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    本發明係關於具有序列號碼3所示之胺基酸序列，或於相同之胺基酸序列中，除了第365位置以外之1個或多數個胺基酸殘基被取代、缺少、插入、或加成之胺基酸序列，而且，具有葡萄糖脫氫酶活性之蛋白質，相當於上述胺基酸序列之第365位置之胺基酸殘基為其他胺基酸殘基所取代，提昇對葡萄糖之基質特異性之改性之葡萄糖脫氫酶。
    公开号:TW201307562A
    申请号:TW101140993
    申请日:2006-06-20
    公开日:2013-02-16
    发明作者:Hideaki Yamaoka；Masashi Tsukada
    申请人:Arkray Inc；
    IPC主号:C12Q1-00
    专利说明:
    改性之葡萄糖脫氫酶
    本發明係關於提昇基質特異性之改性之葡萄糖脫氫酶。本發明之改性之葡萄糖脫氫酶係可適合使用於葡萄糖感測器、及葡萄糖分析試劑組等，有效地使用於生化學領域、臨床領域等。
    近幾年來，使用各種酵素作為生物感應元件。以診斷糖尿病為目的，作為測定血液中之葡萄糖濃度之感應元件之葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase，GOD)，雖已經實用化，但有GOD容易受試樣中之溶存氧影響之問題。因此，不受試樣中之溶存氧影響之葡萄糖脫氫酶(GDH)取代GOD而受到注目。
    報告指出GDH中以NAD(P)+作為輔酶者(E.C.1.1.1.47)或以咯奎(pyrroloquinoline quinone，PQQ)作為輔酶者(PQQGDH；E.C.1.1.99.17)等。以NAD(P)+作為輔酶之GDH，於測定系統中必須添加NAD(P)+之要點上，作為感應元件則有問題。另一方面，PQQGDH等之輔酶鍵結型GDH則於測定系統不須添加輔酶。
    另外，對於感應元件，要求即使連續使用或放置於室溫，仍不失去作為感應元件之功能之安定性。
    來自高溫下生長發育之好熱性細菌之酵素，因為一般具有高熱安定性，長期保存或連續使用等，亦顯示高安定性，所以可期待應用於作為感應元件。然而，對於來自好熱性細菌之耐熱性GDH，雖揭示有來自嗜酸熱原體(Thermoplasma acidophilum)、嗜高溫古細菌(Sulfolobus solfataricus)之GDH，但皆以NAD(P)+作為輔酶。
    另一方面，中度好熱性細菌之洋蔥假單胞菌(Burkholderia cepacia)產生之耐熱性GDH係FAD(flavin adenine dinucleotide，黃素腺嘌呤雙核甘酸)鍵結型，已完全明白最適反應溫度、熱安定性、基質特異性等之酵素學的性質(專利文獻1)。此GDH通常存在為具有高耐熱性之催化劑次單元(α次單元)、細胞色素C之電子傳遞次單元(β次單元)、功能不明之γ次單元所構成之異低聚物，雖具有45℃之最適反應溫度，但進行50℃以上之熱處理時，引起次單元之解離，成為具有75℃之最適反應溫度之α次單元單體。α次單元單體對熱安定，即使60℃，30分鐘之熱處理後，仍顯示80%以上之殘存活性。編碼此等次單元之基因亦被離析(專利文獻1，專利文獻2)。
    然而，因為輔酶鍵結型GDH一般基質特性廣，除了葡萄糖以外，亦對麥芽糖或半乳糖等反應，所以作為糖尿病患者用血糖測定用之葡萄糖感測器應用時，若糖尿病患者為必須實施腹膜透析之嚴重症狀時，因為透析液中含有大量的麥芽糖，所以有出現比原本血糖值高之測定值之危險性。洋蔥假單胞菌之GDH亦同樣地除了葡萄糖以外，亦對麥芽糖或半乳糖等具有反應性。
    已知由導入胺基酸取代突變，改變GDH之基質特異性之技術。作為如此改性GDH，例如來自大腸桿菌(專利文獻3、4)、乙酸鈣葡萄糖桿菌(Gluconobacter calcoaceticus)(專利文獻5)、或不動桿菌(Acinetobacter baumannii)(專利文獻6至8)之以咯喹為輔酶之PQQGDH。
    專利文獻1：美國專利申請書公開第2004/0023330號
    專利文獻2：國際公開第03/091430目錄
    專利文獻3：特開平10-243786號公報
    專利文獻4：特開2001-197888號公報
    專利文獻5：特開2004-173538號公報
    專利文獻6：特開2004-313172號公報
    專利文獻7：特開2004-313180號公報
    專利文獻8：特開2004-344145號公報 〔發明之揭示〕

    本發明係以提供提昇對葡萄糖之基質特異性之FAD鍵結型GDH為課題。
    本發明者係為解決上述課題，努力進行檢討的結果，發現由改變洋蔥假單胞菌之FAD鍵結型GDH之特定部位之胺基酸序列，可於維持對葡萄糖之反應性下，降低對其他糖類之反應性，而完成本發明。
    亦即，本發明係如下所述。
    (1)具有序列號碼3所示之胺基酸序列，或於相同之胺基酸序列中，除了第365位置以外之1個或多數個胺基酸殘基被取代、缺少、插入、或加成之胺基酸序列，而且，具有葡萄糖脫氫酶活性之蛋白質，相當於該胺基酸序列之第365位置之胺基酸殘基為其他胺基酸殘基所取代，提昇對葡萄糖之基質特異性。
    (2)如(1)記載之改性之葡萄糖脫氫酶，相當於第365位置以外係具有序列號碼3所示之胺基酸序列。
    (3)如(1)或(2)記載之改性之葡萄糖脫氫酶，與相當於之第365位置之胺基酸殘基係野生型之葡萄糖脫氫酶相比較，對雙糖類之反應性降低。
    (4)如(3)記載之改性之葡萄糖脫氫酶，雙糖類係麥芽糖。
    (5)如(4)記載之改性之葡萄糖脫氫酶，對麥芽糖之反應性係對葡萄糖之反應性之20%以下。
    (6)如(1)至(5)中任一項記載之改性之葡萄糖脫氫酶，上述其他胺基酸殘基係選自苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸及組織胺酸之胺基酸殘基。
    (7)如(1)至(6)中任一項記載之改性之葡萄糖脫氫酶，進一步，相當於至少1個選自序列號碼3之胺基酸序列中324、326、333、334、368、369、376、377、418、419、436、433、448、472、475、525、及529位置之胺基酸殘基為其他胺基酸殘基所取代。
    (8)如(7)記載之改性之葡萄糖脫氫酶，上述位置係至少1個選自326、472、475、及529。
    (9)如(8)記載之改性之葡萄糖脫氫酶，上述位置係第472位置。
    (10)如(8)記載之改性之葡萄糖脫氫酶，上述位置係第475位置。
    (11)如(8)記載之改性之葡萄糖脫氫酶，上述位置係第472位置及第475位置二者。
    (12)如(8)記載之改性之葡萄糖脫氫酶，上述位置係第326位置。
    (13)如(8)記載之改性之葡萄糖脫氫酶，上述位置係第529位置。
    (14)如(9)記載之改性之葡萄糖脫氫酶，相當於第472位置之胺基酸殘基為選自天冬胺酸、麩胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、異酪胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、及組織胺酸之胺基酸所取代。
    (15)如(10)記載之改性之葡萄糖脫氫酶，相當於第475位置之胺基酸殘基為組織胺酸或絲胺酸所取代。
    (16)如(12)記載之改性之葡萄糖脫氫酶，相當於第326位置之絲胺酸之胺基酸殘基為麩胺醯胺或纈胺酸所取代。
    (17)如(13)記載之改性之葡萄糖脫氫酶，相當於第529位置之白胺酸之胺基酸殘基為酪胺酸、組織胺酸或色胺酸所取代。
    (18)具有序列號碼3所示之胺基酸序列，或於相同之胺基酸序列中，1個或多數個胺基酸殘基被取代、缺少、插入、或加成之胺基酸序列，而且，具有葡萄糖脫氫酶活性之蛋白質，包含(i)相當於至少1個選自上述胺基酸序列中324、326、333、334、365、368、369、376、377、418、419、436、433、448、525、及529位置之胺基酸殘基為其他胺基酸殘基所取代，(ii)相當於第472位置之胺基酸殘基為天冬胺酸所取代，及(iii)相當於第475位置之胺基酸殘基為組織胺酸所取代之提昇對葡萄糖之基質特異性之改性之葡萄糖脫氫酶。
    (19)如(18)記載之改性之葡萄糖脫氫酶，上述其他胺基酸殘基為苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸。
    (20)如(18)記載之改性之葡萄糖脫氫酶，上述位置為第326位置，相當於相同位置之胺基酸殘基為麩胺醯胺或纈胺酸所取代。
    (21)如(18)記載之改性之葡萄糖脫氫酶，上述位置為第529位置，相當於相同位置之胺基酸殘基為酪胺酸、組織胺酸或色胺酸所取代。
    (22)包含序列號碼7之胺基酸序列之FAD鍵結型改性之葡萄糖脫氫酶。
    (23)至少包含如(1)至(22)中任一項記載之改性之葡萄糖脫氫酶，及電子傳遞次單元(subunit)之改性之葡萄糖脫氫酶複合體。
    (24)如(23)記載之葡萄糖脫氫酶複合體，電子傳遞次單元係細胞色素C。
    (25)編碼如(1)至(22)中任一項記載之改性之葡萄糖脫氫酶之DNA。
    (26)保持如(25)之DNA，產生如(1)至(22)中任一項記載之改性之葡萄糖脫氫酶或如(23)記載之葡萄糖脫氫酶複合體之微生物。
    (27)包含如(1)至(22)中任一項記載之改性之葡萄糖脫氫酶、如(23)記載之葡萄糖脫氫酶複合體、或如(26)記載之微生物之葡萄糖分析試劑組。
    (28)包含如(1)至(22)中任一項記載之改性之葡萄糖脫氫酶、如(23)記載之葡萄糖脫氫酶複合體、或如(26)記載之微生物之葡萄糖感測器。〔用以實施發明之最佳型態〕
    以下詳細地說明本發明。
    本發明之改性GDH係由導入特定的突變於野生型GDH所製造。作為野生型GDH，可舉例如洋蔥假單胞菌所產生之GDH。作為洋蔥假單胞菌之GDH，可舉例如洋蔥假單胞菌KS1株、JCM2800株或JCM2801株所產生之GDH。KS1株係平成12年9月25日寄託於獨立行政法人產業技術總合研究所特許生物寄託中心(〒305-8566日本國茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6)，受託號碼第FERM BP-7306。JCM2800株或JCM2801株係保存於獨立行政法人理化學研究所微生物系統保存施設(Japan Collection of Microorganisms,JCM)。
    含有KS1株之GDH α次單元基因、及部份β次單元基因之染色體DNA斷片之鹽基序列如序列號碼1所示(美國特許申請書公開第2004/0023330號)。此鹽基序列存在3個開放讀架(open reading frame,ORF)，自5’端之第2個及第3個之ORF係分別編碼α次單元(序列號碼3)及β次單元(序列號碼4)。另外，推測第1個ORF係編碼γ次單元(序列號碼2)。另外，於序列號碼5中顯示含有β次單元基因全長之斷片之鹽基序列。進而，β次單元之胺基酸序列如序列號碼6所示(歐洲專利申請書公開第1498484號)。於序列號碼6中，推測胺基酸號碼1至22係訊息胜肽。另外，序列號碼5及序列號碼6中，第1個胺基酸殘基雖記載為Val，但為Met之可能性高，另外，有轉譯(translation)後脫落之可能性。
    本發明之改性GDH，可僅為α次單元，亦可為α次單元及β次單元之複合體，或α次單元、β次單元及γ次單元所形成之複合體。本發明之改性GDH，雖任一種皆為導入特定之突變於α次單元者，此特異之突變之外，亦可有保存性突變。另外，即使其他次單元為野生型，亦可為具有保存性突變者。另外，所謂「保存性突變」係指實質上不影響GDH活性之突變。
    本發明之改性型α次單元係以除了後述之特定突變以外，具有如序列號碼13所示之胺基酸序列為宜。另外，改性型α次單元係只要具有GDH活性，亦可具有如上述之保存性突變。亦即，於序列號碼13之胺基酸序列中，除了上述特定之突變以外，亦可為具有1個或多數個胺基酸殘基被取代、缺少、插入、或加成之胺基酸序列之蛋白質。另外，於序列號碼13中，雖顯示由序列號碼11之鹽基序列編碼所得之胺基酸序列，N端之甲硫胺酸殘基係具有轉譯(translation)後脫落之可能性。上述所謂「1個或多數個」係指1至10個為宜，以1至5個尤佳，以1至3個更好。
    另外，β次單元係典型地具有序列號碼16之胺基酸序列。然而，只要可作為GDH之β次單元運作，亦可為於序列號碼16之胺基酸號碼23至425所形成之胺基酸序列中，具有1個或多數個胺基酸殘基被取代、缺少、插入、或加成之胺基酸序列之蛋白質。上述所謂「1個或多數個」係指1至20個為宜，以1至10個尤佳，以1至5個更好。另外，所謂作為GDH之β次單元運作時，係指與α次單元形成複合體時，不損及相同複合體之GDH活性，而作為細胞色素C運作。
    作為野生型α次單元基因，具體上可舉例包含如序列號碼11之鹽基號碼764至2380所形成之鹽基序列之DNA。另外，α次單元基因可為具有序列號碼11之鹽基序列之鹽基號碼764至2380所形成之鹽基序列之DNA，或由此序列調製所得之探針，於嚴苛(stringent)條件下雜交，而且編碼具有GDH活性之蛋白質之DNA。
    另外，作為β次單元基因，具體上可舉例如含有序列號碼15之鹽基號碼187至1398所形成之鹽基序列之DNA。另外，β次單元基因可為具有序列號碼15之鹽基號碼187至1398所形成之鹽基序列之DNA，或此序列調製所得之探針，於嚴苛條件下雜交，而且編碼具有可作為β次單元運作之蛋白質之DNA。
    作為上述嚴苛條件係具有相同性為70%，以80%為宜，以90%尤佳，以95%以上更好之DNA彼此雜交之條件，具體上可舉例如1×SSC，0.1%SDS，60℃。
    α次單元基因及β次單元基因係例如由以洋蔥假單胞菌KS1株之染色體DNA為模板之PCR而可取得。PCR用引子係基於上述之鹽基序列，由化學合成而可調製。另外，亦可基於上述序列所製作之寡聚核苷酸(oligonucleotide)作為探針，由雜交而可自洋蔥假單胞菌KS1株之染色體DNA取得。另外，自洋蔥假單胞菌以外之其他菌株，亦可同樣地取得變異型(variant)。作為其他的菌株，可舉例如上述之JCM2800株及JCM2801株。此等菌株產生之GDH之α次單元係與KS1株之α次單元分別具有95.4%及93.7%之相同性。
    另外，其他微生物產生之GDH，只要具有與洋蔥假單胞菌之GDH類似的結構及具有酵素學的性質者，即可使用於製造本發明之改性GDH。作為如此之改性GDH，可舉例如來自(i)類鼻疽桿菌(Burkholderia pseudomallei),(ii)鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderia mallei),(iii)青枯病菌(Ralstonia solanacearum)之GDH((i)、(ii)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101(39),14240-14245(2004),(iii)Natute 415(6871),497-502(2002))。
    本發明之改性GDH係具有如上述之野生型GDH或保存性突變之GDH，由特定之突變，提昇對葡萄糖之基質特異性者。所謂「提昇對葡萄糖之基質特異性」係指包含實質地維持對葡萄糖之反應性下，對其他單糖類、雙糖類或寡糖等之糖類，例如麥芽糖、半乳糖、木糖等之反應性降低，或對葡萄糖之反應性比對其他糖類之反應性高。例如，即使對葡萄糖之反應性降低，若對其他糖類之反應性比其更為降低時，則提昇對葡萄糖之基質特異性。另外，即使對其他糖類之反應性昇高，若對葡萄糖之基質特異性昇高超過其以上，則提昇對葡萄糖之基質特異性。具體上例如，對野生型酵素之改性型酵素之基質特異性(對葡萄糖之比活性與對其他糖類，例如麥芽糖之比活性之比)昇高(以下述式所表示)若為10%以上，以20%以上尤佳，以40%以上更好時，對葡萄糖之基質特異性昇高。例如基質特異性係野生型酵素為60%，改性型GDH為40%時，對葡萄糖以外之糖類之反應性降低33%。
    基質特異性=(對葡萄糖以外之糖類之比活性/對葡萄糖之比活性)×100
    基質特異性之昇高=(A-B)×100/A
    A：野生型酵素之基質特異性
    B：改性型酵素之基質特異性
    另外，改性型GDH係對麥芽糖之反應性(比活性)為對葡萄糖之反應性(比活性)之30%以下，以20%以下為宜。
    上述所謂特定之改變，具體上如下所述。
    (1)相當於序列號碼3所示之胺基酸序列之第365位置之胺基酸殘基為其他胺基酸所取代。
    (2)相當於序列號碼3所示之胺基酸序列中之第365位置之胺基酸殘基為其他胺基酸所取代，以及相當於至少1個或任意2個以上之324、326、333、334、368、369、376、377、418、419、436、433、448、472、475、525、及529位置之胺基酸殘基為其他胺基酸殘基所取代。
    (3)(i)相當於至少1個或任意2個以上選自序列號碼3所示之胺基酸序列中324、326、333、334、365、368、369、376、377、418、419、436、433、448、525、及529位置之胺基酸殘基為其他胺基酸殘基所取代，(ii)相當於第472位置之胺基酸殘基為其他胺基酸殘基所取代，及(iii)相當於第475位置之胺基酸殘基所取代。
    另外，作為上述特定之突變，可舉例如GDH之胺基酸序列中，包含序列號碼7所示之胺基酸序列之突變。序列號碼7所示之胺基酸序列係序列號碼3所示之GDH中，相當於第360至366位置。認為即使洋蔥假單胞菌以外之FAD鍵結型GDH，野生型GDH未含序列號碼7所示之胺基序列時，含序列號碼7之胺基序列之改性型GDH提昇了基質特異性。
    上述(1)之突變中，作為其他胺基酸殘基，除了絲胺酸以外之胺基酸，具體上可舉例如苯丙胺酸、酪胺酸、天冬胺酸、組織胺酸、精胺酸、色胺酸、賴胺酸、天冬醯胺、白胺酸、半胱胺酸、蘇胺酸、異白胺酸、甘胺酸、纈胺酸、甲硫胺酸、麩胺醯胺、麩胺酸、丙胺酸、脯胺酸。此等中係以苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸及組織胺酸為宜。
    上述(2)之突變中，作為其他胺基酸殘基，可舉例如野生型GDH之各個位置之胺基酸殘基以外之胺基酸。上述之胺基酸取代之位置中，以第326位置、第472位置、第475位置及第529位置為宜，以第472位置及第475位置尤佳。相當於第472位置及第475位置之胺基酸殘基之取代，雖可分別獨立，但以二者皆被取代尤佳。
    於第472位置，取代後之胺基酸殘基，以天冬胺酸、麩胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、異白胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸或組織胺酸為宜，以天冬胺酸尤佳。
    於第475位置，取代後之胺基酸殘基，以組織胺酸或絲胺酸為宜，以組織胺酸尤佳。
    於第326位置，取代後之胺基酸殘基，以麩胺酸或纈胺酸為宜。
    於第529位置，取代後之胺基酸殘基，以酪胺酸、組織胺酸或色胺酸為宜。
    上述適合之胺基酸取代型態亦與上述(3)之突變相同。
    上述胺基酸取代突變之位置係序列號碼3，亦即洋蔥假單胞菌KSI株之野生型GDH α次單元之胺基酸序列中之位置，序列號碼3之胺基酸序列中，除了上述特定之突變以外，於具有1個或多數個胺基酸殘基被取代、缺少、插入、或加成之胺基酸序列之GDH α次單元之同源基因(homologue)或變種(variant)，與序列號碼3之胺基酸序列之排比(Alignment)中，顯示相當於上述胺基酸取代之位置。例如，於第1個至第364個位置之區域，具有1個胺基酸殘基缺少之GDH α次單元之保存性變種中，所謂第365位置係表示上述變種之第364位置。
    本發明之改性型GDH之適合突變型態如下所示。
    (數字係表示於胺基酸序列中之位置，胺基酸殘基係取代上述位置後之胺基酸殘基，「+」係表示同時具有2個胺基酸取代。)
    (A)365Arg、365Asn、365Asp、365Cys、365Glu、365Gly、365His、365Ile、365Leu、365Met、365Phe、365Pro、365Trp、365Tyr、365Val、365Lys、365Gln、365Thr、365Ala
    (B)326Gln、326Val、326Arg
    (C)529His、529Tyr、529Trp
    (D)365Tyr+326Gln、365Tyr+326Val、365Tyr+326Arg、365Tyr+472Phe、365Tyr+472Ile、365Tyr+472Asn、365Tyr+472Asp、365Tyr+472His、365Tyr+472Leu、365Tyr+472Ser、365Tyr+475Ser、365Tyr+475His、365Phe+472Phe
    (E)472Asp+475His+365Phe、472Asp+475His+326Gln、472Asp+475His+326Thr、472Asp+475His+326Val、472Asp+475His+529Trp、472Asp+475His+529His、472Asp+475His+529Tyr、472Tyr+475His+365Phe、472Tyr+475His+365His、472Tyr+475His+326Val、472Ile+475His+326Gln
    (F)472Asp+475His+529His+326Gln、472Asp+475His+529Trp+326Gln
    本發明者比較具有FAD作為輔酶之GMC氧化還原酶群之Glucobacter oxydans之山梨糖醇脫氫酶(GenBank accession AB039821)、轉形葉表生菌(Erwinia herbicola )之2-氧代戊二酸脫氫酶(GenBank accession AF068066)、白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)之纖維二糖脫氫酶(CDH)(J.Mol.Biol.,315(3),421-34(2002))、放射線菌屬(Streptomyces sp.)之膽固醇氧化酶(COD)(J.Struct.Biol.116(2),317-9(1996))、Penicillium amagasakiense之葡萄糖氧化酶(Eur.J.Biochem.252,90-99(1998))之胺基酸序列，發現保存FAD鍵結區域及FAD-covering lid等之區域，及保存參與蛋白質折疊之胺基酸殘基之脯胺酸之區域。接著，由改變此等區域及其他區域之邊界附近之序列，對於可提昇基質特異性之可能性，進行檢討。具體上檢討R53至H73、E88至A108、N308至G336、K362至A377、A391至R497、S509至V539。該結果係發現於上述區域中，有幾處可提昇基質特異性之處。
    具有所需突變之GDH α次單元係於編碼α次單元之DNA(α次單元基因)，由部位特異之突變法，導入對應所需胺基酸突變之核苷酸突變，由使用適當之表現系統，使所得之突變DNA表現而可取得。另外，使編碼改性GDH α次單元之DNA，與編碼β次單元之DNA(β次單元基因)、或編碼β次單元基因及γ次單元之DNA(γ次單元基因)表現，而可取得改性GDH複合體。另外，導入突變於編碼GDH α次單元之DNA，亦可使用依序編碼γ次單元、α次單元及β次單元之多基因性(polycistronic)DNA斷片。
    導入突變之GDH α次單元或GDH複合體對於糖類之基質特異性係由實施例所記載之方法，調查對各種糖類之反應性，由比較野生型GDH α次單元或GDH複合體之反應性而可決定。
    將γ次單元、α次單元及β次單元，依此序編碼之多基因性(polycistronic)DNA斷片係例如由洋蔥假單胞菌KSI株之染色體DNA作為模板，具有序列號碼8、9之鹽基序列之寡核苷酸作為引子之PCR而可取得(參考後述之實施例)。
    取得GDH之各次單元之基因、導入突變、表現基因等所使用之載體，例如以大腸桿菌屬細菌運作之載體，具體上可舉例如pTrc99A、pBR332、pUC18、pUC118、pUC19、pUC119、pACYC184、pBBR122等。作為使用於基因表現之啟動子，可舉例如lac、trp、tac、trc、PL、tet、PhoA等。另外，含啟動子之表現載體之適當部位上，由插入α次單元基因或其他次單元基因，插入此等基因於載體與鍵結啟動子係可以相同步驟進行。作為如此之表現載體，可舉例如pTrc99A、pBluescript、pKK223-3等。
    另外，α次單元基因或其他次單元基因，亦可以可表現之型態加入於宿主微生物之染色體DNA中。
    以重組載體轉型微生物時，可舉例如鈣處理法之勝任細胞(competent cell)法、原生質體法(protoplast)或電孔法(electroporation)法等。
    作為宿主微生物，雖可舉例如枯草桿菌(Bacillus subtilis)等之芽孢桿菌屬細菌、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等之酵母、黑麴菌(Aspergillus niger)等之絲狀菌，但不侷限於此等，只要適合產生異種蛋白質之宿主微生物，皆可使用。
    本發明之突變α次單元或改性GDH複合體或表現此等之微生物係可作為葡萄糖感測器之酵素電極、或葡萄糖之分析試劑之構成要素使用。使用洋蔥假單胞菌之野生型GDH之葡萄糖感測器及葡萄糖分析試劑係記載於美國專利公開第2004/0023330A1。本發明之改性GDH亦可同樣地使用。〔實施例〕
    其次，舉實施例更具體地說明本發明，但本發明不侷限於此等實施例。 〔實施例1〕表現洋蔥假單胞菌之GDH之質體
    作為表現洋蔥假單胞菌之GDH之質體，準備表現GDH之α次單元及γ次單元之質體，以及表現GDH之α次單元、β次單元及γ次單元之質體。 <1>表現GDH之α次單元及γ次單元之質體
    作為表現α次單元及γ次單元之質體，使用WO02/036779(EP1331272A1、US2004023330A1、CN1484703A)所記載之質量pTrc99A/γ+α。相同質體係將離析自洋蔥假單胞菌KSI(FERM BP-7306)染色體DNA之含有連接GDH γ次單元結構基因及α次單元結構基因之DNA斷片，插入載體pTrc99A(Pharmacia社)之複製(cloning)部位之Ncol/HindⅢ所形成之質體。本質體中之GDH γ α基因係由trc啟動子所控制。pTrc99A/γ+α係保持青黴素耐性基因。 <2>表現GDH之α次單元、β次單元及γ次單元之質體
    表現GDH之α次單元、β次單元及γ次單元之質體如下述調製。 (1)調製來自洋蔥假單胞菌KSI株之染色體DNA
    由洋蔥假單胞菌KSI株，依常法調製染色體基因。亦即，將相同菌株使用TL液體培養基(10g之多胜肽，1g之酵母萃取液，5g之NaCl，2g之KH2PO4，5g之葡萄糖；pH7.2)，以34℃振盪一晚。由離心分離回收增殖菌體。懸濁此菌體於含有10mM NaCl，20mM Tris-HCl(pH8.0)，1 mM EDTA，0.5% SDS，100μg/ml之蛋白酶K之溶液。以50℃處理6小時。在此，加入等量之苯酚-氯仿，於室溫下攪拌10分鐘後，由離心分離回收上澄液。於其中加入醋酸鈉，使最終濃度成為0.3M，重層2倍量之乙醇，於中間層析出染色體DNA。使用玻璃棒將其撈起，以70%之乙醇洗淨後，溶解於適當量之TE緩衝溶液，作為染色體DNA溶液。 (2)調製編碼GDH之γ次單元、α次單元及β次單元之DNA斷片
    由上述染色體作為模板，以具有下述序列之寡核苷酸作為引子之PCR，增幅編碼DNA之γ次單元、α次單元及β次單元之DNA斷片。 〔前置引子(forward primer)〕
    5’-CATGCCATGGCACACAACGACAACAC-3’(序列號碼8) 〔反置引子(reverse primer)〕
    5’-GTCGACGATCTTCTTCCAGCCGAACATCAC-3’ (序列號碼9)
    將增幅斷片之碳端平滑末端化後，以Ncol消化N端側，連接(ligation)於同樣處理之pTrc99A(Pharmacia社)。以所得之重組載體，轉型E.coli DH5 α，以含有50μg/ml青黴素之LB((Luria-Bertani))瓊脂培養基，採取產生之菌落。將所得之轉型株，以液體之LB培養基培養，萃取質體。分析該插入DNA斷片時，確認約為3.8kb之插入斷片。本質體取名為pTrc99A γ α β。本質體中之GDH之各結構基因係由trc啟動子控制。pTrc99A γ α β係保持青黴素耐性基因及卡那黴素(Kanamycin)耐性基因。 〔實施例2〕由導入突變於GDH α次單元，探索基質相互作用部位 (1)導入突變於第472位置及第475位置
    於實施例1所得之pTrc99A γ α β中所含之GDH α次單元基因中，編碼相同基因之α次單元之第472位置之丙胺酸殘基為天冬胺酸取代，及第475位置之天冬酶胺殘基為組織胺酸所取代，而導入突變。稱此突變體為472D+475H突變體。由此等突變而改善基質特性，本發明者等已經確認。
    具體上，使用市售之部位特異之突變導入試劑組(Stratagene社，QuilkChangell Site-Directed Mutagenesis Kit)，將實施例1記載之質體pTrc99A/γ+α及pTrc99A γ α β中所含之GDH α次單元基因中第475位置之天冬醯胺(AAT)密碼子(codon)，取代成天冬胺酸(GAT)或麩胺酸(GAA)之密碼子(codon)。引子係使用下述之寡核苷酸。 〔A472D突變導入用引子〕 前置引子：序列號碼224
    5’-CGTGTTCAACGACGAATTCGATCCGAACAATCACATCACGG-3’ 反置引子：序列號碼225
    5’-CCGTGATGTGATTGTTCGGATCGAATTCGTCGTTGAACACG-3’ 〔N475H突變導入用引子〕 前置引子：序列號碼226
    5’-AATTCGCGCCGAACCACCACATCACGGGCTC-3’ 反置引子：序列號碼227
    5’-GAGCCCGTGATGTGGTGGTTCGGCGCGAATT-3’ (2)導入突變於第472位置及第475位置以外之位置
    使用上述所得之編碼472D+475H突變體之突變基因，再實施取代如下述區域之胺基酸殘基成苯丙胺酸。但是野生型之胺基酸殘基為苯丙胺酸之位置時，不進行胺基酸取代。另外，下述數字係表示於胺基酸序列中之位置，數字前之英文字母係表示胺基酸種類。例如R53係表示第53位置之精胺酸。
    (i)R53至H73
    (ii)E88至A108
    (iii)N308至G336
    (iv)K362至A377
    (v)A391至R497
    (vi)S509至V539
    另外，關於導入突變之目標α次單元基因，由組合突變以期具有相乘效果，使用已經確認基質特性改善效果之472D+475H突變體。
    上述胺基酸殘基取代所使用之前置引子之序列如下所示。反置引子之序列為前置引子之完全互補股。
    另外，於表示突變之記錄中，數字係表示胺基酸序列中之位置，數字前之英文字母係表示胺基酸取代前之胺基酸殘基，數字後之英文字母係表示胺基酸取代後之胺基酸殘基。例如R53F係取代第53位置之精胺酸成為苯丙胺酸。
    PCR反應係以下述之反應組成，95℃ 30秒後，55℃ 1分鐘，68℃ 8分鐘，重覆15次，進行68℃ 30分鐘之反應後，保持4℃。 〔反應液組成〕

    PCR反應後，添加0.5μl之DNA聚合酶於反應液，以37℃培養1小時，使模板質體分解。
    於所得之反應液，將大腸桿菌DH5 α(supE44,△lacU169( 80lacZ△M15),hsdR17,recAi,endAl,gyrA96,thi-1,relA1)之勝任細胞(competent cell)轉型。將於含青黴素(50μg/ml)及卡那黴素(30μg/ml)之LB瓊脂培養基(1%之bacto-tryptone(胰化蛋白腖)，0.5%之酵母萃取物，1%之氯化鈉，1.5%之瓊脂)上之數個生長發育之菌數，調製質量DNA，進行序列分析，確認導入目的突變於GDH α次單元基因。



    〔實施例3〕分析改性GDH之基質特異性
    使用實施例2所得之改性GDH表現質體，製造改性GDH，檢討基質特異性。 (1)培養
    將導入突變之大腸桿菌DH5 α株，分別以2ml之LB培養基(含有青黴素(50μg/ml)及卡那黴素(30μg/ml))，使用L字管，以37℃振動培養一晚。將此等培養液，接種於含有150ml之LB培養基(含有50μg/ml之青黴素及30μg/ml之卡那黴素)之500ml之振動式三角錐瓶，以37℃振動培養。自開始培養3小時後，添加IPTG(異丙基-β-右旋thiogalactopyranoside)，使最終濃度為0.1mM，再培養2小時。 (2)調製粗酵素試樣
    自上述所培養之培養液，收集菌體，洗淨後，以每0.3mg之濕菌體，為1ml之含有0.2%Triton×100之10mM磷酸鈣緩衝溶液(PPB)(pH7.0)，懸浮菌體，以超音波粉碎。離心分離(1000r.p.m，10分鐘，4℃)此懸浮液，除去殘渣後，將上澄液超離心分離(50,000r.p.m，60分鐘，4℃)，將所得之上澄液(水溶性部份)，作為粗酵素試樣。另外，將此試樣，由通常之疏水性層析法(管柱名octylsepharose：(Amersham Biosciences製)及離子交換層析法(Q-Sepharose)(製))精製，而得精製試樣。決定目的之酵素部份係以GDH活性為指標而進行。 (3)測定GDH活性
    於8μl之上述酵素中，添加8μl之活性測定用試劑(於12μl之600mM之methylphenazine methosulfate(PMS)、120μl之6mM之2,6-dichloroindophenol(DCIP)中，加入0.2(w/v)%之Triton X-100 10mM PPB，總量為480μl之溶液)。使用鋁塊恒溫槽，以各反應溫度將其培養1分鐘後，快速地加入8μl之各濃度之基質(葡萄糖或麥芽糖)、或蒸餾水攪拌，使用分光光度計，測定來自DCIP之吸收長之600nm之吸光度。各試藥之最終濃度係DCIP：0.06mM，PMS，0.6mM。基質之最終濃度為5mM。
    結果如表8至表14所示。另外，野生型GDH之反應比為48%。



    此結果係472D+475H+365F維持對葡萄糖之反應性下，與麥芽糖之反應性降低至1%左右，效果非常高之突變。
    第365位置以外之突變，發現G324、S326、L333、W334、S368、R369、K376、I377、V418、P419、Y436、K433、H448、A525、L529突變成苯丙胺酸，與麥芽糖之反應性係導入突變前之60%以下之效果。 〔實施例4〕驗證導入突變於第365位置
    由實施例3所得之結果，推測第365位置係對於與麥芽糖之反應性降低之非常有效之部位。因此，對於此部位，進行詳細的檢討。
    具體上驗證對於α次單元基因，導入單突變於第365位置之基質特性改善效果。
    實施導入突變於pTrc99A γ α β所含之野生型GDH α次單元基因之第365位置，評估突變酵素之基質特異性。關於導入突變，與實施例2同樣地進行。
    導入突變用前置引子係如下所述。反置引子係前置引子之完全互補股。
    〔實施例5〕分析改性GDH之基質特異性
    使用實施例4所得之改性GDH表現質體，與實施例3同樣地製造改性GDH，檢討基質特異性。酵素活性係使用粗酵素試樣進行。各改性GDH之對葡萄糖之比活性，對麥芽糖之比活性，反應比(對葡萄糖之比活性/對麥芽糖之比活性。單位為U/ml)如表16所示。關於基質濃度，係以5mM及10mM評估。
    該結果係關於第365位置，認為除了野生型之絲胺酸殘基以外之全部19種之胺基酸取代，具有基質特性改善效果。具體上以全部的胺基酸取代，與野生型比較，對麥芽糖之反應性降低50%以上。尤其取代成酪胺酸、色胺酸，基質濃度為5mM，10mM中任一種，野生型之反應比為40%左右，相對於此，2%以下時，對麥芽糖之反應性係降低野生型之90%以上，認為有極大之基質特性改善效果。 〔實施例6〕驗證組合第365位置與其他部位之效果
    由實施例2及實施例5之結果，確認第365位置係至少365F與472D+475H組合，具有效果，進而，由僅第365位置之單突變導入，發現所有胺基酸取代具有效果，顯示為基質特性改善效果非常高之部位。因此，由組合第365位置之胺基酸取代與其他部位之胺基酸取代，以更進一步改善基質特性為目標，進行更努力的檢討。具體上檢討第365位置與第326位置、第529位置、第472位置中任一種組合之2突變導入，以及由與第472位置及第475位置突變之組合，檢討3突變導入。

    檢討與全部部位之組合中，發現改善基質特性，具有相乘性效果，第365位置與改善基質特性之其他部位之胺基酸取代之組合，顯示更可改善基質特性。 〔實施例7〕驗證組合第472位置及第475位置以及其他部位之效果
    由實施例6之結果顯示，具有改善基質特性效果之胺基酸取代係由此等部位彼此間組合，可改善基質特性，具有相乘性效果。
    因此，驗證已經由發明者確認基質特性改善效果之部位之第472位置、第475位置及第365位置以外之部位之組合效果。
    具體上驗證第472位置及第475位置之組合中，基質特性改善效果最高之472D+475H，與第326位置或第529位置之組合。另外，對於第472位置及第475位置之其他突變，亦同樣地進行檢證。

    對於第472位置及第475位置與其他部位之組合，亦確認具有相乘效果。尤其472、475、326、529位置之4突變導入，降低對麥芽糖之反應性之效果高，由此結果顯示由具有基質特性改善效果之胺基酸取代彼此之組合，可改善基質特性，具有相乘性效果。 〔實施例7〕調製精製酵素
    對於實施例5及實施例6中確認改善基質特異性之幾個改性GDH，實施精製。方法係如實施例3之記載而進行。各精製酵素之對葡萄糖之比活性(U/mg)係如表8所示。
    該結果係含S365Y之突變係維持對葡萄糖之比活性接近90%，就測定葡萄糖之觀點上，顯示適合之突變。另外，亦認定S326Q突變具有提昇對葡萄糖比活性之效果。
    〔實施例8〕製作使用改性GDH之血糖測定用比色式感測器
    使用實施例7所得之精製改性酵素，製作葡萄糖感測器。
    製作具有如圖1所示之基本結構之葡萄糖感測器。亦即，上述之葡萄糖感測器係具有對於透明基板2A，介由分隔器3而層合透明蓋4A(材質為PET(聚乙烯對苯二甲酸酯))型態，由各要素2A至4A規定毛細管5A。毛細管5A之尺寸係1.3mm×9mm×50μm(圖1)。透明基板2A及透明蓋4A係由厚度為250μm之PET所形成，分隔器3A係由黑色之雙面膠布所組成。
    葡萄糖感測器係具有如圖2所示之第1試藥部份至第3試藥部份，各成份及塗佈量如表23所示。表中，「Ru」係表示(Ru(NH3)6Cl3)，CHAPS係表示3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonic acid ，ACES係表示N-(2-acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid，MTT係表示3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide。
    供應試樣於上述葡萄糖感測器之毛細管，由該時間點，每隔0.1秒鐘重覆測定吸光度，製成吸光度之時間變化。於測定各次之吸光度，對於第3試藥部份，沿著毛細管高度方向照射光線，此時透過葡萄糖感測器，接收光線。光的照射係使用發光二極體，照射630nm的光而進行。透過光係於光電二極體接收光。
    作為測定試樣，係使用添加葡萄糖之血液。使用於調整血球比容成為42%之血液中，添加葡萄糖，使濃度成為0、100、200、400、600或800mg/dl者，評估葡萄糖感測器之直線性。另外，直線性評估係由標繪導入測定試樣於感測器5秒後之終點之吸光度而進行。結果如圖3所示。
    另外，使用調整血球比容值為45%，葡萄糖濃度為45mg/dl之血液中，再添加麥芽糖而成為0、100、200或300mg/dl者，評估麥芽糖之影響。結果如圖4所示。此試驗係由同樣地標繪導入測定試樣於感測器5秒後之吸光度而進行。
    使用葡萄糖為基質之直線性評估中，可知關於全部的酵素，隨著濃度而吸光度增加，可測定葡萄糖。尤其含有365之突變之365Y及326Q365Y比野生型更為直線性延伸，顯示可測定高濃度區域(600mg/dl附近)。
    接著，關於麥芽糖的影響，於45mg/dl之葡萄糖中，添加麥芽糖時，野生型係隨著麥芽糖濃度而吸光度大幅增加，顯示與麥芽糖強烈反應。另一方面，使用突變酵素之感測器，抑制因應麥芽糖濃度之吸光度之增加，可知麥芽糖之影響變少。將此等數據換算成表觀血糖上昇值之結果係如圖5及表24所示。使用野生型酵素之感測器中，低血糖(45mg/dl之葡萄糖)因混入麥芽糖而表觀上表示正常範圍以上之(138mg/dl之葡萄糖)。另一方面，使用改性GDH之感測器中，即使混入最多之300mg/dl之麥芽糖，表觀血糖值最多亦僅上昇至60mg/dl，稱得上大幅壓抑所受之影響。結論係顯示含365之突變，就對葡萄糖反應性(直線性)及麥芽糖影響之觀點而言，係最適合的。
    由以上結果顯示，使用改性GDH之葡萄糖感測器，即使確保直線性亦與野生型相同程度以上，仍大幅降低與麥芽糖之反應性。若使用採用此改性GDH之葡萄糖感測器時，對於醫院等所投予之血中麥芽糖濃度之上限值200mg/dl，可說無正誤差，即使上限值以上之300mg/dl，亦不會判斷低血糖(50mg/dl)為正常值或高血糖，可進行安全治療。另外，如上所述，因GDH亦不與溶存氧反應，提供使用此改性GDH之感測器，進行糖尿病患者之正確診斷治療。 〔實施例9〕精製酵素之SV標繪評估
    實施例5及6中，對於認為尤其具有基質特異性改善效果之365Y及326Q+365Y改性GDH，取得使用精製酵素之SV標繪。
    該結果係於精製酵素中，關於試驗之所有基質濃度，反應比(對麥芽糖之比活性/對葡萄糖之比活性)與野生型相比較，可確認大幅降低而改善。另外，關於結果，因為與由粗酵素溶液所測定結果大致一致，所以可由粗酵素評估改性酵素。另外再補充，因為由麥芽糖輸液，血中之麥芽糖濃度之上昇，最多也僅上昇至200mg/dl，所以尤其基質濃度10mM(360 mg/dl)及5mM(180mg/dl)時之反應比受到注目。該結果係於此濃度範圍時，S365Y突變之麥芽糖/葡萄糖反應比為0.1%時，顯示幾乎與麥芽糖無反應。
    另外，由附加326Q於365Y，亦顯示可提昇對葡萄糖之比活性，相對地降低對麥芽糖之比活性。
    〔產業上利用性〕
    本發明之改性GDH係提昇對葡萄糖之基質特異性，可適合使用於使用葡萄糖感測器等之葡萄糖測定。
    1‧‧‧葡萄糖感測器
    2‧‧‧透明基板
    3‧‧‧分隔器
    4‧‧‧透明蓋
    5‧‧‧毛細管
    [圖1]表示葡萄糖感測器之結構圖。
    [圖2]表示葡萄糖感測器之各試藥部份圖。
    [圖3]表示使用改性型GDH之葡萄糖感測器對葡萄糖之反應性圖。
    [圖4]表示使用改性型GDH之葡萄糖感測器，於葡萄糖存在下，對麥芽糖之反應性圖。
    [圖5]表示使用野生型GDH及改性GDH之葡萄糖感測器，所測定之表觀上血糖值圖。
    <110> 愛科來股份有限公司
    <120> 改性之葡萄糖脫氫
    <130> G1017-C6142
    <150> JP2005-179231
    <151> 2005-06-20
    <160> 227
    <170> 系統版本3.3
    <210> 1
    <211> 2467
    <212> DNA
    <213> 洋蔥假單胞菌
    <220>
    <221> CDS
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    <220>
    <221> CDS
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    <220>
    <221> CDS
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    <400> 1



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    <212> PRT
    <213> 洋蔥假單胞菌
    <400> 2

    <210> 3
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    <212> PRT
    <213> 洋蔥假單胞菌
    <400> 3

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    <212> PRT
    <213> 洋蔥假單胞菌
    <400> 4
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    <211> 1441
    <212> DNA
    <213> 洋蔥假單胞菌
    <220>
    <221> CDS
    <222> (121)..(1398)
    <400> 5


    <210> 6
    <211> 425
    <212> PRT
    <213> 洋蔥假單胞菌
    <400> 6

    <210> 7
    <211> 7
    <212> PRT
    <213> 合成
    <220>
    <221> misc_feature
    <222> (4)..(4)
    <223> Xaa可為絲胺酸以外之任何自然發生之胺基酸
    <400> 7
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    <212> DNA
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 人工序列描述：引子
    <400> 8
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    <211> 30
    <212> DNA
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    <212> DNA
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    <212> DNA
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    <220>
    <223> 引子
    <400> 11
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    <212> DNA
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    <220>
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    <220>
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    权利要求:
    Claims (10)
    [1] 一種改性之葡萄糖脫氫酶，其特徵為，具有序列號碼3所示之胺基酸序列，或於相同之胺基酸序列中，1至10個胺基酸殘基被取代、缺少、插入、或加成之胺基酸序列，而且，具有葡萄糖脫氫酶活性之蛋白質的改性之葡萄糖脫氫酶，包含(i)相當於至少1個選自該胺基酸序列中324、326、333、334、365、368、369、376、377、418、419、436、433、448、525、及529位置之胺基酸殘基為其他胺基酸殘基所取代，(ii)相當於第472位置之胺基酸殘基為天冬胺酸所取代，及(iii)相當於第475位置之胺基酸殘基為組織胺酸所取代，提昇對葡萄糖之基質特異性。
    [2] 如申請專利範圍第1項之改性之葡萄糖脫氫酶，其中該其他胺基酸殘基為苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸。
    [3] 如申請專利範圍第1項之改性之葡萄糖脫氫酶，其中該位置為第326位置，相當於相同位置之胺基酸殘基為麩胺醯胺或纈胺酸所取代。
    [4] 如申請專利範圍第1項之改性之葡萄糖脫氫酶，其中該位置為第529位置，相當於相同位置之胺基酸殘基為酪胺酸、組織胺酸或色胺酸所取代。
    [5] 一種改性之葡萄糖脫氫酶複合體，其特徵為，至少包含如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之改性之葡萄糖脫氫酶，及電子傳遞次單元(subunit)。
    [6] 如申請專利範圍第5項之葡萄糖脫氫酶複合體，其中電子傳遞次單元係細胞色素C。
    [7] 一種DNA，其特徵為，編碼如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之改性之葡萄糖脫氫酶。
    [8] 一種微生物，其特徵為，保持如申請專利範圍第7項之DNA，產生如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之改性之葡萄糖脫氫酶或如申請專利範圍第5項之改性之葡萄糖脫氫酶複合體。
    [9] 一種葡萄糖分析試劑組，其特徵為，包含如申請專利範圍第1項至第4項之改性之葡萄糖脫氫酶、如申請專利範圍第5項之改性之葡萄糖脫氫酶複合體、或如申請專利範圍第8項之微生物。
    [10] 一種葡萄糖感測器，其特徵為，包含如申請專利範圍第1項至第4項之改性之葡萄糖脫氫酶、如申請專利範圍第5項之改性之葡萄糖脫氫酶複合體、或如申請專利範圍第8項之微生物。
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