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    本發明係關於經改良之免疫原性組合物及疫苗、其製備方法及其醫藥用途。特定而言，本發明係關於選自肺炎球菌溶血素及多組胺酸三合體家族成員(例如PhtD)之非偶聯(unconjugated)肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)蛋白之免疫原性組合物，其包括含有QS21及單磷醯脂質A(MPL)之佐劑，且以脂質體形式呈現。
    公开号:TW201309327A
    申请号:TW101117268
    申请日:2012-05-15
    公开日:2013-03-01
    发明作者:Philippe Denoel；Jan Poolman；Vincent Verlant；Hugues Wallemacq
    申请人:Glaxosmithkline Biolog Sa；
    IPC主号:A61K39-00
    专利说明:
    疫苗
    本發明係關於經改良免疫原性組合物及疫苗、其製備方法及其醫藥用途。特定而言，本發明係關於選自肺炎球菌溶血素及多組胺酸三合體家族成員(例如PhtD)之非偶聯肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)蛋白之免疫原性組合物，其包括含有QS21及單磷醯脂質A(MPL)之佐劑且呈現為脂質體形式。
    肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae、S.pneumoniae)亦稱為肺炎球菌，其係革蘭氏(Gram)陽性細菌。肺炎鏈球菌係全世界之重大公共健康問題且會導致較大之發病率及死亡率，尤其係在嬰兒、老年人及免疫力減弱之人員中。肺炎鏈球菌會引起寬範圍之重要人類病況，包含社區獲得性肺炎、急性鼻竇炎、中耳炎、腦膜炎、菌血症、敗血症、骨髓炎、敗血性關節炎、心內膜炎、腹膜炎、心包炎、蜂窩織炎及腦膿腫。據估計，肺炎鏈球菌每年僅在美國即係3,000例腦膜炎、50,000例菌血症、500,000例肺炎及7,000,000例中耳炎中之致病因子(Reichler,M.R.等人，1992,J.Infect.Dis.166：1346；Stool,S.E.及Field,M.J.,1989 Pediatr.Infect.Dis J.8：S11)。在發達國家及發展中國家中，由肺炎球菌疾病所致之死亡率在年齡小於5歲之兒童中尤其地高。老年人、免疫力減弱者及患有其他潛在病狀(糖尿病、哮喘)之患者亦尤其易於發生該疾病。
    已充分識別由肺炎鏈球菌引起之主要臨床症狀並論述於所有標準醫學教科書中(Fedson D S,Muscher D M.：Plotkin S A,Orenstein W A(編者)。Vaccines.第4版。Philadelphia WB Saunders公司，2004a：529-588)。舉例而言，將侵襲性肺炎球菌疾病(IPD)定義為自血液或另一通常無菌之位點分離肺炎鏈球菌之任一感染(Musher D M.Streptococcus pneumoniae.Mandell G L,Bennett J E,Dolin R(編輯)。Principles and Practice of Infectious diseases(第5版)。New York,Churchill Livingstone,2001，第2128-2147頁)。
    慢性阻塞性肺疾病係肺之慢性發炎性疾病且係全世界中發病率及死亡率之主要病因。2005年在美國，20名死亡者中大約有一名患有COPD作為基本病因。(Drugs and Aging 26：985-999(2009))。預計在2020年，COPD將上升為失能調整存活人年(disability adjusted life years)、慢性導致虛弱之疾病(chronic invalidating diseases)之第五主要病因，且成為死亡之第三最重要病因(Lancet 349：1498-1504(1997))。
    COPD過程之特徵在於氣流限制之逐漸惡化且肺功能發生衰退。COPD可併發於頻繁及復發之急性加重(AE)，該等急性加重與巨大健康護理支出及高發病率有關。(Proceedings of the American Thoracic Society 4：554-564(2007))。一研究表明，COPD中大約50%之症狀急性加重係由非分型流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、黏膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、肺炎鏈球菌及綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)引起。(Drugs and Aging 26：985-999(2009))。流感嗜血桿菌發現於20-30%之COPD加重中；肺炎鏈球菌發現於10-15%之COPD加重中；且黏膜炎莫拉菌發現於10-15%之COPD加重中。(New England Journal of Medicine 359：2355-2365(2008))。已展示，流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌及黏膜炎莫拉菌係香港、韓國及菲律賓中之枝氣管炎急性加重中之原發性病原體，而克雷伯氏菌屬(Klebsiella spp.)、綠膿桿菌及不動桿菌屬(Acinetobacter spp.)構成其他亞洲國家/地區(包含印度尼西亞、泰國、馬來西亞及臺灣)中之大量病原體(Respirology,(2011)16,532-539；doi：10.1111/j.1440.1843.2011.01943.x)。在孟加拉國，20%之COPD患者展示關於假單胞菌(Pseudomonas)、克雷伯氏菌、肺炎鏈球菌及流感嗜血桿菌之陽性痰培養液，而65%之AECOPD患者展示關於假單胞菌、克雷伯氏菌、不動桿菌、腸桿菌(Enterobacter)、黏膜炎莫拉菌及其組合之陽性培養液。(Mymensingh Medical Journal 19：576-585(2010))。然而，其表明，預防COPD加重之兩種最重要措施係主動免疫及藥物療法之慢性維持。(Proceedings of the American Thoracic Society 4：554-564(2007))。
    儘管抗微生物藥物之發現已減小了源自肺炎球菌疾病之總死亡率，但肺炎鏈球菌之抗生素抗性菌株之出現係嚴重且快速增加之問題。因此，研發抵抗肺炎鏈球菌之有效疫苗較為重要。有效肺炎球菌疫苗可對於與肺炎鏈球菌疾病有關之發病率及死亡率具有重大影響。
    本發明係關於呈現為脂質體形式之非偶聯肺炎鏈球菌蛋白之免疫原性組合物。業內已知脂質體調配物，且已表明其可用作佐劑組合物(WO96/33739、WO07/068907)。WO96/33739揭示某些疫苗(其含有抗原、衍生自奎拉雅屬皂樹(Quillaja Saponaria Molina)之樹皮之免疫活性部分(例如QS21)及固醇，且可呈現為脂質體形式)及脂質體之製備方法。WO07/068907揭示某些包括抗原或抗原性製劑與佐劑之組合之免疫原性組合物，該佐劑包括衍生自奎拉雅屬皂樹之樹皮且呈現為脂質體形式之免疫活性皂苷部分及脂多糖，其中該等皂苷部分及脂多糖皆以低於30 μg含量之人類劑量存在。
    然而，仍需要經改良疫苗組合物，尤其係更有效地預防或改善老年人及幼兒之肺炎球菌疾病者。本發明提供基於非偶聯肺炎鏈球菌蛋白及佐劑之特定組合之經改良疫苗。
    本發明者已發現，非偶聯肺炎鏈球菌蛋白(其選自肺炎球菌溶血素及多組胺酸三合體家族成員(例如PhtD))與佐劑(其包括QS21、單磷醯脂質A(MPL)、磷脂及固醇)組合之呈現為脂質體形式之疫苗或免疫原性組合物具有有利性質。已發現非偶聯肺炎鏈球菌蛋白及佐劑之此組合可提供增強之免疫原性反應。
    因此，在本發明之第一態樣中，提供呈現為脂質體形式之免疫原性組合物，其包括至少一種選自肺炎球菌溶血素及多組胺酸三合體家族成員(例如PhtD)之非偶聯肺炎鏈球菌蛋白及包括QS21、單磷醯脂質A(MPL)、磷脂及固醇之佐劑。
    在本發明之另一態樣中，提供呈現為脂質體形式之疫苗組合物，其包括至少一種選自肺炎球菌溶血素及多組胺酸三合體家族成員(例如PhtD)之非偶聯肺炎鏈球菌蛋白及包括QS21、單磷醯脂質A(MPL)、磷脂及固醇之佐劑。
    在本發明之另一態樣中，提供治療或預防由肺炎鏈球菌感染引起之疾病之方法，其包括向有需要之個體實施肌內投與，包括向該個體投與呈現為脂質體形式之免疫原性組合物，該免疫原性組合物包括至少一種選自肺炎球菌溶血素及多組胺酸三合體家族成員(例如PhtD)之非偶聯肺炎鏈球菌蛋白及包括QS21、單磷醯脂質A(MPL)、磷脂及固醇之佐劑。
    在本發明之另一態樣中，提供呈現為脂質體形式之免疫原性組合物(其包括至少一種選自肺炎球菌溶血素及多組胺酸三合體家族成員(例如PhtD)之非偶聯肺炎鏈球菌蛋白及包括QS21、單磷醯脂質A(MPL)、磷脂及固醇之佐劑)之用途，其用以製造用於治療或預防由肺炎鏈球菌感染引起之疾病之藥劑。
    本發明提供呈現為脂質體形式之免疫原性組合物，其包括至少一種選自肺炎球菌溶血素及多組胺酸三合體家族成員(例如PhtD)之非偶聯肺炎鏈球菌蛋白及包括QS21、單磷醯脂質A(MPL)、磷脂及固醇之佐劑。肺炎鏈球菌蛋白係「非偶聯」，此意指該蛋白質並不共價結合至糖(例如作為載體蛋白)。 肺炎球菌溶血素
    在一態樣中，本發明提供呈現為脂質體形式之免疫原性組合物，其包括至少一種選自肺炎球菌溶血素之非偶聯肺炎鏈球菌蛋白及包括QS21、單磷醯脂質A(MPL)、磷脂及固醇之佐劑。在一實施例中，本發明之免疫原性組合物包括3 μg至90 μg、3 μg至20 μg、20 μg至40 μg或40 μg至70 μg(例如10 μg、30 μg或60 μg)非偶聯肺炎球菌溶血素/人類劑量。
    肺炎球菌溶血素或「Ply」意指：來自肺炎球菌之原始或野生型肺炎球菌溶血素、重組肺炎球菌溶血素及其片段及/或變體。在一實施例中，肺炎球菌溶血素係來自肺炎球菌之原始或野生型肺炎球菌溶血素或重組肺炎球菌溶血素。肺炎球菌溶血素係發現於所有肺炎鏈球菌菌株中之53 kDa硫醇活化之細胞溶素，其自我釋放且引起肺炎鏈球菌之發病。其高度保守且僅在不同血清型之Ply蛋白之間發生少量胺基酸取代。肺炎球菌溶血素係具有不同細胞溶解(溶血)及補體活化活性之多功能毒素(Rubins等人，Am.Respi.Cit Care Med,153：1339-1346(1996))。其效應包含(例如)刺激藉由人類單核細胞產生發炎性細胞因子、抑制人類呼吸道上皮上之纖毛拍動及降低嗜中性粒細胞之殺菌活性及遷移。肺炎球菌溶血素之最明顯效應係紅血細胞之裂解作用，此涉及與膽固醇之結合。業內已知野生型或原始肺炎球菌溶血素之表現及選殖。例如參見Walker等人(Infect Immun,55：1184-1189(1987))、Mitchell等人(Biochim Biophys Acta,1007：67-72(1989)及Mitchell等人(NAR,18：4010(1990))。WO2010/071986闡述野生型Ply，例如SEQ ID 2-42(例如SEQ ID 34、35、36、37、41)。在一態樣中，肺炎球菌溶血素係WO2010/071986之Seq ID No.34。在另一態樣中，肺炎球菌溶血素係WO2010/071986之Seq ID No.35。在另一態樣中，肺炎球菌溶血素係WO2010/071986之Seq ID No.36。在另一態樣中，肺炎球菌溶血素係WO2010/071986之Seq ID No.37。在另一態樣中，肺炎球菌溶血素係WO2010/071986之Seq ID No.41。另外，EP1601689B1闡述藉由層析在洗滌劑及高濃度鹽存在下純化細菌細胞溶素(例如肺炎球菌溶血素)之方法。
    本說明書中所使用之術語「片段」係能夠誘發宿主動物中之體液及/或細胞免疫反應之部分。可使用業內已知之技術(例如以重組方式、藉由蛋白水解消化或藉由化學合成)產生蛋白質片段。可藉由自編碼多肽之核酸之一端(對於末端片段而言)或兩端(對於內部片段而言)去除一或多個核苷酸來生成多肽之內部或末端片段。通常，片段包括全長序列之至少10、20、30、40或50個連續胺基酸。可易於藉由在N及C末端之一者或二者中增加或去除1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50個胺基酸來修飾片段。
    本說明書中所使用之術語「保守胺基酸取代」涉及使用非原始殘基取代原始胺基酸殘基，從而對於該位置處胺基酸殘基之大小、極性、電荷、疏水性或親水性具有較小或沒有影響且不會導致免疫原性降低。舉例而言，該等取代可為下列基團內之取代：纈胺酸、甘胺酸；甘胺酸、丙胺酸；纈胺酸、異白胺酸、白胺酸；天門冬胺酸、麩胺酸；天門冬醯胺酸、麩醯胺酸；絲胺酸、蘇胺酸；離胺酸、精胺酸；及苯丙胺酸、酪胺酸。對於多肽序列之保守胺基酸修飾(及對於編碼核苷酸之相應修飾)可產生與親代多肽之彼等功能及化學特性具有類似特性之多肽。
    本說明書中所使用之術語「缺失」係自蛋白質序列去除一或多個胺基酸殘基。通常，在蛋白質分子內之任一位點處缺失不超過約1至6個殘基(例如1至4個殘基)。
    本說明書中所使用之術語「插入」係在蛋白質序列中增加一或多個非原始胺基酸殘基。通常，在蛋白質分子內之任一位點處插入不超過約1至6個殘基(例如1至4個殘基)。
    在一實施例中，本發明包含核酸或胺基酸序列與野生型序列相比具有差異之肺炎球菌溶血素之片段及/或變體。在使用肺炎球菌溶血素之片段時，該等片段之長度為至少約15、至少約20、至少約40或至少約60個連續胺基酸殘基。在本發明之一實施例中，肺炎球菌溶血素之免疫原性片段包括全長序列之至少約15、至少約20、至少約40或至少約60個連續胺基酸殘基，其中該多肽能夠誘發該胺基酸序列之特異性免疫反應。已知肺炎球菌溶血素由4個主要結構域組成(Rossjohn等人，Cell.1997年5月30日；89(5)：685-92)。可藉由去除及/或修飾該等結構域中之一或多者來修飾該等結構域。在一實施例中，該片段或每一片段恰好含有或含有至少1、2或3個結構域。在另一實施例中，該片段或每一片段恰好含有或含有至少2或3個結構域。在另一實施例中，該片段或每一片段含有至少3個結構域。該片段或每一片段可與野生型肺炎球菌溶血素序列大於50%、60%、70%、80%、90%一致或100%一致。
    根據本發明，肺炎球菌溶血素之變體包含與野生型序列相比取代及/或缺失及/或插入一或多個胺基酸之序列。胺基酸取代可為保守或非保守取代。在一態樣中，胺基酸取代係保守取代。可在單一變體中組合取代、缺失、插入或其任一組合，只要該變體係免疫原性多肽即可。肺炎球菌溶血素變體通常包含與野生型肺炎球菌溶血素序列(例如來自WO2010/071986之SEQ ID 2-42，例如SEQ ID 34、35、36、37、41)共享至少80%、90%、94%、95%、98%或99%胺基酸序列一致性之任一肺炎球菌溶血素或任一肺炎球菌溶血素片段。在一實施例中，肺炎球菌溶血素變體通常包含與來自WO2010/07198之SEQ ID 36共享至少80%、90%、94%、95%、98%或99%胺基酸序列一致性之任一肺炎球菌溶血素或任一肺炎球菌溶血素片段。在一實施例中，本發明包含以任一組合取代、缺失或增加若干個、5至10、1至5、1至3、1至2或1個胺基酸之片段及/或變體。在另一實施例中，本發明包含含有B細胞或T細胞表位之片段及/或變體。可使用2D結構預測(例如使用PSIPRED程式，其來自David Jones,Brunel Bioinformatics Group,Dept.Biological Sciences,Brunel University,Uxbridge UB8 3PH,UK)及基於由Jameson及Wolf所闡述之方法計算之抗原性指數(CABIOS 4：181-186[1988])之組合來預測該等表位。肺炎球菌溶血素變體闡述於(例如)WO04/43376、WO05/108580、WO05/076696、WO10/071986、WO10/109325(SEQ ID 44、45及46)及WO10/140119(SEQ ID 50及51)中。在一實施例中，本發明之免疫原性組合物包括肺炎球菌溶血素之變體，例如，彼等闡述於WO05/108580、WO05/076696、WO10/071986中者。
    在本發明之一實施例中，肺炎球菌溶血素及其片段及/或其變體具有與野生型肺炎球菌溶血素序列(例如來自WO2010/071986之SEQ ID 34、35、36、37、41)共享至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致性之胺基酸序列。在本發明之另一實施例中，肺炎球菌溶血素及其片段及/或其變體包括野生型肺炎球菌溶血素序列之至少約15、至少約20、至少約40或至少約60個連續胺基酸殘基。
    通常在去毒(亦即在以適於保護之劑量提供時使其對人類無毒)之後投與肺炎球菌溶血素。如本文中所使用，應理解，術語「dPly」係指適於醫學應用之去毒肺炎球菌溶血素(亦即無毒)。可以化學方式及/或以基因方式將肺炎球菌溶血素去毒。因此，在一實施例中，本發明之免疫原性組合物包括dPly。
    可藉由化學方式(例如使用交聯劑)來實施肺炎球菌溶血素之去毒，該交聯劑係(例如)甲醛、戊二醛及含有N-羥基琥珀醯亞胺基酯及/或馬來醯亞胺基團之交聯試劑(例如GMBS)或該等物質之組合。用於各種毒素之該等方法在業內已眾所周知，例如參見EP1601689B1、WO04/081515、WO2006/032499。用於化學去毒中之肺炎球菌溶血素可為原始或重組蛋白或已經基因改造以減小其毒性之蛋白質(參見下文)。亦可藉由化學方式將肺炎球菌溶血素之融合蛋白或肺炎球菌溶血素之片段及/或變體去毒。因此，在一實施例中，本發明之免疫原性組合物可包括已以化學方式去毒(例如藉由甲醛處理)之肺炎球菌溶血素。
    亦可以基因方式將肺炎球菌溶血素去毒。因此，本發明涵蓋可為(例如)突變蛋白之肺炎球菌蛋白。本文所使用之術語「突變」意指(例如)藉由使用用定點誘變之熟知技術或任一其他習用方法缺失、增加或取代一或多個胺基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個胺基酸)之分子。在一實施例中，分子缺失或取代1-15個、適宜地10-15個胺基酸。突變序列可去除不合意活性(例如針對人類紅細胞及其他細胞之膜滲透、細胞裂解及細胞溶解活性)以減小毒性，同時在投與人類後保留誘導抗肺炎球菌溶血素保護性及/或中和抗體之能力。亦可藉由基因方式將肺炎球菌溶血素之融合蛋白或肺炎球菌溶血素之片段及/或變體去毒。可使用標準分子生物學及生物化學技術引入該等修飾中之任一者。舉例而言，如上所述，可改變突變肺炎球菌溶血素蛋白從而其在生物上係惰性同時仍維持其免疫原性表位，例如參見WO90/06951、Berry等人(Infect Immun,67：981-985(1999))及WO99/03884。舉例而言，可藉由三個胺基酸取代(包括T65至C、G293至C及C248至A)將肺炎球菌溶血素蛋白去毒。可用於本發明中之以基因方式去毒之肺炎球菌溶血素之另一實例係來自WO2011/075823之SEQ ID 9。因此，在另一實施例中，本發明之免疫原性組合物可包括以基因方式去毒之肺炎球菌溶血素。
    可使用各種技術之組合將肺炎球菌溶血素去毒。舉例而言，本發明之免疫原性組合物可包括以化學方式及基因方式去毒之肺炎球菌溶血素。 多組胺酸三合體家族蛋白
    在另一態樣中，本發明提供呈現為脂質體形式之免疫原性組合物，其包括至少一種選自多組胺酸三合體家族成員(例如PhtD)之非偶聯肺炎鏈球菌蛋白及包括QS21、單磷醯脂質A(MPL)、磷脂及固醇之佐劑。在一實施例中，本發明之免疫原性組合物包括3 μg至90 μg、3 μg至20 μg、20 μg至40 μg或40 μg至70 μg(例如10 μg、30 μg或60 μg)選自多組胺酸三合體家族成員(例如PhtD)之非偶聯肺炎鏈球菌蛋白/人類劑量。
    Pht(多組胺酸三合體，PhtX)家族包括蛋白質PhtA、PhtB、PhtD及PhtE。該家族之特徵在於脂質化序列、由富含脯胺酸之區域分開之兩個結構域及若干組胺酸三合體，其可能涉及金屬或核苷結合或酶活性、(3至5)捲曲螺旋區域、保守N-末端及異質C末端。
    術語「多組胺酸三合體家族成員」包含全長多組胺酸三合體家族(Pht)蛋白、其片段或融合蛋白或免疫功能等效物。該等成員可選自具有與揭示於WO00/37105或WO00/39299中之序列共享至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致性之胺基酸序列之PhtA、PhtB、PhtD或PhtE蛋白。在使用Pht蛋白之片段(單獨或作為融合蛋白之一部分)之情形下，該等片段之長度為至少約15、至少約20、至少約40或至少約60個連續胺基酸殘基，例如來自WO00/37105或WO00/39299中之Pht胺基酸序列，其中該多肽能夠誘發WO00/37105或WO00/39299中之該胺基酸序列之特異性免疫反應。在一實施例中，該片段或每一片段恰好含有或含有至少2、3、4或5個組胺酸三合體基序(視情況，具有位於2個或更多個三合體之間之原始Pht序列，或具有與原始肺炎球菌三合體內Pht序列大於50%、60%、70%、80%、90%一致或100%一致之三合體內序列)。在一實施例中，該片段或每一片段恰好含有或含有至少2、3或4個捲曲螺旋區域。融合蛋白可由PhtA、PhtB、PhtD、PhtE中之2者、3者或4者之全長或片段(例如PhtA/B、PhtA/E、PhtB/A、PhtB/E、PhtE/A、PhtE/B、PhtA/D、PhtB/D、PhtD/A、PhtD/B、PhtD/E及PhtE/D)構成，其中該等蛋白質與首次提及之物質在N端連接(參見例如WO01/98334)。
    對於PhtX蛋白而言，揭示於WO98/18930中之PhtA亦稱為Sp36。其係來自多組胺酸三合體家族之蛋白質且具有II型信號基序。PhtB揭示於WO00/37105中，且亦稱為Sp036B。PhtB家族之另一成員係C3降解多肽，如WO00/17370中所揭示。此蛋白質亦來自多組胺酸三合體家族且具有II型信號基序。免疫功能等效物係Sp42揭示於WO98/18930中之蛋白質。PhtB截短物(大約79 kD)揭示於WO99/15675中，其亦視為PhtX家族之成員。PhtE揭示於WO00/30299中且稱為BVH-3。
    在一實施例中，選自多組胺酸三合體家族成員之肺炎鏈球菌蛋白係PhtD。本文所使用之術語「PhtD」包含附接有信號序列之全長蛋白或去除信號肽(例如N-末端處之20個胺基酸)之成熟全長蛋白及片段、其變體及/或融合蛋白，例如WO00/37105之SEQ ID NO：4。PhtD亦稱為「Sp036D」。在一態樣中，PhtD係附接有信號序列之全長蛋白，例如WO00/37105之SEQ ID NO：4。在另一態樣中，PhtD係包括去除信號肽(例如N-末端處之20個胺基酸)之成熟全長蛋白之序列，例如WO00/37105之SEQ ID NO：4之胺基酸21-838。適宜地，PhtD序列包括N-末端甲硫胺酸。本發明亦包含PhtD多肽，其係PhtD之免疫原性片段、PhtD之變體及/或PhtD之融合蛋白。舉例而言，如WO00/37105、WO00/39299、US6699703及WO09/12588中所述。
    在使用PhtD蛋白之片段(單獨或作為融合蛋白之一部分)之情形下，該等片段之長度為至少約15、至少約20、至少約40或至少約60個連續胺基酸殘基，例如來自WO00/37105或WO00/39299中之PhtD胺基酸序列，例如WO00/37105之SEQ ID NO：4。在本發明之一實施例中，PhtD蛋白之免疫原性片段包括至少約15、至少約20、至少約40或至少約60個展示於WO00/37105之SEQ ID NO：4中之序列之連續胺基酸殘基，其中該多肽能夠誘發胺基酸序列之特異性免疫反應。在一實施例中，本發明之免疫原性組合物包括(例如)闡述於WO09/12601、WO01/98334及WO09/12588中之PhtD之片段。在使用PhtD蛋白之片段(單獨或作為融合蛋白之一部分)，每一片段視情況含有該等多肽之一或多個組胺酸三合體基序。組胺酸三合體基序係具有序列HxxHxH之多肽部分，其中H係組胺酸且x係除組胺酸外之胺基酸。在本發明之一實施例中，該片段或每一片段恰好含有或含有至少2、3、4或5個組胺酸三合體基序(視情況，具有位於2個或更多個三合體之間之原始PhtD序列或三合體內序列)，其中該片段與原始肺炎球菌三合體內PhtD序列(例如展示於WO00/37105之SEQ ID NO：4中之三合體內序列)大於50%、60%、70%、80%、90%一致或100%一致。PhtD蛋白之片段視情況含有該等多肽之一或多個捲曲螺旋區域。捲曲螺旋區域係由Lupus,A等人(1991)Science 252；1162-1164中之「螺旋」演算法預測之區域。在本發明之一實施例中，該片段或每一片段恰好含有或含有至少2、3或4個捲曲螺旋區域。在本發明之一實施例中，該片段或每一片段恰好含有或含有至少2、3或4個捲曲螺旋區域，其中該片段原始肺炎球菌PhtD序列(例如展示於WO00/37105之SEQ ID NO：4中之序列)大於50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%一致或100%一致。在本發明之另一實施例中，該片段或每一片段包含一或多個組胺酸三合體基序以及至少1、2、3或4個捲曲螺旋區域。
    在PhtD多肽係變體之情形下，變化通常在組胺酸三合體殘基及捲曲螺旋區域以外之部分中，雖然在該等區域之一或多者中可作變化。根據本發明，多肽變體包含與野生型序列相比一或多個胺基酸經取代及/或缺失及/或插入之序列。胺基酸取代可為保守或非保守取代。在一態樣中，胺基酸取代係保守取代。單一變體中可組合取代、缺失、插入或其任何組合，只要該變體係免疫原性多肽。PhtD之變體通常包含與野生型PhtD序列(例如WO00/37105之SEQ ID NO：4)共有至少80%、90%、95%、96%、98%或99%胺基酸序列一致性之PhtD之任何片段或變化。在一個實施例中，本發明包含若干個、5至10個、1至5個、1至3個、1至2個或1個胺基酸經取代、缺失或增加之任何組合之片段及/或變體。在另一實施例中，本發明包含含有B細胞或T細胞表位之片段及/或變體。可使用2D結構預測(例如使用PSIPRED程式，其來自David Jones,Brunel Bioinformatics Group,Dept.Biological Sciences,Brunel University,Uxbridge UB8 3PH,UK)及基於Jameson及Wolf(CABIOS 4：181-186[1988])所述方法計算之抗原性指數之組合來預測該等表位。可藉由習用分子生物學技術來產生變體。本文所使用之變體亦可包含替代鏈球菌菌株之天然存在之PhtD等位基因，其在同源性PhtD基因內之一或多個位點展現多型性。
    融合蛋白係由PhtD及PhtA、PhtB及/或PhtE全長或片段構成。融合蛋白之實例係PhtA/D、PhtB/D、PhtD/A、PhtD/B、PhtD/E及PhtE/D，其中該等蛋白質與首次提及之物質在N端連接(參見例如WO01/98334)。可例如藉由重組技術或藉由使用適當連接體用於融合先前製得之多肽或活性片段來產生融合片段或融合多肽。
    在本發明之一個實施例中，PhtD及其片段、其變體及/或融合蛋白包括與WO00/37105之SEQ ID NO：4之胺基酸序列21至838共有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之胺基酸序列。在本發明之另一實施例中，PhtD及其片段、其變體及/或融合蛋白具有與WO00/37105之SEQ ID NO：4之胺基酸序列21至838共有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之胺基酸序列。適宜地，PhtD及其片段、其變體及/或融合蛋白包括具有N端甲硫胺酸之胺基酸序列。在本發明之另一實施例中，PhtD及其片段、其變體及/或融合蛋白包括WO00/37105之SEQ ID NO：4中所示序列之至少約15個、至少約20個、至少約40個，或至少約60個，或至少約100個，或至少約200個，或至少約400個，或至少約800個連續胺基酸殘基。
    在本發明之一實施例中，PhtD及其片段、其變體及/或融合蛋白包括與WO00/39299之胺基酸序列SEQ ID NO：73共享至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之胺基酸序列。在本發明之另一實施例中，PhtD及其片段、其變體及/或融合蛋白具有與WO00/39299之胺基酸序列SEQ ID NO：73共享至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之胺基酸序列。在本發明之另一實施例中，PhtD及其片段、其變體及/或融合蛋白包括至少約15、至少約20、至少約40或至少約60或至少約100或至少約200或至少約400或至少約800個展示於WO00/39299之SEQ ID NO：73中之序列之連續胺基酸殘基。在本發明之另一實施例中，PhtD序列係來自WO2011/075823之SEQ ID NO.1或5。
    本發明亦包含與天然存在之肺炎鏈球菌多肽在並不涉及胺基酸序列之方面有所不同之PhtD蛋白。非序列修飾包含乙醯化、甲基化、磷酸化、羧基化或糖基化之變化。本發明內亦涵蓋彼等具有增加肽穩定性之修飾者；該等類似物可在肽序列中含有(例如)一或多個非肽鍵(其代替肽鍵)。本發明內亦涵蓋包含除天然存在之L-胺基酸(例如D-胺基酸)或非天然存在或合成胺基酸(例如β或γ胺基酸)外之殘基之類似物及環狀類似物。
    在一態樣中，本發明之免疫原性組合物包括至少一種選自肺炎球菌溶血素(例如dPly)及PhtD(例如包括WO00/37105之SEQ ID NO：4之胺基酸21至838之序列)之非偶聯肺炎鏈球菌蛋白及包括QS21、單磷醯脂質A(MPL)、磷脂及固醇之佐劑，且呈現為脂質體形式。本發明之免疫原性組合物亦可含有兩種或更多種不同非偶聯肺炎鏈球菌蛋白抗原。在另一態樣中，本發明之免疫原性組合物包括2種或更多種選自肺炎球菌溶血素及PhtD之非偶聯肺炎鏈球菌蛋白。在另一實施例中，本發明之免疫原性組合物包括肺炎球菌溶血素及PhtD。舉例而言，本發明之免疫原性組合物可包括非偶聯肺炎球菌溶血素(例如dPly)及非偶聯肺炎球菌PhtD。 QS21
    本發明者已發現，組合至少一種選自肺炎球菌溶血素及多組胺酸三合體家族成員(例如PhtD)之非偶聯肺炎鏈球菌蛋白及包括QS21及單磷醯脂質A(MPL)之佐劑之免疫原性組合物會提供有利性質。
    QS-21係來自南美樹種奎拉雅皂樹(Quillaja saponaria)之樹皮提取物之純化皂苷部分。QS21通常包括兩種主要異構體，其共用三萜、具支鏈三糖及糖基化假二聚體醯基鏈。兩種異構體形式在不同之處在於直鏈四糖區段內之末端糖之構造，其中主要異構體QS-21-Api納入β-D-洋芹糖殘基，且次要異構體QS-21-Xyl之末端具有β-D-木糖取代基。(Cleland,J.L.等人，J.Pharm.Sci.1996,85,22-28)。
    可藉由來自Quil A之HPLC純化來製備QS21。Dalsgaard等人在1974(「Saponin adjuvants」，Archiv.für die gesamte Virusforschung，第44捲，Springer Verlag,Berlin，第243-254頁)中闡述Quil A具有佐劑活性。產生QS21之方法闡述於US5057540(如同QA21)及EP0362278中。在一實施例中，本發明之免疫原性組合物含有實質上純形式之QS21，亦即，QS21至少90%純，例如至少95%純或至少98%純。
    適宜地，QS21之劑量能夠增強對於人類中之抗原之免疫反應。特定而言，適宜QS21量係與非佐劑化組合物相比或與具有另一QS21量之佐劑化組合物相比改良組合物之免疫學潛力同時在致反應力特徵方面可接受之量。可(例如)以1 μg至100 μg/組合物劑量之量(例如以10 μg至50 μg/組合物劑量之量)使用QS21。QS21之適宜量為(例如)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50 μg/組合物劑量中之任一者。在一實施例中，QS21量介於25 μg至75 μg/組合物劑量之間。在一實施例中，QS21量介於1 μg至30 μg/組合物劑量、適宜地5 μg至20 μg/組合物劑量之間，例如5 μg至15 μg/組合物劑量或6 μg至14 μg/組合物劑量或7 μg至13 μg/組合物劑量。在一實施例中，最終濃度為每ml疫苗組合物含有100 μg QS21，或為50 μg/0.5 ml疫苗劑量。在另一實施例中，最終濃度為每ml疫苗組合物含有50 μg QS21，或為25 μg/0.5 ml疫苗劑量。具體而言，0.5 ml疫苗劑量體積含有25 μg或50 μg QS21/劑量。在一實施例中，本發明之免疫原性組合物包括5 μg至60 μg、45 μg至55 μg或20 μg至30 μg(例如20 μg、25 μg、30 μg、35 μg、40 μg、45 μg或50 μg)QS21。舉例而言，本發明之免疫原性組合物可包括50 μg QS21/人類劑量。適宜地，以重量計(w/w)(μg)，肺炎鏈球菌蛋白：QS21之比率為0.05：1至3：1，例如1：1至3：1。 單磷醯脂質A
    單磷醯脂質A(MPL)係革蘭氏陰性細菌(例如明尼蘇達沙門氏菌(Salmonella minnesota)R595)之脂多糖(LPS)之無毒衍生物。其保留LPS之佐劑性質同時顯示減小之毒性(Johnson等人，1987 Rev.Infect.Dis.9增刊：S512-S516)。MPL係由一系列在脂肪酸取代之程度及位置上有所不同之4'-單磷醯脂質A物質構成。其可藉由使用輕度酸及鹼水解處理LPS隨後純化經修飾LPS來製得。舉例而言，可在中等強度無機酸溶液(例如0.1 M HCl)中使LPS回流大約30分鐘之時間。此過程導致在1位處去磷酸化且在6’位處脫羧。本文所使用之術語「單磷醯脂質A(MPL)」包含單磷醯脂質A之衍生物。單磷醯脂質A之衍生物包含3D-MPL及合成衍生物。
    3D-MPL係3-O-去醯基化單磷醯脂質A(或3 De-O-醯基化單磷醯脂質A)。化學上，其係具有4、5或6個醯基化鏈之3-去醯基化單磷醯脂質A之混合物。3D-MPL可以商標MPL®自GlaxoSmithKline Biologicals North America獲得。3-O-去醯基化單磷醯脂質A(3D-MPL)。其進一步減小毒性同時仍維持佐劑活性，且通常可藉由輕度鹼水解製得，例如參見US4912094。鹼水解通常係在有機溶劑(例如氯仿/甲醇混合物)中藉由使用弱鹼水溶液(例如pH 10.5之0.5 M碳酸鈉)飽和來實施。對於製備3D-MPL之其他資訊而言，參見GB2220211A及WO02078637(Corixa公司)。在本發明之一態樣中，可使用小顆粒3 D-MPL。小顆粒3D-MPL之粒徑可使其經由0.22 μm過濾器實施無菌過濾。該等製備闡述於國際專利申請案第WO94/21292號中。在一實施例中，本發明之免疫原性組合物包括3-O-去醯基化單磷醯脂質A(3D-MPL)。
    來自革蘭氏陰性細菌之脂多糖(LPS)及其衍生物或其片段(包含3D-MPL)係能夠經由TLR-4信號傳導路徑引起信號傳導反應之TLR-4(類鐸(Toll-like)受體4)配體(Sabroe等人，JI 2003，第1630-5頁)。類鐸受體(TLR)係在昆蟲與人類之間在進化上保守之I型跨膜受體。迄今為止已確定10種TLR(TLR 1-10)。TLR家族成員具有類似之細胞外及細胞內結構域；已展示其細胞外結構域具有富含白胺酸之重複序列，且其細胞內結構域與介白素-1受體(IL-1R)之細胞內區域類似。TLR細胞在免疫細胞及其他細胞(包含血管上皮細胞、脂肪細胞、心肌細胞及腸上皮細胞)中之表現有所不同。TLR之細胞內結構域可與在細胞質區域中亦擁有IL-1R結構域之銜接蛋白Myd88相互作用，此引起細胞因子之NF-KB活化；此Myd88路徑係藉由TLR活化實現細胞因子釋放之一種方式。迄今為止實施之研究發現，TLR識別不同類型之激動劑，但一些激動劑為若干TLR所共有。
    已知脂質A之合成衍生物且將其視為TLR 4激動劑，包含但不限於：OM174(2-去氧-6-o-[2-去氧-2-[(R)-3-十二烷醯基氧基四癸醯基胺基]-4-o-磷醯基-β-D-吡喃葡萄糖基]-2-[(R)-3-羥基四癸醯基胺基]-α-D-吡喃葡萄糖基二氫磷酸酯)(WO95/14026)；OM 294 DP(3S,9 R)-3--[(R)-十二烷醯基氧基四癸醯基胺基]-4-側氧基-5-氮雜-9(R)-[(R)-3-羥基四癸醯基胺基]癸-1,10-二醇，1,10-雙(二氫磷酸酯)(WO99/64301及WO00/0462)；OM 197 MP-Ac DP(3S-,9R)-3-((R)-十二烷醯基氧基四癸醯基胺基]-4-側氧基-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基四癸醯基胺基]癸-1,10-二醇，1-二氫磷酸酯10-(6-胺基己酸酯)(WO01/46127)。
    適宜地，單磷醯脂質A(MPL)(例如3D-MPL)之劑量能夠增強對於人類中之抗原之免疫反應。特定而言，適宜單磷醯脂質A(MPL)(例如3D-MPL)量係與非佐劑化組合物相比或與具有另一MPL量之佐劑化組合物相比改良組合物之免疫學潛力同時在致反應力特徵方面可接受之量。可(例如)以1 μg至100 μg/組合物劑量之量(例如以10 μg至50 μg/組合物劑量之量)使用單磷醯脂質A(MPL)(例如3D-MPL)。單磷醯脂質A(MPL)(例如3D-MPL)之適宜量為(例如)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50 μg/組合物劑量中之任一者。在一實施例中，單磷醯脂質A(MPL)(例如3D-MPL)量介於25 μg至75 μg/組合物劑量之間。在一實施例中，3D-MPL量介於1 μg至30 μg/組合物劑量、適宜地5 μg至20 μg/組合物劑量之間，例如5 μg至15 μg/組合物劑量或6 μg至14 μg/組合物劑量或7 μg至13 μg/組合物劑量。在一實施例中，最終濃度為每ml疫苗組合物含有100 μg單磷醯脂質A(MPL)(例如3D-MPL)，或為50 μg/0.5 ml疫苗劑量。在另一實施例中，最終濃度為每ml疫苗組合物含有50 μg單磷醯脂質A(MPL)(例如3D-MPL)，或為25 μg/0.5 ml疫苗劑量。具體而言，0.5 ml疫苗劑量體積含有25 μg或50 μg單磷醯脂質A(MPL)(例如3D-MPL)/劑量。在一態樣中，本發明之免疫原性組合物包括5 μg至60 μg、45 μg至55 μg或20 μg至30 μg(例如20 μg、25 μg、30 μg、35 μg、40 μg、45 μg或50 μg)單磷醯脂質A(MPL)。舉例而言，本發明之免疫原性組合物可包括50 μg 3D-MPL/人類劑量。適宜地，以重量計(w/w)(μg)，肺炎鏈球菌蛋白：單磷醯脂質A(MPL)(例如3D-MPL)之比率為0.05：1至3：1，例如1：1至3：1。
    在另一實施例中，使用TLR分子之其他天然或合成激動劑作為可選之其他免疫刺激劑。該等物質可包含但不限於用於TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8及TLR9或其組合之激動劑(參見例如Sabroe等人，JI 2003，第1630-5頁)。可用之其他TLR4配體係胺基葡萄糖苷磷酸烷基酯(AGP)，例如，彼等揭示於WO9850399或US6303347中(亦揭示製備AGP之方法)者或AGP之醫藥上可接受之鹽(如揭示於US6764840中者)一些AGP係TLR4激動劑，且某些為TLR4拮抗劑。據信，二者均可用作佐劑。其他適宜TLR激動劑係：熱休克蛋白(HSP)10、60、65、70、75或90；表面活性蛋白A、透明質酸寡糖、硫酸乙醯肝素片段、纖維連接蛋白片段、纖維蛋白原肽及b-防衛素-2、胞壁醯二肽(MDP)或呼吸道合胞體病毒之F蛋白。在一實施例中，TLR激動劑係HSP 60、70或90。
    在本發明之一實施例中，QS21及單磷醯脂質A(MPL)(例如3D-MPL)在免疫原性組合物之每一人類劑量中以相同最終濃度存在。在另一實施例中，本發明之免疫原性組合物之人類劑量包括50 μg單磷醯脂質A(MPL)(例如3D-MPL)及50 μg QS21之最終濃度。在另一實施例中，本發明之免疫原性組合物之人類劑量包括25 μg單磷醯脂質A(MPL)(例如3D-MPL)及25 μg QS21之最終濃度。 脂質體載劑
    用於本發明組合物之佐劑包括脂質體載劑。可使用業內已知之技術自磷脂(例如二油醯基磷脂醯膽鹼DOPC)及固醇(例如膽固醇)來製備脂質體。該等脂質體載劑可攜帶QS21及/或單磷醯脂質A(MPL)(例如3D-MPL)。本發明之適宜組合物係彼等如下組合物：其中最初在沒有MPL之情形下製備脂質體(如WO96/33739中所述)，且然後適宜地以小於100 nm顆粒之較小顆粒或易於經由0.22 μm膜進行無菌過濾之顆粒形式添加MPL。MPL由此並不含於囊膜內(稱為外MPL)。MPL含於囊膜內(稱為內MPL)之組合物亦形成本發明之一態樣。非偶聯肺炎鏈球菌蛋白可含於囊膜內或含於囊膜外側。適宜可溶性抗原位於外側且疏水性或脂質化抗原含於膜之內側或外側。脂質體內囊封闡述於US4235877中。
    本發明之脂質體包括磷脂(例如磷脂醯膽鹼)，其在室溫下可為非結晶，例如蛋黃磷脂醯膽鹼、二油醯基磷脂醯膽鹼或二月桂基磷脂醯膽鹼。適宜地，磷脂係二油醯基磷脂醯膽鹼(DOPC)。另一態樣係包括0.1 mg至10 mg、0.2 mg至7 mg、0.3 mg至5 mg、0.4 mg至2 mg或0.5 mg至1 mg(例如0.4 mg至0.6 mg、0.9 mg至1.1 mg、0.5 mg或1 mg)磷脂之本發明之免疫原性組合物。在本發明之一特定實施例中，DOPC之量為1000 μg/人類劑量。在本發明之另一特定實施例中，DOPC之量為500 μg/人類劑量。
    本發明之脂質體包括固醇。固醇增加了脂質體結構之穩定性。適宜固醇包含β-植物固醇、豆固醇、麥角固醇、麥角鈣化固醇及膽固醇。該等固醇在業內已眾所周知，舉例而言，膽固醇揭示於Merck Index，第11版，第341頁中，其作為發現於動物脂肪中之天然存在之固醇。在本發明之一特定實施例中，固醇係膽固醇。通常，可在使用經固醇淬滅之QS21調配抗原製劑期間添加固醇，如WO96/33739中所述。
    添加至磷脂中之固醇之量為1%至50%(w/w)、適宜地20%至35%，例如25%。適宜地，QS21：固醇之比率介於1：10至1：1(w/w)之間，適宜地，存在過量固醇，QS21：固醇之比率為至少1：2(w/w)，例如1：5(w/w)。在一實施例中，本發明之免疫原性組合物包括0.025 mg至2.5 mg、0.05 mg至1.5 mg、0.075 mg至0.75 mg、0.1 mg至0.3 mg或0.125 mg至0.25 mg(例如0.2 mg至0.3 mg、0.1 mg至0.15 mg、0.25 mg或0.125 mg)固醇。在另一實施例中，本發明之免疫原性組合物包括250 μg固醇(例如膽固醇)/人類劑量。在另一實施例中，本發明之免疫原性組合物包括125 μg固醇(例如膽固醇)/人類劑量。
    本發明之脂質體適宜地包括於液體介質中。液體介質包括生理學可接受之液體，例如水、鹽水溶液及緩衝液(例如PBS)等。舉例而言，本發明之免疫原性組合物可包括水及磷酸鈉緩衝液。
    在本發明之一態樣中，佐劑係AS01B(例如參見WO96/33739)。在本發明之另一態樣中，佐劑係AS01E(例如參見WO2007/068907)。 其他抗原
    本發明之免疫原性組合物可包括能夠誘發針對人類或動物病原體之免疫反應之其他抗原。該等其他抗原包含(例如)其他肺炎鏈球菌抗原，例如肺炎鏈球菌蛋白抗原。在其他抗原係肺炎球菌蛋白之情形下，該蛋白質視情況偶聯至(例如)糖。視情況，肺炎球菌蛋白係非偶聯形式或以游離蛋白形式存在於免疫原性組合物中。
    在一實施例中，本發明之免疫原性組合物包括至少1種選自由以下組成之群之其他蛋白質：多組胺酸三合體家族(PhtX)、膽鹼結合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合體)、PspA、PsaA、Sp128、Sp101、Sp130、Sp125及Sp133。在另一實施例中，本發明之免疫原性組合物包括兩種或更多種選自由以下組成之群之其他蛋白質：多組胺酸三合體家族(PhtX)、膽鹼結合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合體)、PspA、PsaA及Sp128。在另一實施例中，本發明之免疫原性組合物包括兩種或更多種選自由以下組成之群之其他蛋白質：多組胺酸三合體家族(PhtX)、膽鹼結合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合體)及Sp128。
    關於膽鹼結合蛋白家族(CbpX)，該家族之成員包括N端區域(N)、保守重複區域(R1及/或R2)、富含脯胺酸之區域(P)及保守膽鹼結合區域(C)(其由多個重複構成且包括該蛋白質之約一半)。如本案中所使用，術語「膽鹼結合蛋白家族(CbpX)」係選自由以下組成之群：WO97/41151中所鑑別之膽鹼結合蛋白、PbcA、SpsA、PspC、CbpA、CbpD及CbpG。CbpA揭示於WO97/41151中。CbpD及CbpG揭示於WO00/29434中。PspC揭示於WO97/09994中。PbcA揭示於WO98/21337中。SpsA係揭示於WO98/39450中之膽鹼結合蛋白。視情況，膽鹼結合蛋白選自由以下組成之群：CbpA、PbcA、SpsA及PspC。
    本發明之一個實施例包括CbpX截短物，其中「CbpX」定義於上文中且「截短物」係指缺乏50%或更多膽鹼結合區域(C)之CbpX蛋白。視情況，該等蛋白質缺乏整個膽鹼結合區域。視情況，該蛋白質截短物缺乏(i)膽鹼結合區域及(ii)該蛋白質之N端一半之一部分，但保留至少一個重複區域(R1或R2)。視情況，截短物具有2個重複區域(R1及R2)。該等實施例之實例係NR1xR2及R1xR2，如WO 99/51266或WO99/51188中闡釋，然而缺乏類似膽鹼結合區域之其他膽鹼結合蛋白亦涵蓋於本發明範圍內。在另一實施例中，本發明之免疫原性組合物可包括PcpA之免疫原性多肽，例如選自肺炎鏈球菌TIGR4、肺炎鏈球菌14453、肺炎鏈球菌B6(GenBank登錄編號：CAB04758)或肺炎鏈球菌R6(GenBank登錄編號：NP_359536)。在一個實施例中，免疫原性多肽PcpA缺乏N端信號序列。在另一實施例中，免疫原性多肽PcpA缺乏發現於天然存在序列中之膽鹼結合域錨序列。在另一實施例中，免疫原性多肽PcpA缺乏信號序列及膽鹼結合域。舉例而言，本發明之免疫原性組合物可包括與WO2011/075823之SEQ ID No.2具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、99%一致性之PcpA的免疫原性多肽。在另一實施例中，本發明之免疫原性組合物可包括具有WO2011/075823之序列SEQ ID No.7之PcpA的免疫原性多肽。
    LytX家族係與細胞裂解有關之膜相關蛋白。N-末端結構域包括膽鹼結合結構域，然而，LytX家族並不具有發現於上述CbpA家族中之所有特徵且由此對於本發明而言，LytX家族可視為與CbpX家族不同。與CbpX家族相比，C-末端結構域含有LytX蛋白家族之催化結構域。該家族包括LytA、LytB及LytC。對於而言，LytX家族之LytA揭示於Ronda等人，Eur J Biochem,164：621-624(1987)中。LytB揭示於WO98/18930中，且亦稱為Sp46。LytC亦揭示於WO98/18930中，且亦稱為Sp91。本發明之一實施例包括LytC。
    另一實施例包括LytX截短物，其中「LytX」定義於上文中且「截短物」係指缺乏50%或更多膽鹼結合區域之LytX蛋白。視情況，該等蛋白質缺乏整個膽鹼結合區域。本發明之另一實施例包括CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合體)。視情況，此實施例包括CbpX之NR1xR2(或R1xR2)及LytX之C-末端部分(Cterm，亦即缺乏膽鹼結合結構域，例如LytCCterm或Sp91Cterm)。視情況，CbpX係選自由以下組成之群：CbpA、PbcA、SpsA及PspC。視情況，其係CbpA。視情況，LytX係LytC(亦稱為Sp91)。本發明之另一實施例係缺乏膽鹼結合結構域(C)且表現為具有LytX之融合蛋白之PspA或PsaA截短物。視情況，LytX係LytC。
    業內已知PsaA及PspA。舉例而言，PsaA及其跨膜缺失變體已由Berry及Paton，Infect Immun 1996 Dec；64(12)：5255-62予以闡述。PspA及其跨膜缺失變體已揭示於(例如)US5804193、WO92/14488及WO99/53940中。
    Sp128及Sp130揭示於WO00/76540中。Sp125係具有LPXTG(其中X係任一胺基酸)之細胞壁錨定基序之肺炎球菌表面蛋白之實例。具有此基序之此類肺炎球菌表面蛋白內之任一蛋白質已發現可用於本發明背景內，且由此視為本發明之另一蛋白質。Sp125本身揭示於WO98/18930中，且亦稱為ZmpB-鋅金屬蛋白酶。Sp101揭示於WO98/06734中(其中其具有參考編號y85993)。其特徵在於I型信號序列。Sp133揭示於WO98/06734中(其中其具有參考編號y85992)。其特徵亦在於I型信號序列。
    本發明之免疫原性組合物亦可包括肺炎鏈球菌莢膜糖(適宜地偶聯至載體蛋白)。糖(例如多糖)可衍生自肺炎球菌之血清型，例如血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F及33F。在一實施例中，在組合物中包含至少4個血清型，例如6B、14、19F及23F。在另一實施例中，在組合物中包含至少7個血清型，例如4、6B、9V、14、18C、19F及23F。適宜地，每一糖皆偶聯至載體蛋白。在一實施例中，本發明之免疫原性組合物包括肺炎球菌溶血素及/或多組胺酸三合體家族成員(例如PhtD)作為載體蛋白。 劑量
    本文所使用之術語「人類劑量」意指適於人類應用之體積劑量。通常，最終劑量體積(疫苗組合物體積)可介於0.25 ml至1.5 ml、0.4 ml至1.5 ml或0.4 ml至0.6 ml之間。在一實施例中，人類劑量為0.5 ml。在另一實施例中，人類劑量高於0.5 ml，例如0.6、0.7、0.8、0.9或1 ml。在另一實施例中，人類劑量介於1 ml與1.5 ml之間。在另一實施例中，特定而言，在免疫原性組合物係用於兒科群體時，人類劑量可小於0.5 ml，例如在介於0.25 ml與0.5 ml之間。
    各劑量中之肺炎鏈球菌蛋白數量選擇成可在典型疫苗接種者中誘導免疫保護性反應而無顯著之不良副作用之量。該量將端視所採用之具體免疫原以及其呈現方式而有所變化。通常，預計每一劑量將包括1-1000 μg蛋白質抗原，例如1 μg至500 μg、1 μg至100 μg或1 μg至50 μg。用於特定免疫原性組合物之最佳量可藉由涉及觀察個體中之適當免疫反應之標準研究來確定。 疫苗接種
    本發明提供包括本發明之免疫原性組合物之疫苗。本文中涉及本發明之「免疫原性組合物」之實施例亦適應於涉及本發明之「疫苗」的實施例，且反之亦然。在一實施例中，疫苗包括本發明之免疫原性組合物及醫藥上可接受之賦形劑。
    可藉由任一適宜遞送途徑(例如真皮內、黏膜(例如鼻內)、經口、肌內或皮下)來投與本發明之疫苗。其他遞送途徑在業內已眾所周知。疫苗製劑通常闡述於Vaccine Design(「The subunit and adjuvant approach」(Powell M.F.及Newman M.J.編輯)(1995)Plenum Press New York)中。
    在一態樣中，藉由肌內遞送途徑來投與本發明之免疫原性組合物。肌內投與可指大腿或上臂。通常經由針(例如皮下針)實施注射，但另一選擇為可使用無針注射。典型肌內劑量為0.5 ml。
    疫苗之真皮內投與形成本發明之一實施例。人類皮膚包括稱為角質層之外「角質」角皮，其覆蓋表皮。在此表皮下方係稱為真皮之層，其繼而覆蓋皮下組織。真皮內注射之習用技術「芒圖氏程序(mantoux procedure)」包括以下步驟：清潔皮膚，且然後將一隻手伸展開，且在窄規格注射針(規格26至31)之斜面朝上之情形下，將針以10°至15°之間之角度插入。在針之斜面插入時，使針之針筒降低並在提供輕微壓力的同時進一步推進，以將針在皮膚下抬高。然後極緩慢地注射液體，由此在皮膚表面上形成小泡或隆起，隨後緩慢抽出針。
    最近，已闡述經特定設計以將液體藥劑投與皮膚中或穿過皮膚之裝置，例如闡述於WO99/34850及EP1092444中之裝置以及闡述於(例如)以下中之噴射裝置：WO01/13977、US5,480,381、US5,599,302、US5,334,144、US5,993,412、US5,649,912、US5,569,189、US5,704,911、US5,383,851、US5,893,397、US5,466,220、US5,339,163、US5,312,335、US5,503,627、US5,064,413、US5,520,639、US4,596,556、US4,790,824、US4,941,880、US4,940,460、WO97/37705及WO97/13537。經真皮內投與疫苗製劑之替代方法可包含習用注射器及針或經設計用於彈道遞送固體疫苗之裝置(WO99/27961)或經皮貼片(WO97/48440、WO98/28037)或施加至皮膚表面(經皮或經表皮遞送，WO98/20734、WO98/28037)。
    在向皮膚或更具體而言向真皮中投與本發明之疫苗時，疫苗具有低液體體積，尤其係介於約0.05 ml與0.2 ml之間之體積。
    另一適宜投與途徑係皮下途徑。可使用任一適宜裝置用於皮下遞送，例如典型針。在本發明之一態樣中，使用無針式噴射器服務，例如公開於以下中者：WO01/05453、WO01/05452、WO01/05451、WO01/32243、WO01/41840、WO01/41839、WO01/47585、WO01/56637、WO01/58512、WO01/64269、WO01/78810、WO01/91835、WO01/97884、WO02/09796、WO02/34317。在本發明之另一態樣中，使用液體疫苗調配物預填充裝置。
    另一選擇為，經鼻內投與疫苗。通常，在(例如)並不吸入肺中之情形下將疫苗局部投與鼻咽區。期望使用鼻內遞送裝置將疫苗調配物遞送至鼻咽區，其中疫苗調配物並不或實質上並不進入肺中。用於經鼻內投與本發明之疫苗之較佳裝置係噴霧裝置。適宜市售經鼻噴霧裝置包含AccusprayTM(Becton Dickinson)。
    在一實施例中，用於鼻內應用之噴霧裝置係裝置性能並不依賴於由使用者所施加之壓力之裝置。該等裝置稱為壓力臨限裝置。僅在施加臨限壓力時，自噴嘴釋放液體。該等裝置使得較易於達成具有規則液滴大小之噴霧。業內已知適應於本發明中之壓力臨限裝置且闡述於(例如)WO91/13281及EP311 863及EP516636(其以引用方式併入本文中)中。該等裝置可購自Pfeiffer GmbH且亦闡述於Bommer,R.Pharmaceutical Technology Europe,1999年9月中。
    在另一實施例中，鼻內裝置產生介於1 μm至200 μm(例如10 μm至120 μm)之液滴(使用水作為液體量測)。在小於10 μm時，存在吸入風險，由此期望使不超過約5%之液滴小於10 μm。大於120 μm之液滴並不如較小液滴一般充分擴散，因此期望不超過約5%之液滴超過120 μm。
    雙劑量遞送係用於本發明之疫苗中之鼻內遞送系統之另一實施例。雙劑量裝置含有單一疫苗劑量之兩個亞劑量，向每一鼻孔投與一個亞劑量。通常，兩個亞劑量存在於單一室中且裝置之構造容許每次有效遞送單一亞劑量。另一選擇為，可使用單劑量裝置來投與本發明之疫苗。
    本發明之另一態樣係製備本發明之疫苗之方法，其包括混合非偶聯肺炎鏈球菌蛋白與佐劑組合物之步驟。
    儘管可以單一劑量形式投與本發明之疫苗，但亦可同時或在不同時間一起共投與其組份(舉例而言，可單獨、同時或在投與疫苗之任一細菌蛋白組份之後1至2週時投與肺炎球菌糖偶聯物以最佳地協調關於彼此之免疫反應)。在初始疫苗接種後，個體可接受一個或若干個適當間隔之加強免疫。
    在本發明之一態樣中，目標群體係未致敏(naive)或先前對感染或疫苗接種無反應之未接觸抗原之群體。在另一態樣中，目標群體適宜地為65歲及以上之老年人、較年輕高風險成人(亦即介於18歲與64歲之間，例如在健康機構工作之人員)或彼等具有諸如心血管及肺疾病或糖尿病等風險因素之青少年。另一目標群體係6個月年齡及以上之所有兒童，尤其係6至23個月年齡之兒童。另一目標群體係免疫力減弱之人員。
    本發明之免疫原性組合物可用於預防性及治療性目的二者。由肺炎鏈球菌感染引起之疾病包含肺炎、急性鼻竇炎、中耳炎、腦膜炎、菌血症、敗血症、骨髓炎、敗血性關節炎、心內膜炎、腹膜炎、心包炎、蜂窩織炎及腦膿腫。在本發明之一實施例中，肺炎鏈球菌感染包含肺炎、中耳炎、腦膜炎及菌血症。在一實施例中，由肺炎鏈球菌引起之疾病係肺炎，例如社區獲得性肺炎。在另一實施例中，由肺炎鏈球菌引起之疾病係侵襲性肺炎球菌疾病(IPD)，亦即可自血液或另一通常無菌之位點分離肺炎鏈球菌之感染。在另一實施例中，由肺炎鏈球菌引起之疾病係肺炎，例如嚴重肺炎。根據由各種組織(包含American Thoracic Society，ATS)所闡述之導則來表徵稱為「嚴重肺炎」之病狀(Am J Respir Crit Care Med 2001；163：1730-1754)。舉例而言，除用於診斷嚴重肺炎之其他標準外，ATS需要至少一種主要標準，例如機械通風或敗血性休克所需之標準。通常，嚴重肺炎可源自急性肺病、發炎性肺病或肺功能由諸如發炎或凝聚等因素所致之任一擾動。本發明之免疫原性組合物亦可用於治療或預防AECOPD。在一態樣中，本發明之免疫原性組合物可用於治療或預防由肺炎鏈球菌引起之AECOPD。
    本發明之其他態樣包含：- 藉由使用本發明之免疫原性組合物免疫哺乳動物來誘發免疫反應之方法；- 治療或預防由肺炎鏈球菌感染引起之疾病之方法，其包括對有需要之個體(例如人類)實施肌內投與，包括向該個體(例如人類)投與本發明之免疫原性組合物；- 治療或預防由肺炎鏈球菌感染引起之疾病之方法，其包括向患有或易患肺炎鏈球菌感染之患者經肌內投與本發明之免疫原性組合物；- 用於治療或預防由肺炎鏈球菌感染引起之疾病之本發明之免疫原性組合物；- 本發明之免疫原性組合物在製造藥劑中之用途，該藥劑用於治療或預防由肺炎鏈球菌感染引起之疾病；- 本發明之免疫原性組合物在製造肌內注射型疫苗中之用途，該肌內注射型疫苗用於治療或預防由肺炎鏈球菌感染引起之疾病。 免疫原性
    本發明之另一態樣係能夠引起哺乳動物中之T細胞反應的本發明之免疫原性組合物。在一態樣中，T細胞反應可為細胞溶解性T細胞反應。可使用標準分析量測細胞溶解性T細胞反應，舉例而言，藉由使用鉻釋放分析量測T細胞之細胞毒性活性(舉例而言，將51Cr添加至靶細胞中並量測藉由裂解細胞釋放之51Cr量)，或藉由流式細胞術量測涉及T細胞細胞毒性之分子(例如粒酶B、穿孔蛋白)之表現。
    在一態樣中，與使用相應非佐劑化組合物(亦即並不含有任一外源性佐劑，在本文中亦稱為「純淨組合物」)及/或業內已知之其他佐劑化組合物獲得之CD4 T細胞免疫反應相比，本發明之免疫原性組合物能夠誘導針對組份抗原或抗原性組合物中之至少一者之經改良CD4 T細胞免疫反應。
    「經改良CD4 T細胞免疫反應」意指在投與佐劑化免疫原性組合物之後在哺乳動物(例如人類)中獲得之CD4反應，其高於在投與沒有佐劑及/或具有其他已知佐劑之相同組合物之後獲得者。舉例而言，與在投與非佐劑化免疫原性組合物及/或業內已知之其他佐劑化組合物之後誘導之反應相比，在投與本發明之免疫原性組合物後在哺乳動物中獲得較高CD4 T細胞反應。
    可藉由量測產生下列細胞因子中之任一者之細胞之數量來評價經改良CD4 T細胞免疫反應：
    ˙產生任一細胞因子(IFNγ,IL-2,IL-17,IL-13)之細胞
    ˙產生IFNγ之細胞
    ˙產生IL-17之細胞
    在投與本發明之免疫原性組合物後與投與非佐劑化組合物及/或其他佐劑化組合物相比產生上述細胞因子中之任一者之細胞具有較高量時，具有經改良CD4 T細胞免疫反應。在一實施例中，達成上文所提及三個條件中之至少一者。在另一實施例中，達成上文所提及三個條件中之至少兩者。在另一實施例中，達成上文所提及之所有三個條件。在另一態樣中，本發明之免疫原性組合物能夠刺激IFNγ產生。可如本文之實例中所述來量測IFNγ產生。舉例而言，可藉由以下方式來量測IFNγ產生：使用對應於IFNγ之抗原(例如PhtD及dPly)在活體外再刺激周邊血抗原特異性CD4及CD8 T細胞、習用免疫螢光標記及藉由流式細胞術進行量測以測定CD4或CD8細胞亞群內之細胞因子陽性CD4或CD8 T細胞之頻率。在另一態樣中，本發明之免疫原性組合物能夠刺激IL-17產生。可如本文之實例中所述來量測IL-17產生。舉例而言，可藉由以下方式來量測IL-17產生：使用對應於IL-17之抗原(例如PhtD及dPly)在活體外再刺激周邊血抗原特異性CD4及CD8 T細胞、習用免疫螢光標記及藉由流式細胞術進行量測以測定CD4或CD8細胞亞群內之細胞因子陽性CD4或CD8 T細胞之頻率。
    參照下列非限制性實例對本發明加以進一步闡述。 實例1 小鼠模型(C57Bl6)中對於PhtD及dPly之AS01B對AS03B Th反應之臨床前比較
    在第0、14及28天藉由IM途徑使用調配於AS01B或AS03B中之9 μg或3 μg PhtD或dPly對6週齡C57bl6小鼠實施免疫。使用調配於AS15中之5 μg PhtD、dPly或Sivp27(使用Sivp27作為陽性對照)對對照組實施免疫。在對全血實施第二及第三免疫之後第7天及在對脾臟實施第三免疫之後第9天時實施FACS分析。
    試驗1：
    試驗2：
    佐劑調配物之製備
    AS01B/劑量之最終組成：
    脂質體：1000 μg DOPC，250 μg膽固醇，50 μg 3D-MPL 50 μg QS21
    使用PBS補足至體積為0.5 ml
    AS01E/劑量之最終組成：
    脂質體：500 μg DOPC，125 μg膽固醇，25 μg 3D-MPL 25 μg QS21
    使用PBS補足至體積為0.5 ml
    AS03B/劑量之最終組成：
    水包油型乳液：角鯊烯及DL-α-生育酚
    聚山梨醇酯80(Tween 80)
    AS15/劑量之最終組成：
    脂質體：1000 μg DOPC，250 μg膽固醇，50 μg 3D-MPL 50 μg QS21
    CpG7909：420 μg
    MPL/QS21脂質體佐劑AS01之製備：佐劑(稱為AS01)包括3D-MPL及呈經膽固醇淬滅之形式之QS21，且如WO 96/33739(以引用方式併入本文中)中所述製得。特定而言，基本上如WO 96/33739之實例1.1中所述來製備AS01佐劑。AS01B佐劑包括：脂質體，其繼而包括二油醯基磷脂醯膽鹼(DOPC)、膽固醇及3D MPL[其量為：1000 μg DOPC、250 μg膽固醇及50 μg 3D-MPL，所給出之每一值大致為每一疫苗劑量之值]、QS21[50 μg/劑量]、磷酸鹽NaCl緩衝液及水(補足至體積為0.5 ml)。
    AS01E佐劑與AS01B包括相同成份，但具有以下較低濃度之量：500 μg DOPC,125 μg膽固醇、25 μg 3D-MPL及25 μg QS21、磷酸鹽NaCl緩衝及水(補足至體積為0.5 ml)。
    在產生含有MPL之脂質體之過程中，將DOPC(二油醯基磷脂醯膽鹼)、膽固醇及MPL溶於乙醇中。藉由在真空下蒸發溶劑來形成脂質膜。添加pH為6.1之磷酸鹽緩衝鹽水(9 mM Na2HPO4,41 mM KH2PO4,100 mM NaCl)且對混合物實施預均質化，隨後在15,000 psi下實施高壓均質化(約15至20個循環)。此使得產生脂質體，經由0.22 μm膜在無菌(等級100)區中將該等脂質體無菌過濾。然後將無菌產物分佈於無菌玻璃容器中並儲存於冷室(+2℃至+8℃)中。
    以此方式，所產生之脂質體含有存於膜中之MPL(WO 96/33739之「內MPL」實施例)。
    在水溶液中添加QS21直至期望濃度。
    水包油型乳液及佐劑調配物AS03B之製備：除非另有所述，否則用於隨後實例中之油/水乳液包括：有機相，其係由2種油(α-生育酚及角鯊烯)組成；及含有Tween 80作為乳化劑之PBS之水相。除非另有所述，否則用於隨後實例中之水包油型乳液佐劑調配物包括下列水包油型乳液組份(給出最終濃度)：2.5%角鯊烯(v/v)、2.5% α-生育酚(v/v)、0.9%聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯(v/v)(Tween 80)，參見WO 95/17210。隨後實例中之此乳液(稱為AS03)係遵循以兩倍濃縮物形式製得。
    乳液SB62之製備：藉由在強烈攪動下混合下列部分來製備SB62乳液：油相，由疏水性組份(DL-α-生育酚及角鯊烯)構成；及水相，含有水溶性組份(陰離子型洗滌劑Tween 80及PBS mod(經修飾)，pH 6.8)。在攪拌的同時，將油相(總體積之1/10)轉移至水相(總體積之9/10)，且將混合物在室溫下攪拌15分鐘。然後使所得混合物在微射流機之相互作用室中經受剪切、衝擊及空化力(15000 PSI-8個循環或3個循環，在用於實例III中所報告之臨床試驗中之佐劑中)以產生亞微液滴(介於100 nm與200 nm之間之分佈)。所得pH介於6.8±0.1之間。然後藉由經由0.22 μm膜進行過濾來將SB62乳液滅菌且將大量無菌乳液冷凍儲存於2℃至8℃之庫帕克容器(Cupac container)中。使用無菌惰性氣體(氮或氬)將SB62乳液最終散裝容器之死體積沖洗至少15秒。
    SB62乳液之最終組成如下：Tween 80：1.8%(v/v)，19.4 mg/ml；角鯊烯：5%(v/v)，42.8 mg/ml；α-生育酚：5%(v/v)，47.5 mg/ml；PBS-mod：121 mM NaCl、2.38 mM KCl、7.14 mM Na2HPO4、1.3 mM KH2PO4；pH 6.8±0.1。
    佐劑調配物AS15之製備：佐劑系統AS15先前已闡述於WO 00/62800中。
    AS15係兩個佐劑系統AS01B之組合，第一系統係由含有3D-MPL及QS21之脂質體構成，且第二系統係由存於磷酸鹽緩衝鹽水中之CpG 7909(亦稱為CpG 2006)構成。
    抗原之製備
    dPly之製備：製備肺炎球菌溶血素並如WO2004/081515及WO2006/32499中所述使用甲醛去毒進行去毒。
    PhtD之表現及純化：
    PhtD之表現：PhtD蛋白係特徵在於存在組胺酸三合體之肺炎球菌組胺酸三合體(Pht)蛋白家族之成員。PhtD係838 aa-分子且攜帶5個組胺酸三合體(參見Medlmmune WO00/37105 SEQ ID NO：4(對於胺基酸序列而言)及SEQ ID NO：5(對於DNA序列而言))。PhtD亦在中間(胺基酸位置348-380)含有富含脯胺酸之區域。PhtD具有20 aa-N-末端信號序列。PhtD之製備及純化闡述於WO2007/071710中(參見實例1b)。
    轉移材料之闡述：SIV-p27 批號PE04MY1901
    緩衝液：DPBS(136.87 mM NaCl、2.68 mM KCl、8.03 mM Na2HPO4、1.47 mM KH2PO4)
    重組蛋白：來自SIV mac 251之SIV p27闡述於WO2009/077436中(SEQ ID No.19)。
    製備：
    大腸桿菌(E.coli)表現，50 mM TRIS-HCl pH 8.0中之提取，BLUE Trisacryl Plus，硫酸銨沈澱，DPBS回收，DPBS透析，Acticlean Etox，濃縮，Acticlean Etox，濃縮。
    蛋白質特性：
    分子量 27477 Da
    莫耳消光係數：38010±5% 1A(280)=0.72 mg/ml
    等電點：5.77
    具有佐劑之疫苗組合物之製備
    1. AS01B
    1.1 2倍濃縮之AS01B之製備
    將稀釋10倍之磷酸鹽緩衝鹽水(pH 6.1)添加至注射用水中以在最終調配物中分別達成10 mM磷酸鹽及140 mM NaCl之濃度。將濃縮之脂質體(由DOPC、膽固醇及MPL組成)添加至QS21中並在室溫下藉由磁力攪拌混合15 min。將由脂質體及QS21組成之混合物添加至經稀釋緩衝液中並在室溫下藉由磁力攪拌混合30 min。檢查pH以使其約為6.0。
    在兩倍濃縮之佐劑中，QS21之濃度為200 μg/ml且MPL之濃度為200 μg/ml。
    1.2最終調配物之製備
    在AS01B中，PhtD或dPly為180 μg/ml或60 μg/ml
    根據下列順序就地製備調配物：注射用水+稀釋10倍之pH 6.1鹽水緩衝液+2倍濃縮佐劑，在室溫下於定軌振盪臺上混合5 min，+抗原(添加量應達成180 μg/ml或60 μg/ml之最終濃度)，在室溫下於定軌振盪臺上混合5 min。
    單獨之AS01B
    根據下列順序就地製備調配物：注射用水+稀釋10倍之pH 6.1鹽水緩衝液+2倍濃縮佐劑，在室溫下於定軌振盪臺上混合2×5 min。
    2. AS15
    2.1 2倍濃縮之AS15之製備
    將稀釋10倍之磷酸鹽緩衝鹽水(pH 6.1)添加至注射用水中以在最終調配物中分別達成10 mM磷酸鹽及140 mM NaCl之濃度。將濃縮之脂質體(由DOPC、膽固醇及MPL組成)添加至QS21中並在室溫下藉由磁力攪拌混合15 min。將由脂質體及QS21組成之混合物添加至經稀釋緩衝液中並在室溫下藉由磁力攪拌混合30 min。添加CpG以達成在濃縮佐劑中為1680 μg/ml。在室溫下藉由磁力攪拌將佐劑混合15 min。檢查pH以使其約為6.0。
    在兩倍濃縮佐劑中，QS21之濃度為200 μg/ml，MPL之濃度為200 μg/ml且CpG之濃度為1680 μg/ml。
    2.2最終調配物之製備
    在AS15中，PhtD或dPly或p27gag為100 μg/ml
    根據下列順序就地製備調配物：注射用水+稀釋10倍之pH 6.1鹽水緩衝液+2倍濃縮佐劑，在室溫下於定軌振盪臺上混合5 min，+抗原(添加量應達成100 μg/ml之最終濃度)，在室溫下於定軌振盪臺上混合5 min。
    3. AS03B
    3.1最終調配物之製備
    在AS03B中，PhtD或dPly為180 μg/ml或60 μg/ml
    根據下列順序就地製備調配物：注射用水+稀釋10倍之pH6.8鹽水緩衝液+SB62水包油型乳液(最終調配物)，在室溫下於定軌振盪臺上混合5 min，+抗原(添加量應達成180 μg/ml或60 μg/ml之最終濃度)，在室溫下於定軌振盪臺上混合5 min。
    單獨之AS03B
    根據下列順序就地製備調配物：注射用水+稀釋10倍之pH 6.8鹽水緩衝液+SB62水包油型乳液(最終濃度為250 μl/ml)，在室溫下於定軌振盪臺上混合2×5 min。
    T細胞反應
    簡言之，收集來自28隻小鼠/組及14隻小鼠/組(用於陽性對照)之周邊血淋巴細胞(PBL)並彙集(4或2池，每組7隻小鼠)。實施紅血細胞裂解，然後以100萬個細胞/孔將該等細胞平鋪於圓形96孔板中。然後在活體外使用重疊15聚體肽之池(1 μg/ml/肽，其含有兩種抗體CD49d及CD28)將細胞再刺激2小時。使用培養基(無肽刺激)中剩餘之細胞作為陰性對照用於背景反應。在與肽池共培養之後兩小時，向孔中添加佈雷菲德菌素A(Brefeldin A)(以抑制細胞因子分泌)且使細胞在37℃下進一步與5% CO2一起培育過夜。隨後使用下列標記物：CD4、CD8、IL-2、IFN-γ、IL13及IL17將細胞染色。藉由流式細胞術分析試樣。
    細胞內細胞因子染色
    在抗原再刺激步驟後，將PBL在37℃下於佈雷菲德菌素(1 μg/ml)存在下培育過夜以抑制細胞因子分泌。
    如下所述來實施IFN-γ/IL17/IL3或IL5/IL2/CD4/CD8染色：洗滌細胞懸浮液，再懸浮於50 μl含有2% Fc阻斷(抗CD16/32)試劑(1/50)之PBS 1% FCS中。
    在4℃下培育10 min之後，添加50 μl抗CD4 pacific Blue(1/50)及抗CD8 perCp-Cy5.5(1/50)之混合物並在4℃下培育30 min。在PBS 1% FCS中洗滌之後，藉由再懸浮於200 μl Cytofix-Cytoperm(kit BDTM)中來對細胞實施滲透化並在4℃下培育20 min。然後使用Perm洗滌液(kit BDTM)洗滌細胞並使用稀釋於Perm洗滌液中之50 μl抗IFN-γ APC(1/50)+抗IL-2-FITC(1/50)+抗IL13或IL5-PE(1/50)+抗IL17-Alexa 700(1/50)之混合物再懸浮。在培育1 h之後，使用BDTM穩定固定劑溶液(BD Biosciences)洗滌細胞。藉由FACS實施試樣分析。選通活細胞(FCS/SSC)且在約10 000個CD8細胞上實施獲取。在CD4及CD8+選通群中計算IFN-γ+或IL17+或IL3或IL5+或IL2之百分比。
    藉由細胞因子流式細胞術(CFC)評估細胞調介之免疫
    若使周邊血抗原特異性CD4及CD8 T細胞與其相應抗原一起培育，則可在活體外將其再刺激以產生IFNγ、IL2、IL13、IL17。因此，在細胞表型之習用免疫螢光標記以及細胞內細胞因子產生後，可藉由流式細胞術來列示抗原特異性CD4及CD8 T細胞。在本研究中，使用PhtD及dPly蛋白以及衍生自該等特異性鏈球菌蛋白之肽作為抗原來再刺激特異性T細胞。將結果表示為CD4或CD8細胞亞群內細胞因子陽性CD4或CD8 T細胞之頻率。
    IgG之量化：
    在37℃下，分別以1 μg/ml及4 μg/ml在高結合微量滴定板(NUNC Maxisorp)上之PBS中將純化PhtD及Ply塗覆2小時。稀釋小鼠抗血清且然後在微量板中進一步製成兩倍稀釋液並在室溫及攪動下培育30 min。洗滌之後，使用Jackson ImmunoLaboratories公司之在PBS-Tween中以1/2500稀釋之0.05%偶聯過氧化物酶affinipure山羊抗小鼠IgG(H+L)(參考編號：115-035-003)來檢測結合抗體。將該等檢測抗體在室溫及攪動下培育30 min。洗滌之後，在室溫下於黑暗中經15分鐘，使用4 mg OPD+5 μl H2O2/10 ml pH 4.5 0.1 M檸檬酸鹽緩衝液實施顯影。使用50 μl 1 N HCl終止反應，且在490-620 nm下讀取光學密度(OD)。藉由與參考曲線進行比較來測定存在於血清試樣中之抗PhtD及抗dPly IgG之濃度並以μg/ml形式表示。
    結果及結論之匯總
    在C57BL6小鼠中之第三免疫後血液中評估由AS01B或AS03B中之dPly/PhtD誘導之抗原特異性T細胞反應。使用AS01B中之dPly/PhtD誘導高抗原特異性T細胞反應，而使用AS03B觀察到較低反應或沒有反應。AS01B主要誘導分泌IFN-γ之CD4+ T細胞(Th1)。在第三免疫之後7天，AS01B主要誘導對於dPly具有特異性之Th17，而使用AS03B可誘導極少檢測到之Th17反應。使用AS15/sivP27或dPly/AS15作為用於Th17誘導之陽性對照。
    對於兩種蛋白質而言，由AS01B誘導之抗體IgG反應亦高於AS03B。 實例2：致死攻擊模型(具有4CDC菌株之MF1)中之佐劑之評估
    在致死攻擊模型中評估不同佐劑。在第0及14天，使用2劑量之經不同佐劑系統(AS01B、AS01E及AS03)調配之3 μg/50 μl PhtD抗原經肌內(IM)對OF1雌性小鼠(4週齡)實施免疫。使用單獨之佐劑系統對對照小鼠接種疫苗。隨後使用5×106 CFU之4CDC型肺炎鏈球菌經鼻內攻擊小鼠。記錄8天內之死亡率。結果展示於圖8中。
    使用AS01E及AS03與PhtD之組合幾乎完全(約90%)防止菌株4CDC。對於所有佐劑而言，皆觀察到顯著差異(PhtD/AS(接種疫苗之小鼠)及單獨之AS(陰性對照)之間)。然而，在使用AS01E時，觀察到接種疫苗之小鼠與相應陰性對照之間之最佳差異。
    肺定植模型中之佐劑之評估
    在肺定植模型中評估兩種佐劑。在第0、14及28天，使用經不同佐劑系統(AS01B、AS01E)調配之PhtD經肌內(IM)對CBAJ雌性小鼠實施免疫。使用單獨之佐劑系統對對照小鼠接種疫苗。隨後2×107 CFU之19F/2737型肺炎鏈球菌經鼻內攻擊小鼠。藉由在攻擊後3及5天收集之肺中實施菌落計數來量測細菌載量。結果展示於圖9中。
    與僅接受單獨之相應佐劑之陰性對照組相比，在使用經AS01B或AS01E佐劑化之PhtD免疫之後在此模型中誘導顯著保護。
    圖1：血液中之總體dPly特異性T細胞反應：AS03B對AS01B。在PIII(亦即在第三免疫之後)表現任一細胞因子(IFN-g、IL-2、IL-17、IL-13)之T細胞。
    圖2：血液中之總體PhtD特異性T細胞反應：AS03B對AS01B。表現任一細胞因子(IFN-g、IL-2、IL-17、IL-13)之T細胞。
    圖3：dPly特異性Th1反應：AS03B對AS01B。表現IFNg之T細胞(Th1)。
    圖4：PhtD特異性Th1反應：AS03B對AS01B。表現IFNg之T細胞(Th1)。
    圖5：dPly特異性Th17反應：AS03B對AS01B(PIII)。
    圖6：PhtD特異性Th17反應：AS03B對AS01B。
    圖7：AS01B對AS03B：抗體反應。圖7a：PhtD劑量IgG總和。圖7b：dPly劑量IgG總和。
    圖8：致死攻擊模型中之AS01B及AS01E之評估。
    圖9：肺定植模型中之AS01B及AS01E之評估。
    权利要求:
    Claims (40)
    [1] 一種免疫原性組合物，其包括至少一種選自肺炎球菌溶血素及多組胺酸三合體家族成員之非偶聯(unconjugated)肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)蛋白及包括QS 21、單磷醯脂質A(MPL)、磷脂及固醇之佐劑，該免疫原性組合物以脂質體形式呈現。
    [2] 如請求項1之免疫原性組合物，其中肺炎鏈球菌蛋白：單磷醯脂質A(MPL)之比率為0.05：1至3：1(w/w)。
    [3] 如請求項1或2之免疫原性組合物，其中肺炎鏈球菌蛋白：QS21之比率為0.05：1至3：1(w/w)。
    [4] 如請求項1或2之免疫原性組合物，其包括5 μg至60 μg、45 μg至55 μg、5 μg至20 μg，或20 μg至30 μg(例如20 μg、25 μg、30 μg、35 μg、40 μg、45 μg或50 μg)單磷醯脂質A(MPL)。
    [5] 如請求項1或2之免疫原性組合物，其包括5 μg至60 μg、45 μg至55 μg、5 μg至20 μg，或20 μg至30 μg(例如20 μg、25 μg、30 μg、35 μg、40 μg、45 μg或50 μg)QS21。
    [6] 如請求項1或2之免疫原性組合物，其包括0.1 mg至10 mg、0.2 mg至7 mg、0.3 mg至5 mg、0.4 mg至2 mg，或0.5 mg至1 mg(例如0.4 mg至0.6 mg、0.9 mg至1.1 mg、0.5 mg或1 mg)磷脂。
    [7] 如請求項1或2之免疫原性組合物，其包括0.025 mg至2.5 mg、0.05 mg至1.5 mg、0.075 mg至0.75 mg、0.1 mg至0.3 mg，或0.125 mg至0.25 mg(例如0.2 mg至0.3 mg、0.1 mg至0.15 mg、0.25 mg或0.125 mg)固醇。
    [8] 如請求項1或2之免疫原性組合物，其中該單磷醯脂質A(MPL)係3-O-去醯基化單磷醯脂質A(3D-MPL)。
    [9] 如請求項8之免疫原性組合物，其中3D-MPL之量為50 μg/人類劑量。
    [10] 如請求項1或2之免疫原性組合物，其中QS21之量為50 μg/人類劑量。
    [11] 如請求項1或2之免疫原性組合物，其中磷脂係二油醯基磷脂醯膽鹼(DOPC)。
    [12] 如請求項11之免疫原性組合物，其中DOPC之量為1000 μg/人類劑量。
    [13] 如請求項1或2之免疫原性組合物，其中固醇係膽固醇。
    [14] 如請求項13之免疫原性組合物，其中膽固醇之量為250 μg/人類劑量。
    [15] 如請求項1或2之免疫原性組合物，其能夠引起哺乳動物中細胞溶解性T細胞反應。
    [16] 如請求項1或2之免疫原性組合物，其能夠刺激干擾素γ產生。
    [17] 如請求項1或2之免疫原性組合物，其能夠刺激IL-17產生。
    [18] 如請求項1或2之免疫原性組合物，其中該肺炎球菌溶血素係去毒肺炎球菌溶血素(dPly)。
    [19] 如請求項18之免疫原性組合物，其中該肺炎球菌溶血素已以化學方式去毒。
    [20] 如請求項18之免疫原性組合物，其中該肺炎球菌溶血素已以基因方式去毒。
    [21] 如請求項1或2之免疫原性組合物，其包括3 μg至90 μg、3 μg至20 μg、20 μg至40 μg，或40 μg至70 μg(例如10 μg、30 μg或60 μg)非偶聯肺炎球菌溶血素/人類劑量。
    [22] 如請求項1或2之免疫原性組合物，其中該多組胺酸三合體家族成員係PhtD。
    [23] 如請求項22之免疫原性組合物，其中該PhtD包括與WO00/37105之序列ID No.4之胺基酸21至838之序列至少90%一致的胺基酸序列。
    [24] 如請求項22之免疫原性組合物，其中該PhtD具有與WO00/37105之序列ID No.4之胺基酸21至838之序列至少90%一致的胺基酸序列。
    [25] 如請求項22之免疫原性組合物，其中該PhtD具有胺基酸序列包括WO00/37105之序列ID NO：4之胺基酸21至838。
    [26] 如請求項22之免疫原性組合物，其中PhtD具有胺基酸序列包括至少10個來自WO00/37105之序列ID No.4之連續胺基酸。
    [27] 如請求項1或2之免疫原性組合物，其包括3 μg至90 μg、3 μg至20 μg、20 μg至40 μg，或40 μg至70 μg(例如10 μg、30 μg或60 μg)非偶聯PhtD/人類劑量。
    [28] 如請求項1或2之免疫原性組合物，其包括非偶聯肺炎球菌溶血素及非偶聯肺炎球菌PhtD。
    [29] 如請求項1或2之免疫原性組合物，其包括一或多種其他抗原。
    [30] 如請求項1或2之免疫原性組合物，其包括一或多種肺炎鏈球菌莢膜糖。
    [31] 如請求項1或2之免疫原性組合物，其中劑量體積介於0.4 ml與1.5 ml之間。
    [32] 如請求項31之免疫原性組合物，其中該劑量體積為0.5 ml。
    [33] 如請求項1或2中任一項之免疫原性組合物，其用於治療或預防由肺炎鏈球菌感染引起之疾病。
    [34] 如請求項1或2之免疫原性組合物，其用於治療或預防AE COPD。
    [35] 一種疫苗，其包括如請求項1至32中任一項之免疫原性組合物。
    [36] 一種製備如請求項35之疫苗之方法，其包括混合該非偶聯肺炎鏈球菌蛋白與該佐劑組合物之步驟。
    [37] 一種如請求項1至32中任一項之免疫原性組合物之用途，其用以製造用於誘發免疫反應之藥劑。
    [38] 一種如請求項1至32中任一項之免疫原性組合物之用途，其用以製造用於治療或預防由肺炎鏈球菌感染引起之疾病之藥劑。
    [39] 一種如請求項1至32中任一項之免疫原性組合物之用途，其用以製造用於治療或預防由肺炎鏈球菌感染引起之疾病之肌內注射型疫苗。
    [40] 一種如請求項1至32中任一項之免疫原性組合物之用途，其用以製造用於治療或預防AE COPD之藥劑。
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    法律状态:
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