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    提供具有優異酪胺酸酶抑制作用、具備高安全性之酪胺酸酶抑制劑及酪胺酸酶抑制劑之製造方法。一種酪胺酸酶抑制劑之製造方法，其特徵係具備使粉末狀羥基羧酸與生的蚯蚓相接觸，以水稀釋並調整pH值為2~5，保持3~180分鐘之後，或，於pH值2~5之羥基羧酸水溶液與生的蚯蚓相接觸，保持3~180分鐘之後，以水清洗生的蚯蚓並將之磨碎，凍結乾燥所得到之磨碎物之步驟。
    公开号:TW201311292A
    申请号:TW101127254
    申请日:2012-07-27
    公开日:2013-03-16
    发明作者:Yoichi Ishii；Kazuyuki Ishii
    申请人:Well Stone Co；
    IPC主号:A61K35-00
    专利说明:
    使用蚯蚓乾燥粉末之酪胺酸酶抑制劑及其製造方法
    本發明，係關於使用蚯蚓乾燥粉末之酪胺酸酶抑制劑及其製造方法，更詳言之，係關於使用安全、高效果之蚯蚓乾燥粉末之酪胺酸酶抑制劑及其製造方法。
    近年來，高齡化社會正在進行中，另一方面，抗衰老的需求也不斷增加，年輕人對皮膚自然之美的認識增長顯著，化妝品，特別是追求強調具美白效果化妝品的比例越來越大。
    肌膚因為增齡等內在因子或紫外線、活性酸素等之外在因子，使皮膚原本維持之多樣功能下降，各種各樣的問題都現實化。強烈被要求預防．消除之肌膚煩惱的其中之一為藉由斑點、雀斑、曬斑等所造成之皮膚色素沉澱。據說，色素沉澱其主要原因為，存在於皮膚內之酪胺酸經由酵素反應變成黑色素先驅物，經氧化而生成黑色素。
    抑制黑色素生成之物質主要分成兩大類型類型。第一種為關於影響黑色素生成之酪胺酸酶酵素之活性由本身直接抑制之類型，另外一種為本身不會直接對於酪胺酸酶活性進行抑制，在色素細胞內抑制黑色素生成之類型。又，也可看到結合雙方之物質。具有黑色素生成抑制作用，作為預防或消除色素沉澱之有效成分，一般所知的物質則為抗壞血酸或麩胱甘胺酸、對苯二酚等，其他各種天然植物性成分等已經提出(例如，專利文獻1及2)。
    另外，蚯蚓萃取物或蚯蚓乾燥粉末，自古以來對東洋各國而言，就被作為各種疾病之預防劑、治療劑來使用，到目前為止已知有作為膀胱內結石縮小劑及排出促進劑、黃疸治療劑、分娩促進劑、強壯劑、育毛劑、強精劑、解熱劑、痙攣治療劑、循環促進劑、半身癱瘓治療劑、間接鎮痛劑、排尿劑、支氣管哮喘劑、高血壓症治療劑等之用途。
    專利文獻3中，揭示在熱水處理後，藉由有機溶劑萃取或水解萃取所得到之蚯蚓萃取物對於酪胺酸酶具活性抑制作用。 〔先行技術文獻〕 〔專利文獻〕
    〔專利文獻1〕特開2011-032173號公報
    〔專利文獻2〕特開2011-037764號公報
    〔專利文獻3〕特開昭63-238009號公報
    但是，抑制黑色素生成之物質當中，有抗壞血酸類之安定性問題，在水系中不安定是造成變色、變臭的原因。麩胱甘胺酸等之硫醇系化合物則有強烈異臭、容易被氧化等之問題點。進而，對苯二酚對皮膚有安全性之問題。
    又，上述專利文獻3記載之蚯蚓萃取物當中，將蚯蚓進行加熱並剁碎之後於有機溶劑中萃取而取得，有殘留有機溶劑之問題，經水解萃取(酵素處理)法取得者，最終加入氯化鯨蠟吡啶溶液或乙醇進行處理，如果從長期抹在皮膚之化妝品或配合皮膚外用劑之觀點來看的話，並不適當。此外，用專利文獻3記載之方法所得到之蚯蚓萃取物之酪胺酸酶抑制活性尚未能夠令人滿意。
    在此本發明的目的，在於提供一種可以得到具有優異酪胺酸酶抑制作用、具備高度安全性之酪胺酸酶抑制劑之製造方法，以及使用由該製造方法所得到之酪胺酸酶抑制劑之化妝品。
    本發明者為解決上述問題經深入研究的結果，找到對於生的蚯蚓作特定之處理之後進行磨碎所得到之蚯蚓成分具有優異酪胺酸酶抑制作用，導致本發明的完成。
    亦即，本發明之酪胺酸酶抑制劑之製造方法，其特徵係具備使粉末狀羥基羧酸與生的蚯蚓相接觸，以水稀釋並調整pH值為2~5，保持3~180分鐘之後，或，於pH值2~5之羥基羧酸水溶液與生的蚯蚓相接觸，保持3~180分鐘之後，以水清洗生的蚯蚓並將之磨碎，凍結乾燥所得到之磨碎物之步驟。
    本發明之酪胺酸酶抑制劑之製造方法，以具備於前述粉末狀羥基羧酸或羥基羧酸水溶液與生的蚯蚓相接觸之前，將生的蚯蚓與鉀、鈉、鎂及鈣所成之群中選出至少一種之金屬氯化物相接觸之步驟為佳。
    又，本發明之酪胺酸酶抑制劑之製造方法，以具備於前述粉末狀羥基羧酸或羥基羧酸水溶液與生的蚯蚓相接觸之前，將生的蚯蚓於明亮處放置10~50小時之後，剝離附著在體皮上污物之步驟為佳。
    在本發明之酪胺酸酶抑制劑之製造方法，前述凍結乾燥係將磨碎物於-18℃~-35℃下使其凍結20~240小時後，經由在真空下進行凍結乾燥者為佳。
    本發明之酪胺酸酶抑制劑之製造方法，更進一步以具備將前述磨碎物凍結乾燥後溶解於水或乙醇水溶液中，除去或分離不溶物之步驟為佳。
    本發明之化妝品，其特徵為使用上述中任一項之酪胺酸酶抑制劑之製造方法所得到之酪胺酸酶抑制劑。
    經由本發明，提供一種不用有機溶劑等，可以得到具優異酪胺酸酶抑制作用，具備高度安全性之酪胺酸酶抑制劑之酪胺酸酶抑制劑之製造方法變成可能。
    本發明之酪胺酸酶抑制劑之製造方法，其特徵係具備使粉末狀羥基羧酸與生的蚯蚓相接觸，以水稀釋並調整pH值為2~5，保持3~180分鐘之後，或於pH值2~5之羥基羧酸水溶液與生的蚯蚓相接觸，保持3~180分鐘之後，以水清洗生的蚯蚓並將之磨碎，凍結乾燥所得到之磨碎物之步驟。
    又，本發明之其他酪胺酸酶抑制劑之製造方法，其係將生的蚯蚓使其與鉀、鈉、鎂及鈣所成之群中選出至少一種之金屬氯化物相接觸，
    之後，使粉末狀羥基羧酸與生的蚯蚓相接觸，以水稀釋並調整pH值為2~5，保持3~180分鐘之後，或於pH值2~5之羥基羧酸水溶液與生的蚯蚓相接觸，保持3~180分鐘之後，以水清洗生的蚯蚓並將之磨碎，凍結乾燥所得到之磨碎物之步驟。
    本發明之酪胺酸酶抑制劑之製造方法，其係以生的蚯蚓作為原料、可以提供一種具優異酪胺酸酶抑制作用，具備高度安全性之酪胺酸酶抑制劑之酪胺酸酶抑制劑之製造方法。
    關於本發明之製造方法，在生的蚯蚓置於不愉快環境下處理之前，亦即將生的蚯蚓與金屬氯化物或羥基羧酸相接觸之前，將生的蚯蚓移送到如麵包箱之平箱，於明亮處放置10~50小時之後，去除附著在體皮上之污物為佳。在明亮處之放置時間，以12~24小時為更佳。以此時之收容量來看，蚯蚓厚度為30~60mm，較佳為40~50mm之厚度所堆積程度的量為佳。此平箱內不存在砂、泥之類的異物，又因蚯蚓為夜行性動物在黑暗中生活活動變得活躍，因為擔心會有體力消耗的問題，所以夜間以電照培養方式來保持明亮為佳。此操作之活蚯蚓，發揮其自我防禦本能，將消化管內殘留之消化物進行排泄，此排泄物會覆蓋全身，以防止水分蒸發，為維持其生活環境，所以此覆蓋之污物亦即排泄物用適當之手段返覆進行剝離的話，最後可以去除其消化管內之消化物以及附著於體皮之污物。
    附著於蚯蚓體皮之污物之剝離，例如用不織布來覆蓋活蚯蚓，污物會吸附在不織布上。這在明亮處放置及去除附著於體皮之污物，通過與金屬氯化物及/或羥基羧酸相接觸之組合，可以期待一層蚯蚓體內有毒物之排出、去除。
    本發明其他酪胺酸酶抑制劑之製造方法所使用之金屬氯化物，其係鉀、鈉、鎂及鈣所組成之群中選出至少1種之金屬氯化物。亦即，從氯化鉀、氯化鈉、氯化鎂及氯化鈣所組成之群中選出選至少1種。又，該等之混合物亦可，這些與其他可添加在食品之無害成分之混合物亦可。作為如此之混合物，例如列舉食鹽、岩鹽、曬鹽。上述金屬氯化物，可以經由將其粉末狀物噴灑在生的蚯蚓上，藉此使蚯蚓與金屬氯化物相接觸。
    在本發明其他酪胺酸酶抑制劑之製造方法，較佳為將生的蚯蚓與金屬氯化物或羥基羧酸相接觸之後，使生的蚯蚓羥基羧酸相接觸。又，在本發明之酪胺酸酶抑制劑之製造方法，其亦可不與金屬氯化物相接觸，與羥基羧酸相接觸。
    關於與羥基羧酸之接觸，可以將粉末狀之羥基羧酸噴灑在生的蚯蚓上來進行。又，也可以浸漬在pH值2~5之羥基接酸水溶液中。經過與金屬氯化物之接觸後再與羥基羧酸相接觸的情況時，與羥基羧酸之接觸，其係在與上述之金屬氯化物相接觸之後迅速進行。又，在生的蚯蚓與羥基羧酸相接觸之前，用水洗蚯蚓為佳。經由水洗去除上述金屬氯化物之後使蚯蚓與羥基羧酸相接觸得到酵素活性高之蚯蚓乾燥粉末。與羥基羧酸相接觸前用水洗的情況時，與金屬氯化物接觸開始之後，就進行水洗，以30分鐘為佳，更佳為20分鐘以內。水洗方法沒有特別限定，可以採用大家已知的方法。
    活蚯蚓在長時間與羥基羧酸粉末相接觸後就死亡，生活功能消失，因為消化管內之消化物變成無法排泄，在切實可行範圍內盡快，30秒以內為佳，20秒以內更佳，將羥基羧酸用水稀釋，有必要將pH值調整為2~5之範圍。
    羥基羧酸對蚯蚓而言因為形成不愉快之生活環境，所以活蚯蚓經自我保存本能，將體液、排泄物放出以圖改善其生活環境。又，因為羥基羧酸具有殺菌性，除促進如上述之消化器內殘留消化物排泄等之功能外，同時可預期對附著於蚯蚓上之雜菌有殺菌之效果。
    在本發明方法中所使用之結晶狀羥基羧酸，如有使用條件下所展示之結晶狀體的話，不用管該之羥基數或羧基數皆可使用。亦即，單羥基單羧酸、單羥基聚羧酸、聚羥基單羧酸、聚羥基聚羧酸之任一種皆可。
    本發明所使用之羥基羧酸，例如，可列舉乙醇酸、乳酸、醋酸、β-羥基丙酸、α-羥基-n-酪酸、β-羥基-n-酪酸、α-羥基-n-吉草酸、β-羥基-n-吉草酸、蘋果酸、α-甲基蘋果酸、α-羥基戊二酸、β-羥基戊二酸、檸檬酸、丙二酸及琥珀酸等。其中對於食品可以使用且容易取得則為乳酸、醋酸、蘋果酸、檸檬酸、丙二酸及琥珀酸為佳。羥基羧酸，可1種單獨使用，亦可2種以上混合使用。
    生的蚯蚓其組織有65%是水分。生的蚯蚓其作為保身功能運行的時間，雖然會有部分程度的余裕，活蚯蚓死亡後其酵素也停止作用、置於不愉快生活環境下之時間控制有必要慎重進行。此時間，會因條件有所不同，通常為3~180分鐘之範圍。
    在本發明中，以羥基羧酸處理之蚯蚓生體，再用水洗淨之後，加以磨碎成為液狀或糊狀之磨碎物。洗淨以純水為佳。洗淨方法沒有特別限定，可採用已知的水洗方法。又，磨碎前處理步驟之合計時間，亦即，於生的蚯蚓噴灑金屬氯化物之後，羥基羧酸由水進行洗淨為止所需的時間，合計為240分鐘以內為佳。
    上述磨碎方法沒有特別限定，例如，使用均質機、混合器、均相攪拌機、擂潰機、加壓型細胞破壞裝置，通常於1~25℃下進行。從蚯蚓構成成分之分解抑制觀點來看，低溫下進行為宜，以2~15℃之溫度為佳。
    經由磨碎蚯蚓所得到之磨碎物，例如收容在不銹鋼製托盤，附上凍結乾燥。這時，蚯蚓生體所包含之酵素，因為對活細胞不作用但對死細胞會立即進行作用之故，擔心會產生腐敗性氣體，所以為了防止此事發生於-18℃~-35℃下進行瞬間即時急冷．凍結抑制酵素作用之後，進行凍結乾燥為佳。
    如此，在不損害蚯蚓本來之藥理作用下進行粉末化，有必要迅速凍結，但另一方面太短時間下凍結的話，為蚯蚓糊狀物主成分之蛋白質會同時與存在之不純物形成斑點狀之不凍結部分，因為有時無法分離，所以過度急速凍結不可取。因此，凍結適合以-18℃至-35℃之低溫下進行20~240小時，更佳為進行50~170小時。
    進行凍結乾燥之際，選擇水分與不純物能同時不得殘留並去除之條件很重要。因此，壓力50Pa以下、在-60℃至+90℃之溫度下、溫度分階段性的上昇同時控制在10~60小時之範圍內進行為佳。
    作為凍結乾燥之方法，例如，前述之磨碎物於-18℃至-35℃之溫度下以20~240小時進行凍結，在-60℃~+90℃之溫度，分數階段昇溫，在壓力25~40Pa，分數階段減壓的同時，於10~60小時使其凍結真空乾燥可得到無菌狀態之淡黃色蚯蚓乾燥粉末。
    本發明之酪胺酸酶抑制劑之製造方法，進一步而言，具備將前述磨碎物經凍結乾燥後溶解於水或乙醇水溶液中，去除不溶物或分離之步驟為佳。去除不溶物或分離之步驟，與上述相同，可以經由放置依沉澱、離心分離、過濾等。溶解於水或乙醇水溶液之步驟，以一邊攪拌一邊振動來進行為佳。溶解於水所需要的時間以1~120分鐘為佳，5~80分鐘為更佳。乙醇水溶液之乙醇濃度沒有特別限定，以10~70%(v/v)為佳，30~60%為更佳。
    經由本發明之製造方法所得到之酪胺酸酶抑制劑其形狀沒有特別限定。亦即，如上述之溶解於水或乙醇水溶液之上清液，可直接使用此狀態之水溶液，亦可除去水分作為濃縮液來使用，可以使其乾燥以粉末狀來使用。使用上清液經乾燥後之粉末狀物溶解於水中亦可。又，蚯蚓糊狀物經凍結乾燥後之粉末，不溶解於水或乙醇水溶液直接使用亦可。
    在本發明方法中，所使用之原料蚯蚓並沒有特別限定，例如可用紅蚯蚓(Lumbricus rubellus)、LT蚯蚓(Lumbricus terrestris)、赤子愛勝蚓(Eisenia foetida)、縞蚯蚓(Allolobophora caliginosa)、紫釣蚯蚓(Dendrobaena octaedra)、日本杜拉蚓(Allolobophora japonica Michaelsen)、八田蚯蚓(Drawida hattamimizu Hatai)、背黑蚯蚓(Pheretima divergens Michaelsen)、Futsuu蚯蚓(Pheretima communissima)、畑蚯蚓(Pheretima agrestis)、Sieboldi蚯蚓(Pheretima sieboldi Horst)、一紋蚯蚓(Pheretima hilgendorfi)、湖濱蚯蚓(Pontodrilus matsushimensis Iizuka)、系蚯蚓(Tubifex hattai Nomura)、五島系蚯蚓(百合蚯蚓)〔Limnodrilus gotoi Hatai=L.SocialisStephenson〕等。
    本發明之化妝品，其特徵係含有依本發明之製造方法所得到之酪胺酸酶抑制劑。經由酪胺酸酶抑制劑之作用，抑制黑色素之生成，可以預期美肌效果、防止色素沉澱之效果。
    與本發明相關之化妝品形態，並沒有特別限定。根據上述酪胺酸酶抑制劑之有效成分的效果，可利用各作用效果皆適用之全部化妝品上。例如，與本發明相關之有效成分配合於各種化妝品基劑等上，面霜、乳液、化妝水、面膜劑、洗顏料等之各種基礎化妝品、粉底霜、口紅、腮紅、白粉等之各種彩妝料、洗髮料、養毛劑、洗髮精、潤絲等之各種頭髮用化妝品、肥皂、美甲材料、古龍水、其他、洗液、乳膠、軟膏、溶膠、凝膠、粉、噴霧、固形物等之形態上皆可適用。
    與本發明相關之酪胺酸酶抑制劑對於各種化妝品之配合量，其係可以因應化妝品之實施態樣、化妝品之使用形態等而有所變動所以並沒有特別限定。原則上，有效量存在的話是件好事，一般而言化妝品組成物中，換算成乾燥重量其中有0.0001~100質量%為可利用，以0.01~10質量%為佳。
    其他，可以配合一般化妝品上所使用之添加成分或其他有效成分。例如，可以配合水、乙醇、油性成分、保濕劑、增黏劑、防腐劑、乳化劑、藥效成分、粉體、紫外線吸收劑、香料、乳化安定劑等。 〔實施例〕
    以下，經由實施例對本發明作更詳細說明。本發明經由以下之實施例並沒有被任何制限。 〔蚯蚓乾燥粉末之調製〕 (實施例1)
    放置明亮處24小時後，剝離附著在30kg重之生的紅蚯蚓體皮上之污物並將其攤開在平盤上，厚度約5cm，並於其上撒上250g檸檬酸15秒後加入30公升純水加以稀釋。
    撒上檸檬酸粉末時，蚯蚓會立刻放出黃色體液。以水稀釋之後，保持此狀態20分鐘。
    接著，從弄髒之檸檬酸水溶液將生的蚯蚓取出，以水清洗，再用均質機10℃下磨碎，調製成蚯蚓糊狀物。緊接著，將這蚯蚓糊狀物進行抽吸脫氣，將其中所含之氣體排除之後，移送至不銹鋼製托盤上，瞬間急速冷凍至-35℃，在此溫度維持50小時慢慢使其凍結。
    凍結之蚯蚓糊狀物在-35℃下以壓力0Pa保持2小時，再昇溫至溫度25℃，壓力40Pa、10小時，再來40℃、壓力35Pa下14小時，再接著65℃、壓力35Pa下12小時進行乾燥，最後溫度調為80℃，在壓力25Pa保持6小時進行真空凍結乾燥。經由此處理得到含水量8質量%之淡黃色蚯蚓乾燥粉末。 (實施例2)
    放置明亮處24小時後，剝離附著在30kg重之生的紅蚯蚓體皮上之污物並將其攤開在平盤上，厚度約5cm，並於其上均一撒上250g氯化鈉，20分鐘後，用水清洗蚯蚓。
    之後，並於其上撒上250g檸檬酸15秒後加入30公升純水加以稀釋。此時，剛加水後立即之pH值為2.25，完全稀釋之後其pH值為2.74。
    撒上檸檬酸粉末時，蚯蚓會立刻放出黃色體液。以水稀釋之後，保持此狀態20分鐘。接著，從弄髒之檸檬酸水溶液將生的蚯蚓取出，以水清洗，再用均質機10℃下磨碎，調製成蚯蚓糊狀物。緊接著，將這蚯蚓糊狀物進行抽吸脫氣，將其中所含之氣體排除之後，移送至不銹鋼製托盤上，瞬間急速冷凍至-35℃，在此溫度維持50小時慢慢使其凍結。
    凍結之蚯蚓糊狀物在-35℃下以壓力0Pa保持2小時，再昇溫至溫度25℃，壓力40Pa、10小時，再來40℃、壓力35Pa下14小時，再接著65℃、壓力35Pa下12小時進行乾燥，最後溫度調為80℃，在壓力25Pa保持6小時進行真空凍結乾燥。經由此處理得到含水量8質量%之淡黃色蚯蚓乾燥粉末。
    對於上述所得到各1g之蚯蚓乾燥粉末，加入20ml離子交換水進行1小時攪拌。之後，進行離心分離(10000×g、室溫、15分)，分離上清液作為測定試料。 〔測定試藥〕
    關於酪胺酸酶抑制活性之測定，使用以下之試藥。
    磷酸緩衝液(磷酸+磷酸鈉。0.05M、pH6.8)
    酪胺酸酶(來自香菇，50U/ml在磷酸緩衝液)
    L-DOPA(2.5mM在磷酸緩衝液) 〔測定方法〕
    於磷酸緩衝液500μL中加入酪胺酸酶200μL並進行混合，再來，加入上述測定試料或離子交換水(控制)100μL，於25℃下培養3分鐘。之後，加入L-DOPA 250μL並攪拌後，測定波長490nm之吸光度。測定開始後，每30秒畫出其吸光度值曲線，測定10分鐘。拉出測定開始後與10分鐘後之值之間的近似線，算出其斜率。以相對於離子交換水進行反應時(控制)曲線之近似線之斜度作為100時其斜率之比率展示在圖形上。圖形如圖1所示。
    從圖1可以清楚揭示，根據本發明之酪胺酸酶抑制劑，其係強列抑制酪胺酸酶之功能。酪胺酸酶，具有將L-酪胺酸變更為L-DOPA、甚至是L-多巴醌(Dopaquinone)之作用。之後，為了合成黑色素色素從L-多巴醌(Dopaquinone)經過數階段之反應，抑制酪胺酸酶活性，可導致抑制黑色素之合成。從而，本發明之酪胺酸酶抑制劑適用於化妝品、特別是於美白化妝品用途。 (參考例1)
    依據專利第2090412號公報所記載之方法，得到蚯蚓之凍結乾燥粉末。
    亦即，放置明亮處24小時後，剝離附著在30kg重之生的紅蚯蚓體皮上之污物並將其攤開在平盤上，厚度約5cm，加入30公升純水加以稀釋。以水稀釋之後，保持此狀態20分鐘。接著，從水中將生的蚯蚓取出，以水清洗，再用均質機10℃下磨碎，調製成蚯蚓糊狀物。緊接著，將這蚯蚓糊狀物進行抽吸脫氣，將其中所含之氣體排除之後，移送至不銹鋼製托盤上，瞬間急速冷凍至-35℃，在此溫度維持50小時慢慢使其凍結。
    凍結之蚯蚓糊狀物在-35℃下以壓力0Pa保持2小時，再昇溫至溫度25℃，壓力40Pa、10小時，再來40℃、壓力35Pa下14小時，再接著65℃、壓力35Pa下12小時進行乾燥，最後溫度調為80℃，在壓力25Pa保持6小時進行真空凍結乾燥。經由此處理得到含水量8質量%之淡黃色蚯蚓乾燥粉末。
    當該凍結乾燥粉末，於50%乙醇水溶液中，將乙醇：凍結乾燥粉末溶解成20：1(v/w)，在室溫(25℃)下，以1500rpm振動1小時。之後，以4℃、10000×g進行15分鐘離心分離，分離上清液，在75℃減壓濃縮15分鐘，得到凍結乾燥之凍結乾燥粉末A-I。 (參考例2)
    取代50%乙醇使用離子交換水除此之外與上述參考例1相同條件進行，得到凍結乾燥粉末B-I。 (參考例3)
    取代50%乙醇使用離子交換水，除沒有進行最後之減壓濃縮之外與上述參考例1相同條件進行，得到凍結乾燥粉末C-I。 (實施例3)
    經由水洗將附著在30kg重之生的紅蚯蚓體皮上之污物剝離並將其攤開在平盤上，厚度約5cm，之後，並於其上均一撒上250g檸檬酸15秒後加入30公升純水加以稀釋。
    再來，將這稀釋後浸有蚯蚓之檸檬酸液放置在20℃ 60分鐘，接著，從弄髒之檸檬酸水溶液將生的蚯蚓取出，以水清洗，再用均質機10℃下磨碎，調製成蚯蚓糊狀物。緊接著，將這蚯蚓糊狀物進行抽吸脫氣，將其中所含之氣體排除之後，移送至不銹鋼製托盤上，瞬間急速冷凍至-35℃，在此溫度維持50小時慢慢使其凍結。
    將凍結之蚯蚓糊狀物在-30℃下以壓力5Pa減壓保持10小時之後，再昇溫至溫度20℃，壓力10Pa、10小時，再來40℃下10小時進行乾燥，最後溫度調為80℃，在壓力5Pa保持5小時進行真空凍結乾燥完了後。經由此處理得到含水量8質量%之淡黃色蚯蚓乾燥粉末。
    當該凍結乾燥粉末，於50%乙醇水溶液中，將乙醇：凍結乾燥粉末溶解成20：1(v/w)，在室溫(25℃)下，以1500rpm振動1小時。之後，以4℃、10000×g進行15分鐘離心分離，分離上清液，在75℃減壓濃縮15分鐘，得到凍結乾燥之凍結乾燥粉末A-II。 (實施例4)
    取代50%乙醇改用離子交換水除此之外與上述實施例3相同之條件進行，得到凍結乾燥粉末B-II。 (實施例5)
    取代50%乙醇使用離子交換水，除沒有進行最後之減壓濃縮之外與上述實施例3相同條件進行，得到凍結乾燥粉末C-II。 (實施例6)
    與上述實施例2同樣條件進行，得到淡黃色之凍結乾燥粉末。
    當該凍結乾燥粉末，於50%乙醇水溶液中，將乙醇：凍結乾燥粉末溶解成20：1(v/w)，在室溫(25℃)下，以1500rpm振動1小時。之後，以4℃、10000×g進行15分鐘離心分離，分離上清液，在75℃減壓濃縮15分鐘，得到凍結乾燥之凍結乾燥粉末A-III。 (實施例7)
    除取代50%乙醇改用離子交換水之外其他與上述實施例6相同之條件進行，得到凍結乾燥粉末B-III。 (實施例8)
    取代50%乙醇使用離子交換水，除沒有進行最後之減壓濃縮之外與上述實施例6相同條件進行，得到凍結乾燥粉末C-III。
    對於上述之凍結乾燥粉末A-I、A-II、A-III、B-I、B-II、B-III、C-I、C-II、C-III，各自將0.1g凍結乾燥粉末加入磷酸緩衝液，調整成0.05g/ml。振盪此溶液(1500rpm、25℃、1小時)，再來以離心分離(10000×g、4℃、15分鐘)取其上清液成為測定樣品。
    磷酸緩衝液，基本上將酪胺酸酶(Sigma、來自香菇)、L-DOPA(Nacalai)調整成該緩衝液之規定濃度(2.5mM)。利用分光光度計，加入0.5ml磷酸緩衝液與0.2ml酪胺酸酶(250U/ml)與0.1ml測定樣品，在37℃培養3分鐘。從培養開始2分48秒時開始進行測定，3分鐘時加入0.25mlL-DOPA(2.5mM)在37℃ 10分鐘(每10秒)，在波長490nm實施吸光度測定。
    從測定結果，計算出下述式所定義之酪胺酸酶活性抑制率(%)(下述式其例為5分鐘後之值)。
    At：包含酪胺酸酶以及L-DOPA之測定溶液在開始測定後30秒至5分30秒後其吸光度之增加值。
    Ac：包含酪胺酸酶、不含L-DOPA之測定溶液在開始測定後30秒至5分30秒後其吸光度之增加值。
    At0：不含酪胺酸酶、包含L-DOPA之測定溶液在開始測定後30秒至5分30秒後其吸光度之增加值。
    Ac0：不含酪胺酸酶及L-DOPA之測定溶液在開始測定後30秒至5分30秒後其吸光度之增加值。
    活性比(%)=([At]-[At0])/([Ac]-[Ac0])×100
    酪胺酸酶活性抑制率(%)=100-活性比
    結果如下述表1~表3、以及圖2~圖4所示。還有，各表中，有0.05M磷酸緩衝液pH值6.8，其係取代測定樣品用磷酸緩衝液來作為對照。

    從上述表1~3及圖2~4可以清楚揭示，根據本發明之製造方法所得到之蚯蚓凍結乾燥粉末所組成之酪胺酸酶抑制劑，其係顯示對於酪胺酸酶之抑制活性。特別是經由包含將磨碎處理前之生的蚯蚓，使其接觸金屬鹽以及羥基羧酸之步驟之方法所得到者，其具高度酪胺酸酶抑制活性。 (比較例1)
    遵從特開昭63-238009號公報記載之方法，將生的蚯蚓(90.0g)在約80℃中水浴20分鐘，並以水道水洗淨。排除水之後，用攪拌機得到蚯蚓糊狀物。
    當該凍結乾燥粉末，於50%乙醇水溶液中，將乙醇：糊狀物溶解成10：1(v/w)，於5~10℃低溫下，放置2星期並同時攪拌。之後，以4℃、10000×g進行15分鐘離心分離，分離上清液，在75℃減壓濃縮15分鐘，得到凍結乾燥之凍結乾燥粉末D-I。 (實施例9)
    與上述實施例2同樣條件，得到淡黃色之凍結乾燥粉末。
    當該凍結乾燥粉末，於50%乙醇水溶液中，將乙醇：凍結乾燥粉末溶解成10：1(v/w)，於5~10℃低溫下，放置2星期並同時攪拌。之後，以4℃、10000×g進行15分鐘離心分離，分離上清液，在75℃減壓濃縮15分鐘，得到凍結乾燥之凍結乾燥粉末D-II。 (參考例4)
    與參考例1相同，依照專利第2090412號公報記載之方法，得到蚯蚓之凍結乾燥粉末。
    當該凍結乾燥粉末，於50%乙醇水溶液中，將乙醇：凍結乾燥粉末溶解成10：1(v/w)，於5~10℃低溫下，放置2星期並同時攪拌。之後，以4℃、10000×g進行15分鐘離心分離，分離上清液，在75℃減壓濃縮15分鐘，得到凍結乾燥之凍結乾燥粉末D-III。
    對於上述之凍結乾燥粉末D-I、D-II、D-III，各自將0.1g凍結乾燥粉末加入磷酸緩衝液，調整成0.05g/ml。振盪此溶液(1500rpm、25℃、1小時)，再來以離心分離(10000×g、4℃、15分鐘)取其上清液成為測定樣品。
    磷酸緩衝液，基本上將酪胺酸酶(Sigma、來自香菇)、L-DOPA(Nacalai)調整成該緩衝液之規定濃度(2.5mM)。利用分光光度計，加入0.5ml磷酸緩衝液與0.2ml酪胺酸酶(250U/ml)與0.1ml測定樣品，在37℃培養3分鐘。從培養開始2分48秒時開始進行測定，3分鐘時加入0.25mlL-DOPA(2.5mM)在37℃ 10分鐘(每10秒)，在波長490nm實施吸光度測定。
    從測定結果，計算出下述式所定義之酪胺酸酶活性抑制率(%)(下述式其例為5分鐘後之值)。
    At：包含酪胺酸酶以及L-DOPA之測定溶液在開始測定後30秒至5分30秒後其吸光度之增加值。
    Ac：包含酪胺酸酶、不含L-DOPA之測定溶液在開始測定後30秒至5分30秒後其吸光度之增加值。
    At0：不含酪胺酸酶、包含L-DOPA之測定溶液在開始測定後30秒至5分30秒後其吸光度之增加值。
    Ac0：不含酪胺酸酶及L-DOPA之測定溶液在開始測定後30秒至5分30秒後其吸光度之增加值。
    活性比(%)=([At]-[At0])/([Ac]-[Ac0])×100
    酪胺酸酶活性抑制率(%)=100-活性比
    結果如下述表4以及圖5所示。還有，各表中，有0.05M磷酸緩衝液pH值6.8，其係取代測定樣品用磷酸緩衝液來作為對照。
    從上述表4及圖5可以清楚揭示，根據本發明之製造方法，特別是經由包含將磨碎處理前之生的蚯蚓，使其接觸金屬鹽以及羥基羧酸之步驟之方法所得到之蚯蚓凍結乾燥粉末所組成之酪胺酸酶抑制劑(D-II)，比起遵照特開昭63-238009號公報記載之製造方法所得到之(D-I)，其具更高之酪胺酸酶抑制活性。 (比較例2)
    遵從特開昭63-238009號公報記載之方法，將生的蚯蚓(90.0g)在約80℃中水浴20分鐘，並以水道水洗淨。排除水之後，用攪拌機得到蚯蚓糊狀物。
    當該糊狀物，於離子交換水中，將離子交換水：糊狀物溶解成10：1(v/w)，
    所加之離子交換水再加50%量之氯仿進行振動，於5~10℃低溫下，放置24小時。取出水層，加入水層量之90%量之50%乙醇並進行攪拌於5~10℃低溫下，放置24小時。之後，以4℃、10000×g進行15分鐘離心分離，分離沉澱層進行凍結乾燥，得到凍結乾燥粉末E-I。另一方面，將上清液在75℃減壓濃縮15分鐘，得到凍結乾燥之凍結乾燥粉末F-I。 (實施例10)
    用生的蚯蚓(90.0g)，與上述實施例2同樣條件得到淡黃色之凍結乾燥粉末。
    當該凍結乾燥粉末，於離子交換水中，將離子交換水：凍結乾燥粉末溶解成10：1(v/w)，所加之離子交換水再加50%量之氯仿進行振動，於5~10℃低溫下，放置24小時。取出水層，加入水層量之90%量之50%乙醇並進行攪拌於5~10℃低溫下，放置24小時。之後，以4℃、10000×g進行15分鐘離心分離，分離沉澱層進行凍結乾燥，得到凍結乾燥粉末E-II。另一方面，將上清液在75℃減壓濃縮15分鐘，得到凍結乾燥之凍結乾燥粉末F-II。 (參考例5)
    與參考例1相同，依照專利第2090412號公報記載之方法，得到蚯蚓之凍結乾燥粉末。
    當該凍結乾燥粉末，於離子交換水中，將離子交換水：凍結乾燥粉末溶解成10：1(v/w)，所加之離子交換水再加50%量之氯仿進行振動，於5~10℃低溫下，放置24小時。取出水層，加入水層量之90%量之50%乙醇並進行攪拌於5~10℃低溫下，放置24小時。之後，以4℃、10000×g進行15分鐘離心分離，分離沉澱層進行凍結乾燥，得到凍結乾燥粉末E-III。另一方面，將上清液在75℃減壓濃縮15分鐘，得到凍結乾燥之凍結乾燥粉末F-III。
    對於上述之凍結乾燥粉末E-I、E-II、E-III、F-I、F-II、F-III，各自將0.1g凍結乾燥粉末加入磷酸緩衝液，調整成0.05g/ml。振盪此溶液(1500rpm、25℃、1小時)，再來以離心分離(10000×g、4℃、15分鐘)取其上清液成為測定樣品。
    磷酸緩衝液，基本上將酪胺酸酶(Sigma、來自香菇)、L-DOPA(Nacalai)調整成該緩衝液之規定濃度(2.5mM)。利用分光光度計，加入0.5ml磷酸緩衝液與0.2ml酪胺酸酶(250U/ml)與0.1ml測定樣品，在37℃培養3分鐘。從培養開始2分48秒時開始進行測定，3分鐘時加入0.25mlL-DOPA(2.5mM)在37℃ 10分鐘(每10秒)，在波長490nm實施吸光度測定。
    從測定結果，計算出下述式所定義之酪胺酸酶活性抑制率(%)(下述式其例為5分鐘後之值)。
    At：包含酪胺酸酶以及L-DOPA之測定溶液在開始測定後30秒至5分30秒後其吸光度之增加值。
    Ac：包含酪胺酸酶、不含L-DOPA之測定溶液在開始測定後30秒至5分30秒後其吸光度之增加值。
    At0：不含酪胺酸酶、包含L-DOPA之測定溶液在開始測定後30秒至5分30秒後其吸光度之增加值。
    Ac0：不含酪胺酸酶及L-DOPA之測定溶液在開始測定後30秒至5分30秒後其吸光度之增加值。
    活性比(%)=([At]-[At0])/([Ac]-[Ac0])×100
    酪胺酸酶活性抑制率(%)=100-活性比
    結果如下述表5、6及圖6、7所示。還有，各表中，有0.05M磷酸緩衝液pH值6.8，其係取代測定樣品用磷酸緩衝液來作為對照。

    從上述表5、6及圖6、7可以清楚揭示，根據本發明之製造方法，特別是經由包含將磨碎處理前之生的蚯蚓，使其接觸金屬鹽以及羥基羧酸之步驟之方法所得到之蚯蚓凍結乾燥粉末所組成之酪胺酸酶抑制劑(E-II、F-II)，比起遵照特開昭63-238009號公報記載之製造方法所得到之(E-I、F-I)，其具更高之酪胺酸酶抑制活性。
    〔圖1〕表示實施例1、2結果之圖形圖。
    〔圖2〕表示實施例6結果之圖形圖。
    〔圖3〕表示實施例7結果之圖形圖。
    〔圖4〕表示實施例8結果之圖形圖。
    〔圖5〕表示實施例9結果之圖形圖。
    〔圖6〕表示實施例10結果之圖形圖。
    〔圖7〕表示實施例10結果之圖形圖。
    权利要求:
    Claims (9)
    [1] 一種酪胺酸酶抑制劑之製造方法，其特徵係具備使粉末狀羥基羧酸與生的蚯蚓相接觸，以水稀釋並調整pH值為2~5，保持3~180分鐘之後，或，使pH值2~5之羥基羧酸水溶液與生的蚯蚓相接觸，保持3~180分鐘之後，以水清洗生的蚯蚓並將之磨碎，凍結乾燥所得到之磨碎物之步驟。
    [2] 如申請專利範圍第1項所記載之酪胺酸酶抑制劑之製造方法，其係具備於前述粉末狀羥基羧酸或羥基羧酸水溶液與生的蚯蚓相接觸之前，將生的蚯蚓與鉀、鈉、鎂及鈣所成之群中選出之至少一種之金屬氯化物相接觸之步驟。
    [3] 如申請專利範圍第1項所記載之酪胺酸酶抑制劑之製造方法，其係具備於前述粉末狀羥基羧酸或羥基羧酸水溶液與生的蚯蚓相接觸之前，將生的蚯蚓於明亮處放置10~50小時之後，剝離附著在體皮上污物之步驟。
    [4] 如申請專利範圍第2項所記載之酪胺酸酶抑制劑之製造方法，其係具備於前述氯化物與生的蚯蚓相接觸之前，將生的蚯蚓於明亮處放置10~50小時之後，剝離附著在體皮上污物體皮之後，使其與前述金屬之氯化物相接觸之步驟。
    [5] 如申請專利範圍第1項所記載之酪胺酸酶抑制劑之製造方法，其中，前述凍結乾燥為經由將磨碎物於-18℃~-35℃使其凍結20~240小時後，在真空下進行凍結乾燥。
    [6] 如申請專利範圍第2項所記載之酪胺酸酶抑制劑之製造方法，其中，前述凍結乾燥為經由將磨碎物於-18℃~-35℃使其凍結20~240小時後，在真空下進行凍結乾燥。
    [7] 如申請專利範圍第1項所記載之酪胺酸酶抑制劑之製造方法，其具備將前述磨碎物凍結乾燥後溶解於水或乙醇水溶液中，除去或分離不溶物之步驟。
    [8] 如申請專利範圍第2項所記載之酪胺酸酶抑制劑之製造方法，其具備將前述磨碎物凍結乾燥後溶解於水或乙醇水溶液中，除去或分離不溶物之步驟。
    [9] 一種化妝品，其特徵為使用由申請專利範圍第1~8項中任一項所記載之酪胺酸酶抑制劑之製造方法所得到之酪胺酸酶抑制劑。
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