• 专利附录
  • 专利说明
  • 权利要求
  • 类似技术
  • 同族专利
  • 引用文献
  • 法律状态
  • 优先权
    • 专利摘要:
    本說明書揭示一種合成胜肽，其具有20–39個胺基酸殘基，且其序列與序列編號1所示之胺基酸序列具有至少80%的胺基酸序列相似度。此合成胜肽有至少20個連續胺基酸殘基，其與序列編號1所示之第11–30個胺基酸殘基具有至少90%的胺基酸序列相似度。本說明書揭示含有此合成胜肽的組合物及其用途。根據本說明書所載的多種實施方式，此合成胜肽可用以促進幹細胞生長或傷口癒合。
    公开号:TW201309724A
    申请号:TW101109972
    申请日:2012-03-23
    公开日:2013-03-01
    发明作者:Yeou-Ping Tsao；Tsung-Chuan Ho
    申请人:Mackay Memorial Hospital；
    IPC主号:C07K14-00
    专利说明:
    色素上皮衍生因子衍生之多胜肽於促進幹細胞增殖與傷口癒合之用途
    【相關申請案】
    本申請案主張台灣專利申請案第100109945號（申請日2011年3月23日）之國內優先權，此處將該申請案之完整內容納入為本說明書的一部分。
    本發明是有關於幹細胞之增殖，且特別是有關於輪部上皮幹細胞（limbal epithelial stem cells，簡稱LSCs）或毛囊幹細胞（hair follicle stem cells，簡稱HFSCs）之增殖。
    幹細胞與胚胎發生（embryogenesis）以及成體動物受傷與老化過程中所涉及的組織形成、修復與維護等機制息息相關。幹細胞的獨特性在於具有自我更新（self-renewal）之能力以及分化（differentiation）的潛能。自我更新能力使得幹細胞能夠產生出其自身的複本，而分化潛能使得幹細胞可分化成為多種或所有的細胞譜系（lineages）。這些特性統稱為幹細胞的「幹細胞性」（stemness）。
    哺乳類動物的幹細胞可概略地分為胚胎幹細胞（embryonic stem cells）與成體幹細胞（adult stem cells）。胚胎幹細胞是來自哺乳類動物胚胎發生早期所形成之囊胚（blastocysts）的內細胞團（inner cell mass）。這些胚胎幹細胞為全能（totipotent）幹細胞，意指其能夠形成一完整生物體的所有組織。可在培養系統中培養胚胎幹細胞，以保持其未分化的細胞系（cell lines），或誘導其分化成多種不同的細胞譜系；因此目前在分子生物學與醫藥領域已大量地使用幹細胞來進行研究。然而，此種應用的缺點之一在於培養於培養系統中的胚胎幹細胞有自動分化的傾向，而因此會隨著時間逐漸喪失其增殖能力。
    已在成體動物的多種組織內發現到幹細胞的存在，此種幹細胞稱為「成體幹細胞」。和胚胎幹細胞相較之下，成體幹細胞的分化能力較為有限，且通常與特定細胞譜系相關。這些成體幹細胞通常都與組織的修復與維護相關；譬如骨髓幹細胞會在動物受傷後遷移到多種不同的組織，而位於骨髓以外的組織幹細胞則可修復所處部位的相關組織。
    在解剖學上，輪部位於角膜與鞏膜交界處。輪部表皮基底層（basal layer）中富含一種特殊的細胞群，稱為輪部上皮幹細胞。角膜是分層的鱗狀上皮組織，其具有快速更新的特性，以維持角膜的透明度及視覺清晰度。角膜表皮的更新是由快速增生細胞（transient amplifying cells，簡稱TACs）來負責，此種快速增生細胞是由輪部上皮幹細胞的不對稱分裂所生。在一般情形下，輪部上皮幹細胞的細胞分裂較慢，但當角膜受損時會活化輪部上皮幹細胞，以進行角膜損傷之修復。
    臨床上，將部分或完全喪失輪部上皮幹細胞或其功能不全等狀況稱為輪部上皮幹細胞不全症（LSC deficiency），此症狀往往伴隨著角膜血管新生、持續性上皮缺損、角膜結疤、潰瘍等情形，並進一步導致視力喪失。LSC不全症的成因很多，包括化學或熱灼傷所造成的傷害以及各種疾病，譬如先天的無虹彩症（aniridia）、慢性感染（如砂眼（trachoma））、黴菌性角膜炎（mycotic keratitis）與史蒂文強生症候群（Stevens Johnson syndrome）等。
    目前在治療LSC不全症最常用的方法是移植在活體外（ex vivo）擴增的輪部上皮組織。簡單來說，此方法會先將取自患者或捐贈者的小片輪部切片放置在移植用載體（transplantable carriers，如去細胞核的人類羊膜）上，以承載由切片中遷移出來的輪部細胞，並使這些細胞於其上生長而形成似輪部的上皮薄層。此外，可採用懸浮培養系統（suspension culture system）並以酵素方法自輪部組織中分離出輪部細胞與其擴增細胞，藉以降低輪部上皮幹細胞的自發性分化。然而，在移植後經常會發生輪部上皮幹細胞耗盡的情形，而導致移植失敗。因此，需要更有效率的培養方法，以便在移植前於活體外或試管內（in vitro）有效擴增輪部上皮幹細胞的數量。
    成體哺乳類動物的表皮層是由毛囊（hair follicles，簡稱HFs）、皮脂腺（sebaceous glands，簡稱SGs）與毛囊間表皮（interfollicular epidermis）所組成。這三種表皮成分之間的動態平衡（homeostasis）分別是由其各自的幹細胞族群來調節。毛囊幹細胞位於毛囊外根鞘隆突部（bulge，或稱髮突）中，屬於多能（multipotent）幹細胞，能夠分化成各種表皮譜系之細胞。一般情形中，毛囊幹細胞主要負責與動態平衡相關的毛囊重建，而非表皮層之形成。然而，當皮膚受傷時，毛囊幹細胞就會參與毛囊間表皮之修復。所以成功擴展毛囊幹細胞可以減少皮膚的損傷，促進傷口癒合。更有甚者，在表皮大量損失的情形中（譬如因為感染、手術切除與燒燙傷等因素所致），可能沒有可用的毛囊幹細胞能夠參與傷口癒合。
    有鑑於此，相關領域亟需提出一種幹細胞的增殖方法，藉以促進傷口癒合。
    發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。
    本說明書至少部分是基於發現來自色素上皮衍生因子（pigment epithelium-derived factor，簡稱PEDF）的合成胜肽能夠促進輪部上皮幹細胞或毛囊幹細胞之增殖，且因而能夠促進與這兩種幹細胞相關的傷口癒合過程。因此，根據本發明的PEDF衍生合成胜肽可作為治療傷口的製劑或藥劑。
    有鑑於上述，本發明的一態樣是關於一種用以促進幹細胞增殖的合成胜肽。
    根據本說明書多個實施例，所述的合成胜肽長度為20–39個胺基酸殘基，且其序列至少80%與序列編號1相同。此外，上述胺基酸序列包含至少20個連續胺基酸殘基，其序列至少90%與序列編號1的胺基酸殘基11–30相同，而使得此合成胜肽可用於促進輪部上皮幹細胞或毛囊幹細胞之增殖。此種合成胜肽的非限制性例示包括胺基酸序列如序列編號1、序列編號2、序列編號3、序列編號5、序列編號7或序列編號8所示者。
    本發明的另一種態樣是關於用以促進幹細胞增殖之組合物。此種組合物適用以促進幹細胞於活體內（in vivo）、活體外（ex vivo）或試管內（in vitro）的增殖，所述幹細胞特別是輪部上皮幹細胞或毛囊幹細胞。
    根據本發明一實施例，此組合物包含任一根據本發明上述態樣/實施例的合成胜肽，且此合成胜肽的含量足以促進幹細胞增殖。此組合物亦包含可用以攜帶該合成胜肽的一載體。
    在試管內增殖的情形中，所述的載體可以是一種適用以培養幹細胞的粉末狀培養基。根據本說明書多個實施例，此培養基中合成胜肽的有效含量為約1–100 nM，且較佳為約25–50 nM。在體內增殖的情形中，所述載體可以是藥學上可接受的載體，此載體可供施用於一活體哺乳類動物，包括人類。舉例來說，藥學上可接受載體可以是液體、膠體、乳霜、乳膏、黏著劑、羊膜、皮膚替代物、人工皮膚或其他皮膚均等物。
    本發明又一態樣是關於促進輪部上皮幹細胞或毛囊幹細胞增殖之方法。
    根據本發明一實施例，所述方法包含以一有效量的根據本發明上述態樣/實施例之合成胜肽來處理幹細胞，藉以促進幹細胞之增殖。在多種實施例中，上述幹細胞之增殖可於活體內（in vivo）、活體外（ex vivo）或試管內（in vitro）進行。
    在本發明又另一態樣中，提出一種用以促進一個體/患者體內角膜或上皮傷口癒合之方法。所述的個體/患者可以是任何哺乳類動物，包括人類。
    在本發明一實施例中，此方法包含對該個體投予一治療有效量的根據本發明上述態樣/實施例之合成胜肽，以促進該個體體內與該角膜或上皮傷口相關之幹細胞（如輪部上皮幹細胞或毛囊幹細胞）的增殖。在實際操作時，可透過局部施用（topical administration）、角膜下注射（subconjunctival injection）、皮下注射（subcutaneous injection）或肌肉內注射（intradermal injection）的方式來投予該組合物。
    根據本發明不同實施例，所述的角膜傷口是由以下任一種狀況所引起的：翳狀片（pterygium）手術、復發性角膜糜爛（recurrent corneal erosion）、乾眼症引起之角膜輪部細胞缺陷、藥物毒性引起之角膜輪部細胞缺陷、化學灼傷或燒燙傷引起之角膜缺損、皰疹病毒（herpes virus）引起之角膜缺損、隱形眼鏡引起之角膜病變（contact lens-induced keratopathy）、史帝文強生症候群引起之角膜病變、眼部瘢痕性類天皰瘡（ocular cicatricial pemphigoid，簡稱OCP）、先天性無虹膜症、角膜輪部細胞腫瘤（limbal tumors）、輻射性角膜病變和角膜輪部細胞功能不全引起的角膜血管新生或由糖尿病所造成的角膜傷口癒合困難。
    根據本發明另一些實施例，所述的上皮傷口是由以下任一種狀況所引起的：手術切除、皮膚感染造成之潰瘍、化學灼傷或燒燙傷、皮膚移植的供皮區、褥瘡、缺血性皮膚壞死（ischemic necrosis）或糖尿病或老化所造成的上皮傷口癒合困難。
    在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。
    為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
    除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。
    雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數界是約略的數值，已盡可能精確地呈現具體實施例的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比（例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者）均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。
    在此處「胜肽」（peptide）一詞係指胺基酸殘基所組成的高分子。「合成胜肽」（synthetic peptide）一詞則代表此胜肽並未包含存在於自然界的完整蛋白質分子。此種胜肽之所以是「合成的」，表示其乃是由人類利用技術手段所得，譬如化學合成、重組遺傳技術或將整個抗原切段。於本說明書中，任何胺基酸殘基於一胜肽中的位置係由該胜肽的N端起算。
    「幹細胞」（stem cell）一詞在此係指此細胞在某些條件下保有能夠增殖而不實質分化的能力，且亦能夠在某些條件下分化成更專一或分化程度較高的細胞。如上文所述，本說明書特別是有關於兩種成體組織幹細胞，即輪部上皮幹細胞與毛囊幹細胞。組織幹細胞位於各自的利基（niches）部位中，此利基部位的位置隨著組織種類而不同。舉例來說，輪部上皮幹細胞主要分布於周邊角膜的輪部表皮基底層內；而毛囊幹細胞多位在毛囊髮突（follicle bulge）中。
    在此處「增殖」的各種詞性（如proliferate或proliferation）係指族群中的細胞數目透過細胞分裂而增加之情形。
    「促進」及其各種時態（如promote或promoting）在此係指一種正面的改變；特別是指在統計上具有顯著意義的正面改變。在一實施例中，正面的改變係指相較於一參考標準，增加了至少10%。
    此處針對合成胜肽序列所述的「胺基酸序列相似度百分比」（Percent % amino acid sequence identity）係指該候選合成胜肽之胺基酸殘基與一參考多胜肽之胺基酸殘基完全相同的百分比。於進行上述比對時，可將該候選合成胜肽與該參考多胜肽並排，並於必要時引入間隙，以使二序列形成最高的序列相似度，且在計算相似度時，並未將保守性置換之胺基酸殘基納入考量。相關領域已有多種方法可供進行上述並排，譬如可公開取得的軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign（DNASTAR）等。本發明所屬技術領域中具有通常知識者在進行並排時，可選擇適當的參數與計算方式，以得到最佳的排列方式。在本說明書中，二胺基酸序列間的序列比較是採用美國國家生物科技資訊中心（Nation Center for Biotechnology Information，簡稱NCBI）所提供的蛋白質-蛋白質BLAST分析軟體Blastp來進行。一候選胺基酸序列A相較於一參考胺基酸序列B的胺基酸序列相似度（在本說明書中亦稱之為序列A與序列B具有特定百分比（%）的胺基酸序列相似度）的計算方式如下:

    其中X是利用Blastp軟體對序列A、B進行排列後所得到的相同胺基酸殘基數目（identical matches），而Y是A、B二序列中較短者的胺基酸殘基總數。
    在此處「藥學上可接受載體」（pharmaceutically acceptable carrier）係指一種藥學上可接受的材料、組合物或媒劑（vehicle），諸如液體或固體填充物（liquid or solid filler）、稀釋劑（diluent）、賦型劑（excipient）、溶劑（solvent）或包覆材料（encapsulating material），其可用以攜帶或運送標的成分由身體的一器官或部分到達身體的另一器官或部份。「可接受」的載體係指其可含組合物中的其他成分相容。載體可為固態、半固態、液態、乳霜或膠囊等形式。
    於本說明書中，「治療」一詞的各種詞性與時態（如treat、treating或treatment）係指預防性（如，預防用藥）、療癒性或緩和性的處置。「治療」一詞可用以指稱將此處提出的組合物投予或施用於一個體，此個體可能有一醫療疾患、症狀、疾病或與疾患相關的異常或易於罹患一疾患，以期能部分地或完全地緩和、改善、減輕一特定異常和/或病症的一或多種症狀或特徵，或延緩其發生、阻礙其進展、減輕其嚴重性和/或減低發生率。亦可對並未表出現疾病、異常和/或病症之徵兆的個體和/或呈現早期徵兆的個體進行治療，以期降低發展出與該疾病、異常和/或病症相關之病理變化的風險。在本說明書中，當一或更多種症狀或臨床指標減少時，通常認為該治療是「有效」的。或者是，有效的治療意味著一疾病的進展減少或暫停。亦即，「治療」不僅包含改善症狀或降低疾病指標，還涵蓋了使得原本在不進行治療的情形下，極有可能發生的疾病進展或症狀惡化等情形停止或減緩。有益的或的臨床結果包括，但不限於：一或多種症狀的緩解、疾病程度的縮減、疾病狀態的穩定（如，並未惡化）、疾病進程的延遲或延緩、疾病狀態的部分或完全改善或緩和，以上所述包含可偵測或不可偵測的症狀、程度、狀態或進程。
    在此處，「有效量」一詞係指一成分的用量足以招致所欲的反應或效果。「治療有效量」一詞則是指藥學組合物中的治療藥劑之含量足以產生上文定義的所欲「有效治療」。具體的治療有效量取決於多種因素，諸如欲治療的特定狀況、個體的生理條件（如，個體體重、年齡或性別）、接受治療的哺乳動物或動物的類型、治療持續時間、目前療法（如果有的話）的本質以及所用的具體配方和化合物或其衍生物的結構。治療有效量亦指於此用量下，該化合物或組合物的毒性或負面效果不及於其所帶來的正面療效。
    「患者」或「個體」等詞在此係指可接受本發明之組合物或方法來進行治療的哺乳類動物，包括人類。除非另有指明，「個體」一般包含雄性與雌性。
    色素上皮衍生因子（Pigment epithelium-derived factor，簡稱PEDF）是一種多功能的分泌性蛋白質，其具有抗血管新生（anti-angiogenic）、抗腫瘤生成（anti-tumorigenic）與神經滋養（neurotrophic）等功能。人類PEDF蛋白質是一種大小約50 kDa的分泌性蛋白質，具有418個胺基酸。已知PEDF的34-mer片段（相當於PEDF之第44–77號殘基）與44-mer片段（相當於PEDF之第78–121號殘基）分別具有抗血管新生與神經滋養性質。
    Gomez等人提出的美國專利申請案（公開號：2010/0047212）指出全長人類PEDF分子可用以促進神經幹細胞的對稱性自我更新（symmetrical self-renewal）。此申請案亦揭示C端PEDF（第195–400號殘基）無法促進神經幹細胞的自我更新。這些結果暗示在N端前194個胺基酸殘基中，可能含有與神經幹細胞自我更新相關的必要區域；然而，該申請案中未提出或試驗任何具體的N端片段。Gomez等人進一步教示上述C端PEDF能夠競爭性地亦指全長PEDF對神經幹細胞的自我更新效果，由此一結果可以推知，C端PEDF在全長天然PEDF的自我更新活性中，亦有一定的重要性。儘管如此，Gomez等人並未明白或隱喻地教示或建議任何特定的PEDF片段能夠促進神經幹細胞的對稱性自我更新。此外，除了神經幹細胞之外，先前技術並未揭示或試驗PEDF（全長或其片段）對其他種類或來源的幹細胞之自我更新的效果。有鑑於各種組織幹細胞所處之利基環境各不相同，且對稱與非對稱幹細胞增殖的誘導與調控機制非常複雜，Gomez等人並未提供任何方向或指引，來指出其他在全長PEDF分子作用下能有較佳效果之幹細胞種類。
    本說明書至少部分是基於發現來自PEDF的合成胜肽能夠促進輪部上皮幹細胞或毛囊幹細胞之增殖。本發明的一創新特徵在於此處所提出的合成胜肽最長只有39個胺基酸殘基，比起先前技術所述的全長PEDF短了許多；因此，本發明克服了傳統蛋白質在臨床使用上經常面臨的困境，諸如製造成本高昂、生體可用率（bioavailability）低落與藥物動力學（pharmacokinetics）表現不佳等。此外，本說明書提出的實驗例顯示此種合成胜肽能夠經皮膜（transdermal）傳送，因而可避免採用先前傳送蛋白質藥物通常必須使用的侵入性給藥途徑（如注射）。再者，本說明書所載的結果證實這些合成胜肽能夠有效地在活體內與試管內促進輪部上皮幹細胞與毛囊幹細胞增殖。因此，這些合成胜肽可用以治療角膜與上皮傷口。且因而能夠促進與這兩種幹細胞相關的傷口癒合過程。因此，根據本發明的PEDF衍生合成胜肽可作為治療傷口的製劑或藥劑。
    根據本發明一態樣，提出一種用以促進幹細胞增殖的合成胜肽。
    根據本說明書多個實施例，此合成胜肽有20–39個胺基酸殘基，且其胺基酸序列與序列編號1（LSVATALSALSLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT）有至少80%的胺基酸序列相似度。舉例來說，此合成胜肽與序列編號1的胺基酸序列相似度可為約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%。另外，此合成胜肽包含至少20個連續的胺基酸殘基，其與序列編號1第11–30個殘基有至少90%的胺基酸序列相似度。具體來說，這20個連續胺基酸殘基與序列編號1第11–30個殘基的胺基酸序列相似度可為約90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%。
    在本發明一實施例中，所述的合成胜肽有39個胺基酸殘基，其序列即如序列編號1所。在下文實驗例中，亦將此合成胜肽稱為39-mer。此種39-mer胜肽是來自人類PEDF的已知44-mer片段（PEDF第78–121號殘基）的一種較短的變形。
    下文提出的實驗例證實還有其他數種來自此39-mer的短、合成PEDF序列能夠有效促進輪部上皮幹細胞或毛囊幹細胞之增殖。
    舉例來說，下文一實驗例證明了如序列編號2（ALSALSLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT）所示的34-mer合成胜肽能夠有效促進HFSC與LSC增殖。根據上文所述的胺基酸序列相似度的計算方法，此34-mer與39-mer的胺基酸序列相似度為100%，且34-mer的第6–25號胺基酸殘基與39-mer的第11–30號胺基酸殘基的胺基酸序列相似度也是100%。
    此外，下文多個實驗例證明如序列編號3（SLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT）所示的29-mer合成胜肽能夠有效促進LSC與HFSC增殖，還能促進角膜與上皮傷口癒合。此29-mer與39-mer的胺基酸序列相似度為100%，且29-mer的第1–20號胺基酸殘基與39-mer的第11–30號胺基酸殘基的胺基酸序列相似度亦為100%。
    某些實驗例證實，如序列編號5（SLGAEQRTESIIHRALYYDL）所示的20-mer亦可有效促進LSC與LFSC增殖。此20-mer的序列與39-mer的第11–30號胺基酸殘基完全相同（胺基酸序列相似度：100%）且其相較於39-mer的胺基酸序列相似度同樣也是100%。
    另外有兩種衍生自小鼠PEDF的短、合成胜肽同樣也能夠有效地促進LSC與LFSC增殖以及角膜與上皮傷口癒合。第一種衍生自小鼠的合成胜肽在本說明書中亦稱為Mo 29-mer，其序列如序列編號7（SLGAEHRTESVIHRALYYDLITNPDIHST）所示，其序列與39-mer的胺基酸序列相似度為83%，且其前20個胺基酸殘基與39-mer第11–30個殘基的胺基酸序列相似度為90%。另一種衍生自小鼠PEDF的合成胜肽是Mo 20-mer，其序列如序列編號8（SLGAEHRTESVIHRALYYDL）所示。Mo 20-mer與39-mer或39-mer的第11–30號胺基酸殘基的胺基酸序列相似度皆為90%。
    可利用任何習用的技術來合成此處所述的合成胜肽，譬如t-BOC或FMOC來保護α-氨基（alpha-amino groups）。這兩種方法都採用了逐步合成法，其係由該胜肽的C端開始，每次加上一個胺基酸。亦可利用其他已知的固態胜肽合成（solid phase peptide synthesis，簡稱SPPS）法來合成此處所述的合成胜肽。
    本發明之範圍亦涵蓋了其他相較於39-mer具有保守性置換的合成胜肽。在此處，「保守性置換」一詞係指利用另一種在生物學上相似的殘基來取代某一殘基。保守性置換的例示包括親水性殘基（如異白胺酸、纈胺酸、白胺酸與甲硫胺酸）彼此間的置換，或相近極性殘基（如精胺酸與離胺酸；或麩胺酸與天冬胺酸）彼此間的置換，以及其他類似的置換模式。「保守性置換」在此亦指利用一具有取代基的胺基酸來取代一不具有取代基的原始胺基酸，只要可和此具有取代基之胺基酸反應的抗體亦可和原始胺基酸進行免疫反應即可。
    亦可將上述實施方式所述的各種合成胜肽調製成用以促進幹細胞增殖的組合物，此組合物即屬於本發明另一態樣之範圍。在本發明多種實施方式中，此組合物可用以促進活體內（in vivo）、活體外（ex vivo）或試管內（in vitro）的幹細胞增殖，特別是LSC與HFSC。
    根據本發明一實施例，上述組合物包含根據本發明上述態樣/實施方式所述的任一種合成胜肽，且此合成胜肽的含量足以促進幹細胞增殖。此組合物亦包適用於該合成胜肽的載體。
    當用於試管內增殖時，所述的載體可以是粉末狀的培養基，此培養基於復水（reconstitution）後，可用以培養幹細胞。所述的復水一般是先將粉末狀的培養基溶解於無熱源（pyrogen-free）的水、等張食鹽水或磷酸鹽緩衝液中；且之後將復水培養基的酸鹼值調整到適當的範圍，如pH值6.8至7.4之間。根據本說明書多個實施例，此合成胜肽於於該培養基中的量約為1–100 nM，且較佳為約25–50 nM。在下文提出的實驗例中，此合成胜肽於用以培養LSC與HFSC的培養基中的濃度分別是25 nM與50 nM。
    欲進行活體內增殖時，所述的載體可以是藥學上可接受的載體，其可施用於一活體哺乳類動物，包括人類。舉例來說，藥學上可接受載體可以是液體、膠體、乳霜、乳膏、黏著劑、羊膜、皮膚替代物、人工皮膚或皮膚均等物。
    可作為藥學上可接受載體之例示性物質包括動物膠（gelatin）、賦型劑、無熱源水、等張食鹽水與磷酸鹽緩衝液。在本發明一實施例中，藥學上可接受載體包括一眼科上可接受的藥學賦型劑。
    在選擇適用於投遞合成胜肽之藥學上可接受載體時，主要需考量該組合物的給藥途徑。本發明的組合物可發揮區域性效用（如，局部、結膜下或肌肉內給藥）或全身性效用（如，皮下給藥）。
    在本說明書中，「局部給藥」（topical administration）係指施用於人類或動物體表任何可接觸的部位，譬如皮膚或眼睛外表面。適用於局部給藥的藥學上可接受載體包括可用於液體（包括溶液與乳液）、乳霜、膠體及其類似物中者。較佳地，此組合物為無菌的，且可製成一劑型，以供用於局部眼部施用。可將所述組合物包裝成適合量度給藥的包裝，譬如備有滴管的容器內。
    在本發明一實施例中，所述組合物為一溶液，其可利用生理實驗水為載體。在另一實施例中，該組合物為乳膏，其中含有約50 μM的合成胜肽。在較佳的情形中，可利用適當的緩衝系統，將所述溶液或乳膏的pH值調整於約4.5至8.0之間；一般來說，中性pH值更佳。或者是，可將合成胜肽添加於能夠直接施覆傷口部位的材料中，譬如羊膜、皮膚替代物、人工皮膚或其他皮膚均等物。
    在結膜下、肌肉內或皮下注射的情形中，可將合成胜肽和如無菌水溶液之類的藥學上可接受載體一起調製，在較佳的情形中，所用的水溶液和受體的血液應為等張。在配置此類配方時，可將固態的活性成分溶解或懸浮於含有生理可相容物質的水中，所述的生理可相容物質如氯化鈉、甘胺酸及與其相似者，且其pH值經緩衝可與生理條件相容，以得到一水溶液，而後再進行滅菌。
    本發明之組合物亦可包含各種本領域習知的添加物。舉例來說，可使用溶劑（包括少量乙醇）來穩定某些藥物。其他可任選的藥學上可接受添加物包括：乳白劑、抗氧化劑、香料、色素、膠化劑、增稠劑、安定劑、界面活性劑及與其相似者。亦可添加其他物質以防止組合物因儲存而變質，譬如可添加抗菌劑來抑制微生物（如酵母菌與霉菌）的生長。本發明的組合物中亦可包括滲透促進劑和/或降低刺激性的添加物。
    在另一態樣中，本發明提出了一種用以促進幹細胞增殖的方法。
    根據本發明一實施例，上述方法包含以有效量的如本發明上述態樣/實施例所述的合成胜肽來處理幹細胞，藉以促進幹細胞增殖。在多種實施例中，此方法可於活體內、活體外或試管內促進幹細胞增殖。
    在又一態樣中，本發明提出了一種用以促進一個體/患者的角膜或上皮傷口癒合的方法。所述個體/患者可以是任何哺乳類動物，包括人類。
    在本發明一實施例中，此方法包含對該個體投予一治療有效量的根據本發明上述態樣/實施例所述的組合物，以促進與該角膜或上皮傷口相關的幹細胞增殖。在實際應用時，此組合物可經由局部給藥、結膜下注射、皮下注射或肌肉內注射等方式給藥。
    根據本發明某些實施例，所述的角膜傷口可能是由以下任一種狀況所引起的：翳狀片手術、復發性角膜糜爛、乾眼症引起之角膜輪部細胞缺陷、藥物毒性引起之角膜輪部細胞缺陷、化學灼傷或燒燙傷引起之角膜缺損、皰疹病毒引起之角膜缺損、隱形眼鏡引起之角膜病變、史帝文強生症候群引起之角膜病變、眼部瘢痕性類天皰瘡、先天性無虹膜症、角膜輪部細胞腫瘤、輻射性角膜病變和角膜輪部細胞功能不全引起的角膜血管新生或由糖尿病所造成的角膜傷口癒合困難。
    根據本發明另一些實施例，所述的上皮傷口是由以下任一種狀況所引起的：手術切除、皮膚感染造成之潰瘍、化學灼傷或燒燙傷、皮膚移植的供皮區、褥瘡、缺血性皮膚壞死或糖尿病或老化所造成的上皮傷口癒合困難。
    下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明。不應將這些實施例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。
    實驗例
    材料與方法
    材料
    經HEPES緩衝的DMEM培養基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）、Ham’s/F12培養基、胰蛋白-乙二胺四乙酸（trypsin-EDTA）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、綜合抗生素（antibiotic-antimycotic）溶液與抗-BrdU抗體皆購自Invitrogen（Carlsbad, CA）。皮質醇（hydrocortisone）、二甲亞碸（dimethyl sulfoxide，DMSO）、胰島素-運鐵蛋白-亞硒酸鈉（insulin-transferrin-sodium selenite，ITSE）培養基補充物、絲裂黴素C（mitomycin C，MMC）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、5-溴-2'-去氧尿苷（5-bromo-2'-deoxyuridine，BrdU）、界面活性劑Triton X-100、Hoechst 33258染料、甲醛（formalin）與曼森氏三色染劑（Masson's Trichrome）皆購自Sigma-Aldrich（St. Louis, MO）。蛋白酶Dispase II與上皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）皆購自Roche（Indianapolis, IN）。ΔNp63α多株抗體與各種螢光染料-共軛二級抗體皆購自BioLegend（San Diego, CA）。角蛋白-3（keratin-3；AE5株；CBL218）係購自Millipore Corporation（Bedford, MA）。Lgr6抗體（sc-48236）係購自Santa Cruz Biotechnology（Santa Cruz, CA）。
    根據Petersen等人所述的方法，利用第一型膠原蛋白-瓊脂糖樹脂（collagen I–sepharose resin）由人類血漿中純化出天然人類PEDF（序列編號9；參見Pigment-epithelium-derived factor (PEDF) occurs at a physiologically relevant concentration in human blood: purification and characterization. Biochem J 2003; 374(Pt 1):199–206）。接著利用抗-PEDF抗體，以SDS/PAGE與西方墨點法進行分析。短合成胜肽（39-mer、34-mer、29-mer、25-mer、20-mer、18-mer、Mo 29-mer與Mo 20-mer)係購自GenScript（Piscataway, NJ），於合成後，將其N端醯化（acetylated）並將C端醯胺化（amidated）以提升安定性，並以質譜儀定性（純度>95%）。除了上文所述的序列編號1–3、5與7–8之外，以下實驗例中尚使用了序列編號4（EQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT，亦稱為25-mer）以及序列編號6（EQRTESIIHRALYYDLIS，亦稱為18-mer）的合成胜肽。
    輪部上皮幹細胞的分離與培養
    根據Cheng等人與Wang等人提出的方法並略加修改後，由六個月大的紐西蘭白兔中分離出LSC，並利用細胞懸浮培養系統進行培養（參見：The growth-promoting effect of KGF on limbal epithelial cells is mediated by upregulation of DeltaNp63alpha through the p38 pathway. J Cell Sci 2009; 122 (Pt 24): 4473–4480；以及Importin 13 serves as a potential marker for corneal epithelial progenitor cells. Stem Cells 2009; 27: 2516–2526）。在含有100 U/ml 盤尼西林（penicillin）與50 μg/ml建它霉素（gentamicin）的PBS溶液中清洗兔子輪部組織。於仔細移除虹膜以及多餘的鞏膜之後，在4°C下使輪部環（limbal rings）與蛋白酶dispase II（1.2 IU/ml，溶於不含鎂離子與鈣離子的漢克氏平衡鹽溶液（Hanks’ balanced salt solution）中）接觸16小時。利用細胞刮刀移除脫落的上皮層，進行酵素分解（0.05%胰蛋白與0.01% EDTA）以將其分離成單一細胞，反應條件：37°C，15分鐘，輕度搖晃。之後將細胞轉移至停止培養基（9毫升經HEPES緩衝之DMEM，含10% FBS）中。透過離心收集細胞（400 xg，5分鐘）。
    在六孔盤的每一孔中植入約1 X 105個細胞，並培育於DMEM/Ham’s F-12基本培養基（10 mM HEPES、5 ng/ml 人類EGF、1% SITE液體培養基、綜合抗生素溶液、0.5% DMSO與0.5 μg/ml皮質醇）中，培養基中添加了10% FBS，於培育兩天後轉移到一基本培養基或含有4.5 nM PEDF、25 nM 39-mer、25 nM 34-mer、25 nM 29-mer、25 nM 25-mer、25 nM 20-mer、25 nM 18-mer、25 nM Mo 29-mer或25-nM Mo 20-mer的基本培養基中。在37°C與5%二氧化碳的條件下，將細胞持續培養3天，直到細胞生長至滿（confluence）為止，此即繼代0（passage 0）。將LSC和位於trans-well共培養盤（0.4 μm pore；購自BD Biosciences（Bedford, MA））的經MMC處理的NIH-3T3纖維母細胞滋養細胞（feeder cells）共同培養。欲進行繼代時，再次利用酵素處理（0.25%胰蛋白）來收集幾近長滿的細胞，且之後將密度1 X 105的繼代培養細胞培養於個別的培養基中，於持續進行繼代培養時，每隔四天觀察細胞的增殖能力。
    製備滋養細胞
    在37°C、5%二氧化碳的環境下，將生長至滿的NIH-3T3細胞和4 μg/ml的MMC培育2小時，並於胰蛋白處理（trypsinized）後以每平方公分2.2 X 104個細胞的密度植於trans-well培養盤（BD Biosciences）上。滋養細胞於植盤後可使用約4至24小時。
    免疫螢光分析
    脫臘（deparaffinized）的組織切片或經4%三聚甲醛（paraformaldehyde）固定的LSC以溶於PBST（PBS含有0.1% Tween-20）中的10%山羊血清及5% BSA處理約1小時以進行阻斷。在37°C下利用抗ΔNp63α（稀釋比例1：150）、BrdU（稀釋比例1：250）、角蛋白-3（稀釋比例1：250）、ABCG2（稀釋比例1：150）與Bmi-1（稀釋比例1：150）的初級抗體染色約2小時，之後和適當的玫紅（rhodamine）-或FITC-結合抗體（稀釋比例1：500）在室溫下一起反應約1小時。利用Hoechst 33258對細胞核進行對比染色（約7分鐘）。利用帶有CCD相機的蔡司（Zeiss）螢光顯微鏡來擷取影像，並利用Axiovert軟體照相。
    BrdU標記
    將2 X 105個輪部細胞（繼代第1代）植於經FNC COATING MIX R溶液（購自Athena Enzyme Systems（Baltimore, MD））塗覆的玻片上，並以培養基培育1天。將BrdU（最終，10 μM）加入培養系統中約2小時。在以4%三聚甲醛固定後，將細胞置於冷的甲醇中約2分鐘，而後在室溫下以1N氯化氫處理約1小時，而後再進行免疫螢光分析。進行動物實驗時，以DMSO將BrdU（80 mM）復水備用。將10 μl的BrdU和90 μl的PBS混合後，於小鼠安樂死前3小時將其經腹膜內注射至小鼠體內。
    角膜傷口與治療
    本實驗採用八週大的雌性C57BL/6小鼠，實驗過程經馬偕紀念醫院審查委員會同意並遵循國家動物實驗相關規定。動物經腹腔內注射舒泰（zoletil，用量為每公斤體重6毫克）與若朋（xylazine，用量為每公斤體重3毫克）混合液，以進行麻醉。將一濾紙（直徑0.9 mm）浸泡於20%乙醇中後，放置於小鼠右眼角膜中間部位約1分鐘，之後以PBS清洗小鼠眼部。其後透過解剖顯微鏡利用穿孔器在小鼠眼睛的整個角膜區域上形成一個圓形傷口（機械性括除直徑約2 mm的角膜），在不觸及角膜基質、輪部或結膜的情況下形成一機械性的角膜傷口。
    以DMSO分別將每一合成胜肽（39-mer、34-mer、29-mer、25-mer、20-mer、18-mer、Mo 29-mer或Mo 20-mer）復水備用（5 mM）；而後將合成胜肽混合於TOBREXR眼藥膏（Alcon；含0.3%泰百黴素（Tobramycin）與0.5%氯丁醇（Chlorobutanol））中，添加濃度約50 μM。在每一實驗組中（樣本數為6–10），於受傷後，每日一次在小鼠右眼上塗抹20 μl含合成胜肽的眼藥膏。對於對照組小鼠（樣本數為20），在小鼠右眼塗抹20 μl含有媒劑DMSO的眼藥膏。以局部螢光素（Fluor-I-Strip，購自Ayerst Laboratories（Philadelphia, PA））來染色小鼠角膜以觀察傷口癒合情形，並以數位相機拍攝照片。利用電腦協助的影像分析器（Adobe Photoshop CS3 10.0）由相片計算缺陷面積，並據以計算在每一時間點相較於初始傷口面積的殘餘上皮缺損百分比。
    毛囊幹細胞之培養
    人類毛囊組織取自健康捐贈者的毛髮。在顯微鏡下以鑷子分解毛囊，並移除大部分的脂肪與結締組織。將位於皮脂腺下方的毛囊髮突區域（包括中央狹長區域（central isthmus））剪下，並將髮突碎片移到含有1毫升膠原蛋白酶（1 mg/ml；購自Roche）的35-mm培養盤中並於約37°C下培育約1.5小時，以分解膠原蛋白鞘（collagen capsule）。其後，將髮突碎片移到含有蛋白酶dispase II（2.4 U/ml）/0.05%胰蛋白的新鮮細胞培養盤中，並於約37°C下培育約1.5小時，以得到一單一細胞懸浮液。
    在上述的機械解剖與酵素分解後，在12孔培養盤的每一孔中，植入分離自五個髮突碎片的懸浮髮突細胞，並以基本培養基培養5天，以利細胞吸附。上述基本培養基包含4重量份的Gibco無鈣DMEM培養基與1重量份的Ham’s F12培養基（鈣離子濃度達約0.25 mM），並添加了10% FBS、10 ng/ml人類上皮生長因子、500 mg/l的L-麩醯胺（L-glutamine）、0.2%牛腦下垂體萃出物（bovine pituitary extract）、0.18 g/ml皮質醇、1% ITSE以及綜合抗生素溶液。所用的培養方法與Blazejewska等人所述相似（請參見Stem Cells 2009; 27:642）。於培育5天候，將細胞培育於不含血清的基本培養基中或分別含PEDF（4.5 nM）、29-mer（50 nM）或20-mer（50 nM）的基本培養基中，直到細胞生長至滿（約2週；繼代0）。期間每隔2至3天更換培養基。將髮突細胞與3T3纖維母細胞滋養細胞共同培養。欲進行繼代培養時，利用酵素處理（0.25%胰蛋白；37°C、5分鐘）來收獲生長至滿的細胞。將約1 × 105個人類髮突細胞轉移到新的培養盤中，並讓細胞生長約14天以使細胞生長至滿（繼代1）。
    皮膚傷口癒合
    進行皮膚全層切除（full-thickness skin excision）試驗時採用8至10週大的C57BL/6小鼠，先以腹腔內注射舒泰（用量為每公斤體重6毫克）與若朋（用量為每公斤體重3毫克）混合液，以進行麻醉。利用Sklar Tru-Punch拋棄式組織穿孔器（購自Sklar（West Chester, PA））在每一小鼠背側中線的兩側各形成直徑約4 mm的全層皮膚切除傷口。在每一處理組別（樣本數為6）中，於皮膚傷口形成後，每日塗抹一次25 μl的皮膚乳膏（含有50 μM合成胜肽與0.006 μl的DMSO媒劑）。在對照組小鼠（樣本數為6）中，於皮膚傷口形成後，每日塗抹一次25 μl的皮膚乳膏（含有0.006 μl的DMSO媒劑）。上述乳膏每克含有5 mg的硫酸新黴素（neomycin sulfate）與12.5 mg的枯草菌素鋅鹽（Bacitracin Zinc）。在不覆蓋傷口的情況下，分別於受傷後4天與7天進行取樣。在傷口癒合期間中，每隻小鼠飼育於獨立的飼養籠中。
    利用電腦協助的影像分析器（Adobe Photoshop CS3 10.0）由相片計算傷口面積，並據以計算在每一時間點相較於初始傷口面積的殘餘上皮缺損百分比。
    進行組織學分析時，將完整傷口（包含直徑2 mm的上皮傷口邊緣）分離後以含4 % PFA的PBS溶液固定一夜，並以石蠟包埋。根據製造商所述方法，利用曼森氏三色染劑將傷口中間部位的切片（5 μm）染色，以將上皮組織染成紅色，並將結締組織染成藍色。利用萊卡（Leica）DC 500相機（Leica Microsystems）拍照。
    統計分析
    實驗結果表示成平均值±平均值標準誤差（standard error of mean，簡稱SEM）。利用單向ANOVA分析進行統計比較。除非另有說明，否則P< 0.05時具有統計學上的顯著意義。
    實驗例I
    衍生自PEDF的短合成胜肽可促進試管內LSC增殖
    為了確認與活化LSC增殖相關的功能區域，首先分析了PEDF蛋白質片段（來自人類PEDF分子第78-200號胺基酸殘基的123個胺基酸殘基；GenBank編號U29953）的表面可能性（surface probability）與親水性，並發現最多樣化的區域位在第83-121號胺基酸殘基（以下稱為39-mer）內。分別合成了一系列涵蓋來自第83-121號胺基酸殘基的短胜肽及其變異體，並分別探究其於促進培養中LSC增殖活性的效果。
    利用BrdU脈衝標記染色體DNA的合成（2小時；紅色）來觀察衍生自PEDF的短胜肽對LSC自我更新能力的影響，並利用ΔNp63α（綠色）進行免疫染色來觀察LSC表現型。
    如第1A圖所示，培養於含有全長PEDF、39-mer、34-mer、29-mer或20-mer的培養基中之LSC的增殖情形明顯優於對照組培養基（第1B圖；22.0±1.5%、30.1±1.9%、30.0±3.4%、33.9±2.6%與31.8±1.7%；相對於3.0±0.5%）。相較之下，在含有25-mer或18-mer合成胜肽的培養基中，則未觀察到LSC擴增有明顯的提升。
    衍生自小鼠PEDF的胜肽，如Mo 29-mer與Mo 20-mer，和人類29-mer與20-mer分別只有4個與2個胺基酸殘基的差異；這些衍生自小鼠PEDF的短胜肽促進LSC有絲分裂活性的效果與其同源的人類短胜肽相近（第1B圖；27.1±1.8%與26.3±2.2%）。總結來看，在添加全長PEDF、39-mer、34-mer、29-mer、20-mer、Mo 29-mer或Mo 20-mer的培養基中，LSC擴增皆有明顯的提升。
    實驗例II
    衍生自PEDF的短合成胜肽可促進活體內角膜傷口癒合
    為了探究衍生自PEDF的短胜肽對小鼠角膜傷口癒合的效果，利用圓形穿孔器（直徑約2 mm）在小鼠角膜形成傷口，之後將對照組眼藥膏或含根據本發明之PEDF短合成胜肽的眼藥膏塗抹至受傷的眼部，接著利用螢光素染色來評估傷口癒合情形。在接受PEDF短合成胜肽治療的小鼠與對照小鼠之間，其初始傷口的大小沒有顯著差異。經48小時後，可在接受39-mer、34-mer、29-mer、20-mer、Mo 29-mer或Mo 20-mer治療的小鼠中觀察到完整的角膜上皮再形成（re-epithelialization）；而對照組或接受25-mer與18-mer治療的小鼠傷口癒合則不完整（第2A圖）。相較於對照組小鼠，接受39-mer、34-mer、29-mer、20-mer、Mo 29-mer或Mo 20-mer治療的小鼠的殘餘上皮缺損百分比明顯較小。具體來說，在24小時後，上述各處理各組的殘餘上皮缺損百分比分別是37.2±4.3%、40.6±7.2%、36.5±6.4%、42.2±4.3%、33.8±5.2%與43.9±7.6%，而對照組則為84.9±5.1%；且在48小時後，各處理組的殘餘上皮缺損百分比分別為4.8±2.7%、4.6±2.1%、3.7±2.9%、5.0±3.7%、4.6±2.3%與6.2±3.5%，而對照組是39.5±3.1%（第2B圖）。
    實驗例III
    衍生自PEDF的短合成胜肽於角膜受傷後可促進活體內LSC增殖
    為了探究本發明提出的合成胜肽是否能在角膜癒合過程中促進LSC增殖，於角膜受傷後24小時，將BrdU透過腹腔內注射至小鼠體內，而後進行安樂死。對眼部切片進行ΔNp63α（綠色）與BrdU（紅色）雙重免疫染色後可觀察到，接受29-mer與20-mer治療的小鼠眼睛輪部具有較多的BrdU-與ΔNp63α-雙重陽性細胞，相較於對照組小鼠眼睛（第3A與3B圖；43.2±4.6%與42.4±4.3%相對於15.0±7.6%）；而接受18-mer治療的小鼠眼部中，LSC增殖的情形則與對照組小鼠相近。
    在受傷後第5天，透過眼部切片的ΔNp63α（綠色）免疫染色與HE染色可以觀察到接受29-mer、20-mer、Mo 20-mer治療的小鼠眼部皆已回復各分層原本的厚度（相較於正常、未受傷的眼部）；而接受18-mer與對照處理的眼睛之輪部上皮則較薄，且具有較少的ΔNp63α-陽性LSC（第4A圖）。平均來看，在正常、未受傷眼睛輪部中的ΔNp63α-陽性LSC百分比約為74.8±6.3%；而受傷的角膜經過對照組藥膏或29-mer、20-mer、18-mer或Mo 20-mer藥膏處理後的ΔNp63α-陽性LSC百分比分別是38.9±2.8%、77.0±4.1%、73.1±8.6%、39.4±2.6%與76.3±6.2%（第4B圖）。總結來說，29-mer或20-mer處理能夠活化活體內LSC增殖，且相較於自然傷口癒合過程中的角膜再生，29-mer或20-mer處理可造成更為明顯的角膜上皮再形成。
    以上實施例的結果顯示，此處提出的合成PEDF序列（譬如29-mer、20-mer、Mo 29-mer與Mo 20-mer）在培養系統中能夠促進LSC增殖，同時可抑制LSC的自發分化。此一特徵可大幅提升輪部移植均等物的品質，且因而有利於角膜再生醫學。直接刺激輪部原祖細胞（progenitor cells）的增殖以及後續使角膜上皮再形成加速，意味著此處提出的PEDF合成胜肽可作為活性成分以治療與LSC不全症相關的各種異常。
    實驗例IV
    衍生自PEDF的短合成胜肽可促進試管內HFSC的增殖
    本實驗例中，利用BrdU脈衝染色（2小時；紅色）來探究全長PEDF與其短胜肽對HFSC增殖的影響，並利用Lgr6免疫染色（綠色）來觀察HFSC表現型。如第5A圖所示，培養於含有20-mer的培養基中的人類HFSC的擴增比起對照組的培養基更為顯著。第5B圖所示的資料顯示，接受全長PEDF、29-mer與20-mer處理的組別中，全體Lgr6-陽性細胞中，BrdU與Lgr6-雙陽性細胞的百分比分別為73.8±6.0%、86.2±3.9%與79.3±3.1%，相較之下，對照組與接受18-mer處理的百分比是31.4±5.2%與30.1±6.3%。
    實驗例V
    衍生自PEDF的短合成胜肽可加速上皮傷口癒合
    參照第6A圖，在受傷後第4天，接受39-mer、34-mer、29-mer、20-mer、Mo 29-mer或Mo 20-mer治療的小鼠的傷口癒合情形較佳。上述處理組別在第4天的殘餘上皮缺陷分別是48.1±3.2%、41.4±2.5%、46.3±3.7%、50.1±3.8%、47.8±4.3%與49.6±3.9%；相較之下對照組的殘餘上皮缺損為61.5±3.2%（第6B圖）。在受傷後第7天，接受上述短胜肽序列治療的小鼠的上口幾乎完全癒合，且疤痕較不明顯（第6A圖）；且處理組的殘餘上皮缺損分別為18.4±5.7%、17.9±6.1%、18.2±4.3%、20.0±4.9%、16.8±6.6%與20.3±7.5%，相較於對照組的44.5±5.3%（第6B圖）。然而，25-mer與18-mer則未能促進傷口癒合（第6A與6B圖）。上述結果說明此處提出的衍生自PEDF的短胜肽（如39-mer、34-mer、29-mer、20-mer、Mo 29-mer與Mo 20-mer）有助於皮膚上皮再形成。
    為了進一步確認29-mer與20-mer對皮膚傷口修復的功效，對受傷後第4天的皮膚切片進行曼森氏三色染色。參照第7A圖，可以發現接受29-mer與20-mer治療的動物之傷口癒合情形較佳（相較於對照組）。接受29-mer與20-mer治療的動物之殘餘上皮缺陷分別為52.7±6.2%與49.7±5.6%；相較之下對照組動物的殘餘上皮缺陷是63.8±5.8%（第7B圖）。此外，參見第7C圖，可觀察到接受29-mer治療的小鼠在靠近傷口邊緣處有較厚的高度增 生上皮（hyper-proliferative epithelial，簡稱HE）組織與肉芽組織（granulation tissue，GT）。HE組織面積的定量結果顯示接受29-mer及20-mer治療的小鼠的皮膚厚度分別為對照組的約1.41±0.25倍與1.32±0.21倍（第7D圖）。此外，GT面積的定量結果顯示接受29-mer及20-mer治療的小鼠的皮膚厚度分別為對照組的約1.45±0.23倍與1.37±0.17倍（第7E圖）。
    將受傷後第7天的皮膚切片進行曼森氏三色染色，以觀察傷口復原情形。接受29-mer、Mo 29-mer或20-mer治療的小鼠上口有較佳的上皮再形成作用，其殘餘上皮缺損小於接受對照組藥膏處理的傷口（第8A與8B圖；17.9±3.3%、17.2±7.3%與20.8±6.1%，相較於43.5±6.5%）。
    實驗例VI
    衍生自PEDF的短合成胜肽可藉由促進過度增生上皮組織的基底細胞之增殖而加速上皮傷口癒合
    皮膚更新（skin resurfacing）通常涉及細胞複製，為了探究29-mer、Mo 29-mer、20-mer或Mo 20-mer是否可加速皮膚更新，分別以含有29-mer、Mo 29-mer、20-mer或Mo 20-mer的皮膚乳膏塗抹傷口，並於第4天將BrdU透過腹腔內注射至小鼠體內（3小時），而後進行安樂死。利用抗BrdU抗體對皮膚樣本進行免疫組織學分析，結果顯示BrdU-陽性細胞主要分佈於HE組織的基底層以及毛囊的髮突區域（第9A圖）。相較於對照組傷口，在接受29-mer、Mo 29-mer、20-mer或Mo 20-mer 處理的小鼠傷口中，BrdU-陽性細胞的數量明顯增加（第9B圖；47.9±5.0%、52.5±2.5%、53.1±6.5%與49.2±4.3%；相較於30.8±8.1%）。此一結果與前述實施例中，在接受29-mer或20-mer治療小鼠中觀察到較厚的HE組織相符。
    實驗例VII
    衍生自PEDF的短合成胜肽於皮膚受傷後可促進HFSC增殖
    在皮膚傷口修復過程中，Lgr6-陽性HFSC是重要的前驅細胞。第10A圖顯示免疫組織分析的結果，如圖所示，在受傷後第4天，接受20-mer治療的小鼠HE組織中有明顯較多的Lgr6-陽性細胞（相較於對照組傷口）。免疫組織分析亦顯示Lgr6-陽性細胞部分位於HE組織的基底層。此一結果和上文實施例中觀察到細胞增殖主要發生在HE組織的基底層一致。雙重免疫染色進一步確認Lgr6-陽性基底細胞（綠色）與20-mer誘發的HE組織中的細胞增殖相關（第10B圖）。
    以上實驗例的結果顯示本發明提出的PEDF合成胜肽（如20-mer、29-mer、34-mer、39-mer、Mo 20-mer與Mo 29-mer）可促進培養系統中HFSC的增殖。具體來說，上述促進HFSC增殖與上皮再形成以及傷口癒合相關。因此，此處提出的PEDF合成序列可作為治療藥劑以促進傷口癒合，特別是大面積的傷口或是因為糖尿病或年邁而導致的傷口癒合困難。
    雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。
    無














    為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：
    第1A圖提供了免疫螢光顯微照片，而第1B圖為一柱狀圖；這些圖式說明了根據本發明一實驗例，不同處置組別之LSC的試管內增殖情形。利用BrdU染色2小時來觀察LSC增殖。其後利用免疫螢光顯微鏡（原始放大倍率：400倍）來偵測LSCs（ΔNp63α，綠色）與BrdU（紅色）。每一處理組別中隨機選取10個區域進行照相，並計算全體ΔNp63α陽性細胞中，BrdU與ΔNp63α雙陽性細胞（淡粉色）的百分比。*P< 0.002，相較於對照組細胞。
    第2A圖提供了照片，且第2B圖為柱狀圖；這些圖式說明了根據本發明另一實驗例，不同處理組別的小鼠角膜傷口癒合的情形。在小鼠眼睛上形成直徑約2 mm的角膜傷口，接著以局部螢光素（fluorescein）將小鼠眼睛染色，其後利用電荷耦合元件相機（Olympus）擷取螢光素染色之角膜照片。本實驗例包含九種處理組別，其中對照組每日一次給予20 μl含DMSO（低於0.05 μL）的眼藥膏，而其他實驗組分別每日一次給予20 μl含合成胜肽（50 μM）之眼藥膏。利用Adobe Photoshop CS3 10.0來測量傷口面積。柱狀圖中，將小鼠角膜中殘餘上皮缺損（residual epithelial defect）表示成相對於原始傷口的百分比。在24小時與48小時，相對於對照組皆有顯著差異。*P< 0.05，相較於對照組。
    第3A圖提供了免疫螢光顯微照片，且第3B圖為柱狀圖；這些圖式說明了根據本發明又一實驗例，於角膜受傷後24小時活體內輪部增殖之情形。分別利用對BrdU與ΔNp63α具專一性的抗體來進行雙重免疫染色，以觀察經對照組眼藥膏與含合成胜肽（29-mer、20-mer與18-mer）之眼藥膏處理的小鼠眼睛切片。經Hoechst 33258對比染色確認ΔNp63α於細胞核中表現。*P < 0.005相較於對照組小鼠眼睛。
    第4A圖提供了組織切片照片（圖左，蘇木色素與伊紅（Hematoxylin and Eosin，簡稱H&E）染色，放大倍率：400倍）、免疫螢光顯微照片（圖中，放大倍率：1000倍）以及合併照片（圖右）；這些照片顯示根據本發明前述實驗例，小鼠於角膜受傷後第5天的輪部表皮分層結構。免疫螢光分析呈現出輪部中ΔNp63α陽性細胞的分布與表現量。「正常」表示未受傷的眼睛。正常眼睛的角膜沒有ΔNp63α陽性細胞，在此作為ΔNp63α的陰性免疫染色對照。第4B圖為柱狀圖，闡明在輪部之ΔNp63α陽性細胞的表現量。每一處理組中取六隻小鼠，且在每一小鼠輪部取六個區域來進行免疫螢光評估。將經標記細胞除以經Hoechst 33258螢光核染色所觀察到的細胞總數，以計算標記指數（labeling index）。*P < 0.005；相較於對照組小鼠眼睛。
    第5A圖提供了免疫螢光顯微照片，且第5B圖為柱狀圖；這些圖式說明了根據本發明一實驗例，不同處置組別之HFSC的試管內增殖情形。利用BrdU染色2小時來觀察HFSC增殖。其後利用免疫螢光顯微鏡（原始放大倍率：1000倍）來偵測HFSCs（Lgr6，綠色）與BrdU（紅色）。每一處理組別中隨機選取20個區域進行照相，並計算全體Lgr6陽性細胞中，BrdU與Lgr6雙陽性細胞（淡粉色）的百分比。*P< 0.001，相較於對照組細胞。
    第6A圖提供了照片，而第6B圖為柱狀圖；這些圖式說明了根據本發明另一實驗例，不同處理組別的小鼠皮膚（表皮）傷口癒合的情形。於C57BL/6小鼠背部形成直徑約4 mm的穿孔創傷，並每日一次塗抹皮膚軟膏。利用電荷耦合元件相機（Olympus）擷取傷口部位與尺標（單位10 mm）之影像。殘餘上皮缺損（%）係表示成相對於原始傷口的百分比。所示數據為平均值±標準誤差（SE）。在受傷後4天與7天，相對於對照組皆有顯著差異(*P < 0.05)。
    第7A至7E圖中的照片與資料顯示根據本發明上述實驗例，在受傷後第4天的傷口癒合情形。第7A圖為經過曼森氏三色（Masson trichrome）染色後之皮膚樣本的代表照片（原始放大倍率：100倍），如圖所示，經29-mer與20-mer處理的傷口癒合情形較佳。倒三角形（▼）與箭號（↓）分別標記初始傷口邊緣以及高度增生上皮組織（hyperproliferative epithelium）的最遠端。圖中過度增生上皮組織（HE）為紅色；肉芽組織（granulation tissue，GT）為藍色；痂（eschar，ES）為暗紅色。所示照片為每一處理組中10-16個傷口（每隻小鼠兩個傷口）的代表性照片。第7B圖為柱狀圖，闡明了每一處理組中小鼠的殘餘上皮缺損（%）；進行定量分析時僅採用位於傷口中間部位的切片。所示數據為平均值±標準誤差（SE）。*P < 0.02；相較於對照組小鼠傷口。第7C圖為傷口邊緣的代表性照片，其中肉芽組織（GT）為藍色；痂（ES）為暗紅色。在經29-mer處理的傷口中可觀察到較厚的HE。第7D與7E圖所示的柱狀圖提供了利用Adobe Photoshop CS3 10.0所得之HE與GT面積的定量分析。*P < 0.02；相較於對照組小鼠傷口。
    第8A與8B圖提出了根據本發明上述實驗例，在受傷後第7天的傷口癒合情形。第8A圖為經過曼森氏三色染色後之皮膚樣本的代表照片（原始放大倍率：100倍），如圖所示，經29-mer、Mo 29-mer與20-mer處理的傷口癒合情形較佳。倒三角形（▼）與箭號（↓）分別標記初始傷口邊緣以及高度增生上皮組織（hyperproliferative epithelium）的最遠端。第8B圖為柱狀圖，闡明了每一處理組中小鼠的殘餘上皮缺陷（%）；進行定量分析時僅採用位於傷口中間部位的切片。所示數據為平均值±標準誤差（SE）。*P < 0.05；相較於對照組小鼠傷口。
    第9A與9B圖為根據本發明上述實施例，在受傷後第4天之細胞複製情形的組織學分析。第9A圖呈現了以BrdU進行免疫組織學染色之樣本照片，藉以觀察DNA複製（深咖啡色），並以蘇木色素進行對比染色以觀察細胞核。代表性的照片中顯示細胞複製主要發生在HE組織的基底層，如圖中箭號（↓）所示。（原始放大倍率：200倍）。第9B圖為柱狀圖，闡明HE組織的基底層的BrdU陽性細胞數目。將經標記細胞除以位於HE組織的基底層的細胞總數，以計算標記指數。*P < 0.05；相較於對照組小鼠傷口。
    第10A與10B圖為根據本發明上述實施例，在受傷後第4天之HFSCs分布的組織學分析。第10A圖呈現了以Lgr6進行免疫組織學染色之樣本照片，藉以觀察位於HE組織的衍生自HFSC的細胞，並以蘇木色素進行對比染色以觀察細胞核。（原始放大倍率：400倍）。第10B圖所示的照片顯示了經含20-mer的藥膏處理之傷口以BrdU-與Lgr6-專一性抗體染色的結果。經Hoechst 33258對比染色確認Lgr6於細胞核中表現。
    無
    权利要求:
    Claims (10)
    [1] 一種用以促進幹細胞增殖之合成胜肽，其係由一長度為20-39個胺基酸殘基的胺基酸序列所組成，其中該胺基酸序列與序列編號1具有至少80%的胺基酸序列相似度，且該該胺基酸序列包含至少20個連續胺基酸殘基，其與序列編號1的第11–30個胺基酸殘基具有至少90%的胺基酸序列相似度，藉使該合成胜肽能有效促進輪部上皮幹細胞或毛囊幹細胞之增殖。
    [2] 如請求項1所述的合成胜肽，其中該胺基酸序列係選自由：序列編號1、序列編號2、序列編號3、序列編號5、序列編號7以及序列編號8所組成之群組。
    [3] 一種用以促進幹細胞增殖之組合物，包含：一有效量的如請求項1所述的合成胜肽；以及一載體。
    [4] 如請求項3所述的組合物，其中該載體為一粉末狀培養基，其可用以培養該幹細胞。
    [5] 如請求項4所述的組合物，其中該合成胜肽在該組合物中之含量為1-100 nM。
    [6] 如請求項5所述的組合物，其中該合成胜肽在該組合物中之含量為25-50 nM。
    [7] 如請求項3所述的組合物，其中該載體為一藥學上可接受載體，其係選自由：一液體、膠體、乳霜、乳膏、黏著劑、羊膜、皮膚替代物、人工皮膚與皮膚均等物所組成的群組。
    [8] 如請求項3所述的組合物，其中該胺基酸序列係選自由：序列編號1、序列編號2、序列編號3、序列編號5、序列編號7以及序列編號8所組成之群組。
    [9] 一種用以促進幹細胞增殖之方法，包含對使該幹細胞接觸一有效量的如請求項1所述的合成胜肽，以促進該幹細胞的增殖，其中該幹細胞為輪部上皮幹細胞或毛囊幹細胞。
    [10] 如請求項9所述的方法，其中該胺基酸序列係選自由：序列編號1、序列編號2、序列編號3、序列編號5、序列編號7以及序列編號8所組成之群組。
    类似技术:
    公开号 | 公开日 | 专利标题
    TWI449708B|2014-08-21|色素上皮衍生因子衍生之多胜肽於促進幹細胞增殖與傷口癒合之用途
    US10092624B2|2018-10-09|Methods of treating cancers with peptide-based modulators
    JP4750690B2|2011-08-17|創傷治癒のための、カテリシジンｌｌ−３７、および、それらの誘導体の使用
    DK2968679T3|2018-04-23|IMPROVED PROCEDURE FOR PREPARING EXTRACELLULAR MATRIX COMPOSITIONS
    Shatos et al.2012|Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland
    AU2012387503B2|2016-11-03|Use of PEDF-derived polypeptides for promoting muscle or tendon regeneration or arteriogenesis
    TW201410253A|2014-03-16|免疫調節蛋白於促進傷口癒合或組織損傷治療的用途
    US20120141410A1|2012-06-07|Method and composition for the treatment of moderate to severe keratoconjunctivitis sicca
    Song et al.2020|Mesenchymal stem cells decrease M1/M2 ratio and alleviate inflammation to improve limb ischemia in mice
    Cheng et al.2020|Influence of human platelet lysate on extracellular matrix deposition and cellular characteristics in adipose-derived stem cell sheets
    RU2620342C1|2017-05-24|Косметическое средство на основе продуктов секреции мезенхимных стволовых/стромальных клеток жировой ткани человека и способ его получения
    TW202010513A|2020-03-16|Pedf衍生之短肽在肌腱癒合中的應用
    TWI491616B|2015-07-11|色素上皮衍生因子衍生之多胜肽於促進肌肉或肌腱再生或動脈血管生成之用途
    TWI672147B|2019-09-21|以外源性粒線體爲有效成份之組合物、其用途及修復細胞之方法
    Ogawa et al.2021|The Effects of Amniotic Membrane Transplantation on Vocal Fold Regeneration
    WO2020257626A1|2020-12-24|Methods of promoting vasculogenesis
    同族专利:
    公开号 | 公开日
    US20120245097A1|2012-09-27|
    CN102690344B|2017-08-22|
    US20150183832A1|2015-07-02|
    EP2508196A1|2012-10-10|
    US9051547B2|2015-06-09|
    US9617311B2|2017-04-11|
    CN102690344A|2012-09-26|
    EP2508196B1|2018-09-26|
    TWI449708B|2014-08-21|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    TWI449532B|2012-09-19|2014-08-21|Mackay Memorial Hospital|色素上皮衍生因子衍生之多胜肽於預防和／或緩和皮膚老化之用途|
    TWI491616B|2012-08-09|2015-07-11|Mackay Memorial Hospital|色素上皮衍生因子衍生之多胜肽於促進肌肉或肌腱再生或動脈血管生成之用途|
    TWI554521B|2011-10-19|2016-10-21|台灣基督長老教會馬偕醫療財團法人馬偕紀念醫院|色素上皮衍生因子衍生之多胜肽於治療禿髮和／或毛髮脫色之用途|WO2005041887A2|2003-10-29|2005-05-12|The Johns Hopkins University|Pigment epithelium-derived factor, novel biological activity and methods of use|
    WO2007095350A2|2006-02-15|2007-08-23|Yale University|Compositions and methods for use of pigment epithelial derived factor peptide fragments|
    ES2329636B2|2006-02-17|2010-07-26|Universitat De Valencia, Estudi General |Uso del factor pedf para inducir la auto-renovacion de celulas madre.|CN102757497B|2012-07-16|2014-09-17|中山大学|一种抗pedf单克隆抗体及其制备方法和应用|
    AU2012387503B2|2012-08-09|2016-11-03|Mackay Memorial Hospital|Use of PEDF-derived polypeptides for promoting muscle or tendon regeneration or arteriogenesis|
    JP2015529669A|2012-09-17|2015-10-08|マクカイ メモリアル ホスピタル|脱毛症及び／又は毛髪色素脱失を治療するためのｐｅｄｆ由来のポリペプチドの使用|
    CN104903346B|2012-09-19|2019-04-09|财团法人台湾基督长老教会马偕纪念社会事业基金会马偕纪念医院|Pedf衍生的多肽在预防和/或缓和皮肤老化中的用途|
    EP2897974B1|2012-09-20|2018-03-28|Mackay Memorial Hospital|Use of pedf-derived polypeptides for treating osteoarthritis|
    WO2018067244A1|2016-10-07|2018-04-12|Brim Biotechnology, Inc.|Compositions comprising pedf-derived short peptides and uses thereof|
    CN107602691A|2017-08-22|2018-01-19|徐州医科大学|色素上皮衍生因子的衍生多肽系列对于保护缺血心肌的用途|
    TW202010513A|2018-04-08|2020-03-16|全福生物科技股份有限公司|Pedf衍生之短肽在肌腱癒合中的應用|
    WO2019213640A2|2018-05-04|2019-11-07|Brim Biotechnology, Inc.|Pedf-derived peptides for promoting meibomian gland regeneration and uses thereof|
    WO2021077125A2|2019-10-06|2021-04-22|Brim Biotechnology, Inc.|Compositions comprising pedf-derived short peptidesand uses thereof|
    法律状态:
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    TW100109945||2011-03-23||
    TW101109972A|TWI449708B|2011-03-23|2012-03-23|色素上皮衍生因子衍生之多胜肽於促進幹細胞增殖與傷口癒合之用途|TW101109972A| TWI449708B|2011-03-23|2012-03-23|色素上皮衍生因子衍生之多胜肽於促進幹細胞增殖與傷口癒合之用途|
    [返回顶部]