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    本發明揭示增強個體(諸如年長成人)神經功能之方法。方法包括向個體投與包含HMB的營養組合物。營養組合物有益於患有或處於罹患認知衰退、認知障礙及神經功能障礙之風險中的個體，該等認知衰退、認知障礙及神經功能障礙通常由與神經退化性疾病相關之認知疾病所引起。
    公开号:TW201309212A
    申请号:TW101105347
    申请日:2012-02-17
    公开日:2013-03-01
    发明作者:Jose Maria Lopez Pedrosa；Manuel Manzano Martin；Alejandro Barranco Perez；Maria Ramirez Gonzalez；Ricardo Rueda Cabrera
    申请人:Abbott Lab；
    IPC主号:A61K31-00
    专利说明:
    使用β-羥基-β-甲基丁酸鹽改善腦部發育及認知功能的方法
    本發明係關於藉由投與包含β-羥基-β-甲基丁酸鹽(HMB)之營養產品來增強成人及年長成人神經發育及認知功能的所選方法。
    包含有目的選擇之營養成分的營養液體及粉末製品已熟知且廣泛可用，其中一些可提供單一營養源，而其他可提供補充來源。此等營養包括可用水或其他水性液體復原之粉末以及即飲營養液體，諸如基於牛奶或蛋白質之乳液或非乳化液體。此等營養液體當用所選營養成分調配時尤其有用。
    一種該營養成分為β-羥基-β-甲基丁酸鹽(HMB)。HMB為天然存在之白胺酸胺基酸代謝物，已知其用於多種營養產品及補充劑中。HMB用於該等產品中已知可有助於所選個體增強或維持健康肌肉質量及力量。
    HMB鈣為調配於口服營養產品(該等產品可包括錠劑、膠囊、可復原粉末、營養液體及乳液)中之HMB常用形式。一些此等含HMB產品含有其他營養素，諸如脂肪、碳水化合物、蛋白質、維生素、礦物質等。
    近來，愈來愈多的關注在於設計及銷售所謂「智慧調配物(smart formulation)」，包括專門針對腦部健康及營養所設計之營養產品。許多此等產品係為改善認知力及預防癡呆及相關認知衰退病狀及疾病而專門設計。迄今為止，此等調配物及產品取得有限的成功。
    因此，需要容易且有效地一般性改善認知力及特定治療認知衰退、認知障礙及認知疾病之組合物及方法。另外，不論總體健康及身體狀況，若組合物及方法可為廣泛個體(且尤其年長成人)所用，則為有利。
    本發明係關於改善個體(且尤其年長成人)之認知功能及/或預防/治療/減輕認知衰退、認知障礙及認知疾病的方法。方法包括投與個體有效量之HMB。
    一個實施例係關於一種改善年長成人認知力之方法。方法包含投與年長成人包括有效改善年長成人認知力之量之HMB的組合物。
    另一實施例係關於一種治療年長成人之與神經退化性疾病相關之認知疾病的方法。方法包含投與年長成人包括有效治療年長成人認知疾病之量之HMB的組合物。神經退化性疾病可包括例如阿茲海默氏症(Alzheimer's disease)、亨廷頓氏病(Huntington's disease)、帕金森氏症(Parkinson's disease)、癡呆、肌肉萎縮性側索硬化、中風及精神分裂症。
    另一實施例係關於一種改善學步童、兒童或青少年認知功能的方法。方法包含投與學步童、兒童或青少年包括有效改善學步童、兒童或青少年認知功能之量之HMB的組合物。
    本文所述之方法可對個體(尤其年長成人)腦部及神經組織提供保護且可保護其腦部及神經組織免於退化，從而預防及/或治療與神經退化性疾病相關的認知疾病。另外，投與包括HMB之營養產品可藉由對腦部提供神經保護來增強神經功能。
    營養組合物及補充劑中所用之其他組分可與HMB一起包括在內。舉例而言，在一或多個實施例中，組合物可包括蛋白質、碳水化合物、脂肪、維生素及礦物質中之至少一者。
    本發明方法係關於使用含HMB組合物改善尤其年長成人之認知功能及減輕認知衰退、認知障礙及認知疾病的方法。本發明方法之此等及其他必需或視情況選用之要素或限制詳細地描述於下文中。
    除非另有說明，否則如本文中所用之術語「年長成人」係指年齡至少45歲、包括年齡至少50歲、包括年齡至少55歲、包括年齡至少60歲、包括年齡至少65歲、包括年齡至少70歲、包括年齡至少75歲、包括年齡至少80歲或大於80歲且亦包括年齡約45歲至年齡約80歲、另外包括年齡約55歲至年齡約80歲的個體。
    除非另有說明，否則如本文中所用之術語「HMB鈣」係指β-羥基-β-甲基丁酸(亦稱為β-羥基-甲基丁酸、β-羥基異戊酸或HMB)之鈣鹽，其最通常呈單水合物形式。除非另有說明，否則如本文使用之表徵HMB鈣之所有重量、百分比及濃度均以單水合HMB鈣的重量計。
    除非另有說明，否則如本文使用之術語「噴霧乾燥粉末」係指大部分組分(包括HMB)經均質化且隨後在製造期間經受噴霧乾燥製程的營養粉末。其他成分可經由乾式摻合而添加至噴霧乾燥粉末中，只要HMB至少預先經均質化及噴霧乾燥即可。
    除非另有說明，否則如本文使用之術語「脂肪」與「油」可互換使用，以指自植物或動物得到或處理的脂質物質。此等術語亦包括合成脂質物質，只要此等合成物質適於人類口服。
    除非另有說明，否則如本文使用之術語「存放穩定(shelf stable)」係指營養液體經封裝且接著在18℃至24℃下儲存至少3個月(包括約6個月至約24個月且亦包括約12個月至約18個月)之後保持商品穩定。
    除非另有說明，否則如本文使用之術語「神經功能」係指腦部及神經元組織支持及維持認知能力(例如學習及記憶)的功能。相反，除非另有說明，否則如本文使用之術語「神經功能障礙」係指記憶或認知功能降低。舉例而言，學習能力或回憶資訊之能力降低被視為神經功能障礙。在一些實施例中，神經功能障礙可為老齡化或神經退化性疾病的結果。
    除非另有說明，否則如本文使用之術語「神經保護」係指保護現有神經元及神經組織免於細胞凋亡或退化；保護現有神經元及神經組織對抗物理傷害；及刺激神經元再生。
    除非另有說明，否則如本文使用之術語「認知力」係指涉及獲得知識及理解的心理過程，包括思考、瞭解、記憶、判斷及問題解決。「認知力」包括腦部之高級功能且包涵語言、想像、感知及規劃。
    除非另有說明，否則如本文使用之術語「營養組合物」或「營養產品」係指營養液體及營養粉末(其中後者可經復原形成營養液體)，其皆包含HMB以及脂肪、蛋白質及碳水化合物中之一或多者且適於人類口服消耗。
    除非另有說明，否則如本文使用之術語「營養液體」係指呈即飲液體形式的營養產品及使用前藉由復原本文所述之營養粉末而製得的營養液體。
    除非另有說明，否則如本文使用之術語「實質上澄清的液體」係指實質上無脂肪的營養液體；亦即除原料固有脂肪之外，液體未添加脂肪或添加低濃度脂肪以有助於製造液體。在本上下文中，術語「無脂肪」意謂以營養液體重量計，液體通常含有小於1.0%、更通常小於0.5%且更通常小於0.1%(包括0%)的脂肪。此等實質上澄清的營養液體為在約1℃至約25℃下可流動或可飲用的液體。
    除非另有說明，否則如本文所用之所有百分比、份數及比率皆以組合物總重量計。除非另有說明，否則與所列成分相關的所有此等重量係基於活性程度且因此不包括市售物質中所包括之溶劑或副產品。
    除非提及之上下文另有相反說明或明示，否則對本發明之單數特徵或限制的任何提及應包括相應複數特徵或限制，且反之亦然。
    除非提及組合之上下文另有相反說明或明示，否則如本文所用之方法或製程步驟之所有組合可以任何次序進行。
    本發明之營養組合物的各種實施例亦可實質上不含本文所述之任何可選或所選必需成分或特徵，其限制條件為其餘營養產品仍含有如本文所述之所有必需成分或特徵。在本上下文中，除非另有說明，否則術語「實質上不含」意謂所選營養產品含有小於功能性量的可選成分，以該可選或所選必需成分重量計，通常小於1%，包括小於0.5%、包括小於0.1%且亦包括0%。
    本文所述之營養組合物及方法可包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：如本文所述之組合物及方法的必需要素以及本文所述或在其他方面適用於營養產品應用的任何其他或可選要素。 產品形式
    適用於本發明方法之包括HMB的組合物可調配成用於口服或非經腸投與的任何已知或其他適當產品形式。口服產品形式一般較佳且包括適用於本文的任何固體、液體或粉末調配物，其限制條件為該調配物允許安全及有效地經口傳遞來自所選產品形式之必需及其他所選成分。
    適用於本文之固體營養產品形式的非限制性實例包括點心及膳食替代產品，包括調配為以下形式的產品：棒、棍、小甜餅或麵包或餅乾或其他烘烤商品、冷凍液體、糖果、早餐穀類、粉末或粒化固體或其他微粒、休閒食品(snack chips or bites)、冷凍或烹煮主菜等。
    適用於本文之液體產品形式的非限制性實例包括點心及膳食替代產品、熱或冰飲料、碳酸或非碳酸飲料、汁或其他酸化飲料、基於牛奶或大豆之飲料、混合飲料、咖啡、茶、經腸進食組合物等。此等液體組合物最通常調配為懸浮液或乳液之形式，但亦可調配為任何其他適當形式，諸如澄清液體、實質上澄清的液體、溶液、液態凝膠等。
    適合之口服產品形式的其他非限制性實例包括半固體或半液體組合物(例如布丁、凝膠)以及更多習知產品形式(諸如膠囊、錠劑、囊片、丸劑等)。向目標使用者提供有效量HMB之組合物之量可含於一個或複數個個別劑型中，例如可以每日單次或多次劑量投與的一個錠劑或複數個錠劑中。
    就產品形式(諸如口含錠、錠劑(例如可咀嚼錠劑、包衣錠劑等)、糊劑或凝膠)而言，以產品形式之重量計，胺基酸摻合物可調配的濃度範圍最通常為約5%至約50%、包括約15%至約33%且亦包括約15%至約25%，其皆可與賦形劑或其他成分(諸如碳水化合物、酸化劑、調味劑及著色劑)組合。
    包括HMB之組合物可經調配而具有足夠種類及足量的營養素，以提供單一、主要或補充營養源或提供適用於罹患特定疾病或病狀之個體的專門化營養產品或目標營養益處。 β-羥基-β-甲基丁酸鹽(HMB)
    適用於本發明方法之組合物包含HMB，其意謂組合物在添加HMB(最通常呈鈣單水合物之形式)之情況下調配而成或以其他方式製備以便成品中含有鈣及HMB。任何來源之HMB均適於在本文中使用，其限制條件為成品含有HMB，然而該來源較佳為HMB鈣且最通常在調配期間原樣添加至組合物中。
    如本文所用之術語「所添加HMB鈣」意謂HMB鈣鹽(最通常呈單水合HMB鈣鹽形式)作為HMB源添加至營養產品中。
    儘管單水合HMB鈣為本文中所用HMB之較佳來源，然而其他適當來源可包括呈游離酸、鹽、無水鹽、酯、內酯或其他產品形式的HMB，該等其他產品形式以其他方式提供營養產品中之HMB之生物可利用形式。本文中所用HMB之適合鹽的非限制性實例包括水合或無水之HMB之鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鉻鹽、鈣鹽或其他無毒性鹽形式。單水合HMB鈣較佳且可購自Technical Sourcing International(TSI),Salt Lake City,Utah。
    適用於方法之營養液體組合物中的HMB濃度以營養液體組合物之重量計可在高達10%範圍內，包括約0.01%至10%、且亦包括約0.1%至約5.0%、且亦包括約0.5%至約2.0%、且亦包括約0.4%至約1.5%。在一個特定實施例中，以營養液體組合物之重量計，HMB以約0.67%之量存在於營養液體組合物中。
    適用於方法之營養固體組合物中的HMB濃度以營養固體組合物之重量計可在高達10%範圍內，包括約0.01%至10%、且亦包括約0.1%至約7.0%、且亦包括約1.0%至約5.0%、且亦包括約1.0%至約4.0%。在一個特定實施例中，以營養固體組合物之重量計，HMB以約3.2%之量存在於營養固體中。
    如本文所述投與個體之營養組合物可提供約0.1公克/日至約10公克/日之HMB，包括約0.1公克/日至約5.0公克/日之HMB。相應地，營養組合物每份可提供約0.5公克至約2.5公克、包括約1.0公克至約1.7公克、包括約1.5公克之HMB，其中一份可為約240 ml即食營養液體或約240 ml經復原的營養固體。在一個特定實施例中，HMB以每240 ml約1.58公克之含量提供。個體可投與每日一份、每日兩份、每日三份或每日四份或四份以上，以自營養組合物中得到所需量的HMB。 巨量營養素
    如本文中所揭示之適用於方法之包括HMB的組合物除皆包含如本文所述之HMB以外，可另外包含一或多種其他巨量營養素，包括脂肪源、碳水化合物源及蛋白質源。
    視情況選用之巨量營養素與其他必需或添加成分組合可提供每份或每劑至多1000千卡(kcal)能量、包括每份或每劑約25千卡至約900千卡、亦包括約75千卡至約700千卡、亦包括約100千卡至約500千卡、亦包括約150千卡至約400千卡且亦包括約200千卡至約300千卡(最適宜為單一不分次食用或給與)。
    許多不同來源及類型的蛋白質、脂質及碳水化合物已為人所知且可用於如本文所述之含HMB的組合物中，其限制條件為所選營養素可安全且有效地口服且與必需成分及其他添加成分相容。
    適用於組合物中之碳水化合物可為簡單、複雜碳水化合物或其變體或組合。適合之碳水化合物的非限制性實例包括水解或改質澱粉或玉米澱粉、麥芽糊精、葡萄糖聚合物、蔗糖、玉米糖漿、澱粉糖漿乾粉、稻源碳水化合物、葡萄糖、果糖、乳糖、高果糖玉米糖漿、不消化的寡醣(例如果寡醣)、易溶性或不溶性纖維、蜂蜜、糖醇(例如麥芽糖醇、赤藻糖醇、山梨糖醇)及其組合。
    除如本文所述之HMB組分以外，適用於組合物中之蛋白質包括水解、部分水解或非水解蛋白質或蛋白質源，且可來源於任何已知或其他適合之來源，諸如牛奶(例如酪蛋白、乳清蛋白)、動物(例如肉、魚)、穀物(例如稻、玉米)、蔬菜(例如大豆)或其組合。
    適用於組合物之脂肪包括椰子油、分餾椰子油、大豆油、玉米油、橄欖油、紅花子油、高油酸紅花子油、MCT油(中鏈甘油三酯)、葵花子油、高油酸葵花子油、棕櫚及棕櫚仁油、棕櫚油酸、菜籽油、水產油、棉籽油及其組合。
    本發明組合物中脂肪、蛋白質及碳水化合物的濃度或量視特定產品形式(例如固體、液體、粉末)及各種其他調配物及目標膳食需要而定可顯著改變。最通常在下表所述之任一熱量範圍(實施例A至實施例D)內調配此等巨量營養素。
    視情況選用之成分
    包含HMB之營養組合物可另外包含可修飾產品之物理、營養、化學、嗜好或處理特性或當用於目標群體時充當醫藥或其他營養組分之其他視情況選用的成分。許多該等視情況選用之成分已為人所知或在其他方面適用於其他營養組合物且亦可用於本文所述之營養組合物中，其限制條件為該等視情況選用之成分可安全且有效口服且與所選產品形式中的必需及其他成分相容。
    該等視情況選用之成分的非限制性實例包括防腐劑、抗氧化劑、乳化劑、緩衝劑、果寡醣、吡啶甲酸鉻、醫藥活性物、如本文所述之其他營養素、著色劑、調味劑、增稠劑及穩定劑等。
    組合物可另外包含維生素或相關營養素，其非限制性實例包括維生素A、維生素D、維生素E、維生素K、硫胺素、核黃素、吡哆醇、維生素B12、類胡蘿蔔素、菸酸、葉酸、泛酸、生物素、維生素C、膽鹼、肌醇、鹽及其衍生物及其組合。
    組合物可另外包含礦物質，其非限制性實例包括磷、鎂、鈣、鐵、鋅、錳、銅、鈉、鉀、鉬、鉻、硒、氯及其組合。
    組合物亦可包括一或多種調味劑或掩蔽劑。適合之調味劑或掩蔽劑包括天然及人工甜味劑、鈉源(諸如氯化鈉)及水膠體(諸如瓜爾膠(guar gum)、三仙膠(xanthan gum)、角叉菜膠、結冷膠(gellan gum)、阿拉伯膠(gum acacia)及其組合)。 製造方法
    含HMB營養液體組合物可利用製造營養液體(包括乳液，諸如基於牛奶之營養乳液)的任何已知或其他適當方法進行製造。
    在一種適當製造方法中，營養液體係使用至少三種各別漿液加以製備，包括脂肪包蛋白質(PIF)漿液、碳水化合物-礦物質(CHO-MIN)漿液及水包蛋白質(PIW)漿液。PIF漿液藉由加熱及混合所選油(例如菜籽油、玉米油等)且隨後在繼續加熱及攪拌下添加乳化劑(例如卵磷脂)、脂溶性維生素及一部分總蛋白(例如乳蛋白濃縮物等)來形成。CHO-MIN漿液藉由在加熱攪拌下向水中添加以下來形成：礦物質(例如檸檬酸鉀、磷酸氫二鉀、檸檬酸鈉等)、痕量及超痕量礦物質(TM/UTM預混物)、增稠劑或懸浮劑(例如晶性纖維素(Avicel)、結冷膠、角叉菜膠)及HMB。所得CHO-MIN漿液在繼續加熱及攪拌下保持10分鐘，隨後添加其他礦物質(例如氯化鉀、碳酸鎂、碘化鉀等)及/或碳水化合物(例如果寡醣、蔗糖、玉米糖漿等)。隨後，藉由在加熱及攪拌下將其餘蛋白質(酪蛋白鈉、大豆蛋白濃縮物等)混合至水中來形成PIW漿液。
    所得漿液隨後在加熱攪拌下摻合在一起且將pH值調節至所需範圍(通常為6.6至7.0)，隨後對組合物進行高溫短時(HTST)處理，在此期間組合物經熱處理、乳化及均質化且隨後允許冷卻。添加水溶性維生素及抗壞血酸，必要時再次將pH值調節至所需範圍，添加調味劑，且添加水以獲得所需總固體含量。隨後，無菌封裝組合物以形成無菌封裝之營養乳液，或將組合物添加至殺菌釜式穩定容器中且隨後進行高壓滅菌以形成經高壓滅菌之營養乳液。
    營養乳液之製造方法可在不背離本發明之精神及範疇的情況下以除本文所述方式以外的方式進行。因此，本發明實施例在各個方面應理解為具說明性而非限制性，且所有變化及等效體亦屬於本發明之描述範圍內。
    營養固體(諸如噴霧乾燥營養粉末)可藉由適用於製造及調配噴霧乾燥營養粉末的已知或其他有效技術之任何集合來製備。
    噴霧乾燥步驟同樣可包括已知或在其他方面適用於製造營養粉末之任何噴霧乾燥技術。已知許多不同的噴霧乾燥方法及技術適用於營養領域，其皆適用於製造本文之噴霧乾燥營養粉末。
    一種製備噴霧乾燥營養粉末的方法包含形成及均質化包含HMB及視情況選用之蛋白質、碳水化合物及脂肪的水性漿液或液體，及隨後將漿液或液體噴霧乾燥以製造噴霧乾燥營養粉末。方法可另外包含噴霧乾燥、乾式混合或以其他方式向噴霧乾燥營養粉末中添加其他營養成分(包括本文所述成分中的任一者或多者)的步驟。
    製造方法較佳用HMB鈣(其最通常以單水合HMB鈣之形式調配)作為方法所用之HMB源進行調配。 使用方法
    如本文所述之包括HMB的組合物一般可投與個體(特定言之包括成人、年長成人、學步童、兒童及青少年)以一般性改善認知力或治療特定認知疾病或病狀(諸如年長成人之與神經退化性疾病相關的認知疾病)。個體一般可為健康的或可患有(或處於罹患以下風險之中)認知衰退、認知障礙(包括輕度認知障礙(MCI))、記憶差錯、一般回憶問題、認知病症或神經退化性疾病(諸如阿茲海默氏症、亨廷頓氏病、帕金森氏症、癡呆、肌肉萎縮性側索硬化、中風及精神分裂症)。特定言之對於學步童、兒童及青少年，含HMB組合物可改善總體認知功能及腦部發育。
    含HMB營養組合物增強個體神經功能，包括可自增強之神經功能實質上受益的年長成人，因為神經功能一般隨年齡增長而降低。特定言之，罹患神經功能障礙之年長成人尤其可受益於含HMB組合物。
    在特定實施例中，接受含HMB組合物的個體可為患有認知病症或處於出現認知病症之風險中或處於出現認知衰退或認知障礙(包括MCI)之風險中的年長成人。處於出現認知衰退或認知病症或障礙「風險」之中的個體包括具有稱為APOE-e4之特定基因形式、患有高血壓、糖尿病、抑鬱、高血壓、膽固醇升高及/或具有因年齡所致之認知衰退、認知障礙及/或認知病症/疾病之家族史的個體。
    使用含HMB組合物之本文所述的方法另外關於在投與該等組合物後(最通常在約1個月至約10年、包括約1個月至約1年且另外包括約1個月至約6個月之延長期間內每日使用之後)提供個體以下一或多者：(1)支持且維持成人及年長成人的神經功能；(2)增強成人及年長成人的神經功能；(3)對成人及年長成人具有神經保護作用；(4)預防/治療成人及年長成人之與神經退化性疾病相關的認知疾病；(5)預防/治療成人及年長成人的認知衰退或認知障礙；及(6)改善學步童、兒童及青少年的認知能力。在一個實施例中，每日投與含HMB組合物，為期至少1年。
    營養產品可按需口服以提供所需營養程度，最通常以每日1至2份之形式，每日一次或兩次或兩次以上分次劑量之形式，例如份量範圍通常為約100 ml至約300 ml，包括約150 ml至約250 ml且包括約190 ml至約240 ml。 實例
    以下實例說明本發明之含HMB營養組合物及方法的特定實施例及/或特徵。實例僅出於說明之目的而給出且不應理解為限制本發明，因為在不背離本發明之精神及範疇的情況下可能存在其許多變化形式。除非另有說明，否則所有例示量均為以組合物之總重量計的重量百分比。
    所例示之含HMB組合物為根據營養工業中熟知之用於製備營養乳液及噴霧乾燥營養粉末的製造方法製備的營養產品。 實例1至實例5
    實例1至實例5說明適用於本發明方法之含HMB噴霧乾燥營養粉末，其成分列於下表中。此等產品係利用噴霧乾燥法以各別分批形式製備且在使用前用水復原至所需目標成分濃度。除非另有說明，否則所有成分量均以公斤/1000公斤分批產品形式列出。
    實例6至實例10
    實例6至實例10說明本發明之含HMB營養乳液實施例，其成分列於下表中。除非另有說明，否則所有量均以公斤/1000公斤分批產品形式列出。
    實例11
    在此實例中，在口服HMB之後分析腦間質液中HMB之出現及其隨時間推移的濃度。
    首先，體重400 g至500 g之史泊格-多利大鼠(Sprague-Dawley rat)(Charles River,France)於恆定室溫(22℃±2℃)及45%至55%濕度的籠中按照正常12小時光/暗時程圈養。食物及水可隨意獲得。涉及動物及其護理的程序係依照符合關於實驗動物護理及使用之國家法律及EC政策(RD 2101-2005、86/609/CEE)的制度準則進行。
    導管依照大鼠之立體定向圖中所述之座標立體定向地插入各麻醉大鼠的海馬區內。允許大鼠自手術恢復至少3天。在實驗之第一天，將腦部微透析探針(MD-2204，BR-4，4 mm膜，購自BASi,West Lafayette,Indiana)插入各大鼠之導管內。林格氏溶液(Ringer's solution)(aCFS Harvard apparatus，#597316)以2微升/分鐘之恆定速率灌注探針。大鼠留置在具有相對自由運動空間的籠中。每隔二十分鐘自動收集透析液樣品。在實驗開始後100分鐘管飼給予單次劑量的HMB(250 mg/kg體重)且取樣再繼續160分鐘至220分鐘。
    使用UPLC-MS量測HMB。特定言之，aCSF中30 μl至40 μl之樣品經0.2 μm耐綸過濾器微過濾，用等量水稀釋，且隨後注入UPLC-TQD(Acuity-TQD系統，購自Waters Corporation,Milford,Massachusetts)中。使用BEH Hillic管柱(1.7 μm；2.1×150 mm)、使用由H2O：MeCN 0.1%甲酸組成之梯度分析HMB。質譜計設定為離子模式ES+。
    在不同日分析兩隻大鼠。在第5溶離份時給予管飼。如圖1中所示，投與後40分鐘大鼠1腦部中出現HMB(第7溶離份)，且隨後激增。採集溶離份直至管飼後超過2.5小時。此時，HMB濃度並未降低。所量測之HMB最大濃度為10.5 ppm。
    圖2顯示大鼠2之結果。此次，溶離份採集較長時期以偵測HMB濃度降低。大鼠2之腦部微透析液中之HMB時程濃度圖與大鼠1類似。其在第7溶離份中第一次偵測到且在投與後之2小時20分鐘期間激增(第12至第13溶離份)，其中達到最大濃度(大於4 ppm)。其後HMB濃度降低，然而在實驗結束時(管飼後超過3.5小時)，其尚未達到基礎水準。
    根據結果，口服的HMB出現在腦間質液中，其意謂HMB雖有相對親水性質，但仍能夠穿過大鼠微透析實驗模型之血腦障壁。 實例12
    在此實例中，分析HMB對神經細胞(Neuro 2A)中與蛋白質合成及細胞增殖有關之信號級聯之調節的作用。特定言之，分析HMB作為營養組分誘導神經元發育及可塑性及賦予神經保護的作用。
    神經元發育及突觸傳遞為受細胞外及細胞內條件改變影響的可塑過程。蛋白質激酶對此等現象之調節至關重要，且其中數種(例如有絲分裂原活化蛋白質激酶(ERK)、磷酸肌醇-3'激酶/AKT(PI3K/AKT)及鈣/鈣調蛋白依賴性激酶(CaMK))在神經元發育及突觸可塑性中具有公認作用。近來，愈來愈多地關注絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶、哺乳動物雷帕黴素靶蛋白(mammalian target of rapamycin；mTOR)。實際上，mTOR作為神經元發育之不同階段之調節子以及在軸突導向、樹突棘形態發生及數種形式之長期突觸可塑性中具有關鍵作用。
    肌細胞強化因子2(MEF2)亦在神經元存活中起重要作用。調節MEF2在神經元存活中之活性的路徑包括激素/因子或膜去極化刺激時的p38 MAPK(ERK)及PI3-AKT磷酸化。此外，在神經退化性疾病中，MEF2降解或mTOR路徑抑制可強烈誘導巨自噬，引起神經元死亡。儘管mTOR調節MEF2之機制未知，然而若干觀測資料已指出，MEF2觸發的神經元存活機制可能需要經由mTORC2與AKT/PKB之信號傳導組合。
    此實例中之轉染實驗係使用達爾伯克氏改質伊格爾氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle's medium；DMEM)中生長達80%至90%匯合的Neuro-2A細胞。使細胞暴露於質體pGL3-4xMEF 5小時，該質體pGL3-4xMEF在編碼螢火蟲螢光素酶DNA之序列前含有MEF2D結合DNA序列之4個串聯複本。將效應子添加至培養基中持續18小時且測定螢光素酶活性。為了研究信號傳導因子之抑制，將磷脂醯基-肌醇3激酶(LY294002)、ERK 1/2(PD98059)及mTORC1活化(雷帕黴素)之抑制劑添加至細胞中。
    藉由量測細胞蛋白質池中[3H]-酪胺酸之併入來測定HMB對Neuro-2A細胞中蛋白質合成速率的作用。藉由西方墨點法(western blot)測定mTOR及上調/下調蛋白質激酶(Akt、ERK 1/2)的磷酸化狀態。以MTT(溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓鹽)比色分析來測定細胞增殖/存活率。
    資料以平均值±SEM表示。使用史都登氏t檢驗法(Student t-test)分析結果。
    圖3A至圖3C顯示HMB對Neuro 2A細胞中mTOR及上游調節子之磷酸化的作用。在上述細胞培養條件下，HMB引起mTOR磷酸化顯著增加(圖3A)。此外，HMB使此細胞株中Akt(圖3C)及ERK 1/2(圖3B)之磷酸化狀態增強，其為哺乳動物細胞中mTOR信號傳導路徑之兩個主要的上游調節子。此外，HMB誘導之較高mTOR活化促使蛋白質合成增加(20% HMB相對於對照，圖4)。
    圖5A顯示HMB對Neuro 2A細胞表現MEF2轉錄因子的作用。培養基補充HMB引起MEF2依賴性轉錄螢光素酶活性的顯著增加。LY294002、PD98059及雷帕黴素抑制劑對MEF2轉錄因子之作用亦顯示於圖5B至圖5D中。LY294002或PD98059完全阻斷HMB介導之MEF2增加。然而，雷帕黴素對HMB誘導之MEF2表現無影響。LY294002及PD98059作用於mTOR之上游以阻斷表現。此作用抑制大部分(若不完全)mTOR活性。相反，雷帕黴素異位影響mTOR受質相互作用且僅選擇性阻斷mTOR活性之子集(由mTORC1複合物介導之彼等活性，而非由mTORC2介導之其他活性)。此符合以下發現：雷帕黴素不阻礙PI3/AKT活化所靶向之神經元存活、樹突生長及複雜性或動作電位。上述資料顯示HMB介導之MEF2活性可能均需要Ras/ERK與PI3/AKT路徑，從而使得MEF2為Ras/ERK及PI3/AKT路徑的下游效應子。
    圖6顯示HMB對神經元增殖及存活率之作用。如圖6中所示，HMB刺激神經元增殖及存活率。
    此實例之資料(使用Neuro 2A細胞)顯示HMB充當能夠調節關鍵信號傳導路徑之效應子，諸如調節關鍵基本細胞過程(諸如蛋白質合成及增殖)的mTOR-raptor/rictor-MEF2。因此，HMB可藉由調節神經元信號傳導路徑而有助於神經系統發育以及控制神經退化性疾病。 實例13
    在此實例中，分析HMB對大鼠焦慮/抑鬱行為的作用。
    此實例基於Porsolt等人1978年所描述之抑鬱強迫游泳測試(FST)。為開始實驗，在25℃下將大鼠個別地置於含有30 cm水之直立圓筒(高度：40 cm；直徑：21.5 cm)內持續15分鐘(亦即「預游泳」)。在此預游泳期之後，移出大鼠且在返回其籠中之前允許在熱外罩中乾燥。隨後大鼠經口投與每公斤體重250 mg或每公斤體重500 mg劑量的HMB。
    24小時後，使大鼠接受測試游泳，其中將大鼠再次置於圓筒中5分鐘且評估不活動及逃避行為的總持續時間。對測試游泳進行錄影且隨後評估不動潛伏期，其為未觀測到移動及大鼠處於「錨定(deadman)」狀態(亦即頭向上、尾向下、前腿稍彎曲且後腿向下)之點。在測試游泳前4小時及1小時，大鼠經口投與每公斤體重250 mg或每公斤體重500 mg各別劑量的HMB。
    如圖7中所示，較高劑量之HMB延長不動潛伏期(P=0.07)。此資料表明投與HMB具有抗抑鬱類似作用。
    圖1為描繪大鼠1之腦部微透析液中HMB時程濃度的圖，如實例11中所評估。
    圖2為描繪大鼠2之腦部微透析液中HMB時程濃度的圖，如實例11中所評估。
    圖3A為描繪HMB對Neuro 2A細胞中mTOR磷酸化狀態之作用的圖，如實例12中所評估。
    圖3B為描繪HMB對Neuro 2A細胞中ERK1/2磷酸化狀態之作用的圖，如實例12中所評估。
    圖3C為描繪HMB對Neuro 2A細胞中Akt磷酸化狀態之作用的圖，如實例12中所評估。
    圖4為描繪HMB對Neuro 2A細胞中蛋白質合成速率之作用的圖，如實例12中所評估。
    圖5A至圖5D為描繪HMB對Neuro 2A細胞在不同抑制劑不存在或存在下表現MEF2轉錄因子之作用的圖，如實例12中所評估。
    圖6為描繪HMB對Neuro 2A細胞之增殖及存活率之作用的圖，如實例12中所評估。
    圖7為描繪強迫游泳測試中依據不動潛伏期所量測之HMB之抗抑鬱作用的圖，如實例13中所評估。
    权利要求:
    Claims (15)
    [1] 一種改善年長成人認知力之方法，該方法包含投與該年長成人包含有效改善該年長成人認知力之量的β-羥基-β-甲基丁酸鹽的組合物。
    [2] 如請求項1之方法，其中每日投與該年長成人β-羥基-β-甲基丁酸鹽。
    [3] 如請求項2之方法，其中每日投與該年長成人約0.1 g至約10 g的β-羥基-β-甲基丁酸鹽。
    [4] 如請求項2之方法，其中每日投與該年長成人約0.1 g至約5.0 g的β-羥基-β-甲基丁酸鹽。
    [5] 如請求項1之方法，其中該組合物呈選自由以下組成之群的形式：營養粉末、營養乳液及澄清液。
    [6] 如請求項1之方法，其中該年長成人罹患認知衰退。
    [7] 如請求項1之方法，其中該年長成人罹患神經功能障礙。
    [8] 如請求項1之方法，其中投與該β-羥基-β-甲基丁酸鹽為期至少1年。
    [9] 一種治療年長成人之與神經退化性疾病相關之認知疾病的方法，該方法包含投與該年長成人包含有效治療該年長成人認知疾病之量的β-羥基-β-甲基丁酸鹽的組合物。
    [10] 如請求項9之方法，其中該神經退化性疾病係選自由以下組成之群：阿茲海默氏症(Alzheimer's disease)、亨廷頓氏病(Huntington's disease)及帕金森氏症(Parkinson's disease)、癡呆、肌肉萎縮性側索硬化、中風及精神分裂症。
    [11] 如請求項9之方法，其中每日投與該年長成人β-羥基-β-甲基丁酸鹽。
    [12] 如請求項11之方法，其中每日投與該年長成人約0.1 g至約10 g的β-羥基-β-甲基丁酸鹽。
    [13] 如請求項11之方法，其中每日投與該年長成人約0.1 g至約5.0 g的β-羥基-β-甲基丁酸鹽。
    [14] 如請求項9之方法，其中該組合物呈選自由以下組成之群的形式：營養粉末、營養乳液及澄清液。
    [15] 一種改善學步童、兒童或青少年認知功能的方法，該方法包含投與該學步童、兒童或青少年包含有效改善該學步童、兒童或青少年認知功能之量的β-羥基-β-甲基丁酸鹽的組合物。
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    法律状态:
    2019-10-11| MM4A| Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees|
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    US201161443762P| true| 2011-02-17|2011-02-17||
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