺基苯基)-6,7-二氟-4-側氧基-1,4-二氫喹啉-3-羧酸(化合物3，0.53公克，產率84%)或1-(4-胺基-2-氟苯基)-6,7-二氟-4-側氧基-1,4-二氫喹啉-3-羧酸(化合物4，產率79%)。 化合物3：
    熔點：228-230℃；Rf=0.48(甲醇：二氯甲烷=1：20)；UV λmax奈米(log ε)：262(3.12),248(3.04),241(2.95),228(2.91)；IR(KBr)：3341,1726,1616,1493 cm-1；1H-NMR(200 MHz,DMSO-d 6) δ 5.72(br s,NH2),6.74(m,2H,3’,5’-H),7.19(dd,1H,J=6.6,11.6 Hz,8-H),7.27(m,2H,2’,6’-H),8.32(dd,1H,J=10.4 Hz,5-H),8.62(s,1H,2-H)；分析計算：C16H10F2N2O3‧0.1 H2O：C 60.41,H 3.24,N 8.81；實際值：C 60.26,H 3.19,N 8.43。 化合物4：
    熔點：224-226℃；Rf=0.42(甲醇：二氯甲烷=1：20)；UV λmax奈米(log ε)：258(3.14),246(3.12),239(3.01),230(2.91)；IR(KBr)：3334,1723,1614,1498 cm-1；1H-NMR(200 MHz,DMSO-d 6) δ 6.08(br s,NH2),6.58(m,2H,3’,5’-H),7.27(m,2H,6’,8-H),8.33(dd,1H,J=8.6,10.0 Hz,5-H),8.76(s,1H,2-H),14.53(br s,COOH)；分析計算：C16H9F3N2O3：C 57.49,H 2.71,N 8.38；實際值：C 57.26,H 3.02,N 8.32。 B.　製備1-(4-胺基苯基)-6-氟-7-聯苯基-4-側氧基-1,4-二氫喹啉-3-羧酸(化合物5)或1-(4-胺基-2-氟苯基)-6-氟-7-聯苯基-4-側氧基-1,4-二氫喹啉-3-羧酸(化合物6)
    將溶於吡啶(8毫升)中之聯胺單水合物(2.2毫升，45毫莫耳)與化合物3(0.89公克，2.81毫莫耳)或化合物4(0.94公克，2.84毫莫耳)混合，獲得一混合物，再於70至80℃下加熱混合物達6小時(以薄層色層分析監控)。冷卻反應物並添加醋酸，直至達到pH值為5，接著過濾收集沉澱物，以水清洗，再自乙醇中再結晶，以製得黃色固體之1-(4-胺基苯基)-6-氟-7-聯胺基-4-側氧基-1,4-二氫喹啉-3-羧酸(化合物5，0.67公克，73%)或1-(4-胺基-2-氟苯基)-6-氟-7-聯胺基-4-側氧基-1,4-二氫喹啉-3-羧酸(化合物6，產率76%)。 化合物5：
    熔點：258-260℃；Rf=0.42(甲醇：二氯甲烷=1：20)；UV λmax奈米(log ε)：282(3.07),258(2.92),254(2.77),232(2.73)；IR(KBr) 3326,1713,1624,1466 cm-1；1H-NMR(200 MHz,DMSO-d 6) δ 4.31(br s,聯胺-NH2),5.64(br s,4’-NH2),6.75(m,3H,3’,5’,8-H),7.21(m,2H,2’,6’-H),7.78(d,1H,J=12.2 Hz,5-H),8.21(br s,7-NH),8.38(s,1H,2-H),15.70(br s,1H,COOH)；分析計算：C16H13FN4O3*0.2H2O：C 57.89,H 4.08,N 16.88；實際值：C 57.98,H 4.19,N 16.58。 化合物6：
    熔點：283-285℃；Rf=0.39(甲醇：二氯甲烷=1：20)；UV λmax奈米(log ε)：286(3.12),278(3.07),252(2.85),238(2.76)；IR(KBr)：3350,1705,1629,1464 cm-1；1H-NMR(200 MHz,DMSO-d 6) δ 4.35(br s,聯胺-NH2),5.99(br s,4’-NH2),6.52-6.61(m,2H,3’,5’-H),6.71(d,2H,J=6.2 Hz,8-H),7.327-7.36(m,2H,2’,6’-H),7.78(d,1H,J=12.4 Hz,5-H),8.28(br s,7-NH),8.47(s,1H,2-H),15.38(br s,1H,COOH)；分析計算：C16H12F2N4O3*0.2H2O：C 54.09,H 3.69,N 15.77；實際值：C 54.07,H 3.75,N 15.69。 C.　製備本發明化合物7至11(7-(2-芳亞甲基聯胺基)氟喹諾酮羧酸之衍生物)
    將化合物5或6(2毫莫耳)溶於乙醇中(30毫升)，並依以上流程圖中所示之醛類結構添加適當之芳基醛類(4毫莫耳)，再將所得混合物進行加熱及迴流8至48小時(以薄層色層分析監控)。於真空下移除溶劑，將殘餘物懸浮於水(20毫升)中，再以驟沸管柱色層分析(FC)(甲醇：二氯甲烷=1：50)純化所得沉澱物，並自乙醇中再結晶，以製得終產物7至11(即，7-(2-芳亞甲基聯胺基)氟喹諾酮羧酸之衍生物)。本發明化合物7至11之詳細資料如下。 化合物7：1-(4-胺基苯基)-7-(2-苯亞甲基聯胺基)-6-氟-4-側氧基-1,4-二氫喹啉-3-羧酸
    黃色固體(產率88%)；熔點：314-316℃；Rf=0.46(甲醇：二氯甲烷=1：10)；UV λmax奈米(log ε)：378(3.34),358(3.27),310(3.39),296(3.32),272(3.24),242(3.33)；IR(KBr)：3381,1708,1628,1462 cm-1；1H-NMR(200 MHz,DMSO-d 6) δ: 5.77(br s,NH2),6.80-6.82(m,2H,3’,5’-H),7.15(d,1H,J=7.2 Hz,8-H),7.27-7.48(m,7H,2’,6’,Ar-H),7.95(d,1H,J=11.6 Hz,5-H),8.18(s,1H,HC=N),8.54(s,1H,2-H),11.22(br s,NH),15.47(br s,COOH)；分析計算：C23H17FN4O3*0.3H2O：C 65.49,H 4.20,N 13.28；實際值：C 65.38,H 4.35,N 13.11。 化合物8：1-(4-胺基苯基)-6-氟-7-(2-(4-氟苯亞甲基)聯胺基)-4-側氧基-1,4-二氫喹啉-3-羧酸
    黃色固體(產率85%)；熔點：308-310℃；Rf=0.50(甲醇：二氯甲烷=1：10)；UV λmax奈米(log ε)：374(3.28),312(3.32),298(3.30),286(3.26),254(3.22),234(3.24)；IR(KBr)：3214,1633,1505,1470 cm-1；1H-NMR(200 MHz,DMSO-d 6) δ 5.72(br s,NH2),6.78-6.80(m,2H,3’,5’-H),7.03(d,2H,J=6.4 Hz,8-H),7.14-7.24(m,4H,2’,6’-H,Ar-H),7.46-7.49(m,2H,Ar-H),7.75(d,1H,J=11.2 Hz,5-H),8.13(s,1H,HC=N),8.54(s,1H,2-H),11.03(br s,NH),15.42(br s,COOH)；分析計算：C23H16F2N4O3：C 63.59,H 3.71,N 12.90；實際值：C 63.31,H 3.99,N 12.81。 化合物9：1-(4-胺基苯基)-6-氟-7-(2-(4-甲氧基苯亞甲基)聯胺基)-4-側氧基-1,4-二氫喹啉-3-羧酸
    黃色固體(產率85%)；熔點：307-309℃；Rf=0.45(甲醇：二氯甲烷=1：10)；UV λmax奈米(log ε)：380(2.82),328(2.90),310(2.96),294(2.84),252(2.75),232(2.72)；IR(KBr)：3247,1702,1626,1465 cm-1；1H-NMR(200 MHz,DMSO-d 6) δ 3.81(s,3H,OCH3),5.78(br s,NH2),6.79-6.83(m,2H,3’,5’-H),6.97-7.01(m,2H,Ar-H),7.12(d,1H,J=6.2 Hz,8-H),7.25-7.30(m,2H,2’,6’-H),7.39-7.44(m,2H,Ar-H),7.93(d,1H,J=12.0 Hz,5-H),8.14(s,1H,HC=N),8.54(s,1H,2-H),11.08(br s,NH)15.39(br s,COOH)；分析計算：C24H19FN4O4*0.2H2O：C 64.05,H 4.34,N 12.45；實際值：C 63.96,H 4.42,N 12.31。 化合物10：1-(4-胺基-2-氟苯基)-6-氟-7-(2-(4-甲氧基苯亞甲基)聯胺基)-4-側氧基-1,4-二氫喹啉-3-羧酸
    黃色固體(產率86%)；熔點：321-322℃；Rf=0.48(甲醇：二氯甲烷=1：10)；UV λmax奈米(log ε)：376(3.32),332(3.16),318(3.31),305(3.38),252(3.34),228(3.22)；IR(KBr)：3363,1796,1627,1461 cm-1；1H-NMR(200 MHz,DMSO-d 6) δ: 3.80(s,3H,OCH3),6.16(br s,2H,NH2),6.63-6.65(m,2H,3’,5’-H),6.98-7.01(m,3H,8-,Ar-H),7.37-7.43(m,3H,6’-,Ar-H),7.94(d,2H,J=11.6 Hz,5-H),8.14(s,1H,HC=N),8.66(s,1H,2-H),11.15(br s,NH),15.35(br s,COOH)；分析計算：C24H18F2N4O4*0.2H2O：C 61.59,H 3.96,N 11.97；實際值：C 61.60,H 4.27,N 11.81。 化合物11：1-(4-胺基-2-氟苯基)-6-氟-4-側氧基-7-(2-(吡啶-4-基亞甲基)聯胺基)-1,4-二氫喹啉-3-羧酸
    黃色固體(產率71%)；熔點：176-178℃；Rf=0.43(甲醇：二氯甲烷=1：10)；UV λmax奈米(log ε)：374(3.37),367(3.34),3.16(3.41),302(3.45),281(3.58),256(3.55),238(3.47)；IR(KBr)：3356,1721,1631,1467 cm-1；1H-NMR(200 MHz,DMSO-d 6) δ: 6.18(br s,NH2),6.66-6.72(m,2H,3’,5’-H),7.06(dd,1H,J=6.8,1.2 Hz,8-H),7.34-7.50(m,2H,6’-,吡啶基-H),7.64-7.67(m,2H,吡啶基-H),7.95(d,1H,J=12.0 Hz,5-H),8.09(s,1H,HC=N),8.41(s,1H,2-H),8.59-8.64(m,1H,吡啶基-H),11.49(br s,NH),15.26(br s,COOH)；分析計算：C22H15F2N5O3*1.0H2O：C 58.28,H 3.78,N 15.45；實際值：C 58.19,H 4.03,N 15.40。 [化合物活性試驗1]
    利用MTT(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴鹽)分析法測試由上述製備例所製得之本發明化合物7至11的抑制癌細胞活性。
    首先，於37℃之含5%二氧化碳之培養箱中，分別以Dulbecco’s改良培養基(DMEM培養基)培養人類大腸癌細胞DLD-1(BCRC：60132)與SW620(BCRC：60343)、以及人類乳癌細胞MCF-7(BCRC：60436)(購自台灣，生物資源保存及研究中心(BCRC))。2至3天後，觀察各類癌細胞之生長狀況，當細胞佔滿生長帄面空間(confluence)時，便可用來進行細胞毒性測試。
    將105個細胞/孔種植(seeding)於24孔細胞培養皿中，並培養12至16小時。接著，將本發明化合物7至11(1微莫耳濃度)、習知抗癌藥物雷帕黴素(Rapamycin，作為比較組，1微莫耳濃度)、或二甲基亞碸(DMSO，作為對照組)加入培養皿中。於24小時後，運用倒立式顯微鏡觀察細胞型態的變化，並以MTT分析及計算細胞存活率。
    MTT分析法是常用的細胞毒性試驗方法，其原理為MTT黃色水溶性化學物可被細胞內粒腺體中的去氫酵素(dehydrogenase)代謝，產生紫色不溶於水的產物3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基-甲臜(formazan)，並沉澱堆積在細胞中。添加二甲基亞碸以溶解3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基-甲臜，並以589奈米波長測量吸光值，其中，由於只有活細胞才會有具活性的去氫酵素，故所測得的吸光值會與活細胞數量成正比關係，可藉此評估細胞的存活率。
    以上實驗結果顯示於第1圖中。第1圖結果顯示，本發明化合物7至11具有優異之抑制人類癌細胞的活性，故可用於治療癌症。此外，本發明化合物7至11具有較雷帕黴素優異之抗癌活性，且本發明化合物之分子量較小，有助於生物體吸收並到達癌細胞部位，故可有效治療癌症。 [化合物活性試驗2]
    進行與化合物活性試驗1相同之試驗，以習知抗癌藥物雷帕黴素作為比較組，並以人類乳癌細胞MCF-7進行測試，觀察本發明化合物於不同時間點下之抑制癌細胞活性，試驗結果顯示於第2圖。
    如第2圖所示，本發明化合物7至11具有與雷帕黴素相近、甚至更為優異之抗癌活性，故可有效治療癌症。 [化合物抑癌機制試驗1]
    使用DNA微陣列及生物資訊工具分析本發明化合物7至11之作用機制。首先，將107個人類乳癌細胞MCF-7細胞種植於培養皿中，並培養12小時。接著，將本發明化合物7至11(實驗組)與二甲基亞碸(對照組)分別加入培養皿中。於6小時後，使用Trizol試劑(購自Invitrogen公司)抽取總RNA，並確認RNA的純度260/280大於1.8以上。
    將抽出的mRNA反轉錄成cDNA，並分別染上綠色螢光劑(Cyanine 3，Cy3)，從實驗組和對照組取等量的cDNA，並依據鹼基配對原理和生物晶片(微陣列，Agilent Human G3 Whole Genome Oligo 8×60K生物晶片)上的cDNA進行雜交反應。
    最後，將雷射掃描影像分析與資料進行正規化。接著，將資料以倍數改變值(Fold change)值為2為標準，選出顯著上調和下調的基因，再利用生物資訊網站DAVID(Functional Annotation Bioinformatics Microarray Analysis)與KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析顯著上調和下調的基因途徑。標準化後之微陣列分析結果係顯示於第3圖及第4圖，生物資訊工具之分析結果係顯示於表1。
    如第3圖、第4圖及表1所示，DNA微陣列及生物資訊工具之分析結果顯示，經本發明化合物處理後之樣本中，具有明顯差異化表現之基因係涉及傑納斯激酶-轉錄訊息轉換子及活化子(JAK-STAT)途徑及/或有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑，此結果說明本發明化合物之抑癌作用機制涉及傑納斯激酶-轉錄訊息轉換子及活化子途徑及/或有絲分裂原活化蛋白激酶)途徑。 [化合物抑癌機制試驗2]
    半胱胺酸蛋白分解酶3(caspase 3，CASP3)基因與生長停滯及DNA破壞誘導轉錄3(growth arrest and DNA damage inducible transcript 3，GADD153)基因為細胞凋亡過程中之重要基因，當其表現提升時，可促進細胞凋亡。以上DNA微陣列試驗結果顯示該二基因可受到本發明化合物之增進調控(up-regulation)，說明本發明化合物可促進細胞凋亡。為進一步確認本發明化合物係經由JAK-STAT途徑與MAPK途徑達成抑癌效果，本試驗藉由反轉錄聚合酶連鎖反應(RT-PCR)分析人類乳癌細胞MCF-7之JAK-STAT途徑中CASP3基因及MAPK途徑中GADD153基因的表現。
    首先，使經或未經本發明化合物處理之人類乳癌細胞MCF-7生長至80%的帄面空間。以TRIzol試劑(購自Invitrogen公司)單離細胞的總量RNA。於各樣本中，依據製造商的使用指示，以寡-dT引子(oligo-dT primers)使用SuperscriptII套組(購自Invitrogen公司)，將5微克總量RNA反轉錄為第一股cDNA。依照以下條件使用Applied biosystems 2720熱循環儀進行PCR：(1)升溫：94℃(2分鐘)；(2)94℃(變性分離，30秒)、55℃(接合，1分鐘)、以及72℃(延伸，1分鐘)，共30循環。該PCR係使用如下引子： (a)生長停滯及DNA破壞誘導轉錄3(GADD153)基因：
    正義(sense)：5’-GGG AAG TAG AGG CGA CTC G-3’(SEQ ID NO: 1)
    反義(antisense)：5’-CTT CCC CCT GCG TAT GTG-3’(SEQ ID NO: 2) (b)細胞凋亡相關之半胱胺酸蛋白分解酶3(CASP3)基因：
    正義：5’-AGA ACT GGA CTG TGG CAT TGA G-3’(SEQ ID NO: 3)
    反義：5’-GCT TGT CGG CAT ACT GTT TCA G-3’(SEQ ID NO: 4) (c)肌動蛋白引子(內在控制組)基因：
    正義：5，-GCT CGT CGT CGA CAA CGG CTC-3’(SEQ ID NO: 5)
    反義：5，-CAA ACA TGA TCT GGG TCA TCT TCT C-3’(SEQ ID NO: 6)
    之後，以1重量/體積%洋菜糖之TBE膠體(購自Invitrogen公司)電泳分析所有PCR產物。試驗結果顯示於第5圖。如第5圖所示，經本發明化合物處理之MCF-7癌細胞的CASP3基因與GADD153基因的表現增加，證實本發明化合物係經由JAK-STAT途徑與MAPK途徑達成抑癌效果。
    以上試驗結果說明，本發明化合物可用於治療與JAK-STAT途徑及/或MAPK途徑有關之癌症。
    上述實施例僅係用以例示說明本發明之原理及功效，而非用於限制本發明。任何熟於此項技藝之人士均可在不違背本發明之技術原理及精神的情況下，對上述實施例進行修改及變化。因此，本發明之權利保護範圍應如後附申請專利範圍所界定者。
    第1圖所示為本發明化合物與雷帕黴素抑制癌細胞活性的統計直條圖；
    第2圖所示為本發明化合物與雷帕黴素抑制癌細胞活性的曲線圖；
    第3圖所示為用於分析本發明化合物之作用機制的DNA微陣列分析圖；
    第4圖所示為用於分析本發明化合物之作用機制的DNA微陣列分析圖；以及
    第5圖所示為CASP3基因及GADD153基因的cDNA電泳圖。
    权利要求:
    Claims (10)
    [1] 一種式(I)喹啉衍生物： 其中，R1為視需要經取代之苯基；R2為鹵素；以及R3為視需要經取代之苯基，且該苯基之苯環可視需要含一N雜原子。
    [2] 如請求項1之喹啉衍生物，其中R1為視需要經取代之；R3為視需要經取代之或，且R4為氫、烷氧基或鹵素。
    [3] 如請求項2之喹啉衍生物，其係選自以下群組：
    [4] 一種醫藥組合物，其係包含一醫藥可接受載劑及治療有效量之如請求項1至3中任一項之式(I)喹啉衍生物及其醫藥可接受之鹽類與酯類。
    [5] 如請求項4之醫藥組合物，其係用於治療癌症。
    [6] 如請求項5之醫藥組合物，其係用於治療大腸癌與乳癌。
    [7] 如請求項5之醫藥組合物，其係用於治療與Janus激酶-轉錄訊息轉換子及活化子(JAK-STAT)途徑及有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑之至少一者有關之癌症。
    [8] 一種使用如請求項1至3中任一項之式(I)喹啉衍生物及其醫藥可接受之鹽類與酯類於製造治療癌症之藥劑之用途。
    [9] 如請求項8之用途，其中該藥劑係用於治療大腸癌與乳癌。
    [10] 如請求項8之用途，其中該藥劑係用於治療與Janus激酶-轉錄訊息轉換子及活化子途徑及有絲分裂原活化蛋白激酶途徑之至少一者有關之癌症。
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