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    • 专利摘要:
    本發明係有關於一種球狀體脂肪幹細胞培養材料，係包括一基底；以及表面塗佈一幾丁聚醣(chitosan)薄膜，該幾丁聚醣薄膜係形成於該基底上，且係包含65-90%之去乙醯化度(degree of deacetylation)，並且該幾丁聚醣薄膜表面之最高突出及最低凹陷之一高度差係介於1-25 nm間。此外，本發明更提供一種以上述培養方法使脂肪幹細胞誘導形成球狀體並轉分化成神經相關細胞之方法。
    公开号:TW201309802A
    申请号:TW101124286
    申请日:2012-07-05
    公开日:2013-03-01
    发明作者:Chia-Ching Wu；Yuan-Yu Hsueh；Sheng-Che Lin
    申请人:Univ Nat Cheng Kung；
    IPC主号:C12N5-00
    专利说明:
    誘導脂肪幹細胞形成球狀體及其神經分化之方法
    本發明係關於一種培養球狀體脂肪幹細胞群之培養方法，成體幹細胞中的脂肪幹細胞可透過本發明之培養材料，在無須添加神經誘導營養因子情況下形成球狀體並具有神經轉分化現象。
    中樞神經損害是一種永久性的神經傷害，無法自我修復及復原，至於周圍神經系統(PNS)之損害，對於年輕人來說復原率約50-70%，然而對老年人而言確有漸減之趨勢，且未必能全然復原。
    目前對於較為嚴重的神經傷害可透過神經幹細胞(NSCs)移植，以替換、支持或誘導中樞或周圍神經修復，除此之外，亦可透過胚胎幹細胞之移植而改善神經損傷。然而，對胚胎幹細胞來說，雖然其擁有無限次複製及分化潛能之特性，但卻無法克服臨床移植的排斥問題以及道德上的爭議。而對於成體之神經幹細胞來說，雖然亦具有複製及分化能力，且較不會有移植排斥之狀況，然而成體幹細胞數量少、複製能力有限且需透過不同神經營養因子之刺激以分化成不同的神經細胞，故大幅降低了神經幹細胞移植成功機率。
    至今有多篇文獻探討幹細胞的培養，其技術所需突破之困難處在於成體幹細胞之複製次數以及球狀體細胞群的形成等等，於許多幹細胞培養條件中，不乏以具有生物相容性之材料作為培養基材，例如幾丁聚醣、透明質酸、聚乳酸乙醇酸等，此外可另配合添加營養因子或誘導生長因子來誘導分化成所欲之細胞。由於培養上的繁瑣再加上成體幹細胞數量不足，故對於需使用幹細胞移植之病患來說，可能無法負荷失敗的風險及沈重的醫療負擔。
    據此，目前急需尋找一種能以低成本培養方法，針對成體幹細胞之培養改善，使其能容易形成具有分化能力之球狀體細胞群，並進而能具有誘導神經分化之現象，以對於神經有重大傷害之患者提供較佳之醫療機會。
    本發明之主要目的係提供一種用於培養球狀體脂肪幹細胞群之培養材料，僅藉由幾丁聚醣薄膜，以培養脂肪幹細胞自成球狀體細胞群。
    本發明之另一目的係在提供一種誘導脂肪幹細胞神經分化之方法，俾能以本發明之培養材料，誘導脂肪幹細胞神經轉分化(trans-differentiation)。
    為達成上述主要目的，本發明係提供一種球狀體脂肪幹細胞培養基，包括：一基底；以及一幾丁聚醣(chitosan)薄膜，此幾丁聚醣薄膜係形成於基底上。在此，幾丁聚醣薄膜可包含65-90%之去乙醯化度(degree of deacetylation,DA)，較佳係80-90%之去乙醯化度，更佳係85%之N-乙醯化度，此外，幾丁聚醣薄膜較佳具平坦化特性，其表面之最高突出及最低凹陷之一高度差可於30 nm以內，較佳係介於1-25 nm間，更佳係介於15-20間。
    上述本發明之培養基中，幾丁聚醣薄膜可藉由任何塗布方法將1-5% w/v之一幾丁聚醣溶液塗布於基底上，較佳係使用1-3% w/v之幾丁聚醣溶液，更佳係使用1-2% w/v之一幾丁聚醣溶液。
    除此之外，本發明之培養基可更包含一營養因子，此營養因子可藉由任何方法係添加於該幾丁聚醣薄膜，例如均勻混合於幾丁聚醣薄膜或塗布於幾丁聚醣薄膜之表面。此營養因子可為任何可誘導脂肪幹細胞生長或分化之營養因子，並無特別限制，本發明之營養因子可至少一選自由：神經生長因子(Nerve Growth Factor,NGF)、大腦衍生營養因子(Brain derived Neurotrophic Factor,BDNF)以及膠質細胞衍生營養因子(Glial Cell derived Neurotrophic Factor,GDNF)、鹼性成纖維細胞生長因子(basic Fibroblast Growth Factor,bEGF)、表皮細胞生長因子(Epidermal Growth Factor,EGF)所組成之群組。較佳之營養因子係選自由：神經生長因子(Nerve Growth Factor,NGF)、大腦衍生營養因子(Brain derived Neurotrophic Factor,BDNF)、鹼性成纖維細胞生長因子(basic Fibroblast Growth Factor,bEGF)及表皮細胞生長因子(Epidermal Growth Factor,EGF)所組成之群組。更佳之營養因子係選自由：神經生長因子(Nerve Growth Factor,NGF)及大腦衍生營養因子(Brain derived Neurotrophic Factor,BDNF)所組成之群組。
    為達本發明另一目的，係提供一種誘導球狀體脂肪幹細胞神經分化之方法，其步驟包含：(A)提供上述本發明之用於培養球狀體脂肪幹細胞群之培養材料；以及(B)種植一脂肪幹細胞於該培養材料上，以使該脂肪幹細胞自成球狀體並神經分化。在此，本發明方法所提供之用於培養球狀體脂肪幹細胞群之培養基已如上所述，故於此不再贅述。上述步驟(B)中之種植細胞密度係影響球狀體脂肪幹細胞群培養以及神經轉分化之因素之一，其密度可介於5×103細胞數/cm2至160×103細胞數/cm2間，較佳係介於10×103細胞數/cm2至50×103細胞數/cm2間，更佳係介於15×103細胞數/cm2至25×103細胞數/cm2間。
    於上述步驟中，脂肪幹細胞可於本發明之培養基上培養長達96小時，較佳係24至96小時，更佳係24-72至小時，以使脂肪幹細胞能自成球狀體細胞群並誘導神經轉分化。
    本發明所提供之培養基以及培養方法主要係將由動物或人體所分離之脂肪幹細胞進行體外培養，無須透過以往添加各種營養誘導因子，僅以幾丁聚醣作為培養基，在具有特定N-去乙醯化且一定程度之平坦度下，即可誘導脂肪幹細胞自成球體並進行神經轉分化，藉由將成體幹細胞之脂肪幹細胞培養成具有分化能力之細胞球狀體，且在誘導該球狀體神經轉分化情況下，以有效應用於多種神經損害相關之修復。
    以下係藉由具體實施例說明本發明之實施方式，熟習此技藝之人士可由本說明書所揭示之內容輕易地了解本發明之其他優點與功效。此外，本發明亦可藉由其他不同具體實施例加以施行或應用，在不悖離本發明之精神下進行各種修飾與變更。
    以下實施例之數據皆係將每一時間點及每一樣品之三重複實驗數據，正負其平均標準差而獲得，所有的值皆係藉由獨立t檢測(independent t test)而分析，且p值小於0.05表為有意義之數據。 實施例1-製備幾丁聚醣培養基
    將幾丁聚醣粉末(去乙醯化度=85%；417963，Sigma,St.Louis,MO)溶於1M之醋酸，使其達到濃度為1% w/v之醋酸幾丁聚醣溶液，接著攪拌24小時後，再過濾兩次去除雜質，於12孔組織培養盤(tissue culture plate,TCPS)之每一個培養孔中，各加入1 ml上述過濾溶液，再於60℃下風乾24小時，以形成幾丁聚醣薄膜，接下來，利用1N之NaOH溶液中和幾丁聚醣薄膜之酸鹼值，再以蒸餾水清洗後，於曝露於紫外燈下12小時殺菌，以得到本實施例之幾丁聚醣培養基。
    以原子力顯微鏡(AFM,JPK Nanowizard II，柏林，德國)掃描觀測本實施例培養基之幾丁聚醣薄膜表面，其中顯微鏡之參數為頻率=1 Hz，電壓=1 Mv，iGain=130，Pgain=0.003，影像由JPKSPM軟體分析，其結果如圖1A、1B所示，圖1A係本發明實施例1原子力顯微鏡影像圖，圖1B係圖1量化曲線圖，其中，於掃描之6.742 μm距離下，幾丁聚醣薄膜表面之最高突出及最低凹陷之高度差在20 nm以內。 實施例2-培養人類脂肪幹細胞自成球狀體細胞群
    本實施例之人類脂肪幹細胞(human adipose derived stem cells,hADSCs)係取自成大醫院自願病患，其中將由病患組織所萃取之hADSCs培養於含有10% FBS及1%盤尼西林/鏈黴素之DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium,DEME,Invitrogen Inc.,Carlsbad,CA)培養基中，於37℃及5%條件下培養，以利接下來的實驗使用。在此所使用之hADSCs皆為10次繼代以內之幹細胞，仍保持良好的分化能力。
    首先，將hADSCs分別培養於實施例1之培養基以及一般TCPS培養盤上，觀測48小時後hADSCs之培養情形，結果如圖1C所示，圖1C中a圖係以TCPS培養之結果，而b圖係以實施例1培養基之結果，其中hADSCs於幾丁聚醣培養基可自成直徑為100-200 μm之球狀體hADSCs細胞群，然而直接培養於TCPS培養盤之hADSCs，則無法使細胞自成球狀體細胞群，故無法培養具有分化能力之脂肪幹細胞。 實施例3-球狀體人類脂肪幹細胞群之培養條件測試
    取實施例2之hADSCs細胞，並種植(seed)於實施例1之培養基中，在此，共進行六種不同hADSCs細胞密度之樣品之測試，分別為5×103、1×104、2×104、4×104、8×104、1.6×105細胞數/cm2，並培養4、12、24、72、96小時，觀察hADSCs培養結果，其結果如圖2所示，於12小時後可觀察到球狀體hADSCs細胞群之形成，且隨著培養時間的延長，可觀察到球狀體體積增加及球狀體數量降低之情形，此外，隨著種植培養之幹細胞密度以及培養時間的增加，未聚集成球狀體的單一幹細胞會有失巢雕亡(anoikis)的現象。表1中係呈現之球狀體數量與大小對應於細胞密度之結果，當hADSCs種植密度為2×104時，可培養得到較多之球狀體hADSCs細胞群，換言之，以2×104細胞密度所培養之hADSCs可得到最多具有分化潛力之脂肪幹細胞。

    接著，將上述不同培養細胞密度之樣品進行台盼藍(Trypan Blue，購自Invitrogen)之染色測試，以檢測整體細胞存活率以及球狀體hADSCs細胞群相對存活率。就計算整體細胞存活率來說，其係將所有球狀體細胞群以及單一個細胞收集後，進行胰蛋白酶處理(trypsinzed)，再離心回溶成密度為1×105細胞數/ml之樣品，並與台盼藍混合5分鐘，再以血球計數器(hemocytometer)計算死細胞(藍色)及活細胞(不透明)之數量，以推算整體細胞之存活率。至於球狀體hADSCs細胞群相對存活率之計算則係僅取球狀體之hADSCs細胞群，同樣進行胰蛋白酶處理，以分散球狀體細胞群，同樣進行上述台盼藍染色，以檢測球狀體hADSCs細胞群相對存活率。其檢測結果如圖3所示，其中，圖3A係將hADSCs細胞密度為5×103、1×104、2×104、4×104、8×104、1.6×105細胞數/cm2之樣品培養48小時後，進行整體細胞存活率以及球狀體hADSCs細胞群相對存活率之測試，由結果顯示，當種植細胞密度越大，則整體細胞存活率越低，然而，其球狀體hADSCs細胞群相對存活率確未因而降低，另外，在此可發現，較佳之種植細胞密度係2×104細胞數/cm2。再則，圖3B係取細胞密度為2×104細胞數/cm2之樣品，在不同培養時間點下檢測整體及球狀體hADSCs細胞群相對存活率，由圖3B結果可瞭解，無論是整體細胞存活率(36%)或球狀體hADSCs細胞群相對存活率(91%)，其並不會因培養時間延長而降低，且直至72小時後才會有些微降低之現象發生。
    因此，由以上結果可瞭解，本發明培養hADSCs之最佳條件係使用實施例1之培養基，種植細胞密度2×104細胞數/cm2之hADSCs，培養72小時，可得到最佳狀態以及最多數量數量之球狀體hADSCs細胞群。 實施例4-脂肪幹細胞(hADSCs)之誘導神經轉分化
    本實施例係取於實施例1培養基以及TCPS培養盤，將細胞密度為2×104細胞數/cm2之hADSCs培養72小時，以檢測其神經轉分化之現象。由於脂肪幹細胞在神經轉分化時，細胞表面會有巢蛋白(nestin)、NFH以及GFAP等神經細胞標記之表現，故本實施例係藉由檢測巢蛋白(nestin)、NFH以及GFAP之神經細胞標記，以了解hADSCs是否具有神經轉分化之現象。
    圖4A係檢測於實施例1培養基以及TCPS培養盤之hADSCs細胞群之EPI-螢光顯微鏡影像，實驗方法係以4%甲醛固定上述培養後之hADSCs，並以0.1%之Triton X-100穿透該細胞，透過含有1%馬血清之PBS浸潤30分鐘，以避免非專一抗體之結合後，再以巢蛋白(nestin)(1：250,P48681,Millipore)、NFH(1：250,P12036,Millipore)以及GFAP(1：500,P14136,Millipore)個別之一級抗體於4℃隔夜反應，接著取具有二級抗體之FITC或Alexa Fluor 568(1：250,Molecular Probe,Eugene,OR)作用1小時，結果如圖4A所示，由此，以實施例1所培養之hADSCs細胞群能檢測到明顯的巢蛋白(nestin)、NFH以及GFAP表現，反而以TCPS培養盤之hADSCs較無法檢測到上述之神經細胞標記。
    再則，另以西方墨點法，透過巢蛋白(nestin)(1：500,P48681,Millipore)、NFH(1：1000,P12036,Millipore)以及GFAP抗體(1：2000,P14136,Millipore)檢測以上兩種培養基培養之hADSCs的巢蛋白(nestin)、NFH以及GFAP蛋白質表現，結果如圖4B所示，相較於TCPS培養盤所培養之hADSCs，以幾丁聚醣培養的hADSCs細胞群有較明顯之神經細胞標記蛋白的表現。
    此外，另將上述之實施例1培養基所培養之球狀hADSCs細胞群，進行DAPI(Invitrogen)細胞核染色，並透過上述螢光檢測方法使用共軛顯微鏡來觀察球狀體hADSCs細胞群之巢蛋白(nestin)、NFH以及GFAP螢光呈現結果，並將表現該神經細胞標記之細胞進行量化統計，結果如圖4C及圖4D所示，於球狀體hADSCs細胞群中，表現巢蛋白(nestin)之hADSCs大多出現於球狀體細胞群之周圍及內部，表現NFH之hADSCs大多出現於球狀體細胞群之內部聚集，而表現GFAP之hADSCs大多出現於球狀體細胞群球狀表面周圍。在此，巢蛋白(nestin)之表現細胞係佔19.5±2.6%，NFH之表現細胞係佔22.6±2.0%，而GFAP之表現細胞係佔14.3±1.7%。
    由本實施例之結果可瞭解，透過實施例1培養基培養之hADSCs細胞群能明顯檢測到巢蛋白(nestin)、NFH以及GFAP之表現，故證實本發明之幾丁聚醣培養基確實能培養hADSCs，使其自成球狀體細胞群並具有神經轉分化之現象。 實施例5-繼代檢測脂肪幹細胞
    將實施例2由病患萃取培養之脂肪幹細胞hADSCs繼代3次，並以實施例4之螢光檢測方法檢測球狀體hADSCs細胞群之巢蛋白(nestin)、NFH以及GFAP表現。而本實施例繼代之方法係取第一代培養48小時形成之球狀體hADSCs細胞群，以胰蛋白酶處理打散後，再將單一幹細胞送至新的實施例1之培養基培養，依此方法共繼代三次。以下稱為第一代、第二代及第三代。
    球狀體hADSCs細胞群之神經細胞標記巢蛋白(nestin)、NFH以及GFAP螢光檢測結果如圖5A所示，由圖5A之結果可明顯發現第一代之球狀體hADSCs細胞群之神經細胞標記表現明顯，而第二代之神經細胞標記更為增強，然而第三代則有降低之趨勢。
    此外，同時將TCPS培養盤以及實施例1培養基所培養之hADSCs進行即時聚合酶鏈鎖反應(real time PCR)，檢測hADSCs神經細胞標記巢蛋白(nestin)、NFH以及GFAP之基因表現，在此，即聚合酶鏈鎖反應係先以Rneasy mini kit(QIAGEN,74106，德國)分離出hADSCs之mRNA，再以ReverTra Ace(TOYOBO,FSK101，日本)進行mRNA之反轉錄為cDNA，而個別之序列如表2所示，最後透過LightCycler TaqMan Master Kit(Roche Diagnostics,04-535-286-001，德國)，以LightCycler儀器(LightCycler System,Roch Diagnostics，德國)檢測神經細胞標記之基因表現，其結果如圖5B所示，以TCPS培養盤培養之hADSCs具有較低之神經細胞標記基因之表現，然而，以實施例1培養基所培養之hADSCs具有相較明顯的神經細胞標記之基因表現。顯然，僅單獨以幾丁聚醣培養基培養的脂肪幹細胞不但能自成球體狀細胞群體，亦可在無須透過誘導營養因子情況下發生神經轉分化之現象。
    據此，綜合以上實施例1至5，本發明之培養基除了可在含有營養因子之幾丁聚醣培養基中，自成球狀體細胞群且能誘導神經分化(圖未示)，然而更能僅在具幾丁聚醣培養基條件下，即可使脂肪幹細胞達到自成球狀體細胞群之具有分化特性之幹細胞群(圖1)。在此，本發明更檢測出最佳之細胞培養密度為大約2×104細胞數/cm2，最佳培養時間為72小時，於此最佳條件下，可使脂肪幹細胞培養出最大量的球狀體細胞群，並且具有最高的存活率(圖2、圖3)。此外，本發明另外證實，以本發明培養基所培養之脂肪幹細胞具有神經轉分化之現象，透過螢光呈色、西方墨點法、以及即時聚合酶鏈鎖反應所證實之基因表現皆可證明本發明可在無須額外添加神經誘導營養因子情況下，即可使脂肪幹細胞具有神經轉分化之現象(圖4、圖5)。由此，本發明所提供之培養基以及方法能簡易培養成體幹細胞中的脂肪幹細胞，使其自成大量具有分化能力之球狀體細胞群，並具有神經轉分化之現象，此對於近來眾多具有神經性疾病之患者提供了新的醫療契機。
    上述實施例僅係為了方便說明而舉例而已，本發明所主張之權利範圍自應以申請專利範圍所述為準，而非僅限於上述實施例。
    圖1A係本發明實施例1原子力顯微鏡影像圖。
    圖1B係圖1量化曲線圖。
    圖1C係本發明實施例2之hADSCs培養觀測結果圖。
    圖2係本發明實施例3之hADSCs細胞密度及培養時間結果圖。
    圖3A係本發明實施例3不同hADSCs細胞密度之存活率結果圖。
    圖3B係本發明實施例3以hADSCs細胞密度2×104於不同時間點之存活率結果圖。
    圖4A係本發明實施例4之hADSCs螢光神經細胞標記結果圖。
    圖4B係本發明實施例4之hADSCs西方墨點法結果圖。
    圖4C係本發明實施例4之hADSCs螢光神經細胞標記及量化結果圖。
    圖4D係本發明實施例4之hADSCs螢光神經細胞標記量化結果圖。
    圖5A係本發明實施例5之hADSCs螢光神經細胞標記結果圖。
    圖5B係本發明實施例5之hADSCs神經細胞標記基因表現結果圖。
    权利要求:
    Claims (13)
    [1] 一種用於培養球狀體脂肪幹細胞群之培養材料，包括：一基底；以及一幾丁聚醣(chitosan)薄膜，該幾丁聚醣薄膜係形成於該基底上，且係包含65-90%之去乙醯化度(degree of deacetylation)，並且該幾丁聚醣薄膜表面之最高突出及最低凹陷之一高度差係介於1-25 nm間。
    [2] 如申請專利範圍第1項所述之培養材料，其中該幾丁聚醣薄膜係包含80-90%之去乙醯化度。
    [3] 如申請專利範圍第1項所述之培養材料，其中該幾丁聚醣薄膜係將1-5% w/v之一幾丁聚醣溶液塗佈於該基底上。
    [4] 如申請專利範圍第1項所述之培養材料，其中更包含一營養因子，該營養因子係添加於該幾丁聚醣薄膜，且該營養因子係至少一選自由：神經生長因子(Nerve Growth Factor,NGF)、大腦衍生營養因子(Brain derived Neurotrophic Factor,BDNF)以及膠質細胞衍生營養因子(Glial Cell derived Neurotrophic Factor,GDNF)、鹼性成纖維細胞生長因子(basic Fibroblast Growth Factor,bEGF)及表皮細胞生長因子(Epidermal Growth Factor,EGF)所組成之群組。
    [5] 如申請專利範圍第1項所述之培養材料，其中該幾丁聚醣薄膜表面之最高突出及最低凹陷之該高度差係介於15-20 nm間。
    [6] 一種誘導球狀體脂肪幹細胞神經轉分化之方法，包含：(A)提供一球狀體脂肪幹細胞培養材料，係包括：一基底；以及一幾丁聚醣(chitosan)薄膜，該幾丁聚醣薄膜係形成於該基底上，且係包含65-90%之去乙醯化度(degree of deacetylation)，並且該幾丁聚醣薄膜表面之最高突出及最低凹陷之一高度差係介於1-25 nm間；以及(B)種植密度介於5×103細胞數/cm2至160×103細胞數/cm2間之一脂肪幹細胞於該培養材料上，以使該脂肪幹細胞自成球狀體並神經分化。
    [7] 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中步驟(B)係將該脂肪幹細胞於該培養材料上培養24至96小時，以使該脂肪幹細胞自成球狀體並神經分化。
    [8] 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中步驟(B)係將該脂肪幹細胞於該培養材料上培養24-72至小時，以使該脂肪幹細胞自成球狀體並神經分化。
    [9] 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中該脂肪幹細胞於該培養材料上之種植密度係介於10×103細胞數/cm2至50×103細胞數/cm2間。
    [10] 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中該幾丁聚醣薄膜係包含80-90%之去乙醯化度。
    [11] 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中該幾丁聚醣薄膜係將1-5% w/v之一幾丁聚醣溶液塗佈於該基底上。
    [12] 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中更包含一營養因子，該營養因子係添加於該幾丁聚醣薄膜，且該營養因子係至少一選自由：神經生長因子(Nerve Growth Factor,NGF)、大腦衍生營養因子(Brain derived Neurotrophic Factor,BDNF)以及膠質細胞衍生營養因子(Glial Cell derived Neurotrophic Factor,GDNF)、鹼性成纖維細胞生長因子(basic Fibroblast Growth Factor,bEGF)及表皮細胞生長因子(Epidermal Growth Factor,EGF)所組成之群組。
    [13] 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中該幾丁聚醣薄膜表面之最高突出及最低凹陷之該高度差係介於15-20 nm間。
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
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    TWI490337B|2015-07-01|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    US201161504403P| true| 2011-07-05|2011-07-05||
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