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    一種以一次性使用的聚異丙基丙烯醯胺膠體作為酵素包埋材料之生物檢測方法，包含下列步驟：步驟一：製作N-異丙基丙烯醯胺水溶液；步驟二：製作聚異丙基丙烯醯胺膠體；步驟三：將酵素加入緩衝溶液後與聚異丙基丙烯醯胺膠體混合；步驟四：將酵素以聚異丙基丙烯醯胺膠體包埋固定於生物感測器之感測膜上進行量測，利用聚異丙基丙烯醯胺膠體加熱會凝固的特性作為酵素包埋材料，可於量測後直接降溫以清水沖洗，在操作清洗過程容易且成本低，同時本發明使用銪鈦氧化物（EuTixOy）作為EIS元件之感測膜的生物感測器，在敏感度或精確度皆較以往良好。
    公开号:TW201307844A
    申请号:TW100127898
    申请日:2011-08-05
    公开日:2013-02-16
    发明作者:Tong-Ming Pan；Zhao-Wen Lin；gong-yuan Zhang；min-xian Wu；Xiao-Wen Cai
    申请人:Univ Chang Gung；
    IPC主号:C12Q1-00
    专利说明:
    以一次性使用的聚異丙基丙烯醯胺膠體作為酵素包埋材料之生物檢測方法與生物檢測器
    本發明係提供一種以聚異丙基丙烯醯胺膠體作為酵素包埋材料之生物檢測方法，並搭配使用以銪鈦氧化物(EuTixOy)作為EIS元件之感測膜的生物感測器，達到良好的敏感度與穩定性。
    近年來，酸鹼感測器與生物感測器於化學分析與臨床檢驗上具重要之地位。藉由結合特定酵素膜以及配合上各種酵素固定的方式來偵測人體生理機能之變化如尿液檢測、血糖檢測等等，提升元件的應用範圍。
    離子場效電晶體於感測器相關研究應用上具有元件體積小與反應時間快速且低成本等優點。利用離子場效電晶體的感測機制，廣泛使用於許多生物分子的感測，比如：葡萄糖、尿素、乳酸、尿酸等等。離子場效電晶體主要透過依附在電晶體表面的酵素膜反應後產生的酸鹼值變化來偵測待測物，因而探討如何在電晶體表面固定這層酵素膜。酵素固定的方式主要分為化學方式、物理方式或物理化學結合方式，然而，這些酵素固定的方式有許多缺點，例如：透過化學方式不易控制酵素的活動且酵素的生命期短，物理吸附的方式雖是在溫和的環境下進行，可讓酵素的活性損失最小，但因吸附力較弱，容易造成生化物質的流失，目前亦有人使用海藻膠來作為包埋酵素的材料，但海藻膠則具有不易清洗的缺點。
    是以，針對上述習知結構所存在之問題點，如何開發一種更具理想實用性之創新結構，實消費者所殷切企盼，亦係相關業者須努力研發突破之目標及方向。
    有鑑於此，發明人本於多年從事相關產品之製造開發與設計經驗，針對上述之目標，詳加設計與審慎評估後，終得一確具實用性之本發明。
    習知的酵素固定的化學方式有許多缺點，例如：透過化學方式不易控制酵素的活動且酵素的生命期短，物理吸附的方式雖是在溫和的環境下進行，可讓酵素的活性損失最小，但因吸附力較弱，容易造成生化物質的流失，目前亦有人使用海藻膠來作為包埋酵素的材料，但海藻膠則具有不易清洗的缺點。
    為改善上述之問題，本發明提供一種以一次性使用的聚異丙基丙烯醯胺膠體作為酵素包埋材料之生物檢測方法，係包含下列步驟：步驟一：將1.0g之N-異丙基丙烯醯胺(NIPPAm)粉末加上20ml的水在60℃隔水加熱，使其充分混合形成N-異丙基丙烯醯胺水溶液，並將其靜置室溫等待其冷卻為止；步驟二：將200ul的98.7%的過硫酸銨(ammonium peroxodisulfate，APS)和50ul的99%四甲基乙二胺(N，N，N，N-tetramethylethylenediamine，TEMED)加入N-異丙基丙烯醯胺水溶液中並充分混合，混合後將其靜置室溫30個小時使其內部反應呈透明稠狀，形成聚異丙基丙烯醯胺膠體(poly-N-isopropylacrylamide，PNIPPAm)；步驟三：另取5mg之酵素加入100ul的1X PBS緩衝溶液，並充分混合後，加入等量(100ul)的聚異丙基丙烯醯胺膠體，再充分混合後即可使用，其中，該酵素可為葡萄糖、尿素、乳酸或尿酸；步驟四：將一生物感測器置於加熱器上設定溫度37度，取步驟三所混合之溶液25ul滴在該生物感測器之感測膜上，待加熱後即會凝固成白色膠狀體；步驟五：最後將該生物感測器置入已加熱37度的量測溶液中確保步驟四所凝固之白色膠狀體保持37度，即可進行量測。
    又本發明以一次性使用的聚異丙基丙烯醯胺膠體作為酵素包埋材料之生物檢測器係以銪鈦氧化物(EuTixOy)作為EIS元件之一感測膜，其中，該感測膜係沉積於一半導體基板上，又該半導體基板下方設有一導電層，且該導電層與該感測膜電連結。
    其中，該半導體基板係為一矽基板。
    其中，在該感測膜與該半導體基板外更包覆一封裝材料，並使該感測膜上之感測區域露出。
    其中，該導電層包含一電極，並透過一金屬導線耦接該電極與該感測膜。
    本發明利用聚異丙基丙烯醯胺膠體加熱會凝固的特性作為酵素包埋材料，利用加熱後凝固將酵素固定於生物感測器的感測膜上來量測，並於量測結束後直接降溫以清水沖洗，在操作、清洗的過程都非常容易且成本較低，再加上本發明搭配使用銪鈦氧化物(EuTixOy)作為EIS元件之感測膜的生物感測器，不論是敏感度或精確度皆較以往良好。
    有關本發明所採用之技術、手段及其功效，茲舉一較佳實施例並配合圖式詳細說明於后，相信本發明上述之目的、構造及特徵，當可由之得一深入而具體的瞭解。
    請先參閱第一圖所示，本發明係提供一種以一次性使用的聚異丙基丙烯醯胺膠體作為酵素包埋材料之生物檢測方法，係包含下列步驟：步驟一(S1)，製作N-異丙基丙烯醯胺水溶液：將1.0g之N-異丙基丙烯醯胺(NIPPAm)粉末加上20ml的水在60℃隔水加熱，使其充分混合形成N-異丙基丙烯醯胺水溶液，並將其靜置室溫等待其冷卻為止；步驟二(S2)，製作聚異丙基丙烯醯胺膠體：將200ul的98.7%的過硫酸銨(ammonium peroxodisulfate，APS)和50ul的99%四甲基乙二胺(N，N，N，N-tetramethylethylenediamine，TEMED)加入N-異丙基丙烯醯胺水溶液中並充分混合，混合後將其靜置室溫30個小時使其內部反應呈透明稠狀，形成聚異丙基丙烯醯胺膠體(poly-N-isopropylacrylamide，PNIPPAm)；步驟三(S3)，將酵素加入緩衝溶液後，與聚異丙基丙烯醯胺膠體混合：先取5mg之酵素加入100ul的1X PBS緩衝溶液，並充分混合後，加入等量(100ul)的聚異丙基丙烯醯胺膠體，再充分混合後即可使用，其中，該酵素可為葡萄糖、尿素、乳酸或尿酸；步驟四(S4)，將酵素以聚異丙基丙烯醯胺膠體包埋並固定於生物感測器之感測膜上：請同時搭配參閱第二圖所示，分為以下幾個子步驟：子步驟一(S41)首先先將一生物感測器置於加熱器上設定溫度37度；子步驟二(S42)：取步驟三(S3)所混合之聚異丙基丙烯醯胺膠體溶液25ul滴在該生物感測器之感測膜上；子步驟三(S43)：透過一玻片使溶液水平延展開來並凝固成白色膠狀體；步驟五(S5)，進行量測：將該生物感測器置入已加熱37度的量測溶液中確保步驟四所凝固之白色膠狀體保持37度，即可進行量測，並於量測結束後，原來保持白色膠狀狀態的聚異丙基丙烯醯胺膠體待降溫後，會重新溶解為液狀聚異丙基丙烯醯胺膠體，此時直接以蒸餾水沖洗即可。
    藉此，透過本發明之步驟所製作之一次性使用的聚異丙基丙烯醯胺膠體作為酵素包埋的材料，且利用PNIPPAm加熱會凝固的特性將包埋之酵素形成一層酵素膜，即可進行量測，與習知所使用的海藻膠包埋酵素相比，本發明之膠體在量測結束並降溫後，即回復為液狀膠體，很容易用水清洗來移除，且有高的敏感度與好的穩定性；再者，聚異丙基丙烯醯胺膠體係由低成本的化學產品製作，不但製作容易且可大量配置，使用完畢亦可簡單去除。
    又本發明提供一種以一次性使用的聚異丙基丙烯醯胺膠體作為酵素包埋材料之生物檢測器(1)，如第三圖所示，該生物感測器(1)係以銪鈦氧化物(EuTixOy)作為電解液-絕緣體-半導體(electrolyte-insulator-semiconductor，EIS)元件之一感測膜(10)，其中該感測膜(10)係沉積於一半導體基板(20)上，該半導體基板(20)係為一矽基板，又該半導體基板(20)下方設有一導電層(30)，導電層(30)包含一電極(301)，並透過一金屬導線(302)耦接該電極(301)與該感測膜(10)，在該感測膜(10)與該半導體基板(20)外覆蓋一封裝材料(40)，並露出該感測膜(10)上之感測區域。
    藉此，利用本發明之一次性使用的聚異丙基丙烯醯胺膠體作為酵素包埋材料，其中，該酵素可為葡萄糖、尿素、乳酸或尿酸，並將該生物感測器(1)置於加熱器上設定溫度37度，使聚異丙基丙烯醯胺膠體凝固成白色膠狀體並將酵素膜固定於該感測膜(10)上即可進行檢測，本發明在實驗中利用聚異丙基丙烯醯胺膠體包埋尿酸酵素，再藉由PNIPPAm加熱會凝固的特性形成一層尿酸酵素膜在該生物感測器(1)之銪鈦氧化物(EuTixOy)的該感測膜(10)上量測尿酸溶液，發現本發明利用銪鈦氧化物(EuTixOy)作為EIS元件之感測膜(10)的生物感測器具有高的敏感度，感測值S=17.6mV/mM、線性度R2=0.99476(如第四圖所示)，且本發明並同時比較以銩鈦氧化物(Tm2Ti2O7)作為EIS元件之感測膜，量測尿酸酵素得到之感測值S=15.11mV/mM、線性度R2=0.9813(如第五圖所示)，故本發明利用高介電上述的銪鈦氧化物(EuTixOy)作為EIS元件之感測膜(10)的該生物感測器(1)，並搭配一次性使用的聚異丙基丙烯醯胺膠體與簡單的方法包埋酵素，不但可以保持酵素活性，並可增加生物感測器的敏感度。
    綜上所述，根據本發明所提供之以一次性使用的聚異丙基丙烯醯胺膠體作為酵素包埋材料之生物檢測方法並搭配使用銪鈦氧化物(EuTixOy)作為EIS元件之感測膜(10)的生物感測器，不但操作容易，更可達到高敏感度、高精確度、成本低等功效。
    前文係針對本發明之較佳實施例為本發明之技術特徵進行具體之說明；惟，熟悉此項技術之人士當可在不脫離本發明之精神與原則下對本發明進行變更與修改，而該等變更與修改，皆應涵蓋於如下申請專利範圍所界定之範疇中。
    (S1)．．．步驟一
    (S2)．．．步驟二
    (S3)．．．步驟三
    (S4)．．．步驟四
    (S41)．．．子步驟一
    (S42)．．．子步驟二
    (S43)．．．子步驟三
    (S5)．．．步驟五
    (1)．．．生物感測器
    (10)．．．感測膜
    (20)．．．半導體基板
    (30)．．．導電層
    (301)．．．電極
    (302)．．．金屬導線
    (50)．．．封裝材料
    第一圖：係本發明之方法步驟流程圖。
    第二圖：係本發明將PNIPPAm膠體結合酵素產生酵素膜固定於感測膜表面操作流程圖。
    第三圖：係本發明之生物檢測器結構示意圖。
    第四圖：係利用銪鈦氧化物(EuTixOy)作為感測膜所量測之結果圖。
    第五圖：係利用銩鈦氧化物(Tm2Ti2O7)作為感測膜所量測之結果圖。
    (S1)．．．步驟一
    (S2)．．．步驟二
    (S3)．．．步驟三
    (S4)．．．步驟四
    (S5)．．．步驟五
    权利要求:
    Claims (7)
    [1] 一種以一次性使用的聚異丙基丙烯醯胺膠體作為酵素包埋材料之生物檢測方法，係包含下列步驟：步驟一：將1.0g之N-異丙基丙烯醯胺(NIPPAm)粉末加上20ml的水在60℃隔水加熱，使其充分混合形成N-異丙基丙烯醯胺水溶液，並將其靜置室溫等待其冷卻為止；步驟二：將200ul的98.7%的過硫酸銨(ammonium peroxodisulfate，APS)和50ul的99%四甲基乙二胺(N，N，N，N-tetramethylethylenediamine，TEMED)加入N-異丙基丙烯醯胺水溶液中並充分混合，混合後將其靜置室溫30個小時使其內部反應呈透明稠狀，形成聚異丙基丙烯醯胺膠體(poly-N-isopropylacrylamide，PNIPPAm)；步驟三：另取5mg之酵素加入100ul的1X PBS緩衝溶液，並充分混合後，加入等量(100ul)的聚異丙基丙烯醯胺膠體，再充分混合後即可使用；步驟四：將一生物感測器置於加熱器上設定溫度37度，取步驟三所混合之溶液25ul滴在該生物感測器之感測膜上，待加熱後即會凝固成白色膠狀體；步驟五：最後將該生物感測器置入已加熱37度的量測溶液中確保步驟四所凝固之白色膠狀體保持37度，即可進行量測。
    [2] 如申請專利範圍第1項所述之以一次性使用的聚異丙基丙烯醯胺膠體作為酵素包埋材料之生物檢測方法，其中該酵素可為葡萄糖、尿素、乳酸或尿酸。
    [3] 一種以一次性使用的聚異丙基丙烯醯胺膠體作為酵素包埋材料之生物檢測器，該生物感測器係以銪鈦氧化物(EuTixOy)作為EIS元件之一感測膜。
    [4] 如申請專利範圍第3項所述之生物檢測器，其中該感測膜係沉積於一半導體基板上，又該半導體基板下方設有一導電層，且該導電層與該感測膜電連結。
    [5] 如申請專利範圍第4項所述之生物檢測器，其中該半導體基板係為一矽基板。
    [6] 如申請專利範圍第3項所述之生物檢測器，其中在該感測膜與該半導體基板外更包覆一封裝材料，並使該感測膜上之感測區域露出。
    [7] 如申請專利範圍第4項所述之生物檢測器，其中該導電層包含一電極，並透過一金屬導線耦接該電極與該感測膜。
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