台湾专利TW201307558A 培養基體的使用方法

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本發明涉及一種培養基體的使用方法，該培養基體用於培養神經細胞，該使用方法包括：提供一培養基體，該培養基體包括一載體及一形成在該載體表面的奈米碳管結構，該奈米碳管結構包括複數間隔設置的奈米碳管線或複數交叉設置的奈米碳管線，該複數奈米碳管線相互交叉形成複數孔；對所述奈米碳管結構進行極性化處理，使該奈米碳管結構具有一極性化表面；於所述奈米碳管結構的極性化表面培養所述神經細胞，使該神經細胞的神經突起沿著所述複數奈米碳管線生長。其中，相鄰之奈米碳管線之間的間距或每個孔的有效直徑大於等於所述神經突起之直徑。
公开号:TW201307558A
申请号:TW100129144
申请日:2011-08-16
公开日:2013-02-16
发明作者:Li Fan；Chen Feng；Wen-Mei Zhao
申请人:Hon Hai Prec Ind Co Ltd；
IPC主号:C12N5-00

专利说明:
培養基體的使用方法
本發明涉及一種培養基體的使用方法，尤其係涉及一種可供培養神經細胞的培養基體的使用方法。
神經系統主要係由神經細胞(neurons)以及神經膠質細胞(neuron glial cells)構成的一複雜且特異的生物資訊傳遞網路，用以與其他組織或器官建立連結以進行功能協調。神經系統係由神經細胞來執行接收刺激、通過傳導並輸出神經遞質(neuron transmitter)以進行組織或器官間的資訊溝通，而神經膠質細胞則執行神經細胞物理性支援、營養提供以及調節溝通資訊速度等功能。每一神經細胞依據型態包含胞體(cell body)與神經突起(neurite)兩部分，神經突起自胞體延伸並朝向其他神經細胞或係其他細胞(例如：肌肉細胞)生長，其中神經突起又分為軸突(axon)與樹突(dendrite)兩種。一般來說，刺激由樹突接收並將衝動傳向胞體，衝動經過軸突傳導至軸突末端，並釋放傳導物質給其他細胞。
由於神經系統於生物體內起著協調各組織與器官的作用，因此，研究神經細胞的培養、生長等狀況的重要性不言可喻。目前，因神經系統中的突起受損而導致的神經缺損係臨床常見的致殘性疾病，那麼研究神經細胞的突起的定向生長對治療神經缺損等神經疾病有重要的意義。
有鑒於此，確有必要提供一種能夠使得神經細胞定向生長的培養基體的使用方法。
一種培養基體的使用方法，該培養基體用於培養神經細胞，該使用方法包括：提供一培養基體，該培養基體包括一載體及一形成在該載體表面的奈米碳管結構，該奈米碳管結構包括複數間隔設置的奈米碳管線，且相鄰之奈米碳管線之間的間距大於等於待培養的神經突起之直徑；對所述奈米碳管結構進行極性化處理，使該奈米碳管結構具有一極性化表面；以及於所述奈米碳管結構的極性化表面培養所述神經細胞，使得該神經細胞的神經突起沿著所述複數奈米碳管線生長。
一種培養基體的使用方法，該培養基體用於培養神經細胞，該使用方法包括：提供一培養基體，該培養基體包括一載體及一形成在該載體表面的奈米碳管結構，該奈米碳管結構包括複數奈米碳管線，該複數奈米碳管線相互交叉形成複數孔，且每個孔的有效直徑大於等於待培養的神經突起之直徑；對所述奈米碳管結構進行極性化處理，使該奈米碳管結構具有一極性化表面；以及於所述奈米碳管結構的極性化表面培養所述神經細胞，使得該神經細胞的神經突起沿著所述複數奈米碳管線生長。
與先前技術相比較，本發明提供之培養基體中的奈米碳管結構包括複數間隔或交叉設置的奈米碳管線，該奈米碳管線可以引導神經細胞之神經突起的生長，因此，採用上述培養基體的使用方法培養的神經突起可以定向生長。因此，可以根據生物體受損部位的形狀控制所述奈米碳管結構的圖案，從而使得神經突起按照預定的路線生長，進而使得所述神經移植體中的神經網路能夠快速地與受損部位的兩端或邊緣建立聯繫，完成受損部位的修復。
下面將結合附圖及具體實施例，進一步地詳細說明本發明。
請參閱圖1，本發明第一實施例提供一培養基體10。該培養基體10用於培養神經細胞，其包括一奈米碳管結構12及一載體14。所述奈米碳管結構12設置於該載體14的表面，並通過凡得瓦力(van der Waals force)緊密結合在一起。
所述奈米碳管結構12包括複數擇優取向排列的奈米碳管或者由複數擇優取向排列的奈米碳管組成。於使用所述培養基體10用來培養神經細胞的過程中，該奈米碳管結構12的表面會被極性化形成極性化表面，該奈米碳管結構12的極性化表面具有與待培養的神經細胞相匹配的電荷極性。進一步，該奈米碳管結構12極性化表面中的擇優取向排列的奈米碳管被極化，使得該奈米碳管結構12極性化表面中的奈米碳管具有與待培養的神經細胞相匹配的電荷極性。優選地，所述奈米碳管結構12中複數奈米碳管之間通過凡得瓦力連接，形成一自支撐結構。所謂“自支撐”即該奈米碳管結構12不需要大面積的載體支撐，而只要相對兩邊提供支撐力即能整體上懸空而保持自身特定的形狀，即將該碳奈米結構12置於（或固定於）間隔設置的兩個支撐物上時，位於兩個支撐物之間的奈米碳管結構12能夠懸空保持自身特定的形狀。
進一步，該奈米碳管結構12包括複數奈米碳管線123，該複數奈米碳管線123間隔或交叉設置且形成一圖案，使得該奈米碳管結構12圖案化。每個奈米碳管線123的直徑大約為1微米～10微米。相鄰之兩個奈米碳管線123之間的間距大於等於神經細胞的神經突起之直徑，優選地，該間距大於等於20微米，且小於等於100微米。當所述奈米碳管結構12包括複數交叉設置的奈米碳管線123時，該複數奈米碳管線123相互交叉形成複數孔，每個孔的有效直徑大於等於神經突起之直徑；優選地，每個孔的有效直徑大於等於20微米，且小於等於100微米。當相鄰之奈米碳管線123之間的間距或每個孔的有效直徑大於等於待培養的神經細胞的直徑時，於所述培養基體10上種植神經細胞時，神經細胞吸附於所述載體14的表面。該奈米碳管線123主要用於引導神經細胞的神經突起之生長方向，即，神經細胞的神經突起可以沿著奈米碳管線123的軸向生長。因此，通過控制所述奈米碳管結構12中的奈米碳管線的排列方式及相鄰奈米碳管線之間的間距或每個孔的有效直徑等方式，使該奈米碳管結構12中的奈米碳管線形成一圖案。該圖案化的奈米碳管結構12可以控制神經細胞的神經突起之生長方向，從而實現神經細胞的定向生長。
所述奈米碳管線123包括複數擇優取向排列的奈米碳管。具體地，該奈米碳管線123包括複數通過凡得瓦力首尾相連且基本沿同一方向排列的奈米碳管；該奈米碳管線123也可以包括複數通過凡得瓦力首尾相連且沿著該奈米碳管線123的軸向螺旋延伸的奈米碳管。優選地，所述奈米碳管結構12可以為一膜狀的自支撐結構，該奈米碳管結構12包括至少一個奈米碳管膜。請參閱圖2，每個奈米碳管膜包括複數並排且間隔設置的奈米碳管線，相鄰之奈米碳管線之間通過至少一個奈米碳管搭接，該至少一個奈米碳管通過凡得瓦力緊密連接該相鄰之奈米碳管線。所述奈米碳管線於所述奈米碳管膜中基本沿同一方向排列。相鄰之奈米碳管線之間搭接的至少一個奈米碳管使得所述複數奈米碳管線形成所述奈米碳管膜。其中，當相鄰之奈米碳管線之間搭接複數奈米碳管時，該複數奈米碳管可以通過凡得瓦力首尾相連。所述奈米碳管線由複數奈米碳管構成，該複數奈米碳管沿奈米碳管線的軸向通過凡得瓦力首尾相連。請參閱圖3，當所述奈米碳管結構12包括複數層疊設置的上述奈米碳管膜時，相鄰之奈米碳管膜通過凡得瓦力緊密相互結合，且相鄰之奈米碳管膜中的奈米碳管線的軸向交叉設置形成大於等於0度，且小於等於90度的夾角。
由於所述奈米碳管結構由奈米碳管組成且奈米碳管之間通過凡得瓦力連接，因此所述奈米碳管結構具有彈性佳、延展性良好及品質輕等優點，便於裁剪和拉伸。另外，奈米碳管具有較好的導電導熱及發聲特性，所以所述奈米碳管結構也具有良好的導電、導熱及發聲特性。神經細胞的生長會受到電、熱及發聲的影響，因此，在包含有所述奈米碳管結構12的所述培養基體10上培養定向生長的神經細胞，有利於研究熱、電以及發聲對神經細胞的影響。
所述載體14主要用於放置或支撐所述奈米碳管結構12和待培養的神經細胞。該載體14的具體形狀、材料和厚度可以根據需要確定。所述載體14可以為平面結構，也可以為曲面結構，如，長方形的片狀結構、弧形結構、折面結構等。所述載體14可以為能與生物體相容的生物載體，該生物載體的材料可以為生物降解材料、矽膠或奈米碳管片材等。其中，所述生物降解材料可以為熱塑性澱粉塑膠、脂肪族聚酯、聚乳酸、澱粉聚乙烯醇。所述無生物毒性的材料可以為矽膠。所述奈米碳管片材係指由奈米碳管組成，具有自支撐功能和一定強度的奈米碳管膜或奈米碳管編織物。所述載體14也可以為不能與生物體相容的非生物載體，該非生物載體的材料可以為塑膠，如聚苯乙烯。優選地，所述載體14為塑膠培養皿、塑膠表面皿或塑膠面狀結構。當所述載體14為塑膠培養皿或塑膠表面皿時，所述培養基體10可以比較方便的存儲；而且可以直接採用該培養基體10進行培養細胞，而無需另外的器皿放置該培養基體10。
當所述載體14為生物載體時，該培養基體10可以直接植入生物體中，使生物體受損部位兩端或邊緣的神經細胞自我生長，重新建立聯繫，完成受損部位的修復。該載體14的表面的面積及形狀可大致與所述奈米碳管結構12的面積及形狀大致相當。其中，當該載體14為具有柔性的材料時，如矽膠、奈米碳管材料，所述培養基體也具有柔性。可以理解，當所述奈米碳管結構12的厚度較薄時，該奈米碳管結構12具有較小機械強度及具有較大的比表面積，因此，該奈米碳管結構12容易受外力產生破損或容易黏附在其他物體上。將該奈米碳管結構12設置於所述於所述載體14表面，可以使該奈米碳管結構12更難受外力作用而產生破損，同時便於移動及防止該奈米碳管結構12黏附在親水性物體上。
本實施例中，所述培養基體10係由塑膠圓片載體14和奈米碳管結構12組成，該奈米碳管結構12為單層奈米碳管膜，且該奈米碳管膜包括複數基本沿同一方向延伸的奈米碳管線123，該複數奈米碳管線123基本平行且間隔設置，相鄰之奈米碳管線123之間搭接至少一個奈米碳管。相鄰之奈米碳管線123之間的間距大於等於30微米，且小於等於60微米。每個奈米碳管線123包括複數奈米碳管，且該複數奈米碳管通過凡得瓦力首尾相連且基本沿同一方向排列。當在該培養基體10的表面培養神經細胞時，神經細胞被吸附於所述塑膠圓片載體14的表面，所述神經細胞分化出的神經突起於所述奈米碳管線123的引導下，基本沿著該奈米碳管線123的軸向延伸方向呈直線型生長。因此，利用該培養基體10可以使得神經細胞的神經突起定向生長，如圖4所示。
請參閱圖5，當所述奈米碳管結構12中的奈米碳管線間隔設置時，本發明實施例提供一種製備上述培養基體10的方法，其包括：
S110，提供一奈米碳管結構預製體，該奈米碳管結構預製體包括至少一奈米碳管拉膜，每個奈米碳管拉膜包括複數通過凡得瓦力首尾相連且基本沿同一方向排列的奈米碳管；
S120，處理所述奈米碳管結構預製體形成所述奈米碳管結構12，該奈米碳管結構12具有複數間隔設置的奈米碳管線；以及
S130，將所述奈米碳管結構12固定在一載體14上。
於所述步驟S110中，所述奈米碳管拉膜係由若干奈米碳管組成的自支撐結構。請參閱圖6，所述複數奈米碳管沿同一方向擇優取向排列。所述擇優取向係指在該奈米碳管拉膜中大多數奈米碳管的整體延伸方向基本朝同一方向。而且，所述大多數奈米碳管的整體延伸方向基本平行於奈米碳管拉膜的表面。進一步地，所述奈米碳管拉膜中多數奈米碳管係藉由凡得瓦力首尾相連。具體地，所述奈米碳管拉膜中基本朝同一方向延伸的大多數奈米碳管中每一奈米碳管與在延伸方向上相鄰的奈米碳管藉由凡得瓦力首尾相連。當然，所述奈米碳管拉膜中存在少數隨機排列之奈米碳管，這些奈米碳管不會對奈米碳管拉膜中大多數奈米碳管的整體取向排列構成明顯影響。所述自支撐主要通過奈米碳管拉膜中存在連續的通過凡得瓦力首尾相連延伸排列的奈米碳管而實現。
具體地，所述奈米碳管拉膜中基本朝同一方向延伸的多數奈米碳管，並非絕對的直線狀，可以適當的彎曲；或者並非完全按照延伸方向上排列，可以適當的偏離延伸方向。因此，不能排除奈米碳管拉膜的基本朝同一方向延伸的多數奈米碳管中並列的奈米碳管之間可能存在部分接觸。
具體地，所述奈米碳管拉膜包括複數連續且定向排列之奈米碳管片斷。該複數奈米碳管片斷藉由凡得瓦力首尾相連。每一奈米碳管片斷包括複數相互平行的奈米碳管，該複數相互平行的奈米碳管藉由凡得瓦力緊密結合。該奈米碳管片斷具有任意的長度、厚度、均勻性及形狀。該奈米碳管拉膜中的奈米碳管沿同一方向擇優取向排列。該奈米碳管拉膜具有較好的透光性，可見光透過率可達到75%以上。
當該奈米碳管結構包括複數奈米碳管拉膜時，所述複數奈米碳管拉膜層疊設置形成一層狀結構。該層狀結構的厚度不限。請參閱圖7，該複數奈米碳管拉膜中的相鄰之奈米碳管拉膜通過凡得瓦力結合。該層狀結構中相鄰之奈米碳管拉膜中的奈米碳管之間具有一交叉角度α，且該α大於0度且小於等於90度。當相鄰之奈米碳管拉膜中的奈米碳管之間具有一交叉角度α時，所述複數奈米碳管拉膜中的奈米碳管相互交織形成一網狀結構，使所述奈米碳管結構的機械性能增加。如，所述奈米碳管結構包括複數層層疊設置的奈米碳管拉膜，且相鄰之奈米碳管膜中的奈米碳管之間的交叉角度α大致等於90度，即，相鄰奈米碳管拉膜中的奈米碳管的延伸方向大致垂直。所述奈米碳管拉膜的結構及其製備方法請參見范守善等人於2010年7月11日公告之第I327177號中華民國專利公告本。
其中，每個奈米碳管拉膜的製備方法包括以下步驟：
首先，提供一奈米碳管陣列，優選地，該陣列為超順排奈米碳管陣列。
所述奈米碳管陣列的製備方法可為化學氣相沈積法。也可為石墨電極恒流電弧放電沈積法、雷射蒸發沈積法等。
其次，採用一拉伸工具從所述奈米碳管陣列中拉取獲得所述奈米碳管拉膜。
所述奈米碳管拉膜的製備方法具體包括以下步驟：（a）從上述奈米碳管陣列中選定一定寬度的複數奈米碳管片斷，本實施例優選為採用具有一定寬度的膠帶接觸奈米碳管陣列以選定一定寬度的複數奈米碳管片斷；（b）以一定速度沿基本垂直於奈米碳管陣列生長方向拉取該複數奈米碳管片斷，以形成一連續的奈米碳管拉膜。
在上述拉取過程中，該複數奈米碳管片斷於拉力作用下沿拉伸方向逐漸脫離基底的同時，由於凡得瓦力作用，該選定的複數奈米碳管片斷分別與其他奈米碳管片斷首尾相連地連續地被拉出，從而形成所述奈米碳管膜。
步驟S120可以通過採用揮發性溶劑處理懸空的奈米碳管預製體實現。具體包括以下步驟：
S121：將所述奈米碳管結構預製體懸空設置；如，固定所述奈米碳管結構預製體相對設置的兩端，且使該奈米碳管結構預製體懸空設置。當所述奈米碳管結構預製體中的大多數奈米碳管基本沿同一方向擇優取向排列時，該奈米碳管結構預製體垂直於所述奈米碳管軸向延伸方向的兩端被固定。
S122，採用一揮發性溶劑處理所述懸空設置的奈米碳管結構預製體，該奈米碳管結構預製體中的複數基本平行且相鄰奈米碳管收縮會聚並且首尾相連形成複數並排且間隔設置的奈米碳管線。具體地：先將所述揮發性溶劑霧化成直徑小於等於10微米的液滴；然後在氣流的攜帶下噴塗到所述奈米碳管結構預製體的表面，以浸潤該奈米碳管結構預製體；於所述揮發性溶劑揮發的過程中，該浸潤的奈米碳管結構預製體在表面張力的作用下，奈米碳管拉膜中的複數基本平行且相鄰奈米碳管收縮會聚在一起，該收縮會聚的奈米碳管通過凡得瓦力首尾相連形成複數並排且間隔設置的奈米碳管線，從而得到所述奈米碳管結構12。
其中，可以採用氣流霧化、超聲波霧化或加入霧化劑等方式實現所述溶劑的霧化。所述揮發性溶劑可以為酒精、甲醇、丙酮、乙酸或水等可揮發性溶劑。於噴塗所述揮發性溶劑的霧化液滴的過程中，應確保氣流的壓強比較小，不能吹破所述奈米碳管結構預製體。所述奈米碳管線的直徑優選地大於等於1微米，且小於等於10微米；相鄰之奈米碳管線之間的間距大於等於待培養的神經突起之直徑；優選地，該間距大於等於20微米，且小於等於100微米。該奈米碳管線主要用於引導神經細胞的突起的生長方向，即，神經細胞的突起可以沿著奈米碳管線的延伸方向生長。需要說明的係，所述奈米碳管結構中的相鄰之奈米碳管線之間還可能包括至少一個奈米碳管。
當所述奈米碳管結構預製體中的大多數奈米碳管基本沿同一方向排列時，所述步驟S120也可以通過使該奈米碳管結構預製體在垂直於奈米碳管軸向的方向上受力的方式實現。如，提供至少一彈性支撐體；將所述奈米碳管結構預製體固定設置於所述彈性支撐體，且該奈米碳管結構預製體至少部分懸空設置，其中，所述彈性支撐體的彈性拉伸方向與該奈米碳管結構預製體的奈米碳管的軸向基本垂直；以及沿基本垂直於所述奈米碳管結構預製體中的奈米碳管的軸向方向拉伸所述彈性支撐體，以改變該奈米碳管結構預製體中的並排設置的奈米碳管之間的距離，使得該奈米碳管結構預製體中並排設置的奈米碳管之間的距離增大或減小。其中，所述彈性支撐體可以為彈簧、彈性橡膠或橡皮筋等。
步驟S130為將所述奈米碳管結構置於所述載體的表面，然後採用有機溶劑浸潤該奈米碳管結構。其中，可以採用將有機溶劑滴落或噴塗在奈米碳管結構的表面，使得該有機溶劑浸潤該奈米碳管結構。其中，所述有機溶劑可以為酒精、甲醇、丙酮、乙酸等可揮發性溶劑。
所述有機溶劑在揮發的過程中，所述奈米碳管結構的表面張力會減小，該奈米碳管結構主要通過凡得瓦力吸附於所述載體的表面，使得所述奈米碳管結構固定在該載體上。該載體主要用於放置所述奈米碳管結構，以增強奈米碳管結構的強度。
可以理解，所述培養基體10的製備方法還可以包括以下步驟：提供一具有複數奈米碳管線123的奈米碳管結構12，該複數奈米碳管線123間隔設置，且相鄰之奈米碳管線123之間的間距大於等於待培養的神經細胞的神經突起之直徑；以及採用有機溶劑處理該奈米碳管結構12，使得該奈米碳管結構12固定於所述載體14上。其中，所述奈米碳管線123除了採用揮發性溶劑處理所述奈米碳管拉膜的方法獲得之外，還可以為從一奈米碳管陣列中直接拉取獲得的非扭轉的奈米碳管線；所述奈米碳管線123也可以為通過先從一奈米碳管陣列中拉取獲得一奈米碳管線狀結構或奈米碳管膜狀結構，然後再扭轉該奈米碳管線狀結構或奈米碳管膜狀結構獲得的扭轉的奈米碳管線。所述奈米碳管結構12也可以由上述非扭轉的奈米碳管線或扭轉的奈米碳管線通過並排間隔設置或交叉編織等方式形成。
本實施例中，提供一個奈米碳管拉膜，該奈米碳管膜拉膜包括複數奈米碳管，該複數奈米碳管通過凡得瓦力首尾相連且基本沿同一方向排列，該奈米碳管拉膜從一超順排奈米碳管陣列中直接拉伸獲得的；將該奈米碳管拉膜固定在一中間鏤空的框架上，使該奈米碳管結構懸空設置；將酒精置於一美工噴霧器中，酒精在通過該美工噴霧器噴出的過程中被霧化成幾微米的酒精液滴；該酒精液滴在較弱的氣流的攜帶下輕輕噴塗在該奈米碳管拉膜的表面，浸潤該奈米碳管拉膜；待酒精揮發後奈米碳管拉膜中的大多數奈米碳管收縮會聚成奈米碳管線，從而形成所述奈米碳管結構；將該奈米碳管結構剪成圓形，然後放置在一塑膠圓片上；將酒精滴在置於該塑膠圓片上的奈米碳管結構上浸潤該奈米碳管結構；待酒精揮發後，該奈米碳管結構緊密吸附於所述塑膠圓片的表面。
請參閱圖8，本發明實施例提供一種使用第一實施例提供之培養基體10培養神經細胞的方法，該使用方法包括以下步驟：
A）提供所述培養基體，該培養基體包括一載體及一設置於該載體的奈米碳管結構，該奈米碳管結構包括至少一奈米碳管膜，該奈米碳管膜包括複數間隔或交叉設置的奈米碳管線；
B）對所述奈米碳管結構進行極性化處理，使該奈米碳管結構具有一極性化表面；以及
C）於所述奈米碳管結構的極性化表面培養複數神經細胞，使該複數神經細胞的神經突起沿著所述奈米碳管線生長。
所述步驟B對所述奈米碳管結構的表面進行極性化處理主要係改變所述奈米碳管結構表面的奈米碳管的電荷極性，使得該極性化的奈米碳管結構能夠吸附並與待培養的神經細胞生物相容，有利於神經細胞貼壁生長。具體地，步驟B進一步包括以下步驟：
B1，對所述培養基體進行滅菌處理；以及
B2，採用一多聚賴氨酸（Poly-D-lysine, PDL）溶液或聚醚醯亞胺（PEI）溶液處理所述滅菌後的培養基體中的奈米碳管結構。
步驟B1對所述培養基體進行滅菌處理的方式不限，只要能夠殺死所述奈米碳管結構中的大部分細菌即可。本實施例中，該步驟優選通過紫外光滅菌的方式對所述奈米碳管結構進行滅菌。
B2具體包括以下步驟：首先，將多聚賴氨酸溶液或聚醚醯亞胺溶液滴到所述奈米碳管結構的表面，直至覆蓋該奈米碳管結構，並放置10小時以上，使得所述奈米碳管結構的表面被多聚賴氨酸溶液或聚醚醯亞胺溶液極化，使該奈米碳管結構的表面形成極性化表面，該極性化表面具有與待種植的神經細胞相反的電荷極性，以增加對神經細胞的吸附性，為神經細胞的培養提供條件。然後，採用無菌去離子水清洗形成於所述奈米碳管結構表面的多聚賴氨酸溶液或聚醚醯亞胺溶液，從而減少或避免多聚賴氨酸溶液或聚醚醯亞胺溶液影響神經細胞的培養。
所述奈米碳管結構經過多聚賴氨酸溶液或聚醚醯亞胺溶液處理，直接改變奈米碳管結構表面的奈米碳管的電荷極性，使得該奈米碳管結構的表面具有與細胞相匹配的電荷極性，而不需要通過對所述奈米碳管結構的表面進行鍍層、塗層或化學修飾處理等方法來改變所述奈米碳管結構的表面極性，從而使得該培養神經細胞的方法比較簡單。
當所述培養基體由所述載體及奈米碳管結構組成，且該載體為面狀結構時，該培養基體還可置於一可以用來直接培養神經細胞的容器中，如塑膠表面皿或塑膠培養皿等。此時，該步驟B包括步驟：提供所述容器，並將所述培養基體置於該容器中，且所述載體的表面與該容器的表面直接接觸；對所述容器及培養基體進行滅菌處理；以及採用多聚賴氨酸溶液或聚醚亞醯胺溶液處理所述滅菌後的奈米碳管結構。
可以理解，該步驟B的實施方法不限，只要能夠使得所述奈米碳管結構的表面具有一定的極性，可以吸附神經細胞即可。
步驟C可以包括以下步驟：
C1，於所述奈米碳管結構的極性化表面種植所述複數神經細胞。具體地，於所述奈米碳管結構的極性化表面滴加神經細胞液直到該神經細胞液覆蓋該奈米碳管結構的極性化表面，從而使神經細胞液中的神經細胞種植於所述培養基體的表面。當所述奈米碳管結構中的奈米碳管線之間的間距大於等於神經細胞的直徑時，種植在該培養基體表面的神經細胞吸附於所述載體的表面。所述神經細胞包括哺乳動物的神經細胞，如，海馬神經細胞。其中，種植於所述培養基體表面的神經細胞為未分化的神經細胞，該未分化的神經細胞分散在一種植液中形成所述神經細胞液。
C2，培養種植於所述奈米碳管結構的極性化表面的神經細胞。具體地，將種植有所述神經細胞的培養基體置於一二氧化碳培養箱中培養，並適時更換一飼養液。所述二氧化碳培養箱中的二氧化碳含量大致為5%，溫度大致為37攝氏度。其中，所述神經細胞的培養環境應儘量模擬該神經細胞在生物體內的生存環境。所述神經細胞的培養時間可根據實際需求而定。在該步驟D中，於所述奈米碳管結構中的奈米碳管線的引導下，所述複數神經細胞的神經突起不斷從神經細胞的胞體中生長延伸出來，並沿著所述奈米碳管線的延伸方向生長，從而實現神經細胞的定向生長。在步驟D的環境下，所述神經細胞在經過培養之後達到成熟狀態，該神經細胞分化出的神經突起會定向生長，並且相鄰之神經突起相互連接在一起。
其中，當所述培養基體直接植入體內的受損部位並用來培養神經細胞時，所述步驟C可以為：在無菌條件下，二氧化碳含量大致為5%，溫度大致為37攝氏度的環境中，適時更換一飼養液，使得所述神經細胞的神經突起基本沿著奈米碳管線的軸向生長，直到受損部位的兩端或邊緣重新建立聯繫。
本實施例使用上述培養基體10培養神經細胞的方法具體包括以下步驟：
提供所述培養基體10，該培養基體10係由塑膠圓片載體14和單層奈米碳管膜組成的奈米碳管結構12組成。該奈米碳管結構12中相鄰之奈米碳管線之間的間距大於等於30微米，且小於等於60微米，奈米碳管線的直徑大於1微米，且小於等於10微米。
將上述培養基體10固定於一塑膠培養皿的底部，其中，所述塑膠圓片載體14與所述塑膠培養皿的底部接觸。在一紫外滅菌箱中對所述塑膠培養皿及置於該培養皿中的培養基體10進行紫外照射，大約照射0.5小時。在經過滅菌處理後的奈米碳管結構12的表面滴入濃度大約為20微克/毫升的具有多聚賴氨酸溶液，使得該多聚賴氨酸溶液完全覆蓋所述奈米碳管結構12的表面，並且放置12小時。採用去離子水沖洗掉該多聚賴氨酸溶液，使得該奈米碳管結構12的表面被極化，該奈米碳管結構12被極化的表面具有與待種植的海馬神經細胞相反的電荷極性。
在無菌條件下，於所述奈米碳管結構12被極化的表面滴加一海馬神經細胞液直到該海馬神經細胞液覆蓋該奈米碳管結構12，使得海馬神經細胞液中的海馬神經細胞吸附於所述塑膠圓片載體14的表面。
將培養有所述海馬神經細胞的培養皿置於一二氧化碳培養箱中培養7天左右，並適時更換飼養液。所述二氧化碳培養箱中的二氧化碳含量大致為5%，溫度大致為37攝氏度。其中，按照上述使用方法培養出的神經細胞的電子顯微鏡照片如圖4所示。
請參閱圖9，本發明第二實施例提供一培養基體20，該培養基體20由一奈米碳管結構22及承載該奈米碳管結構22的塑膠圓片載體14組成。該培養基體20的結構與第一實施例提供之培養基體10的不同之處在於，該奈米碳管結構22由兩層層疊設置的奈米碳管膜組成，每個奈米碳管膜中包括複數基本沿同一方向延伸的奈米碳管線123，且該複數奈米碳管線123並排且間隔設置，相鄰之奈米碳管線123之間搭接有至少一個奈米碳管。該兩層奈米碳管膜120中的奈米碳管線123交叉形成90度的夾角，因此，該奈米碳管結構22形成一網格狀結構。該奈米碳管結構22中相鄰且間隔設置的奈米碳管線123的間距大於等於30微米，且小於等於80微米，奈米碳管線123的直徑大於1微米，且小於等於10微米。
所述培養基體20之製備方法包括以下步驟：提供由兩層層疊設置的奈米碳管拉膜組成的奈米碳管結構預製體，該兩層奈米碳管拉膜中的奈米碳管相互交叉形成一大致為90度的夾角；將該奈米碳管結構預製體固定在一中間鏤空的框架上，使該奈米碳管結構懸空設置；將酒精置於一美工噴霧器中，酒精在通過該美工噴霧器噴出的過程中被霧化成幾微米的酒精液滴；該酒精液滴在較弱的氣流的攜帶下輕輕噴塗在該奈米碳管結構預製體的表面，浸潤該奈米碳管結構預製體；待酒精揮發後奈米碳管預製體中的大部分奈米碳管收縮成奈米碳管線，從而得到所述奈米碳管結構，其中，由一個奈米碳管拉膜形成的奈米碳管線與另一個奈米碳管拉膜形成的奈米碳管線相互交叉形成一大致為90度的夾角；將該奈米碳管結構剪成圓形，然後放置在一塑膠圓片上；將酒精滴在置於該塑膠圓片上的奈米碳管結構上浸潤該奈米碳管結構；待酒精揮發後，該奈米碳管結構緊密吸附於所述塑膠圓片的表面。
使用上述培養基體20培養神經細胞的方法與第一實施例提供之使用培養基體10培養神經細胞的方法的不同之處在於，請參閱圖10，由於該培養基體20中的奈米碳管結構22包括兩個奈米碳管膜，且該兩個奈米碳管膜中的奈米碳管線相互交叉形成大致為90度的夾角，即該奈米碳管結構22為網格狀結構，在使用該培養基體20培養神經細胞的過程中，所述神經細胞被吸附於所述塑膠圓片載體14上，其神經突起在該奈米碳管結構22中的網格狀結構的引導下，基本上沿著網格狀結構中的網格生長。因此，使用該培養基體20培養得到的神經細胞的神經突起係呈一定形狀的折線。
由此可見，本發明的培養基體在控制神經細胞的神經突起之生長方向方面具有顯著的效果。
需要說明的係，本文中所述“培養神經細胞”主要係指培養神經細胞的神經突起；“神經細胞的直徑”主要係指神經細胞的胞體的有效直徑；“神經細胞的生長”主要係指“該神經細胞的神經突起的生長”。
請參閱圖11，本發明第三實施例提供一培養基體30，該培養基體30包括一奈米碳管結構12、一載體34以及一容器36。該培養基體30與第一實施例提供之培養基體10的不同之處在於，該培養基體30進一步包括所述容器36，該容器36為用於放置層疊設置的奈米碳管結構12及載體34的器皿。所述載體34為面狀結構且夾持於所述奈米碳管結構12及該容器36之間。所述容器36為培養皿或表面皿，優選地，該容器36的材料為塑膠，如聚苯乙烯。本實施例中，所述載體34為圓片狀的聚苯乙烯，該載體34與所述容器36通過一黏膠層固定在一起。由於該培養基體30中的容器36為可以直接用來培養神經細胞的器皿，所以當使用該培養基體30培養神經細胞時，不需要另外的器皿輔助培養神經細胞，而且便於實際操作，另外，該培養基體30包括所述容器36，也使得該培養基體30便於運輸和儲存。
上述培養基體30的製備方法與第一實施例提供之培養基體10的製備方法基本相同，不同之處在於，該培養基體30的製備方法在培養基體10的製備方法中的步驟S140之後，進一步包括步驟S350，將形成有奈米碳管結構的載體固定於所述容器中。具體地，首先，提供所述容器，並在該容器的內表面設置一黏膠層；其次，將所述載體遠離所述奈米碳管結構的表面置於所述黏膠層上；然後，真空加熱乾燥該容器及置於該容器內的載體及奈米碳管結構，以去除黏膠層中的有毒物質。其中，應確保所述容器、載體及奈米碳管結構在上述真空加熱過程中，不會發生熔化或變形等，優選地，該真空加熱的溫度小於等於95度。真空加熱的時間可以根據實際情況確定。
本實施例中，提供一塑膠培養皿，並在該塑膠培養皿的底部的內表面上滴加黏膠，形成黏膠層；將固定有奈米碳管結構的方形聚苯乙烯載體置於所述塑膠培養皿中的黏膠層上；將該塑膠培養皿連同方形聚苯乙烯及奈米碳管結構置於一真空加熱箱中，加熱溫度為80攝氏度～95攝氏度時，加熱30分鐘左右；然後自然冷卻至室溫。
該步驟S350可以使得所述載體與容器緊密結合在一起，而且可以去除所述奈米碳管結構與載體之間可能存在的氣泡，從而可以使所述奈米碳管結構更加牢固地固定於所述載體的表面。
使用上述培養基體30培養神經細胞的方法與使用第一實施例提供之培養基體10培養神經細胞的方法基本相同。在使用該培養基體30培養神經細胞的過程中，種植的神經細胞在該奈米碳管結構中的奈米碳管線的引導下，分化出的神經突起沿著奈米碳管線呈直線形生長。
請參閱圖12，本發明實施例還提供一種神經移植體100，該神經移植體100包括所述培養基體110及吸附於培養基體110表面的神經網路130。該培養基體110包括生物載體114及設置在該生物載體114表面的奈米碳管結構12。該奈米碳管結構12可以包括至少一個奈米碳管膜，每個奈米碳管膜包括複數間隔或交叉的奈米碳管線；即，該奈米碳管結構12包括複數奈米碳管線123，該複數奈米碳管線123按照一定的方式排列，使得該奈米碳管結構12圖案化。該神經網路130包括複數神經細胞132，每個神經細胞132包括至少一個神經突起134。該複數神經細胞132吸附於所述生物載體114的表面。所述神經細胞的神經突起134沿著所述奈米碳管線123延伸，形成圖案化的神經突起134。其中，所述生物載體114的材料為矽膠或生物降解材料等可以與生物體相容的材料。可以理解，通過控制所述奈米碳管結構12的圖案即奈米碳管線123的延伸方向，可以使神經突起134的形狀為直線形、折線形、四邊形、扇形或其他曲線形。因此，可以根據生物體受損部位的形狀控制所述奈米碳管結構12的圖案，從而使得神經突起134按照預定的路線生長，進而使得所述神經移植體100中的神經網路130能夠快速地與受損部位的兩端或邊緣建立聯繫，完成受損部位的修復。
本實施例中，該神經移植體100由矽膠基底、設置在該矽膠基底上的單層奈米碳管膜以及吸附於該矽膠基底的海馬神經網路構成。該奈米碳管膜中的複數奈米碳管線基本平行且並排設置，且該複數奈米碳管線的軸向基本沿同一方向延伸。因此，該海馬神經網路中的大部分海馬神經細胞的神經突起沿著該複數奈米碳管線的軸向延伸形成直線形神經突起。
可以理解，當所述奈米碳管結構中的奈米碳管線形成扇形結構時，所述神經突起也可以形成扇形。
由本發明實施例提供之培養基體包括所述奈米碳管結構，該奈米碳管結構中的奈米碳管膜包括複數相互平行的奈米碳管線，該奈米碳管線可以引導神經細胞的神經突起的生長，因此，本發明實施例提供之使用所述培養基體培養神經細胞的方法，可以培養定向生長的神經細胞。可以實現通過控制所述奈米碳管結構中的奈米碳管線的排列方式，使所述神經細胞的神經突起按照預定的圖案生長。當該培養基體可以直接植入體內時，可以使得神經細胞按照受損部位兩端或邊緣的神經細胞快速重新建立聯繫，較快的完成受損部位的修復。
此外，本發明實施例係通過採用揮發性溶劑處理奈米碳管結構，使該奈米碳管結構具有複數奈米碳管線的方法來製備上述培養基體的，因此，本發明實施例提供之培養基體的製備方法比較簡單。
綜上所述，本發明確已符合發明專利之要件，遂依法提出專利申請。惟，以上所述者僅為本發明之較佳實施例，自不能以此限制本案之申請專利範圍。舉凡熟悉本案技藝之人士援依本發明之精神所作之等效修飾或變化，皆應涵蓋於以下申請專利範圍內。
10；20；30；110．．．培養基體
100．．．神經移植體
114．．．生物載體
12；22．．．奈米碳管結構
14；34．．．載體
120．．．奈米碳管膜
123．．．奈米碳管線
130．．．神經網路
132．．．神經細胞
134．．．神經突起
36．．．容器
圖1為本發明第一實施例所提供之培養基體的結構示意圖。
圖2為本發明第一實施例採用的一個奈米碳管膜之掃描電鏡照片。
圖3為本發明第一實施例採用的複數層疊的奈米碳管膜之掃描電鏡照片。
圖4為使用本發明第一實施例所提供之培養基體培養的神經細胞經過染色之後的掃描電鏡照片。
圖5為本發明第一實施提供之培養基體的製備流程圖。
圖6為本發明第一實施例提供之培養基體的製備方法中採用的一奈米碳管拉膜之掃描電鏡照片。
圖7為本發明第一實施例提供之培養基體的製備方法中採用的複數層疊的奈米碳管拉膜之掃描電鏡照片。
圖8為使用本發明第一實施提供之培養基體培養神經細胞的製備流程圖。
圖9為本發明第二實施例所提供之培養基體的結構示意圖。
圖10為使用本發明第二實施例所提供之培養基體培養的神經細胞經過染色之後的掃描電鏡照片。
圖11為本發明第三實施例所提供之培養基體的結構示意圖。
圖12為本發明實施例提供之使用所述培養基體的神經移植體之結構示意圖。

权利要求:
Claims (16)
[1] 一種培養基體的使用方法，該培養基體用於培養神經細胞，該使用方法包括：提供一培養基體，該培養基體包括一載體及一形成在該載體表面的奈米碳管結構，該奈米碳管結構包括複數間隔設置的奈米碳管線，且相鄰之奈米碳管線之間的間距大於等於待培養的神經突起之直徑；對所述奈米碳管結構進行極性化處理，使該奈米碳管結構具有一極性化表面；以及於所述奈米碳管結構的極性化表面培養所述神經細胞，使得該神經細胞的神經突起沿著所述複數奈米碳管線生長。
[2] 如申請專利範圍第1項所述之培養基體的使用方法，其中，所述奈米碳管線包括複數奈米碳管，該複數奈米碳管沿同一方向排列且通過凡得瓦力首尾相連。
[3] 如申請專利範圍第1項所述之培養基體的使用方法，其中，所述奈米碳管線包括複數奈米碳管，該複數奈米碳管沿該奈米碳管線的軸向螺旋延伸。
[4] 如申請專利範圍第1項所述之培養基體的使用方法，其中，所述複數奈米碳管線平行設置，且相鄰之奈米碳管線之間搭接至少一個奈米碳管，該至少一個奈米碳管通過凡得瓦力連接該相鄰之奈米碳管線，從而使得該複數奈米碳管線形成一奈米碳管膜。
[5] 如申請專利範圍第4項所述之培養基體的使用方法，其中，所述奈米碳管結構包括複數奈米碳管膜，且相鄰之奈米碳管膜中的奈米碳管線形成一交叉角，該交叉角大於等於0度，且小於等於90度。
[6] 如申請專利範圍第1項所述之培養基體的使用方法，其中，所述奈米碳管線的直徑大於等於1微米，且小於等於10微米。
[7] 如申請專利範圍第1項所述之培養基體的使用方法，其中，所述相鄰之奈米碳管線之間的間距大於等於20微米，且小於等於100微米。
[8] 如申請專利範圍第1項所述之培養基體的使用方法，其中，對所述奈米碳管結構進行極性化處理的步驟包括：對所述奈米碳管結構進行滅菌處理；以及採用多聚賴氨酸溶液或聚醚亞醯胺溶液處理所述滅菌後的奈米碳管結構。
[9] 如申請專利範圍第8項所述之培養基體的使用方法，其中，對所述奈米碳管結構進行滅菌處理的步驟為：採用紫外光照射所述奈米碳管結構。
[10] 如申請專利範圍第8項所述之培養基體的使用方法，其中，採用多聚賴氨酸溶液或聚醚亞醯胺溶液處理所述滅菌後的奈米碳管結構的步驟為：將滅菌後的奈米碳管結構浸泡於所述多聚賴氨酸溶液或聚醚亞醯胺溶液中；以及用滅菌後的去離子水清洗浸泡過的奈米碳管結構以去除形成在該奈米碳管結構表面的多聚賴氨酸溶液或聚醚亞醯胺溶液。
[11] 如申請專利範圍第1項所述之培養基體的使用方法，其中，所述培養基體由面狀結構的載體及奈米碳管結構組成，所述對奈米碳管結構進行極性化處理的步驟包括：提供一容器，並將所述培養基體置於該容器中，且所述載體設置於該容器與所述奈米碳管結構之間；對所述容器及培養基體進行滅菌處理；以及採用多聚賴氨酸溶液或聚醚亞醯胺溶液處理所述滅菌後的奈米碳管結構。
[12] 如申請專利範圍第1項所述之培養基體的使用方法，其中，於所述奈米碳管結構的極性化表面培養所述神經細胞的步驟包括：於所述奈米碳管結構的極性化表面種植所述神經細胞；以及培養種植於所述奈米碳管結構的極性化表面的神經細胞。
[13] 如申請專利範圍第1項所述之培養基體的使用方法，其中，所述載體的材料為塑膠、矽膠、奈米碳管片材或生物降解材料。
[14] 如申請專利範圍第1項所述之培養基體的使用方法，其中，所述培養基體進一步包括一容器，所述載體遠離奈米碳管結構的表面固定於該容器的表面。
[15] 如申請專利範圍第13項所述之培養基體的使用方法，其中，所述容器為培養皿或表面皿。
[16] 一種培養基體的使用方法，該培養基體用於培養神經細胞，該使用方法包括：提供一培養基體，該培養基體包括一載體及一形成在該載體表面的奈米碳管結構，該奈米碳管結構包括複數奈米碳管線，該複數奈米碳管線相互交叉形成複數孔，且每個孔的有效直徑大於等於待培養的神經突起之直徑；對所述奈米碳管結構進行極性化處理，使該奈米碳管結構具有一極性化表面；以及於所述奈米碳管結構的極性化表面培養所述神經細胞，使得該神經細胞的神經突起沿著所述複數奈米碳管線生長。

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