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    本發明揭示用於鑑定生物試樣中且尤其獸醫來源之試樣中之病毒特異性多核苷酸序列之方法及組合物。本發明亦揭示寡核苷酸引物對，以及經標記之寡核苷酸檢測探針，其可用於檢測一或多種病毒來源之哺乳動物病原體之一或多種特定物種、菌株、類型或亞型之存在，亦揭示包含病毒特異性引物及經標記之檢測探針之系統、診斷套組及製造物品，其包括可用於鑑定多價疫苗之病毒成份及量化包含於家畜疫苗中之特定減毒活病毒之效能者。在某些實施例中，已利用即時定量PCR方法來鑑定並區分多價牛科動物運輸熱疫苗中之牛病毒性腹瀉病毒之三種已知遺傳亞型(BVDV-1a、BVDV-1b及BVDV-2)。
    公开号:TW201307571A
    申请号:TW100148447
    申请日:2011-12-23
    公开日:2013-02-16
    发明作者:Dale Wade Weise；James Robert Harris
    申请人:Lilly Co Eli；
    IPC主号:C12Q1-00
    专利说明:
    鑑定及區別多價運輸熱疫苗之病毒成份之組合物及方法
    本發明概言之係關於分子生物學領域，且更具體而言係關於獸醫臨床實驗室診斷方法。特定而言，本發明提供用於鑑定、擴增、量化及/或檢測源自特定病毒物種、類型及/或亞型(包括涉及在牛呼吸道疾病症候群(BRDC)中作為致病或促成因子之彼等物種)之核酸區段之系統、方法、組合物及診斷套組。特定而言，揭示鑑定並區別牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)之三種已知基因亞型之方法及組合物。
    本申請案與共同待決之標題為「Bovine Viral Diarrhea Virus Type 1b Vaccine Compositions and Methods」之美國臨時專利申請案第61/427,361號(與其同時於2010年12月27日申請，且其全文以明確引用方式明確地併入本文中)有關。 「運輸熱」
    「運輸熱」係針對牛及綿羊之臨床特徵在於發熱、急性氣道發炎、流鼻涕、厭食、抑鬱、纖維素性肺炎及感染組織壞死之急性、高傳染性、敗血性症候群的術語。飼養場在運輸後最經常遇到之運輸熱係幼牛之主要死亡原因，且造成該產業年損失估計超過5億美元。僅1991年，估計運輸熱就主要因治療成本、生產損失及死亡而造成美國牛業損失近6億2千4百萬。
    通常認為運輸熱之發病機制涉及使動物易患初期病毒呼吸道感染之不利外部影響，該感染進而產生有利於一或多種繼發細菌感染擴散之條件。 牛呼吸道疾病(BRD)症候群(BRDC)
    BRDC(通常稱為「運輸熱」)係頻繁折磨市場渠道及目的牧場或飼養場之食用犢牛/待肥育犢牛(stocker/feeder calf)之多因子疾病症候群。BRDC之特徵在於伴隨病毒與細菌病原體二者之依序或或同時感染，其係牛肉及奶牛產業經濟損失之主要原因。
    影響所有年齡之牛(包括哺乳犢牛)之該疾病之特徵在於呼吸急促、咳嗽、抑鬱、食欲不振、眼分泌物及流鼻涕及升高之溫度。在急性爆發時，可在症狀發作24小時內發生死亡。展現抑鬱之犢牛會具有下垂之耳朵、伸長之頭、弓背及/或經常與其他牛隔離。隨著犢牛健康狀況逐漸惡化，其會停止進食，展現增加之呼吸速率，且產生顯著發熱(通常在104℉至108℉範圍內)。
    至少4種病毒病原體與BRDC有關。其包括牛皰疹病毒1(BHV-1)(感染性牛鼻氣管炎[IBR]之原因因子)、牛副流行性感冒3型病毒(PI3)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)之一或多種遺傳變體及牛呼吸道合胞病毒(BRSV)。
    在病毒感染後，受影響動物隨後產生一或多種經常在急性肺炎中表現之後續細菌感染(例如，溶血性曼氏桿菌(Mannheimia haemolytica)[以前為溶血性巴氏桿菌(Pasteurella haemolytica)]、多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)、睡眠嗜組織菌(Histophilus somniI)(以前為睡眠嗜血桿菌(Haemophilus somnus))、化膿放線菌(Actinomyces pyogenes)及各種黴漿菌(Mycoplasma spp.))。 牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)
    現在認為BVDV係BRDC中之重要病原體。病毒在畜群內以糞口方式傳播會引起急性感染(包括腹瀉、發熱及出血性症候群)，且能夠穿過孕牛胎盤，此經常導致出生對該病毒免疫耐受且餘生具有持續病毒血症之持續感染(PI)之犢牛。當前，PI牛科動物代表主要病毒庫；該等動物極易感染引起肺炎或腸道疾病之微生物，且為牛之致命性黏膜疾病(MD)之爆發提供必需病毒庫(例如，參見Liess等人，1974：Barber等人，1985；Olafson等人，1946；Ramsey等人，1953；Malmquist,1968；及Ross等人，1986，其每一者之全文以明確引用方式明確地併入本文中)。
    牛病毒性腹瀉病毒係可以表型(例如，參見Baker,1995)(細胞病變或非細胞病變)與基因型(例如，參見Ridpath等人，1994；Vilcek等人，2001；及Flores等人，2002)二者分類之全異病毒群。在家畜中建立抵抗BVDV之保護免疫力出於多種原因而一直存有疑問。如在一些其他病毒介導之疾病中一樣，抵抗BVDV之血清抗體之含量不一定與抵抗疾病之保護相關。在哺乳犢牛中建立保護免疫力呈現額外障礙，此乃因抵抗BVDV之母體抗體可耗盡注射之免疫原並有效地中和疫苗。
    Fulton等人(2006)之研究評估21,743頭進入美國飼養場之犢牛且確定88頭犢牛持續感染(PI)BVDV。在88頭PI犢牛中，77.9%感染BVDV-1b；僅11.6%感染BVDV-1a，且僅10.5%感染BVDV-2a。
    本發明藉由以下方式來克服先前技術中固有之該等及其他限制：有利地提供檢測試樣中且尤其生物或獸醫來源之試樣中或自該等試樣獲得之多核苷酸群體中之病毒特異性核苷酸序列的系統及方法。本發明亦藉由以下方式在另一實施例中克服業內缺陷：有利地提供特異性檢測及區分自兩個或更多個遺傳相關多核苷酸群體獲得之核酸(包括(例如)自兩種或更多種遺傳相關病毒物種、菌株、類型或亞型獲得之核酸)的組合物及方法。本發明可首次提供特異性寡核苷酸擴增引物及經標記之寡核苷酸檢測探針(以及包含其之診斷分析套組)，其用於辨別對BVDV之已知遺傳亞型(例如，1a型、1b型及2型)具有特異性之多核苷酸，及用於鑑定及量化存在於多價病毒顆粒群體中之每一病毒成份。
    本發明亦可有利地提供擴增引物對及經標記之寡核苷酸檢測探針以及使用此等不同實施例中之組合物製備高靈敏度病毒特異性檢測系統之方法，該等檢測系統可用於更精確地測定多價疫苗調配物中個別經修飾活病毒(MLV)之效能，該等調配物包括(例如)申請者之共同待決之美國臨時專利申請案61/427,361(2010年12月27日申請，且其全文以明確引用方式明確地併入本文中)中所述之六價運輸熱疫苗。
    本發明亦揭示包括含有此等病毒特異性引物及探針之診斷套組的製造物件。使用採用本發明組合物之定量(且尤其即時定量)聚合酶鏈反應(qPCR)分析(尤其在與一或多種可檢測標記配合使用時，包括(例如)螢光及發色檢測方法，例如基於螢光共振能量轉移(FRET)之檢測系統)提供之快速分析及增加之靈敏度僅闡釋本發明可向獸醫臨床實驗室環境提供之許多優點中之兩者。
    在第一實施例中，本發明提供組合物，其包括至少一個第一病毒特異性寡核苷酸擴增引物；至少一個第二病毒特異性寡核苷酸擴增引物；及至少一個第一經標記之病毒特異性檢測探針，其適於對多核苷酸群體實施基於PCR之擴增/檢測分析。
    如本文所述，此等病毒特異性檢測探針較佳包括至少一種可檢測標記，包括(但不限於)一或多種發色、螢光、自旋標記或放射性部分或其任一組合。
    在相關實施例中，本發明提供用於檢測水性試樣中之一或多種病毒特異性核酸序列之組合物。較佳地，該試樣係生物來源(包括(但不限於)細胞、組織、血液、血漿、血清及其任何組合)之試樣或已知含有或懷疑含有一或多種病毒特異性核酸之診斷、實驗室或醫藥組合物或調配物。較佳地，此組合物係能夠在一或多種哺乳動物家畜中誘發免疫反應之哺乳動物疫苗調配物或免疫原性組合物。
    較佳地，此等組合物包括一或多種正向擴增引物及一或多種反向擴增引物，其與對一或多種牛-病原性病毒物種、菌株、類型及/或亞型具有特異性之核酸序列特異性雜交，且有助於其聚合酶依賴性擴增。
    本發明之其他態樣包括含有一或多種上述組合物之如本文所進一步詳細闡述之診斷及/或分子分析套組，其較佳適於在適當條件下實施聚合酶鏈反應以自包含獸醫修飾之活病毒疫苗之試樣擴增病毒特異性核酸序列來經由PCR產生複數個經擴增核酸區段，該等區段可使用一或多種適宜標記之寡核苷酸檢測探針(包括(但不限於)彼等本文所闡述及例示之探針序列)檢測及/或量化。
    本發明亦提供一或多種此等組合物在製造物件中之用途，該物件用於擴增及/或檢測自生物試樣獲得之多核苷酸群體中之一或多種病毒特異性多核苷酸。在說明性實施例中，此用途包括擴增、檢測及/或量化一或多個BVDV顆粒且較佳一或多個此等包含MLV之病毒顆粒。在實例性實施例中，證實此等組合物在自複數個包含於多價牛運輸熱疫苗內之減毒活病毒顆粒擴增、檢測及量化BVDV 1b型、1b型及2型特異性多核苷酸中之用途。藉由利用對不同物種、菌株、類型或亞型之病毒具有特異性之探針/引物組合，本發明方法可進一步用於表徵疫苗效能且尤其多價動物疫苗，例如彼等預防具有已知病毒來源之病原之疾病(例如BRDC及相關運輸熱)者。
    總體而言，本發明方法允許快速、精確且容易地檢測來自多核苷酸群內且尤其來自多價疫苗調配物之病毒特異性多核苷酸，該等多價疫苗調配物有效預防、治療、管理及/或改善多因子疾病(且尤其多病因來源之疾病)(例如BRDC及相關運輸熱)之一或多種症狀。此方法通常涉及實施至少一個循環步驟，其中該循環步驟包含至少一個第一擴增步驟及至少一個第一雜交步驟，且其中若試樣中存在病毒特異性核酸分子，則該至少一個第一擴增步驟包含使該試樣與如本文所揭示之探針/引物組合物接觸以產生病毒特異性擴增產物，其中該至少一個第一雜交步驟包含使該試樣與該組合物接觸；及在有效特異性檢測所得雜交產物之條件下使如此產生之擴增產物與至少一個第一經標記之寡核苷酸檢測探針接觸。在說明性實施例中，病毒特異性擴增引物對包含：長度小於約50個核苷酸之第一寡核苷酸擴增引物，其包含選自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：16中之一或多者之核酸序列，基本上由其組成，或另一選擇為由其組成；及長度小於約50個核苷酸之第二寡核苷酸擴增引物，其包含選自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：17中之一或多者之核酸序列，基本上由其組成，或另一選擇為由其組成。
    在某些實施例中，該組合物可進一步包含至少一個第一經標記之病毒特異性檢測探針。此等檢測探針之長度較佳小於約50個核苷酸，且包含選自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：18中之一或多者之核酸序列，基本上由其組成，或另一選擇為由其組成。
    在較佳實施例中，當多核苷酸群體中存在病毒特異性核酸分子時，第一循環步驟較佳包括使多核苷酸群與一對病毒特異性擴增引物接觸以產生擴增產物，且另外其中至少一個第一雜交步驟包含在有效檢測如此產生之擴增產物之條件下使多核苷酸群體與至少一個第一經標記之病毒特異性檢測探針接觸。在某些實施例中，檢測步驟可即時實施，且可進一步視情況包括確定病毒特異性檢測探針與病毒擴增產物間之熔解溫度之額外步驟。 確定疫苗效能之方法及組合物
    本發明提供鑑定MLV試樣中之病毒特異性多核苷酸序列且尤其BVDV特異性多核苷酸序列(例如彼等存在於動物疫苗中者)之方法。本發明亦提供用於特異性檢測試樣中且尤其哺乳動物疫苗中或自牛科動物獲得之獸醫或生物樣本以及來自疫苗候選物之病毒特異性多核苷酸序列的方法及組合物。所揭示方法較佳利用寡核苷酸引物對以及經標記之寡核苷酸探針組合物及套組且尤其彼等包含一或多種本文所揭示之序列來檢測PCR擴增產物，經由雜交引物標記所得擴增產物並使用一或多種基於PCR、qPCR、RT-qPCR及PCR/FRET之分析量化此等擴增產物，該等分析尤其與後續熔解曲線(例如，Cτ)分析組合。
    在一個實施例中，本發明提供檢測一或多種病毒特異性多核苷酸或編碼全部或一部分病毒源蛋白質、肽或多肽之核酸區段之存在或不存在的方法。在某些態樣中，一或多種生物試樣可取自個體(例如，疫苗調配物或自家畜獲得之生物試樣)且對此一序列之存在篩選。在特定實施例中，可對疫苗調配物或生物試樣篩選一或多種特異性病毒序列之存在，該等序列包括(例如)對多因子動物疫苗之一或多種MLV病毒成份具有特異性之序列。
    PCR方法為彼等熟習分子生物學技術者所熟知(例如，參見美國專利第4,683,195號及第4,683,202號，其每一者之全文以明確引用方式明確地併入本文中)。在由適當鹽、金屬陽離子及pH緩衝系統構成之反應介質中在足量的4種三磷酸去氧核糖核苷(dATP、dGTP、dCTP及dTTP)存在下藉由聚合劑來催化PCR中引物之模板依賴性延伸。適宜聚合劑係已知催化模板依賴性DNA合成之酶。舉例而言，若模板係RNA，則將RNA轉化為互補DNA(CDNA)序列之適宜聚合劑係反轉錄酶(RT)，例如禽骨髓胚細胞過多症病毒RT。如美國專利第5,614,388號(其全文以明確引用方式明確地併入本文中)中所述，若擴增用靶係DNA，則適宜聚合酶包括(但不限於)大腸桿菌(E.coli)DNA聚合酶I或其Klenow片段、T4 DNA聚合酶及Taq聚合酶(分離自微生物水生棲熱菌(Thermus aquaticus)之熱穩定DNA聚合酶)。稱為「Taq聚合酶」之後一酶廣泛用於核酸之擴增及測序，且使用此等聚合酶之反應條件為彼等熟習此項技術者所熟知(例如，參見Sambrook及Russell,2001)。在PCR方法之較佳實施例中，藉由熱穩定DNA聚合酶(例如Taq DNA聚合酶)來催化該反應，且在升高溫度下實施。較佳溫度係酶熱穩定且核酸處於單鏈與雙鏈之平衡狀態從而使得足夠引物將退火至模板鏈以達成合理聚合速率之溫度。藉由將反應物加熱至足夠高溫度並保持足夠時間以引起雙鏈體變性，但不引起聚合酶之不可逆變性來達成鏈分離。
    在特定應用中，本發明方法有利地採用至少一個第一基於PCR之擴增步驟，且較佳至少一個第一基於定量PCR之擴增步驟，該步驟通常涉及實施至少一個循環步驟(其包括至少一個第一「擴增」步驟及至少一個第一「雜交」步驟)。若試樣中原來存在病毒靶多核苷酸，則此擴增步驟包括使試樣與一對病毒特異性寡核苷酸引物接觸以產生擴增產物。(反之，若試樣中原來不存在病毒靶多核苷酸，則在PCR方法期間不產生特異性產物擴增)。
    雜交步驟通常包括使擴增步驟產生之試樣與一或多種經標記之寡核苷酸探針接觸，該等探針與所產生之擴增產物特異性雜交(即結合)。在FRET分析之情形下，檢測探針可包含病毒特異性寡核苷酸探針之FRET相容檢測對(例如包括與擴增產物在彼此不多於約4個或5個核苷酸內雜交之FRET相容對)之第一及第二成員。在FRET分析之情形下，檢測探針對之第一探針通常經供體螢光部分標記且檢測探針對之第二探針通常經對應接受體螢光部分標記。用於雜交步驟中之該等檢測探針及可操作地連接至彼等之部分之類型已更詳細地闡述於上文中。
    該方法亦進一步至少包含經由使用適宜標記(且通常為可操作地連接至探針之標記)檢測擴增產物：探針雜合體之存在或不存在之步驟，其中存在來自經標記探針之信號一般指示試樣中存在靶多核苷酸。反之，在不存在產生之擴增產物時，在探針雜交步驟後實質上無法獲得可檢測信號，藉此指示所分析試樣中原來存在之核酸序列群體中不存在靶多核苷酸。
    在某些實施例中，擴增及檢測之步驟可即時實施，且該方法可視情況進一步包括額外量化或分析步驟(包括例如確定檢測探針與對應擴增產物間之熔解溫度以量化或進一步表徵所分析試樣中之病毒源靶序列(若存在))。
    確定探針與其對應靶間之熔解溫度之方法通常涉及以下：將PCR擴增產物及對應檢測探針冷卻至40℃以促進探針退火至靶定PCR擴增產物之互補序列。在可使經標記探針有效退火至靶定PCR產物(若存在)之條件下使該等探針與反應混合物接觸後，然後使用彼等熟習分子生物學技術者已知之習用技術檢測(且隨後量化)可檢測標記(例如，螢光團等)。
    核酸之檢測為彼等熟習此項技術者所熟知，且可藉助應用眾多方法來達成。該等方法通常基於對標記或標記物之檢測，例如業內已知之任何放射性、螢光、生物學或酶標籤或標記(例如，參見美國專利第3,817,837號、第3,850,752號、第3,939,350號、第3,996,345號、第4,277,437號、第4,275,149號及第4,366,241號，其每一者之全文以明確引用方式明確地併入本文中)。可用於本發明之實踐中之可檢測標記之其他實例包括順磁離子，例如鉻(III)、錳(II)、鐵(III)、鐵(II)、鈷(II)、鎳(II)、銅(II)、釹(III)、釤(III)、鐿(III)、釓(III)、釩(II)、鋱(III)、鏑(III)、鈥(III)及鉺(III)，其中釓尤佳。亦可使用包括(但不限於)玫瑰紅(rhodamine)、螢光素及腎造影劑之螢光部分，其中在與發色受質接觸後產生有色產物之酶尤佳。亦可使用二級結合配體(包括(但不限於)二級抗體及/或生物素/抗生物素蛋白(avidin)配體結合佈置)，如為彼等熟習分子生物學技術者已知。
    如上文所述，可使用任一標記作為寡核苷酸探針之標記，只要其滿足上述要求且其與核酸特異性標記相互作用即可。實例包括(但不限於)LightCycler®紅640、LightCycler®紅705、TAMRA及Alexa 633。標記可在任何位置附接至寡核苷酸，只要附接不影響寡核苷酸之雜交即可。在特定應用中，標記一般可操作地連接(即，結合、附接、連接等)至寡核苷酸探針分子之5'或21端。
    除本文具體闡述之寡核苷酸外，亦可設計並合成(例如，使用電腦程式，例如OLIGO[Molecular Biology Insights公司，Cascade,CO,USA])其他核酸作為擴增引物或檢測探針以供本文所述之病毒效能分析。通常，寡核苷酸引物及探針之長度為約7個或8個至約60個或約80個核苷酸(例如，長度為7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個等核苷酸)。本文所用「病毒特異性引物」係指特異性退火至存在於所選特定病毒之基因組內之核酸序列且在適當條件下促進起始擴增產物之聚合酶合成的寡核苷酸引物。同樣，「病毒特異性探針」係指特異性退火至在適當條件下使用雜交引物對由適宜聚合酶擴增之核酸序列且可使用習用寡核苷酸檢測分析及諸如此類來連續、伴隨、依序及/或隨後檢測(且較佳可量化)之寡核苷酸探針。 寡核苷酸組合物
    在一個實施例中，本發明提供對病毒特異性多核苷酸具有特異性之寡核苷酸探針及引物序列及自其產生之擴增產物，其可用於與對應同源病毒多核苷酸序列且尤其與存在於動物疫苗中之經修飾活病毒顆粒之序列雜交及該等序列之擴增。在說明性實施例中，揭示可用於檢測及擴增特定遺傳菌株、類型及亞型之BVDV-特異性核酸序列之實例性寡核苷酸引物序列。
    本發明之寡核苷酸引物及探針經設計用於選擇性擴增及檢測病毒特異性核酸區段且尤其BVDV-特異性多核苷酸(及源自其之擴增產物)。所揭示引物序列適用於雜交方法及DNA擴增方法，例如基於PCRTM之擴增方法(包括例如基於即時-pPCR、RT-PCR、RT-PCR/FRET之遺傳分析)。同樣，所揭示寡核苷酸檢測探針適於經適當標記手段標記，以供檢測及量化自使用本文所揭示一或多對病毒特異性擴增引物擴增核酸獲得之產物。
    在經適當標記物標記時，寡核苷酸檢測探針尤其適於基於螢光之檢測，包括(例如)基於PCR、即時PCR、定量PCR(qPCR)、FRET之分析及諸如此類。舉例而言，經FRET標記之檢測方法尤其可用於基於微體積螢光測定之螢光測定檢測。在基於組合式RT-PCRTM/微體積螢光測定FRET之方法(RT-PCRTM/FRET)中且尤其在由「LightCycler®」儀器(如藉由Idaho Technology公司所研發，且現在由Roche Molecular Systems製造並出售)所促進之分析中尤其涵蓋使用一或多個所揭示擴增及檢測寡核苷酸對。
    對於大多數實施例而言，本發明者預期本發明之所選探針及引物組合物之長度較佳將在長度上小於約50個至約60個核苷酸且更佳將在長度上小於約40個至約45個核苷酸，而本發明之其他探針及引物之長度可近似地為約30個至約35個核苷酸。在一些實施例中，所選寡核苷酸引物序列(例如，「正向」及「反向」引物)之長度及/或所選檢測探針序列(例如，「錨」探針及「感測器」探針)之長度將可能在長度上近似地為約20個至約30個核苷酸，但在一些情形下，特定探針及引物序列之大小可大於該長度，且在長度上近似地為約60個至70個核苷酸。另一選擇為，在一些實施例中，可能期望採用較短探針及/或引物序列，且因此所選用於實踐本發明之寡核苷酸可在長度上近似地為約15個至約20個核苷酸或在一些實施例中甚至略短。
    在本申請案之上下文中，應理解，預期本文所述不同範圍內之所有中間寡核苷酸長度皆明確地屬於本發明之範圍內。為此，「長度小於約XX個核苷酸」之寡核苷酸包括該範圍內所包括之所有整數。舉例而言，「長度小於約60個核苷酸」之寡核苷酸包括長度為59個、58個、57個等至4個、3個、2個或1個核苷酸之寡核苷酸且每一者皆明確地屬於本發明之範圍內。
    本發明之寡核苷酸可藉由彼等熟習此項技術者已知之許多習用方法(例如，參見Ozaki等人，1992；Agrawal等人，1990或諸如此類)使用標準方法，包括亞磷醯胺化學(例如，參見Bcaucage及Iyer,1992；及美國專利第4,980,460號、第4,725,677號、第4,415,732號、第4,458,066號及第4,973,679號及諸如此類)來合成。亦可採用產生(例如)非天然骨架基團(例如硫代磷酸酯、胺基磷酸酯及諸如此類)之替代性化學，前提為所得寡核苷酸之雜交效率不會受到不利影響。較佳地，寡核苷酸之長度在約10個至約120個核苷酸之範圍內；更佳地，長度在約15個至約100個核苷酸之範圍內，且更佳仍長度在約20個至約80個核苷酸之範圍內，但寡核苷酸之精確序列及長度尤其取決於其所雜交之靶核酸序列之性質，此乃因對於特定實施例而言，結合位置及長度可經改變以達成適當退火及熔解性質。作出此等設計選擇之指導可參見闡述用於下文實例中且亦詳細地闡述於Holland等人(1991)中之「Taqman®型」分析的許多上述參考文獻。上述參考文獻中之每一者之全文以明確引用方式明確地併入本文中。 病毒特異性擴增引物
    在本發明之實踐中，用於擴增病毒特異性多核苷酸序列且具體而言編碼BVDV之多核苷酸序列之正向及反向擴增引物較佳將包含至少約6個至至少約25個(包括其間之每一整數)或更多個鄰接核酸、基本上由其組成、或另一選擇為由其組成，該等鄰接核酸來自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：16中所揭示之「正向」寡核苷酸引物序列或SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：17中所揭示之「反向」寡核苷酸引物序列中之任一者；或來自與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：16中所揭示之「正向」寡核苷酸引物序列或SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：17中所揭示之「反向」寡核苷酸引物序列中之任一者至少約90%一致的寡核苷酸序列；或甚至來自與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：16中所揭示之「正向」寡核苷酸引物序列或SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：17中所揭示之「反向」寡核苷酸引物序列中之任一者至少約95%一致的寡核苷酸序列。
    在其他實施例中，本發明之較佳寡核苷酸正向及反向擴增引物序列可包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：16中所揭示之「正向」寡核苷酸引物序列或SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：17中所揭示之「反向」寡核苷酸引物序列中之任一者、基本上由其組成、或另一選擇為由其組成，而在其他實施例中，可能期望採用基本上由以下組成之引物序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：16中所揭示之「正向」寡核苷酸引物序列或SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：17中所揭示之「反向」寡核苷酸引物序列中之任一者，而在其他實施例中，可能期望採用由以下組成之引物序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：16中所揭示之「正向」寡核苷酸引物序列或SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：17中所揭示之「反向」寡核苷酸引物序列中之任一者。
    在其他實施例中，較佳用於實踐本發明方法之正向及反向擴增引物組合物可包含代表如以下序列中之任一者所揭示之約6個至約25個(包括其間之每一整數)或更多個核苷酸之鄰接核酸序列的核酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17，基本上由其組成，或另一選擇為由其組成。
    同樣，較佳用於實踐本發明擴增方法之引物組合物可包含與如以下序列中之任一者所揭示之約6個至約25個(包括其間之每一整數)或更多個核苷酸之鄰接核酸序列約90%一致的核酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17，基本上由其組成，或另一選擇為由其組成。
    另外，較佳用於實踐本發明擴增方法之擴增引物組合物可包含與以下序列中之任一者中所揭示之任一寡核苷酸序列至少約95%一致的核酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17，基本上由其組成，或另一選擇為由其組成。
    在其他實施例中，較佳用於實踐本發明之引物組合物可包含至少約6個至至少約25個(再包括其間之每一整數)或更多個鄰接核酸之核酸序列，基本上由其組成，或另一選擇為由其組成，該等鄰接核酸選自以下序列中之任一者中所揭示之任一寡核苷酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17；或可基本上由與以下序列中之任一者中所揭示之任一寡核苷酸序列至少約90%一致的寡核苷酸序列組成：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17；或甚至可基本上由與以下序列中之任一者中所揭示之任一寡核苷酸序列至少約95%一致的寡核苷酸序列組成：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17。
    在某些實施例中，本發明之說明性擴增引物之長度為至少約50個核苷酸且包含含有如以下序列中之任一者中所揭示核苷酸序列之核苷酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17，基本上由其組成，或由其組成。
    在其他實施例中，本發明之說明性擴增引物之長度為至少約40個核苷酸且包含含有如以下序列中之任一者中所揭示之核苷酸序列之核苷酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17，基本上由其組成，或由其組成。
    在其他實施例中，本發明之說明性擴增引物之長度為至少約30個核苷酸且包含含有如以下序列中之任一者中所揭示之核苷酸序列之核苷酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17，基本上由其組成，或由其組成。
    在本發明之其他態樣中，本發明之說明性擴增引物之長度為至少約25個核苷酸且包含含有如以下序列中之任一者中所揭示之核苷酸序列之核苷酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17，基本由其組成，或由其組成，而在其他態樣中，本發明之說明性擴增引物之長度為至少約20個核苷酸且包含含有如以下序列中之任一者中所揭示之核苷酸序列之核苷酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17，基本上由其組成，或由其組成。
    在特定說明性實例中，本發明之寡核苷酸引物組合物之長度小於約50個核苷酸且包含以下序列中之任一者之核苷酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17，而在其他說明性實例中，本發明之寡核苷酸引物組合物之長度小於約40個核苷酸且包含以下序列中之任一者之核苷酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17，且在其他實例中，本發明之寡核苷酸引物組合物之長度小於約30個核苷酸且包含以下序列中之任一者之核苷酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17。
    在本發明之一些態樣中，可能期望在實踐本文所揭示之方法中採用長度小於約45個核苷酸且基本上由以下序列中之任一者之核苷酸序列組成之寡核苷酸引物組合物：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17；或長度小於約35個核苷酸且基本上由以下序列中之任一者之核苷酸序列組成之組合物：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17，而在其他實例中，可能期望採用長度小於約25個核苷酸且基本上由以下序列中之任一者之核苷酸序列組成之寡核苷酸引物組合物：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17。 病毒特異性檢測探針
    在本發明之實踐中，用於使用本文所述RT-qPCRTM分析檢測病毒特異性多核苷酸序列(且具體而言BVDV-特異性多核苷酸序列)之寡核苷酸探針較佳將包含至少約6個至至少約25個(包括其間之每一整數)或更多個鄰接核酸，該等鄰接核酸來自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：18中所揭示之寡核苷酸探針序列中之任一者；或來自與SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：18中所揭示之寡核苷酸檢測探針序列中之任一者至少約90%一致的寡核苷酸序列；或甚至來自與SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：18中所揭示之寡核苷酸探針序列中之任一者至少約95%一致的寡核苷酸序列。
    在其他實施例中，本發明之較佳寡核苷酸檢測探針可包含以下中所揭示寡核苷酸探針序列中之任一者：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：18，基本上由其組成，或另一選擇為由其組成，而在其他實施例中，可能期望採用基本上由如以下中所揭示寡核苷酸中之任一者組成之檢測探針核酸區段：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：18，而在其他實施例中，可能期望採用由以下中所揭示之任一寡核苷酸序列組成之探針序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：18。
    在其他實施例中，且具體而言其中採用FRET分析來檢測如此產生之擴增產物，本發明之檢測探針較佳將包含一對探針，其第一探針係「錨」探針，且其第二探針係「感測器」探針。
    較佳用於實踐本發明方法之探針組合物可包含一對檢測探針，基本上由其組成，或另一選擇為由其組成，該對檢測探針之第一及第二成員可由代表如以下序列中之任一者中所揭示之約6個至約25個(包括其間之每一整數)或更多個核苷酸之鄰接核酸序列的核酸序列組成：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：18。
    同樣，較佳用於實踐基於FRET之檢測方法之探針組合物可包含一對檢測探針，基本上由其組成，或另一選擇為由其組成，該對檢測探針之第一成員可由與如以下序列中之任一者中所揭示之約6個至約25個(包括其間之每一整數)或更多個核苷酸之鄰接核酸序列約80%、至少約81%一致、至少約82%一致、至少約83%、至少約84%或至少約85%一致的核酸序列組成：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：18，而該對檢測探針之第二成員較佳可包含與如以下序列中之任一者中所揭示之約6個至約25個(包括其間之每一整數)或更多個核苷酸之鄰接核酸序列約90%、至少約91%一致、至少約92%一致、至少約93%、至少約94%或至少約95%一致的核酸序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：18，基本上由其組成，或另一選擇為由其組成。
    另外，當期望對擴增產物實施基於FRET之分析時，較佳用於實踐本發明方法之寡核苷酸探針可包含一對FRET檢測探針，基本上由其組成，或另一選擇為由其組成，該對FRET檢測探針之第一及第二成員可包含與以下序列中之任一者中所揭示之任一寡核苷酸序列至少約95%、至少約96%一致、至少約97%一致或至少約98%或99%一致的核酸序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：18。在其他實施例中，較佳用於實踐本發明之探針組合物可包含一對FRET錨/感測器探針，基本上由其組成，或另一選擇為由其組成，該對FRET錨/感測器探針之第一及第二成員可基本上由至少約6個至至少約25個(包括其間之每一整數)或更多個鄰接核酸之核酸序列組成，該等鄰接核酸選自以下序列中之任一者中所揭示之任一寡核苷酸序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：18；或可基本上由與以下序列中之任一者中所揭示之任一寡核苷酸序列至少約90%一致的寡核苷酸序列組成：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：18；或甚至可基本上由與以下序列中之任一者中所揭示之任一寡核苷酸序列至少約95%、至少約96%一致、至少約97%一致或至少約98%或99%一致的寡核苷酸序列組成：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：18。
    在某些實施例中，本發明之說明性病毒擴增產物特異性寡核苷酸檢測探針組合物之長度較佳為至少約50個核苷酸，該等組合物包含選自由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：18組成之群之核苷酸序列，基本上由其組成，或由其組成。
    在其他實施例中，本發明之說明性檢測探針組合物較佳為長度為至少約40個核苷酸之寡核苷酸，該等組合物包含選自由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：18組成之群之核苷酸序列，基本上由其組成，或由其組成。
    在其他實施例中，檢測探針組合物可為長度為至少約30個核苷酸之寡核苷酸，該等組合物包含選自由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：18組成之群之核苷酸序列，基本上由其組成，或由其組成，而在其他實施例中，適宜檢測寡核苷酸之長度可為至少約20個核苷酸，該等寡核苷酸包含選自由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：18組成之群之核苷酸序列，基本上由其組成，或由其組成。
    在特定說明性實例中，本發明之寡核苷酸檢測探針組合物之長度小於約50個核苷酸且包含以下序列中之任一者之核苷酸序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：18，而在其他說明性實例中，寡核苷酸檢測探針組合物之長度小於約40個核苷酸且包含以下序列中之任一者之核苷酸序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：18。
    在其他應用中，適宜寡核苷酸檢測探針之長度可小於約30個核苷酸且可包含選自由以下組成之群之核苷酸序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：18。
    在本發明之一些態樣中，可能期望在實踐本文所揭示之方法中採用長度小於約45個核苷酸且基本上由以下序列中之任一者之核苷酸序列組成的寡核苷酸探針組合物：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：18；或另一選擇為，長度小於約35個核苷酸且基本上由以下序列中之任一者之核苷酸序列組成的寡核苷酸探針：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：18，而在其他實例中，可能期望採用長度小於約25個核苷酸且基本上由以下序列中之任一者之核苷酸序列組成的寡核苷酸檢測探針組合物：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：18。
    在說明性實施例中，本發明提供病毒特異性擴增引物及檢測探針，其包含較佳與SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：18中所揭示之任一或多個寡核苷酸序列至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%或更多一致的核酸序列，基本上由其組成，或由其組成。
    在某些實施例中，本發明提供基於與病毒特異性擴增產物之一或多個部分之特異性結合設計的引物及探針組合。該等探針及引物尤其可用於快速檢測及鑑定生物試樣中之病毒特異性多核苷酸序列之方法。在特定實施例中，該等方法涉及即時量化，包括(但不限於)基於定量PCT(qPCR)、反轉錄酶-PCR(RT-PCR)及/或RT-PCR/螢光共振能量轉移(FRET)(RT-PCR/FRET)之擴增、檢測及/或量化方法。 說明性實施例之說明
    下文闡述本發明之說明性實施例。為清楚起見，本說明書中並未闡述實際實作之所有特徵。當然，應瞭解，在研發任何此種實際實施方案時，必須作出許多與實作具體相關的決定以達成研發者之具體目標，例如，與系統有關及商業有關之約束條件達成一致性。不同的實施方案，約束條件有所不同。此外，應瞭解，此一研發工作可能複雜且耗時，但對於受益於該揭示內容的彼等熟習此項技術者而言為常規任務。 瘟疫病毒屬病毒(PESTIVIRUSES)
    瘟疫病毒屬病毒在全球引起經濟上重要之動物疾病。瘟疫病毒屬(Pestivirus)屬於黃病毒科(Flaviviridae)，包含3種單鏈正義RNA病毒：牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、經典豬發熱病毒(CSFV)、邊界病病毒(border disease virus)(BDV)。最近，已鑑定瘟疫病毒屬病毒之第4獨特組與BVDV遺傳相關，且在文獻中稱為牛病毒性腹瀉病毒2型(BVDV-2)(例如，參見Thiel等人，1996；及Becher等人，1995；其每一者之全文以明確引用方式明確地併入本文中)。因此，當前，現代課本將BVDV之原始種稱為「BVDV-1」以區分該兩個種。
    瘟疫病毒屬之模式種係BVDV 1型(BDVD-1)，其基因組之長度係約12.5-kb且含有一個大開放閱讀框(ORF)(Collett等人，1988，其全文以明確引用方式明確地併入本文中)。藉由宿主或病毒蛋白酶共轉譯及轉譯後處理約450 kDa之大多蛋白之ORF編碼。標準BVDV多蛋白之N-末端產生非結構蛋白p20(Npro)、殼體蛋白p14(C)；envelope glycoproteins gp48(E0)、gp25(E1)、gp53(E2)；非結構蛋白p125(NS23)、p10(NS4A)、p32(NS4B)、p58(NS5A)及p75(NS5B)(例如，參見Tautz等人，1997；Xu等人，1997；Elbers等人，1996；及Wiskerchen等人，1991，其每一者之全文以明確引用方式明確地併入本文中)。BVDV-1以兩種生物型存在，即細胞病變(指定為「cp」)或非細胞病變(「ncp」)，其不同之處通常在於細胞病變變體中之單80-kDa多肽(非結構蛋白p80、NS3)之產生(例如，參見Gillespie等人，1960，其全文以明確引用方式明確地併入本文中)。
    基於對許多BVDV分離物之系統發生分析，已顯示BVDV-1包含至少13種獨特基因亞型(指定為BVDV-1a至BVDV-1l)，同時已鑑定BVDV-2之兩種基因亞型(BVDV-2a及BVDV-2b)(例如，參見Pellerin等人，1994；Ridpath等人，1994及Xue等人，2010；其每一者之全文以明確引用方式明確地併入本文中)。
    過去30年，已有將近150種BVDV疫苗(經修飾活病毒(MLV)與不活化減毒病毒或病毒顆粒二者)出售給牛產業，且取得不同程度的成功；儘管已廣泛利用及使用市售疫苗調配物，但每年仍報導有BVDV之爆發。現行疾病管理方法涉及每年重複對牛接種疫苗，且通常嘗試採取額外步驟來確保出生犢牛不為PI攜帶者。已研發若干不同測試方法來檢測BVDV及/或檢測BVDV-感染動物，包括反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)、酶聯免疫分析(ELISA)、標準病毒分離技術及各種免疫組織化學分析。 病毒效能分析
    特許給定疫苗之一個主要障礙經常係研發適宜效能測試。過去，人們根據Supplemental Assay Method for the Titration of Bovine Viral Diarrhea Virus in Vaccine(SAM 101)來實施BVDV效能測試。諸如SAM101等方法利用單特異性中和抗血清來中和BHV、PI3及BRSV部分，隨後接種敏感細胞系。觀察培養物之細胞病變效應(CPE)，且隨後使用直接螢光抗體(FA)及/或間接FA(IFA)染色來確定特定孔(稀釋度)對於BVDV 1型或2型而言是否為陽性或陰性。然後基於確定CPE/FA為陽性之孔計算效價。
    然而，諸如該等方法等習用方法不太適於區別BVDV之基因亞型，此主要因為BVDV-1a、BVDV-1b及BVDV-2之現有抗體缺乏精確辨別該等基因型及基因亞型中之個別效價所需之特異性。
    可藉由利用存在於瘟疫病毒屬基因組之5'-未轉譯區域中之差異來克服此問題。已使用該等差異將瘟疫病毒屬病毒分成基因型及基因亞型(Paton,1995；及Hofmann等人，1994)。Ridpath及Bolin(1998)報導區別BVDV-1a、BVDV-1b及BVDV-2之聚合酶鏈反應(PCR)方法。反轉錄-定量PCR(RT-qPCR)分析在人類生物製劑中已變得愈來愈常見，其用於確定麻疹病毒(Schalk等人，2004)；基於腺病毒之疫苗(Wang等人，2005)、輪狀病毒疫苗(Ranheim等人，2006)及三價腮腺炎-麻疹-風疹(MMR)疫苗(Schalk等人，2005)之效能。上述參考文獻中之每一者之全文以明確引用方式明確地併入本文中。
    在共同待決之標題為「Bovine Viral Diarrhea Virus Type 1b Vaccine Compositions and Methods」之美國臨時專利申請案第61/427,361號(與其同時申請，且其全文以明確引用方式明確地併入本文中)中，本發明者報告對基於遺傳修飾之分析方案之研發，該分析方案可用於獲得對多價疫苗中之每一個別病毒成份之直接病毒量化(即，「效能」)。本發明用RT-qPCR分析替代習用FA/IFA分析(例如彼等闡述於現行SAM 101分析中者)來確定個別分析孔(即，稀釋度)中之特定病毒物種、類型或亞型之存在或不存在。
    亦可藉由用對個別孔之RT-qPCR/qPCR分析代替對CPE之目測觀察來使對多價疫苗(例如本文所述之六價MLV疫苗)之個別成份之效能測試更客觀。舉例而言，對病毒滴定分析中CPE之觀察可能相當主觀，且經常視為測試設備間MLV疫苗效價之差異源。然而，藉由提高分析之客觀性，亦應提高實驗室間之再現性。
    可使用改進之Supplemental Assay Method for the Titration of Parainfluenza 3 Virus Vaccines(MVSAM102.01)來實施對PI3之效能測試。可使用改進之Supplemental Assay Method for Titration of Bovine Respiratory Syncytial Virus in Vaccines(MVSAM0129.01)來實施對BRSV之效能測試。藉由用對個別孔之即時qPCR分析代替對CPE之目測觀察來改進該等分析。使用改進之Supplemental Assay Method for the Titration of Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus in Vaccines(MVSAM0105.01)來實施對BHV部分之滴定。在此分析中，可使用96孔模式替代標準6孔模式，以標準化用於多價疫苗分析之分析。重要地，此方案包括用對個別孔之qPCR分析代替對BHV噬斑之目測觀察及計數來提供更精確且穩健之分析。 核酸擴增
    可根據標準方法自病毒或細胞分離用作擴增模板之核酸(Sambrook等人，1989)。核酸可為基因組DNA或分級或全細胞RNA。倘若使用RNA，則可能期望將RNA轉化成互補DNA。在一個實施例中，RNA係全細胞RNA且直接用作擴增模板。
    在允許選擇性雜交之條件下使與對應於病毒特異性多核苷酸(或對應於保守側翼區域)之核酸選擇性雜交的引物對與經分離核酸接觸。本文所定義術語「引物」意欲涵蓋能夠引發在模板依賴性方法中合成新生核酸之任何核酸。通常，引物係長度為約8個或10個至40個鹼基對(bp)之寡核苷酸，但在某些實施例中可採用更長或更短之序列。引物可以雙鏈或單鏈形式提供，但單鏈形式較佳。
    在雜交後，使核酸：引物複合物與一或多種促進模板依賴性核酸合成之酶接觸。實施多輪擴增(亦稱為「循環」)直至產生足量擴增產物。
    接下來，檢測擴增產物。在某些應用中，可藉由目測手段來實施檢測。另一選擇為，檢測可涉及經由化學發光、所納入放射性標記或螢光標記之放射性閃爍掃描或甚至經由使用電或熱脈衝信號之系統對產物進行間接鑑定。
    可獲得許多模板依賴性方法來擴增存在於給定模板試樣中之標記物序列。一種最著名的擴增方法係聚合酶鏈反應(PCR)，其詳細地闡述於美國專利第4,683,195號、美國專利第4,683,202號及美國專利第4,800,159號(其每一者之全文以引用方式併入本文中)中。
    簡言之，在PCRTM中，製備兩個與標記物序列之相反互補鏈上之區域互補的引物序列。將過量三磷酸去氧核苷連同DNA聚合酶(例如Taq聚合酶)一起添加至反應混合物中。若試樣中存在標記物序列，則引物將結合標記物且聚合酶將藉由添加核苷酸使引物沿著標記物序列延伸。藉由升高及降低反應混合物之溫度，經延伸之引物將與標記物解離以形成反應產物，過量引物將結合標記物及反應產物，重複該過程。
    可實施反轉錄酶PCRTM擴增程序以定量所擴增mRNA之量。將RNA反轉錄成cDNA之方法為業內所熟知且闡述於Sambrook等人(1989)中。用於反轉錄之替代方法係利用熱穩定之RNA依賴性DNA聚合酶。
    亦可在本發明之擴增步驟中使用基於在具有所得「二寡核苷酸」之序列之核酸存在下連接兩個(或更多個)寡核苷酸藉以擴增二寡核苷酸之方法。
    在任何擴增後，為測定是否已發生特異性擴增之目的，可能期望自模板及過量引物分離擴增產物。在一個實施例中，藉由瓊脂糖、瓊脂糖-丙烯醯胺或聚丙烯醯胺凝膠電泳使用標準方法分離擴增產物(參見例如Sambrook等人，(1989)，其全文以明確引用方式明確地併入本文中)。
    或者，可採用層析技術來實現擴增產物及/或雜交擴增產物：標記探針雙鏈體之分離。有許多種層析法可用於聯合本發明擴增產物之分析，其包括(但不限於)吸附、分配、離子交換層析、分子篩，及使用彼等之許多專門技術(包括管柱、紙、薄層及氣相層析法)。
    必須呈現擴增產物以驗證標記物序列之擴增。一種典型呈現方法涉及用溴化乙錠染色凝膠及在UV光下呈現。或者，若用放射性或螢光測定標記之核苷酸整合標記擴增產物，則可使擴增產物在分離後暴露至x射線膜或在適當刺激光譜下呈現。
    在某些實施例中，可間接地達成目測。在分離擴增產物後，使經標記核酸探針與經擴增標記物序列接觸。探針較佳與發色團偶聯，但可經放射性標記。在另一實施例中，探針與結合配偶體(例如抗體或生物素)偶聯，且結合對之另一成員帶有可檢測部分。
    在一個實施例中，藉由南方雜交分析(Southern hybridization analysis)(「印漬」)利用適宜標記之寡核苷酸檢測探針進行檢測。參與南方印漬之技術為彼等熟習此項技術者所熟知，且可參見關於分子方案之許多標準書籍。參見Sambrook等人(1989)。簡言之，藉由凝膠電泳分離擴增產物。然後使凝膠與允許核酸轉移及非共價結合之薄膜(例如硝化纖維素)接觸。隨後，將薄膜與能夠與靶擴增產物雜交之發色團偶聯探針一起培育。藉由使薄膜暴露至x射線膜或離子發射檢測器件進行檢測。
    上文之一個實例闡述於美國專利5,279,721(其全文以明確引用方式明確地併入本文中)中，其揭示用於核酸之自動電泳及轉移之裝置及方法。該裝置允許對凝膠進行電泳及印漬而無外部操作且理想地適於實施本發明方法。 多核苷酸擴增套組
    本發明亦提供擴增病毒源核酸且尤其BVDV之一或多種特定菌株、類型或亞型(包括(但不限於)BVDV-1a、BVDV-1b及BVDV-2)所特有之核酸的套組。此等套組通常包含兩種或更多種自多核苷酸群體擴增一或多種病毒核酸所必需之成份。舉例而言，套組內之一個容器可含有第一引物，而套組內之第二容器可包含第二引物。套組內之第三容器可含有一或多種雜交及/或檢測探針及/或一或多種標記一或多種此等檢測探針之試劑。另外，本發明套組亦可包含使用說明書(例如，在如本文所述擴增及/或檢測反應中使用引物之說明書)以及一或多種螢光分子或其他試劑(如可能需要)，該等其他試劑包括(例如但不限於)緩衝酶、聚合酶、RNAse及諸如此類。 檢測及量化病毒特異性核苷酸之套組
    診斷套組代表本發明之另一態樣。此等套組亦可在套組內包含一或多個用於探針、引物、螢光標記或反應緩衝劑、聚合酶等之獨特容器構件。套組亦可進一步包含在一或多種基於聚合酶鏈反應之方法中使用包含於套組內之組合物之說明書，該等方法包括(但不限於)PCR、qPCR、RT-PCR、RT-PCR/FRET及諸如此類。亦可提供使用含於套組內之試劑之說明書，該套組用於檢測試樣中之病毒之一或多種菌株、類型或亞型，該病毒係(例如)BVDV(包括(但不限於)BVDV-1a、BVDV-1b及BVDV-2)或一或多種額外哺乳動物病毒病原體(例如但不限於BHV-1、PI3、BRSV及諸如此類)，該試樣懷疑含有此一或多種病毒特異性多核苷酸。在某些實施例中，本發明之診斷分析套組較佳亦可包含在如本文所述PCR、qPCR、RT-PCR、RT-PCR/FRET分析(包括(例如)即時qPCR)中使用含於此等套組內之物項之說明書。
    任一上述套組可視情況進一步包括一或多種「陽性」或「陰性」對照劑(經標記抑或未經標記)，用於製備檢測分析用標準曲線。套組之成份可以習用方法封裝，包括(例如)呈水性介質或作為乾燥、冷凍-乾燥或凍乾成份。套組之容器構件通常將包括至少一個小瓶、試管、燒瓶、瓶子、注射器或另一容器，其中可放置分析成份，且該等成份較佳適於分配成一或多個等分試樣。倘若提供額外成份，則套組通常亦將含有可放置此成份之第二、第三或另一額外容器。該等套組亦可包括用於鑑定、量化、形態分析(speciating)或表徵含於諸如多價疫苗調配物等試樣內之MLV的其他診斷試劑。本發明套組通常亦將包括用於容納呈封閉限制式用於商業銷售之探針、引物及/或分析試劑之構件。此等容器可包括(例如)一或多個注射或吹塑模製塑膠容器，其中保持期望試劑器皿(例如，小瓶、試管、注射器等)。 實例性定義
    根據本發明，多核苷酸、核酸區段、核酸序列及諸如此類包括(但不限於)DNA(包括例如且不限於基因組DNA或基因組外DNA)、基因、肽核酸(PNA)RNA(包括例如但不限於rRNA、mRNA及tRNA)、核苷及適宜核酸區段，其得自天然源、經化學合成、修飾或以其他方式由人手工全部或部分製備或合成。
    除非另外定義，否則本文所用所有技術及科學術語皆具有與熟習本發明所屬技術領域者通常所理解含義相同之含義。儘管與彼等本文所述者相似或等效之任何方法及組合物皆可用於本發明之實踐或測試中，但本文闡述較佳方法及組合物。出於本發明之目的，下文定義下列術語：本文所用術語「約(about及approximately)」可互換，且通常應理解為指在給定數目周圍之數目範圍，以及指所述數目範圍內之所有數目(例如，除非另有說明，否則「約5至15」意指「約5至約15」)。此外，在本文中所有數目範圍皆應理解為包括該範圍內之每一整整數(whole integer)。
    本文所用術語「PCR試劑」係指實施聚合酶鏈反應分析所需除靶核酸序列外之化學品。該等化學品通常包括5種成份：(a)水性緩衝劑；(b)水溶性鎂鹽；(c)三磷酸去氧核糖核苷(dNTP)；(d)正向及反向寡核苷酸引物對；及(e)熱穩定DNA聚合酶(即，可耐受介於約80℃與約100℃之間之溫度達至少約10 min而不損失其約一半以上酶活性的DNA聚合酶。4種習用dNTP係三磷酸胸苷(dTTP)、三磷酸去氧腺苷(dATP)、三磷酸去氧胞苷(dCTP)及三磷酸去氧鳥苷(dGTP)，但其可在PCR反應中由一或多種含有鹼基類似物之dNTP(例如，三磷酸去氧尿苷[dUTP]及諸如此類)補充或替代，該等鹼基類似物以Watson-Crick方式且以與一種習用鹼基相似之方式進行鹼基配對。
    本文所用術語「寡核苷酸」包括能夠經由有序的單體-單體相互作用模式(例如，經由Watson-Crick鹼基配對或諸如此類)特異性結合靶核酸之天然或經未修飾單體或連接之線性寡聚物，包括去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及諸如此類。單體通常經由磷酸二酯(或等效)鍵連接以形成大小範圍為數個單體單位至幾十個單體單位之寡核苷酸。在本發明通篇中，當以字母序列(例如，「TTACGCAG」)表示寡核苷酸時，應理解，該核苷酸係以5'→3'順序，自左向右讀取來呈現。在此等表示中，「A」應理解為意指腺苷(或在DNA之情形下，去氧腺苷)，而「C」、「G」、「T」及「U」分別表示胞苷/去氧胞苷、鳥苷/去氧鳥苷、去氧胸苷及尿苷。磷酸二酯連接之類似物包括(但不限於)硫代磷酸酯、苯胺基磷酸酯(phosphoranilidate)、胺基磷酸酯及諸如此類。
    本文所用術語「實質上對應於」、「實質上同源」或「實質一致性」表示核酸或胺基酸序列之特性，其中所選核酸或胺基酸序列與所選參考核酸或胺基酸序列相比具有至少約70%或約75%序列一致性。更通常地，所選序列與參考序列將具有至少約76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%或甚至85%序列一致性且更佳至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%或95%序列一致性。仍更佳地，高度同源序列經常在所選序列與所比較之參考序列之間共有大於至少約96%、97%、98%或99%序列一致性。
    序列一致性百分比可經由所欲比較序列之整個長度來計算，或可藉由排除總體小於所選參考序列之約25%之小缺失或添加來計算。參考序列可為較大序列之子集，例如基因或側翼序列之一部分，或染色體之重複部分。然而，在兩個或更多個寡-或多核苷酸序列之序列同源性之情形下，參考序列通常將包含至少約10個至15個核苷酸，更通常至少約16個至25個核苷酸，且甚至更通常至少約26個至35個核苷酸、至少約40個核苷酸、至少約45個核苷酸、至少約50個核苷酸或至少約60個、70個、80個、90個或甚至至少約100個核苷酸。
    較佳地，當期望高度同源片段時，兩個序列(經常稱為「靶」及「探針」序列)之間之一致性百分比將為至少約80%一致、較佳至少約85%一致且更佳至少約90%一致、至少約92%一致、至少約93%一致、至少約94%一致或甚至至少約95%、96%、97%、98%或99%或更高。2個或更多個寡-或多核苷酸序列之間之同源性百分比或一致性百分比可容易地由熟習此項技術者使用一或多種標準序列比較算法(例如由Pearson及Lipman(1988)闡述之FASTA程式分析)來確定。
    本文所用術語「天然」在應用於物體時係指可在自然界中發現物體之事實。舉例而言，可自自然界中之源分離且由人手工有意修飾之多肽或多核苷酸序列係「天然」序列。
    在用於定義胺基酸或核酸序列時，術語「實質上互補」意指特定標的序列(例如寡核苷酸序列)與全部或一部分所選序列實質上互補，且因此將特異性結合一部分編碼所選序列之mRNA。因此，通常，該等序列將與mRNA「靶」序列高度互補，且在序列之整個互補部分內將具有不超過約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個鹼基錯配。
    實質上互補之寡核苷酸序列將與寡核苷酸所特異性結合之對應靶核酸序列具有大於約80%互補、大於約85%互補、大於約90%互補或甚至大於約95%互補(或「%準確匹配」)，且更佳將與寡核苷酸所特異性結合之對應核酸序列具有大於約96%或更高互補。
    在某些態樣中，如上文所述，將期望具有甚至更實質上互補之寡核苷酸序列，以用於本發明之實踐中，且在此等情形下，寡核苷酸序列將與設計之寡核苷酸探針或引物所特異性結合之全部或一部分靶核酸序列具有大於約96%、97%、98%、99%或甚至100%互補。
    任何所揭示序列之相似性百分比或互補百分比皆可藉由(例如)使用自University of Wisconsin Genetics Computer Group(UWGCG)獲得之GAP電腦程式(6.0版)比較序列資訊來確定。GAP程式利用Needleman及Wunsch之比對方法。簡言之，GAP程式將相似性定義為相似比對符號(即，核苷酸或胺基酸)之數目除以兩個序列中較短者中之符號之總數。GAP程式之較佳預設參數包括：(1)核苷酸之一元比較矩陣(含有1(一致性)及0(非一致性)之值)及Gribskov等人之加權矩陣，(2)3.0之懲罰(每一間隙)及額外0.10之懲罰(每一間隙中之每一符號)；及(3)無懲罰(端間隙)。
    在許多情形下，可能期望序列準確匹配，即，與寡核苷酸所特異性結合之序列完全互補，且因此沿互補延伸段具有0錯配。因此，高度互補引物或探針序列通常將相當特異性地結合複數個多核苷酸之靶序列區域且因此將高度有效地經由PCR、qPCR、RT-qPCR或RT-qPCR/FRET等引導靶序列之擴增。
    「擴增反應混合物」係指包含一或多種擴增一或多個所選靶核酸序列所必需之不同試劑的水溶液。此等混合物包括(但不限於)一或多種酶、一或多種水性緩衝劑、一或多種鹽、一或多個靶核酸及複數種習用三磷酸核苷。端視上下文而定，混合物可為完全或不完全擴增反應混合物。
    「擴增反應」係指增加靶核酸序列以產生此等序列群體之任何活體外方法。習用擴增方法包括(但不限於)基於PCR、DNA連接酯、Qβ複製酶、RNA轉錄之擴增系統及諸如此類。
    本文所用術語「擴增試劑」係指用於實施所選擴增反應之不同緩衝劑、酶、引物、三磷酸核苷(習用與非習用二者)及探針。
    本文所用「擴增(amplifying或amplification)」通常係指在本文中使用靶核酸之指數增加來闡述所選靶核酸序列之數目之線性增加與指數增加二者。
    「實質上結合」係指寡核苷酸間之互補雜交且涵蓋微小錯配，該等微小錯配可藉由降低雜交介質之嚴格性以達成PCR聚合酶之期望引發來調適。
    本文所用「生物素化」係指出於與檢測分析中之抗生蛋白鏈菌素(streptavidin)反應之目的共價附接至寡核苷酸之5'端之生物素部分。
    在核酸之背景下，術語「結合(bind、binding及bound)」係指兩個或更多個核酸序列經由互補Watson-Crick鹼基配對之雜交。
    本文所用「核酸」係指呈單鏈或雙鏈形式之去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，且除非另有限制，否則會涵蓋天然核苷酸之可以與天然核苷酸相似之方式起作用之已知類似物。
    「核苷酸聚合酶」係能夠自三磷酸核苷前體群體催化DNA或RNA合成之酶。在本發明之擴增反應中，聚合酶具有模板依賴性且通常自所形成聚合物之21端延伸。在較佳應用中，所用聚合酶係熱穩定聚合酶。
    本文所用「引物」或「寡核苷酸引物」係指能夠在一定條件下用作DNA合成之起始點之天然抑或合成之寡核苷酸，其中在適當緩衝劑中且在適宜溫度下起始與核酸鏈互補之引物延伸產物之合成(即，在4種不同的三磷酸核苷酸及聚合用試劑(例如DNA聚合酶或反轉錄酶)存在下)。在本發明之上下文中，引物較佳為寡去氧核糖核苷酸，且出於最大擴增效率較佳為單鏈。如彼等熟習此項技術者已知，此等引物無需反映靶模板之準確序列，然而但必須與該序列充分互補，以允許在適宜反應條件下與模板雜交(即，結合)。
    本文所用「經修飾活疫苗」係包含病毒之疫苗，該病毒已通常藉由在組織培養細胞中傳代而改變以衰減其引起疾病之能力，但在隨後投與動物時保持其保護抵抗疾病或感染之能力。
    術語「病原體」在本文中定義為任一種傳染因子，包括(例如)病毒、普利昂(prion)、原生動物、寄生蟲、以及微生物(例如細菌、酵母、黴菌、真菌及諸如此類)。
    本文所用術語「個體」(亦可互換地稱為「宿主」、「個體(subject)」、「接受者」、「患者」等)係指可接收一或多種本文所揭示之醫藥組合物或疫苗調配物之任何動物。較佳地，個體係意欲表示任何動物物種(且較佳哺乳動物物種)之脊椎動物。在某些實施例中，個體較佳為任何哺乳動物宿主，包括(但不限於)非人類靈長類動物、牛、犬科動物、羊、cavine、烏鴉、epine、馬科動物、貓科動物、山羊、兔、野兔、狼、綿羊、豬、racine、狐狸、及諸如此類，包括家畜、動物樣本、外來種、以及伴侶動物、寵物、及處於獸醫從業者看護下之任何動物。
    本文所用術語「疫苗」係指含有本發明之免疫原性組合物之組合物或調配物，其呈能夠投與脊椎動物且較佳投與諸如哺乳動物等動物之形式。通常，本發明疫苗將包括一或多種本文所揭示之免疫原性組合物(包括一或多種經修飾活病毒顆粒或其複數形式)，該等組合物經調配用於投與有需要之動物。此等組合物可為任何適宜調配物，包括(但不限於)彼等於水性媒劑中製備者、以及彼等呈冷凍、冷卻乾燥、凍乾或脫水形式者，呈該形式者隨後在投與前再水合或懸浮於習用醫藥上可接受之媒劑(例如，無菌鹽水或相似緩衝水溶液)。在此等形式中，本發明疫苗組合物可以便利的單或多劑量等分試樣製造，該等分試樣可容易地用於一或多種本文所揭示之方法或疫苗接種方案中以預防、管理或以其他方式治療敏感動物中病毒及/或微生物感染之一或多種病況或一或多種症狀。
    本文所用術語「例如」僅係以舉例方式使用，而不欲具有任何限制；因此，不應將其視為僅指說明書中所明確列舉之彼等物項。
    本文所用「靶序列」或「靶核苷酸序列」包括在一定條件下與該等引物序列中之一者雜交之任何核苷酸序列，該等條件允許具有聚合酶活性之酶延長引物序列，且藉此複製互補鏈。
    能夠在宿主細胞中複製及/或可與另一核酸區段可操作地連接以產生所附接區段之複製之核酸分子(通常由DNA構成)。質粒、黏粒或病毒係實例性載體。
    「引物」或「引物序列」可包括與互補模板核酸鏈(「靶序列」)選擇性雜交且用作將核苷酸添加至複製模板鏈之起始點的任何核酸序列或區段。本發明之引物序列可經標記或含有允許檢測及/或分析擴增產物之其他修飾。除用作聚合酶調介之靶DNA序列之複製的起始劑外，引物序列亦可用於將模板RNA反轉錄成對應DNA。
    本文所用「螢光共振能量轉移對」或「FRET對」係指一對包含供體螢光團及受體螢光團之螢光團，其中供體螢光團能夠將共振能量轉移至受體螢光團。在較佳螢光共振能量轉移對中，供體螢光團之吸收譜不會與受體螢光團之吸收譜實質上重疊。本文所用「供體寡核苷酸探針」係指經FRET對之供體螢光團標記之寡核苷酸。本文所用「受體寡核苷酸探針」係指經FRET對之受體螢光團標記之寡核苷酸。本文所用「FRET寡核苷酸對」通常將包含「錨」或「供體」寡核苷酸探針及「受體」或「感測器」寡核苷酸探針，且當供體寡核苷酸探針及受體寡核苷酸探針皆與其互補靶核酸序列雜交時，此一對形成FRET關係。用作FRET對之可接受之螢光團對為彼等熟習此項技術者所熟知且包括(但不限於)螢光素/玫瑰紅、藻紅素/Cy7、螢光素/Cy5、螢光素/Cy5.5、螢光素/LC紅640及螢光素/LC紅705。
    根據存在已久的專利法慣例，詞語「a」及「an」在用於本申請案中(包括申請專利範圍)時表示「一或多者」。 實例
    本發明包括以下實例以證實本發明之說明性實施例。彼等熟習此項技術者應瞭解，以下實例中所揭示之技術代表經發現可良好用於本發明之實踐之技術，且因此可認為該等技術構成本發明實踐之較佳模式。然而，彼等熟習此項技術者根據本揭示內容應瞭解，可對所揭示具體實施例作出許多改變且仍獲得相同或相似結果，此並不背離本發明之精神及範圍。 用於多因子疫苗之成份之效能分析方案
    本實例證實使用定量(即時)聚合酶鏈反應(qPCR)分析來成功地確定多價修飾之活病毒(MLV)疫苗之個別病毒成份之效能。
    在本發明者共同待決之美國臨時專利申請案第61/427,361號中，本發明者已研發出有效抵抗BRDC及運輸熱之六聯(six-way)(即，六價)經修飾活病毒(MLV)疫苗。本實例闡述可用於量化此一疫苗之個別病毒成份之分析。本發明者顯示，該分析在確定多價(即，多價或多成份)疫苗中之遺傳相關菌株之個別效能上尤其優於現有方法。使用六價MLV BRDC疫苗作為模型，本發明者已證實，該分析可有效地區別個別疫苗成份並量化其效能，甚至在疫苗含有單一類型之病毒之三種基因亞型時。此分析提供精確量化BVDV-1a、BVDV-1b及BVDV-2在多價疫苗調配物中之存在的新穎且更可靠之方法。 材料及方法細胞培養物
    使用由Freshney(1987)闡述之習用技術及供應來製備所有培養物。使用在培養物中展現典型上皮樣形態之TVL-牛腎細胞系進行所有培養物分析。
    BVDV-1b主要種源培養物(在申請者共同待決之美國臨時專利申請案第61/427,361號中指定為「TVL BVDV1b MS 04/27/2007 DW3-095」)已於一定條件下寄存，該等條件確保在此專利申請案由專利及商標事務專員(Commissioner of Patents and Trademarks)根據37 C.F.R.§1.14及35 U.S.C.§122決定是否授予其專利之待審期(pendency)期間應可取用培養物。在申請標的申請案之對應案(counterparts)或其子案之國家的專利法需要時可獲得寄存物。然而，應理解，寄存物之可獲得性並不構成對在減損由政府行為所授予之專利權下實踐標的發明之認可。標的培養寄存物將根據用於微生物寄存之布達佩斯條約(the Budapest Treaty for the Deposit of Microorganisms)之規定儲存並可公開獲得，即，其將經必要的精心儲存，以使其在最近請求完成寄存物試樣後保持活力及未污染狀態達至少5年時間，且在任何情形下，在寄存日期後達至少30(三十)年時間或達任何專利可發佈揭示寄存培養物之可實施壽命。若寄存處在受到請求時因寄存物之條件而不能提供試樣，則寄存者承認有責任替代寄存物。對標的培養寄存物之公開可得性之所有限制在授予揭示其之專利後將不可撤消地解除。TVL BVDV1b MS 04/27/2007 DW3-095病毒寄存物根據布達佩斯條約之條款於2010年12月21日進入位於10801 University Blvd.,Manassas,VA,20110-2209,USA之美國典型培養物實驗室專利寄存處(the Patent Depository of the American Type Culture Laboratory)之永久收藏，此後其由寄存處指定登錄號ATCC PTA-11553。 引物/探針組之特異性
    自來自以下經美國農業部(United States Department of Agriculture)(USDA)批准之病毒種中之每一者之病毒流體提取RNA：BVDV-1a(Singer菌株)、BVDV-1b(TGAC菌株)、BVDV-2(125)、PI3(Reisinger SF-4)及BRSV(N375)(不對BHV-1[Cooper菌株]實施提取方法，此乃因其係DNA病毒)。使用RNAqueous®-4PCR(Ambion；Austin,TX,USA)實施提取。
    對於使用TaqMan®一步式RT-PCR化學之六個引物/探針組中之每一者而言，使用每一RNA病毒試樣作為單獨RT-qPCR反應中之模板(試樣)。對於上述六個引物/探針組中之每一者而言，亦使用DNA病毒(BHV-1)作為單獨qPCR反應中之模板(試樣)。針對六價疫苗之所有6個病毒部分分析BRSV引物/探針組指示，每一引物/探針組與任何其他病毒部分不具有交叉反應性。 QPCR分析
    使用Applied Biosystems 7500即時PCR系統實施qPCR分析。 寡核苷酸引物及經標記之分子探針
    以下定製的TaqMan®探針及病毒特異性正向及反向引物對係由Applied Biosystems(Foster City,CA,USA)製造。 BVDV-1b(第一)：
    正向引物：5'-CACCCTATCAGGCTGTATTCATAGC-3'(SEQ ID NO：1)；反向引物：5'-TGCCCACAGCACATCTTAACC-3'(SEQ ID NO：2)；及BVDV-1b檢測探針：5'-TCACCTGGACGACCC-3'(SEQ ID NO：3)。 BVDV-1b(第二)：
    第二正向引物：5'-GTCGTCCAGGTGAAAACGGT-3'(SEQ ID NO：19)；第二反向引物：5'-GTCGTCCAGGTGAAAACGGT-3'(SEQ ID NO：20)；及第二BVDV-1b檢測探針：5'-GTCGTCCAGGTGAAAACGGT-3'(SEQ ID NO：21)。
    BVDV-1b(第一)提供可接受之結果，而BVDV-1b(第二)顯示較佳結果。 BRSV：
    正向引物：5'-GCAATGCTGCAGGACTAGGTATAAT-3'(SEQ ID NO：4)；反向引物：5'-ACACTGTAATTGATGACCCCATTCT-3'(SEQ ID NO：5)；及BRSV檢測探針：5'-AAGACTTGTATGATGCTGCCAA-3'(SEQ ID NO：6)。 BVDV-1a：
    正向引物：5'-GGTCGCCCAGGTAAAAGCA-3'(SEQ ID NO：7)；反向引物：5'-GCCTCTGCAGCACCCTATCA-3'(SEQ ID NO：8)；及BVDV-1a檢測探針：5'-AACCGACTGTTACGAATAC-3'(SEQ ID NO：9)。 BVDV-2：
    正向引物：5'-GCTAGCCATGCCCTTAGTAGGAC-3'(SEQ ID NO：10)；反向引物：5'-GACGAGTCCCCTGTACTCAGG-3'(SEQ ID NO：11)；及BVDV-2檢測探針：5'-CAGTGAGTCCATTGGATGG-3'(SEQ ID NO：12)。 PI 3：
    正向引物：5'-GGAGACCAAGACCAAGGAGATG-3'(SEQ ID NO：13)；反向引物：5'-CGTCTGCCCATGCATAAGG-3'(SEQ ID NO：14)；及PI3檢測探針：5'-ACCTCGGTCATCCATAG-3'(SEQ ID NO：15)。 BHV-1：
    正向引物：5'-CCATGTTAGCGCTCTGGAACC-3'(SEQ ID NO：16)；反向引物：5'-CGTCTTTACGGTCGACGACTCC-3'(SEQ ID NO：17)；及BHV-1檢測探針：5'-ACGGACGTGCGCGAA-3'(SEQ ID NO：18)。 用於單價疫苗之效能分析
    用於每一以下分析之方案利用Applied Biosystems 7500比較閾值循環(CT)方法來確定滴定板之個別孔是否含有大於等效參考孔之量之病毒。大多數病毒試樣含有一些可藉由PCR分析檢測之無活力病毒顆粒，因此可能獲得假陽性結果。此問題可藉由使用不具有細胞之參考板來解決。正如與分析板中一樣，將試樣稀釋於參考板中，但不含有細胞，以消除病毒複製之可能性。使用參考板來產生每一分析中之每一孔之基線或背景CT值。若分析板上之孔具有高於對應背景孔之CT值，則已發生病毒複製且將該孔視為陽性。若未測定孔之CT值，或CT值等於背景CT值，則將該孔視為陰性。 用於多價疫苗之效能分析
    如本文所述製備IBR/BVDV-1a、-1b、-2/PI3/RSV經修飾活病毒六價疫苗之試驗系列。簡言之，在TVL-BK細胞系(第20代)中繁殖BHV-1(Cooper菌株)、BVDV-1a(Singer菌株)、BVDV-1b(TGAC菌株)、BVDV-2(125)、PI3(Reisinger SF-4)及BRSV(N375)。於第10代收穫個別部分且將其與六聯產物摻和在一起。可如本文所述藉助添加適當中和抗血清來實施對6聯疫苗之每一部分之效能測試。基於CPE/FA/IFA結果確定每一病毒部分之TCID50並將其與彼等基於RT-qPCR/qPCR者進行比較。 BVDV-1A、BVDV-1B及BVDV-2效能測試
    可根據Supplemental Assay for the Titration of Bovine Viral Diarrhea Virus in Vaccine(SAM 101)單獨地滴定單價BVDV-1a、BVDV-1b及BVDV-2試樣。簡言之，一式兩份實施分析，其中使用一個板基於所述CPE及/或FA/IFA進行效價計算。使用另一板基於RT-qPCR來確定效價。如上述針對每一病毒所述包括不含細胞之參考板。 PI 3效能測試
    一式兩份實施用於PI3之效能測試，其中使用一個板基於CPE進行效價計算。使用另一板基於如藉由RT-qPCR所測定PI3之比較CT值來確定效價。如上文所述包括不含細胞之參考板。 BRSV效能測試
    一式兩份實施用於BRSV效能測試，其中使用一個板基於如上文所述CPE進行效價計算，其中使用剩餘板基於如藉由RT-qPCR所測定BRSV之比較CT值來確定效價。如上文所述，分析中亦包括不含細胞之參考板。 BHV效能測試
    藉由用對個別孔之qPCR分析代替對噬斑之習用目測觀察及計數，以96孔模式實施用於BHV之效能測試。一式兩份實施分析，其中使用一個板基於個別孔(稀釋度)中存在或不存在CPE進行效價計算，而使用剩餘板基於如藉由QPCR所測定BHV之比較CT值來計算效價。如上文所述包括不含細胞之參考板。 測試結果
    上述測試之結果提供於下文中。




    參考文獻
    以下參考文獻之全文以明確引用方式明確地併入本文中之程度為可提供例示性程序或其他補充彼等本文所闡述者之細節。
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    根據本揭示內容無需過多實驗即可獲得並實施本文所揭示及主張之所有組合物及方法。儘管已根據實例性實施例闡述本發明之組合物及方法，但彼等熟習此項技術者應明瞭，可改變組合物、方法及本文所述方法之步驟之順序，此並不背離本發明之概念、精神及範圍。更具體而言，應明瞭，某些在化學及生理上皆相關之試劑可代替本文所述之試劑，同時可達成相同或相似之結果。彼等熟此項技術者明瞭之所有此等相似替代物及修改皆視為在隨附申請專利範圍所界定之本發明之精神、範圍及概念內。因此，試圖取得專利權之專有權係如下文申請專利範圍中所述。
    <110> 美國禮來大藥廠
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    <223> 合成構築體-引物
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    <213> 人工序列
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    <400> 21
    权利要求:
    Claims (40)
    [1] 一種組合物，其適於檢測多數減毒活病毒顆粒內之病毒特異性核酸(若存在)，該組合物包含：(a)長度小於約50個核苷酸之第一病毒特異性寡核苷酸擴增引物，其包含選自由以下組成之群之核苷酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：16；(b)長度小於約50個核苷酸之第二病毒特異性寡核苷酸擴增引物，其包含選自由以下組成之群之核苷酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：17；及(c)至少一個長度小於約50個核苷酸之第一經標記之病毒特異性檢測探針，病毒特異性檢測探針包含選自由以下組成之群之經標記之核苷酸序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：18。
    [2] 如請求項1之組合物，其中該等病毒顆粒包含於獸醫疫苗內。
    [3] 如請求項1或2之組合物，其中該第一及第二病毒特異性寡核苷酸擴增引物及第一經標記之病毒特異性檢測探針中之一或多者的長度小於約40個核苷酸。
    [4] 如請求項1或2之組合物，其中該第一及第二病毒特異性寡核苷酸擴增引物及第一經標記之病毒特異性檢測探針中之一或多者的長度小於約30個核苷酸。
    [5] 如請求項1或2之組合物，其中該第一及第二病毒特異性寡核苷酸擴增引物及第一經標記之病毒特異性檢測探針中之一或多者的長度小於約20個核苷酸。
    [6] 如請求項1或2之組合物，其中該第一病毒特異性寡核苷酸擴增引物基本上由選自由以下組成之群之核苷酸序列組成：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：16。
    [7] 如請求項1或2之組合物，其中該第二病毒特異性寡核苷酸擴增引物基本上由選自由以下組成之群之核苷酸序列組成：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：17。
    [8] 如請求項1或2之組合物，其中該至少一個第一經標記之病毒特異性檢測探針基本上由選自由以下組成之群之經標記之核苷酸序列組成：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：18。
    [9] 如請求項1或2之組合物，其中該至少一個第一經標記之病毒特異性檢測探針進一步包含至少一個發色、螢光、自旋標記或放射性部分。
    [10] 如請求項1或2之組合物，其中該多數減毒活病毒顆粒包含一或多種選自BRSV、BHV-1、PI3及BVDV之病毒。
    [11] 如請求項1或2之組合物，其中該多數減毒活病毒顆粒包含一或多種選自BVDV-1a、BVDV-1b及BVDV-2之病毒。
    [12] 如請求項1或2之組合物，其中該多數減毒活病毒顆粒包含BVDV-1b。
    [13] 如請求項1或2之組合物，其中該第一病毒特異性寡核苷酸擴增引物基本上由核苷酸序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：19組成，該第二擴增引物基本上由核苷酸序列SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：20組成，且該至少一個第一經標記之病毒特異性檢測探針基本上由核苷酸序列SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：21組成。
    [14] 如請求項1或2之組合物，其用於檢測多核苷酸群體中病毒特異性多核苷酸之存在，該多核苷酸群體係獲自獸醫來源之生物試樣或獲自包含於多價牛運輸熱疫苗內之多數減毒活病毒顆粒。
    [15] 一種組合物，其用於檢測懷疑含有病毒特異性核酸之生物試樣中之病毒特異性核酸序列，該組合物包含：(a)第一病毒特異性正向擴增引物，其係選自由以下組成之群：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：16；及(b)第一病毒特異性反向擴增引物，其係選自由以下組成之群：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：17。
    [16] 如請求項15之組合物，其進一步包含一或多種緩衝劑、一或多種聚合酶，及一或多種dNTP，足以經由聚合酶鏈反應(PCR)擴增該核酸序列。
    [17] 如請求項16之組合物，其中該聚合酶鏈反應係即時實施。
    [18] 如請求項16或17之組合物，其進一步包含至少一種選自由以下組成之群之第一經標記之寡核苷酸檢測探針：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：18，該探針特異性結合該PCR所產生之擴增產物。
    [19] 如請求項16或17之組合物，其中該第一經標記之寡核苷酸檢測探針包含螢光、發色、放射性、化學發光、發光或自旋共振標記。
    [20] 如請求項16或17之組合物，其中該經標記之檢測探針特異性結合BVDV-1a-特異性核酸、BVDV-1b-特異性核酸、BVDV-2-特異性核酸、BHV-1-特異性核酸、PI3-特異性核酸或BRSV-特異性核酸。
    [21] 如請求項16或17之組合物，其進一步包含一或多種另外成份用於定量該即時PCR期間所產生擴增產物之量。
    [22] 一種套組，其包含如請求項1至21中任一項之組合物，其用於實施聚合酶鏈反應以擴增來自包含獸醫修飾之活病毒疫苗之試樣之病毒特異性核酸序列。
    [23] 一種用於檢測多核苷酸群體中病毒特異性多核苷酸存在的方法，該方法包含：實施至少一個循環步驟，其中該循環步驟包含至少一個第一擴增步驟及至少一個第一雜交步驟，且其中若該試樣中存在病毒特異性核酸分子，則該至少一個第一擴增步驟包含使該試樣與如請求項1至15中任一項之組合物接觸以產生病毒特異性擴增產物，其中該至少一個第一雜交步驟包含使該試樣與該組合物接觸；及使如此產生之該擴增產物與至少一個第一經標記之寡核苷酸檢測探針在可有效特異性檢測所得雜交產物之條件下接觸。
    [24] 如請求項23之方法，其中該病毒特異性擴增引物對包含：(a)長度小於約50個核苷酸之第一寡核苷酸擴增引物，其包含選自由以下組成之群之核酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：16；及(b)長度小於約50個核苷酸之第二寡核苷酸擴增引物，其包含選自由以下組成之群之核酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：17。
    [25] 如請求項23或24之方法，其中該至少一個第一經標記之病毒特異性檢測探針包含長度小於約50個核苷酸之寡核苷酸，該寡核苷酸包含以下任一者之核酸序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：18。
    [26] 如請求項23或24之方法，其中當該多核苷酸群體中存在病毒特異性核酸分子時，該第一循環步驟包含使該多核苷酸群體與一對病毒特異性擴增引物接觸以產生擴增產物，且另外其中該至少一個第一雜交步驟包含使該多核苷酸群體與至少一個第一經標記之病毒特異性檢測探針在可有效檢測所產生之擴增產物之條件下接觸。
    [27] 如請求項23或24之方法，其中該檢測步驟係即時實施。
    [28] 如請求項23或24之方法，其進一步包含測定該病毒特異性檢測探針與該病毒擴增產物間之熔解溫度之另外步驟。
    [29] 如請求項23或24之方法，其中該多核苷酸群體係自多數減毒活病毒顆粒獲得。
    [30] 如請求項23或24之方法，其中該多核苷酸群體係獲自含於獸醫來源之生物試樣內之多數減毒活病毒顆粒。
    [31] 如請求項23或24之方法，其中該多核苷酸群體係獲自選自由以下組成之群之生物試樣：血液、血漿、細胞、組織、血清及其任何組合。
    [32] 如請求項23或24之方法，其中該多核苷酸群體係獲自含於哺乳動物疫苗內之多數減毒活病毒顆粒。
    [33] 如請求項23或24之方法，其中該多數減毒活病毒顆粒包含一或多種選自由BHV-1、PI3、BRSV及BVDV組成之群之病毒。
    [34] 如請求項23或24之方法，其中該多數減毒活病毒顆粒包含BVDV 1a型、BVDV 1b型及BVDV 2型中之一或多者。
    [35] 如請求項23或24之方法，其中該哺乳動物疫苗係牛BRDC或運輸熱疫苗。
    [36] 如請求項23或24之方法，其中該經標記之檢測探針進一步包含非螢光淬滅劑或小溝槽結合劑。
    [37] 如請求項23或24之方法，其中該檢測探針經6-羧基-螢光素(FAM)螢光標記。
    [38] 如請求項23或24之方法，其中該經標記之檢測探針特異性結合BVDV-1a、BVDV-1b、BVDV-2、BHV-1、PI3或BRSV病毒核酸。
    [39] 一種如請求項1至21中任一項之組合物之用途，其用於擴增及檢測獲自生物試樣之多核苷酸群體中之病毒特異性多核苷酸。
    [40] 如請求項39之用途，其用於擴增及檢測來自包含於多價牛運輸熱疫苗內之多數減毒活病毒顆粒之BVDV 1a型、1b型或2型-特異性多核苷酸。
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