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    本發明揭示一種人類凝血因子VII之量產方法。該方法包括a)建構一種表現載體，其攜帶：i)二氫葉酸還原酶啟動子，係於其富含GC之區域缺少一個或多個CCGCCC重複序列，以及與其操作性連接的二氫葉酸還原酶(DHFR)基因，及ii)巨細胞病毒(CMV)啟動子，以及與其操作性連接的人類凝血因子VII；b)將步驟a)之表現載體轉染至動物細胞株；c)在二氫葉酸還原酶抑制劑存在下培養步驟b)之經轉染之動物細胞株，以選擇高效率表現人類凝血因子VII之細胞；以及d)添加丁酸鈉至步驟c)之經選擇之動物細胞，而獲得量產人類凝血因子VII之細胞株。利用攜帶著缺少富含GC之重複序列的DHFR啟動子之載體，該方法可高效率地大規模生產人類凝血因子VII，而對於血友病之治療有貢獻。
    公开号:TW201307382A
    申请号:TW100138824
    申请日:2011-10-26
    公开日:2013-02-16
    发明作者:Chang-Hwan Kim；Sung-Kap Hong；Byung-Sun Lee；Sung-Hwan Hong；Se-Chang Kwon
    申请人:Hanmi Science Co Ltd；
    IPC主号:C12N9-00
    专利说明:
    因子VII/VIIA之量產方法
    本發明係關於一種人類凝血因子VII(human coagulation factor VII)之量產方法，其包括：a)建構一種表現載體，其攜帶：i)二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase)啟動子，係於其富含GC之區域缺少一個或多個CCGCCC重複序列，以及與其操作性連接的二氫葉酸還原酶(DHFR)基因，及ii)巨細胞病毒(CMV)啟動子，以及與其操作性連接的人類凝血因子VII；b)將步驟a)之表現載體轉染(transfect)至動物細胞株；c)在二氫葉酸還原酶抑制劑存在下培養步驟b)之經轉染之動物細胞株，以選擇高效率表現人類凝血因子VII之細胞；以及d)添加丁酸鈉至步驟c)之經選擇之動物細胞，而獲得量產人類凝血因子VII之細胞株。
    凝血因子VII(FVII)為絲胺酸蛋白酶之前驅物，係於其活化凝血因子X或因子IX處導致血液在凝結級聯機制(coagulation cascade)中凝結成塊(clot)。肝臟生產之FVII為一種由單鏈組成之醣蛋白，其分子量為50,000道耳吞(Da)。當FVII經由不同蛋白酶(其中有因子Xa、因子XIIa、因子IXa及凝血酶(thrombin))分解為兩鏈時，FVII自身活化為活化態，FVIIa。FVII亦藉由結合至組織因子及帶有負電荷之磷脂質A而活化為FVIIa(Nemerson et al,Thromb. Res,1985,40:351~358)。
    在組織因子及鈣離子存在下，FVIIa將因子X活化成因子Xa，接著，在鈣離子及磷脂質存在下，藉由因子Va之幫助將凝血酶原(prothrombin)轉化為凝血酶，以進行凝血。
    因子VII，由406個胺基酸組成，其精胺酸152與異白胺酸153間之肽鍵被裂解而形成因子VIIa，而因子VIIa之輕鏈(152個胺基酸)及重鏈(254個胺基酸)係經由雙硫鍵維持在一起。該輕鏈包括一個γ-羧基麩胺酸域(domain)及兩個EGF(表皮生長因子)域，同時，該重鏈則負責絲胺酸蛋白酶活性。
    為了使因子VII完全功能化，其必須經過10個N端麩胺酸殘基之γ-羧酸化，此係一種維生素K依賴性過程(Hagen et al,Natl. Acad. SC. U. S. A,1986,83:2412~2416)。此Gla域已知與因子VII結合至含有組織因子之細胞表面有關(Salai et al,J. Biol. Chem,1990,265: 1890~1894)。
    至今，因子VIIa之生產有兩個途徑。其一為自血漿單離及純化因子VII並將之活化為VIIa(Broze et al,J. Biol. Chem,1980,225:1242~1247)。另一個途徑為基因工程技術，係培養經轉形(transform)因子VII之DNA序列之細胞來生產因子VII(歐洲專利申請第86302855.1號)。
    血漿衍生因子VIIa之缺點為低生產量及缺乏供應之一致性。此因子之具體問題為其對於人體之安全性有風險存在。相反地，該基因重組產物則被認為克服了該血漿衍生產物之缺陷。
    然而，藉由基因重組生產因子VII之動物細胞通常具有低表現量，使得該細胞僅可保證低生產力。因此，為了使因子VII被用來作為治療試劑，必須確保可穩定量產該因子之細胞株。於本文中，具有高表現效率之表現載體是不可或缺的。
    談到本發明，係本發明之發明者透過密集研究而完成因子VII之量產方法，其成果係經由一連串實驗測量該表現載體轉染至動物細胞株而提供單一細胞轉形株(transformant)，以及當該單一細胞轉形株培養於廣泛濃度範圍之丁酸鈉時，其中，因子VII之表現量於相對高濃度之丁酸鈉中顯著地增加，而發現一種攜帶著缺少富含GC之重複序列之二氫葉酸還原酶(DHFR)啟動子，使動物細胞轉形成能高效率地穩定表現因子VII之表現載體。
    本發明之一個目的為提供一種因子VII之生產方法，其包括：a)建構一種表現載體，其攜帶：i)二氫葉酸還原酶啟動子，係於其富含GC之區域缺少一個或多個CCGCCC重複序列，以及與其操作性連接的二氫葉酸還原酶(DHFR)基因，及ii)巨細胞病毒(CMV)啟動子，以及與其操作性連接的人類凝血因子VII；b)將步驟a)之表現載體轉染至動物細胞株；c)在二氫葉酸還原酶抑制劑存在下培養步驟b)之經轉染之動物細胞株，以選擇高效率表現人類凝血因子VII之細胞；以及d)添加丁酸鈉至步驟c)之經選擇之動物細胞。
    本發明之另一個目的為提供生產因子VII之細胞株。
    利用攜帶著缺少富含GC之重複序列之DHFR啟動子之載體，本發明可高效率地量產人類凝血因子VII，而對於血友病之治療有貢獻。
    根據其觀點，本發明係提供一種人類凝血因子VII之量產方法，其包括：a)建構一種表現載體，其攜帶：i)二氫葉酸還原酶啟動子，係於其富含GC之區域缺少一個或多個CCGCCC重複序列，以及與其操作性連接的二氫葉酸還原酶(DHFR)基因，及ii)巨細胞病毒(CMV)啟動子，以及與其操作性連接的人類凝血因子VII；b)將步驟a)之表現載體轉染至動物細胞株；c)在二氫葉酸還原酶抑制劑存在下培養步驟b)之經轉染之動物細胞株，以選擇高效率表現人類凝血因子VII之細胞；以及d)添加丁酸鈉至步驟c)之經選擇之動物細胞。
    較佳地，步驟a)關於建構一種表現載體，其攜帶：i)二氫葉酸還原酶啟動子，係於其富含GC之區域缺少一個或多個CCGCCC重複序列，以及與其操作性連接的二氫葉酸還原酶(DHFR)基因，及ii)巨細胞病毒(CMV)啟動子，以及與其操作性連接的人類凝血因子VII。
    本文中所使用之術語「富含GC之區域」意指二氫葉酸還原酶啟動子中重複之CCGCCC序列。當此重複序列的所有或部分序列經由缺失(deletion)或突變而人工地造成缺陷，二氫葉酸還原酶之表現量為最小值。此時，二氫葉酸抑制劑會引起細胞更高頻率地擴增二氫葉酸還原酶基因以利生存，藉此促使由含有二氫葉酸還原酶基因之表現載體所攜帶之有興趣的基因高度表現。
    根據其具體實例，因此，本發明係提供一種高度表現誘發匣(cassette)，其包括缺少一個或多個CCGCCC重複序列之二氫葉酸還原酶啟動子及二氫葉酸還原酶基因。較佳地，該高度表現誘發匣包括該CCGCCC重複序列為重複六次或更少，更佳為三次或更少，具體更佳為一次或更少，及最佳為當缺少該序列時之二氫葉酸還原酶啟動子。
    這些CCGCCC重複序列之去除可藉由本領域中已知之基因重組置換或缺失技術而完成。於本發明之一具體實例中，有一部分的含有該CCGCCC重複序列之鹼基序列被刪除以自該啟動子去除一部分或所有富含GC之區域。
    本文中所使用之術語「二氫葉酸還原酶」意指以NADPH作為電子供給者(electron donor)而將二氫葉酸還原成四氫葉酸之酶。在人類中，由DHFR基因編碼該酶。
    本文中所使用之術語「人類凝血因子」或僅「因子」意指出血後與凝血作用有關進而提供保護之蛋白質。術語「凝血」意指一種血液形成凝塊並由12種因子參與之複雜機制。本發明係涉及因子VII之量產。
    本文中所使用之術語「因子VII」意指一種分子量為50,000 Da之熱不穩定蛋白質，亦已知為肝臟中製造之前轉化素(proconvertin)，且其在血清中之含量範圍係自20至40mg/mL。為了用於凝血，因子VII需活化為活化態，即，因子VIIa。由與野生型因子VII基因有70%或更多，較佳為80%或更多，更佳為90%或更多，又更佳為95%或更多，以及最佳為97%或更多之序列同源性(homology)之基因所編碼之因子VII係在本發明範圍內。較佳為由序列編號3之基因所編碼之因子VII。
    本文中所使用之術語「載體」意指任何用於選殖(cloning)及/或傳送核酸進入宿主細胞之媒介物(vehicle)。載體可為附加至另一DNA片段進而引起該附加片段複製之複製子(replicon)。「複製子」意指任何具有作為體內(in vivo)DNA複製之自發性單元的功能之基因片段(例如：質體、噬菌體、黏質體(cosmid)、染色體、病毒)，即，其具有自我控制複製之能力。術語「載體」包含將核酸引進試管內(in vitro)、體外(ex vivo)、或體內之宿主細胞之病毒及非病毒媒介物兩者。術語「載體」亦可包含微型環狀DNA。例如，載體可為無細菌DNA序列之質體。已顯示去除富含於CpG區域內之細菌DNA序列以減少轉殖基因表現之靜默(silencing)及造成更多來自質體DNA載體之持續表現(見例如，Ehrhardt,A. et al.(2003)Hum Gene Ther 10: 215-25；以及，Yet,N.S.(2002)MoI Ther 5:731-38;Chen,Z. Y. et al.(2004)Gene Ther 11: 856-64)。術語「載體」亦可包含跳躍子(transposons)，如睡美人跳躍子(Sleeping beauty)(Izsvak et al. J. MoI. Biol. 302: 93-102(2000))、或人工染色體。本文中所使用之「表現載體」意指可高效率表現有興趣之蛋白質(例如，本文之因子)之載體。於本文中，該表現載體含有i)二氫葉酸還原酶啟動子，係於其富含GC之區域缺少一個或多個CCGCCC重複序列，以及與其操作性連接的二氫葉酸還原酶(DHFR)基因。較佳地，該表現載體可為第1圖所示之pX0GC-FVII。用於本發明之表現載體之實例包含質體、黏質體、噬菌體、腺病毒載體、反轉錄病毒載體、及腺病毒相關病毒載體，較佳為質體。
    較佳地，該表現載體可進一步包含編碼人類凝血因子VII之基因。人類凝血因子VII可經由表現該表現載體而被高度表現。
    人類凝血因子VII可於DHFR基因啟動子調控下或一獨立啟動子調控下被表現。較佳地，人類凝血因子VII可放置於獨立啟動子調控下。此種啟動子包含本領域廣知者，且此種啟動子之非限制性實例包含巨細胞病毒(CMV)啟動子、LTR啟動子、EFα啟動子、SV40啟動子及TK啟動子。本領域中之技術人員可輕易自上述啟動子所組成之群組中任意選擇其一。
    本發明之表現質體，係被提供用於誘發人類凝血因子VII基因於動物細胞內高度表現，較佳地，係進一步包含動物細胞之抗性基因(resistance gene)，該抗性基因係用來作為人類凝血因子VII基因永久表現於動物細胞內之選擇性標誌(slectable marker)。此種用於動物細胞之抗性基因之非限制性實例包含本領域慣用者，如新黴素(neomycin)抗性基因、博萊黴素(zeomycin)抗性基因、潮黴素(hygromycin)抗性基因、及芽生菌素(balstomycin)抗性基因。
    同樣地，本發明之表現載體可進一步包含載體之一般組成元件，如複製起始點及多腺嘌呤化訊號(polyadenylation signal)、及其它轉錄控制要素，但並不限制於此。
    較佳地，步驟b)係關於動物細胞株與步驟a)之表現載體之轉形(transformation)。
    本文中所使用之所有文法形式及拼字多樣性之術語「轉形」或「轉染」意指因外來基因引進宿主細胞，造成細胞之人工地基因改變，進而使該被引進之基因可自行複製或作為因子嵌入染色體再複製。
    可使用本領域中已知之適合的標準技術將本發明之質體引進宿主細胞，該技術之實例包含電穿孔(electroporation)、磷酸鈣共沉澱、反轉錄病毒感染、微注射(microinjection)、DEAE-葡聚糖、及陽離子性微粒體鈣，但並不限制於此。
    於本文中，例如，將攜帶重組基因之表現載體經由脂質體(lipofectamine)之幫助而轉形進入CHO細胞。
    使用適合的本領域中任何已知之培養基及培養條件可完成培養動物細胞株之步驟。本領域中之技術人員可輕易地調控該培養步驟以因應所使用之細胞品系。例如，根據細胞的生長型式，可能是分批型(batch type)、連續型、分批補料型(fed-batch type)，該步驟可包含懸浮(suspension)培養法或貼壁(attachment)培養法。該培養基必須適當的符合細胞株生長之特定需求。
    動物細胞之培養基可含有碳源、氮源及微量元素。碳源之實例包含碳水化合物，如：葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、澱粉及纖維素；油及脂肪，如：花生油、葵花油、蓖麻油(castor oil)及椰子油；脂肪酸，如：棕櫚酸、硬脂酸及亞麻油酸；醇，如：甘油及乙醇；以及有機酸，如：醋酸。這些碳源可單獨存在或以組合方式存在於該培養基。關於氮源，培養基內可含有有機材料，如：蛋白腖(peptone)、酵母菌萃取物、肉汁(broth)、麥芽萃取物、玉米浸液(corn steeo liquor)(CSL)及黃豆；或是無機氮化合物，如：尿素、硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨及硝酸銨。這些氮源可單獨存在或以組合方式存在。另外，培養基可含有胺基酸、維生素及適合的前驅物。
    此外，該培養基可補充DHFR抑制劑，如甲胺蝶呤(methotrexate)。即，如上所述，由於本發明係著眼於短時間內有效地建立一種系統，係以本發明之表現載體轉形DHFR-缺陷之動物細胞，並投予該細胞DHFR抑制劑，經由擴增並選擇已攜帶DHFR基因之載體，進而擴增重組基因。
    在一較佳實例中，為了生產成本及細胞株穩定性之目的，所使用之DHFR抑制劑之濃度較佳為短時間內越低越好。即，使用低濃度之DHFR抑制劑確保有興趣之該蛋白質穩定量產，且減少其作用表現於細胞株上之時間。具體而言，本發明係提供一種藉由將該重組蛋白質表現載體轉形至DHFR-缺陷之CHO細胞並投予該細胞小於100nM之甲胺蝶呤，較佳為小於50nM之甲胺蝶呤，以生產人類凝血因子VII之方法。
    該有興趣之重組蛋白質需要以動物細胞表現。鑑於本發明之目的，適合之動物細胞實例包含中國倉鼠卵巢細胞瘤(CHO)細胞、猴子腎細胞(COS7)、NSO細胞、SP2/0細胞、W138細胞、倉鼠嬰兒腎(BHK)細胞、MDCK細胞、骨髓瘤細胞、HuT 78細胞及293細胞，但並不限制於此。本領域之技術人員可輕易地根據本發明選擇適合用於該DHFR為基準之擴增系統的動物細胞株。於本發明中，較佳可為二氫葉酸還原酶有缺陷之細胞。
    本文中所使用之術語「轉形重組載體之宿主細胞」意指攜帶著有興趣基因之重組載體所嵌入(anchor)之宿主細胞。適合用於本發明之宿主細胞可為源自齧齒類細胞或哺乳類細胞，較佳為動物細胞或動物衍生細胞，及最佳為CHO細胞。當本目的為穩定表現有興趣基因及擴增該基因於細胞內之套數(copy number)時，可引進對於DHFR缺陷有補償作用之具有DHFR基因之載體(例如：pCHOI)至核酸生成路徑有缺陷之CHO細胞，並以甲胺蝶呤(MTX)擴增。
    本發明中之術語「宿主」包含動物。談到動物，可利用使用哺乳類或昆蟲類之多種生產系統。哺乳類包含山羊、豬、綿羊、小鼠及牛(Vicki Glaser,SPECTRUM Biotechnology Application,1993)。此外，哺乳類亦可包含基因轉殖動物。再者，蠶可用來作為宿主昆蟲。將蠶感染已插入編碼所欲蛋白質的DNA之桿狀病毒(baculovirus)。該所欲蛋白質可得自蠶之體液(Nature,Vol. 315,p. 592-594,1985)。較佳地，CHO細胞係用於作為本發明之宿主細胞。
    具體而言，係使用二氫葉酸還原酶有缺陷之中國倉鼠卵巢細胞瘤細胞株(CHO/dhfr-)。即，以本發明之攜帶著編碼凝血因子VII之基因的表現載體轉形至DHFR缺陷之CHO細胞。在經轉形之CHO細胞中，該基因被發現即使於甲胺蝶呤濃度小於100nM，及較佳為小於50nM，仍能擴增至足夠之套數。因此，本發明係提供此種動物細胞株。
    依照本發明，步驟c)係關於在二氫葉酸還原酶抑制劑存在下培養步驟b)之經轉形之動物細胞株，以選擇高效率表現因子VII之細胞株。
    更佳可為HMF708(KCTC 11779BP)。HMF708細胞株於2010年10月25日寄存於KCTC(Genetic Rosources Center,KRIBB,111 Gwahak-ro,Yuseong-gu,Daejeon,Korea)，其登錄號碼為11779BP(國內生物材料寄存編號為BCRC 960443)。該經選擇之細胞株被同化為使用無血清培養基(EX-CELL CHO培養基,Sigma,U.S.A.,Cat. No. 14360c)之懸浮培養。
    依照本發明，步驟d)係關於將丁酸鈉添加至步驟c)之經選擇之細胞株，以誘發因子VII之量產。
    丁酸鈉抑制組蛋白去乙醯酶(histone deacetylase)而造成組蛋白高度乙醯化。其在培養哺乳類細胞上有多種影響，包含分化及基因表現。於本發明中，該化合物係用來作為誘發因子VII量產之添加劑。在本文中，丁酸鈉之用量可輕易由本領域中之技術人員決定，且較佳為0.1至3.0mM之等級，更佳為0.1至1.5mM之等級。
    根據其實例，本發明提供兩種可誘發之高度表現匣，其一含有只有一個CCGCCC重複序列之DHFR啟動子，而另一個則不含該序列，且大腸桿菌(E. coli)細胞株係轉形這些匣。該等E. coli轉形株係於2006年10月2日寄存於KCTC(Korean Collection for Type Cultures；Genetic Resources Center,韓國生物科學及生物科技研究機構(KRIBB),Yuseong-gu,Daejeon,Korea)，其登錄號碼分別為KCTC 10991 BP及KCTC 10992 BP。為了誘發有興趣之重組蛋白質高度表現，將該等可誘發之高度表現匣自E. coli細胞株分離，並將之基因製作為攜帶著編碼人類凝血因子VII蛋白之基因，以建構重組表現載體。該pX0GC-FVII載體表示於第1圖，較佳可為使人類凝血因子VII蛋白生產於補充丁酸鈉之培養基中之CHO細胞內之表現載體。
    編碼根據本發明所生產之因子VII之鹼基序列較佳可為序列編號3之序列。
    人類凝血因子VII蛋白可在DHRF基因啟動子調控下或在分開之啟動子調控下表現。較佳地，人類凝血因子VII蛋白可放置在獨立啟動子調控下。這種啟動子可為本領域中習知者，且本領域之技術人員可輕易選自其中，例如，巨細胞病毒(CMV)啟動子、LTR啟動子、EFα啟動子、SV40啟動子及TK啟動子。
    當因子VII於上述細胞株中生產時，該方法可進一步包括大規模地純化因子VII。
    該方法亦可進一步包括將所生產之因子VII活化為因子VIIa。
    在本發明之一實例中，係使DHFR啟動子之富含GC之序列失活，進而將DHFR表現量降至最低，接著藉由添加DHFR抑制劑誘發DHFR基因以擴增該基因表現。為了獲得衍生自單一細胞之選殖群體(clonal population)，發生基因擴增之經轉形之細胞係經過限制稀釋。經此獲得之單一細胞株係大規模地培養於含有丁酸鈉之無血清培養基中以生產因子VII。此外，進行純化因子VII及活化因子VII。
    依照另一目的，本發明係提供生產人類凝血因子VII之細胞株。更佳可為HMF708(KCTC 11779)。 發明模式
    本發明之較佳理解可透過下列實施例說明而獲得，但本發明並不因此被限制。 [實施例] 實施例1：重組因子VII之表現載體(pX0GC-FVII)之建構 ＜1-1＞因子VII之擴增
    建構一表現載體以用於誘發重組因子VII在動物細胞中過度表現。含有訊號序列之人類因子VII基因係使用PCR(聚合酶鏈鎖反應)而獲得。使用序列編號1及2之前置及反置引子進行因子VII基因之擴增，並以人類胎兒肝臟cDNA庫(cDNA library)(購自Clontech USA，現合併至TAKARA BIO USA)作為模板(template)。為了選殖(cloning)之方便性，將該前置及反置引子設計成分別具有BamHI及XhoI限制酶切位(restriction enzyme sites)。這些引子為後文表1中所提供。
    將包括該cDNA庫(100奈克(ng))、該等引子、dNTP、及pFX聚合酶(Invitrogen)之混合物置於PCR管內，接著進行PCR，PCR之設置條件為起始於95℃，變性(denaturation)1分鐘，接著進行30個循環的95℃，歷時30秒的變性，於60℃黏合(annealing)30秒，及於68℃延展(extension)90秒，接著是於68℃延展5分鐘。經DNA定序(sequencing)鑑定由此而得之1.3kb長PCR產物具有序列編號3之鹼基序列。 ＜1-2＞重組因子VII之表現載體(pX0GC-FVII)之建構
    將實施例＜1-1＞中製備之因子VII的PCR產物與動物表現載體pX0GC接合(ligate)，以使該因子設置於CMV啟動子之調控下。該pX0GC載體為一種具有可與DHFR基因操作性連接之缺少一個或多個CCGCCC重複序列之DHFR啟動子的表現載體，進而誘發有興趣之重組蛋白高度表現(參照韓國專利第880509號)。
    經PCR所得之1.3kb長之因子VII基因係以BamHI及XhoI於37℃分解(digest)2小時，並使用PCR純化套組純化(Oiagen USA)。另外，亦將該動物表現載體pX0GC以相同限制酶，即，BamHI及XhoI，於上述相同條件下切割，並經由電泳法(electrophoresis)純化。這些DNA片段在T4 DNA接合酶存在下彼此接合，形成重組載體，命名為pX0GC-FVII。 實施例2：表現人類因子VII之細胞株之建立 ＜2-1＞細胞株之轉形作用
    為了製備可量產人類因子VII之細胞株，將實施例1中所建構之重組人類因子VII表現載體(pX0GC-FVII)引進CHO細胞內，該細胞因DHFR缺陷(CHO/dhfr-)而顯現不穩定之DNA合成(Urlaub et al.,Somat. Cell. Mol. Genet.,12,555-566,1986)。在此考量中，將DG44-CHO(dhfr缺陷)細胞(得自哥倫比亞大學的Dr. Chasin)培養於T75燒瓶(flask)中，且當細胞生長至佔據80至90匯集度(confluence)時，使用脂質體轉染細胞(Gibco,Cat. No. 18324-012)。在兩管中各放3mL Opti-MEM(Gibco,Cat. No. 51985034)。接著，此兩管分別接收5微克(mg)DNA及20μL脂質體，並靜置30分鐘。將這兩種溶液混合在一起，並將由此形成之DNA-脂質體複合物滴於已事先以Opti-MEM培養基清洗三次之細胞上。該細胞於37℃，5% CO2培養箱中培養18小時，以補充10%胎牛血清(BSA)之DMEM-F12(Gibco,Cat. No. 11330)清洗三次，並再次培養於培養基中48小時。當細胞生長至幾乎為完全匯集度時，經胰蛋白酶作用收集(harvest)該細胞。為了選擇轉形株，將該細胞播種至含有補充了經透析之10% FBS及1mg/mL G418(Cellgro,Cat. No. 61-234-RG)，但並未補充HT(次黃嘌呤-胸苷，Hypoxanthine-Thymidine)之MEM-α選擇性培養基(WELGENE,Cat. No. LM008-02)之新培養燒瓶中。該細胞以2或3天替換新鮮培養基直至經轉形之細胞存活且形成細胞群落(colony)。 ＜2-2＞使用酶免疫試驗鑑定人類因子VII表現
    將實施例＜2-1＞中之經轉形之細胞以2×104細胞/孔之密度種於24孔盤。當該細胞生長至幾乎為完全匯集度時，將補充了0.3mM丁酸鈉(Sigma,Cat. No. B5887)之無血清CHO-A-SFM(Gibco,Cat. No. 05-5072EF)以200μL/孔的量加入各孔，接著於33℃，5%CO2培養箱中培養48小時。將培養之細胞移至1.5mL試管並離心。根據廠商說明書使用酶免疫試驗套組(American Diagnostica,Cat. no. 877)測量上清液中人類因子VII的表現量。具體而言，將該細胞培養物及該套組所附之標準物質在含有0.05% Tween-20(商品名)之生理食鹽水中稀釋至某個濃度，且將該等稀釋液以100μL加至該套組之各孔，並使其於平盤振盪器(plate shaker)上在室溫反應1小時。待以該套組所附之清洗液清洗四次後，於平盤振盪器上，各孔以100μL抗人類因子VII抗體在室溫培養1小時。以該清洗液再次清洗各孔四次，接著以100μL之HRP(辣根過氧化酶)-接合抗體(HRP-conjugated antibodies)在室溫培養30分鐘，使該抗體接合至抗人類因子VII抗體。隨後，將那些孔清洗四次，各孔並以100μL受質培養於室溫。5分鐘後，各孔加入50μL終止液，接著測量於吸光值450nm。自標準液之各濃度獲得一標準曲線及函數，並獲得吸光值。該曲線係用來定量人類因子VII，指出表現出某種程度之人類因子VII之經選擇之細胞。 ＜2-3＞表現人類因子VII之細胞株之選擇
    為了增加實施例＜2-2＞中所鑑定之表現了人類因子VII之細胞中人類因子VII之表現量，將含有10nM MTX(甲胺蝶呤,Sigma,Cat. No. M8407)之培養基所選擇之細胞每三天繼代(passage)一次，於T75培養瓶中培養兩星期。將各孔中部分細胞移至24孔盤，並於確認人類因子VII之表現量前，使用與實施例＜2-2＞相同方式培養該細胞。由於人類因子VII之表現量於10nM或更高濃度並無增加，因此經由限制稀釋方法將單一細胞群落分離，以減少這點的異質性(heterogeneity)。即，具有異質性表現量之人類因子VII細胞群落被分開而成為其人類因子VII具有同源性表現量且顯示高度生產力之單一細胞群落。在此考量中，將經鑑定為6孔盤之細胞中顯示最高表現量之孔中的細胞，稀釋為96孔盤之每孔不多於一顆細胞之密度，且每孔只種1顆細胞，培養2至3星期。之後，將形成群落處之細胞自該盤分離，並於經由酶免疫試驗方法確認人類因子VII之表現量(第2圖)前次培養(subculture)該細胞。在經由該限制稀釋方法所分離之細胞株中，最後選擇出在10nM MTX之存在下顯現穩定增生特性及高度生產力之重組CHO細胞，並命名為HMF708。該HMF708品系於2010年10月25日寄存於KCTC(Genetic Resources Center,KRIBB,111 Gwahak-ro,Yuseong-gu,Daejeon,Korea)，其登錄號碼為11779BP。該經選擇之細胞株被同化為使用無血清培養基(EX-CELL CHO培養基,Sigma,U.S.A.,Cat. No. 14360c)之懸浮培養。 實施例3：在丁酸鈉存在下之細胞株生長及hVII量之測量(1) ＜3-1＞播種及主要培養
    自液態氮桶中取出在實施例＜2-3＞經選擇且經同化之懸浮培養之一小瓶(vial)(1×107顆細胞/mL)，且於37℃水浴中盡可能地快速解凍。待以插種培養基(補充了0.3g/L麩醯胺酸之EX-CELL CHO培養基(Sigma,Cat. No. 63225C))清洗一次後，將該細胞培養物以90×g離心5分鐘，接著接種於錐形瓶(Erlenmeyer flask)(Corning,USA cat#431144)中之50mL播種培養基。當於CO2培養箱(37℃，5% CO2)中生長1至2日至10×105顆細胞/mL時，以相同方式再次離心該細胞，接著次培養於新的錐形瓶內有之100mL新鮮的播種培養基。二倍體積繼代持續至有足夠的細胞數量。 ＜3-2＞在含有丁酸鈉之生產培養基中之細胞株生長及hFVII量之測量
    檢測丁酸鈉對於hFVII生產上之影響。為此，首先，將培養之重組CHO細胞株以5.0×106顆細胞/mL之密度接種於三個各有50mL生產培養基並分別含有濃度為0.3、1.0及1.5mM之丁酸鈉(Cat. no. B5887,Sigma,USA)之錐形瓶。將生長於0.3mM丁酸鈉存在下之細胞作為對照組用來比較。於30.0℃培養那些細胞四天以生產hFVII。到第4天，檢測該等細胞培養物之細胞濃度及細胞活性。在不同丁酸鈉濃度之細胞培養物中，細胞密度及細胞活性並無改變。
    此外，將第4天之細胞培養物離心後，使用如實施例＜2-2＞中所使用之酶免疫試驗方法測量上清液中hFVIII的量。測量係以相較於對照組的生產量%表示，並摘錄於下文表2中。
    由此可見，hFVIII之生產量係以丁酸鈉的劑量依賴方式增加。 實施例4：在丁酸鈉存在下之細胞株生長及hVII量之測量(2) ＜4-1＞播種及主要培養
    自液態氮桶中取出在實施例＜2-3＞中經選擇且經同化之懸浮培養之一小瓶(vial)(1×107顆細胞/mL)，且於37℃水浴中盡可能地快速解凍。待以播種培養基(補充了0.3g/L麩醯胺酸之EX-CELL CHO培養基(Sigma,Cat. No. 63225C))清洗一次後，將該細胞培養物以90×g離心5分鐘，接著接種於錐形瓶(Corning,USA cat#431144)中之50mL播種培養基。當於CO2培養箱(37℃，5% CO2)中生長1至2日至10×105顆細胞/mL時，以相同方式再次離心該細胞，接著次培養於新的錐形瓶內有之100mL新鮮的種細胞培養基。二倍體積繼代持續至達到足夠的細胞數量。 ＜4-2＞在含有丁酸鈉之量產培養基中之細胞株生長及hFVII量之測量
    當該細胞大規模培養時，檢測丁酸鈉對於hFVII生產上之影響。為此，首先，將培養之重組CHO細胞株以1.2×107顆細胞/mL之密度接種於各有4L生產培養基並分別含有濃度為0.3、1.0、1.5mM及2.0mM之丁酸鈉(Cat. no. B5887,Sigma,USA)之培養桶中。將生長於0.3mM丁酸鈉存在下之細胞作為對照組用來比較。將那些細胞於30.0℃培養11至18天且以0.5至1.0 VVD持續供給培養基。當細胞濃度減少至少於80%時終止培養。培養期間，於固定時間間隔取出該細胞培養物之確認前體積以檢測細胞密度及細胞活性。
    此外，待取自培養期間之細胞培養物離心後，使用如實施例＜2-2＞中所使用之酶免疫試驗方法測量上清液中hFVIII的量。測量係以相較於控制組的生產量%表示，並摘錄於下文表3中。
    當添加高濃度之丁酸鈉時，於表3中可見，儘管FVII生產時段減少仍生產較高量之FVII，指出丁酸鈉有助於改善FVII之生產力。 實施例5：自培養基純化因子VII
    以1L之1N NaOH清洗超過濾膜(SARTOCON Slice Cassette,PESU,Sartorius,MWCO 30K)1小時，並以5L滅菌水清洗。接著，待該超過濾膜以一級純化管柱平衡緩衝液(equilibration buffer)平衡後，將該表現了因子VII之細胞培養物載入該膜且以10倍濃縮。以相同體積之該一級純化管柱平衡緩衝液二倍稀釋該濃縮物，接著濃縮至其原始體積。用該一級純化管柱平衡緩衝液重複7次此稀釋-濃縮步驟以透析過濾(diafiltration)該細胞培養物。於透析過濾期間無因子VII之損失。該因子VII測得之最終濃度為0.3mg/mL。該超過濾及透析過濾於4℃條件進行。經透析過濾之因子VII溶液最後經過0.22μm濾膜(NALGENE,PES)過濾，並載入陰離子交換層析之管柱。於本發明中，填充Q瓊脂糖凝膠(Q sepharose)樹脂之管柱(Fast Flow,GE healthcare)係用於陰離子交換層析。待該樣本載入該管柱後，以平衡緩衝液A(20mM Tris pH8.0+2 mM苯甲脒(benzamidine))、清洗緩衝液B(20mM Tris pH8.0+2 mM苯甲脒+0.2M NaCl)、清洗緩衝液C(20mM Tris pH8.0+2 mM苯甲脒+0.1M NaCl)及溶析(elution)緩衝液D(20mM Tris pH8.0+2 mM苯甲脒+0.1M NaCl+35mM CaCl2)進行溶析，以2.5倍管柱體積，自清洗緩衝液C至溶析緩衝液D之線性梯度，使用梯度溶析這樣的方式來改善所溶析之蛋白質純度。待陰離子交換層之溶析後，立即將含有因子VII的部分經由尺寸排除層析(size exclusion chromatography)，以20mM Tris pH8.0+2 mM苯甲脒進行緩衝液交換。該過濾、該陰離子交換及該尺寸排除層析於4℃進行。將已經過尺寸排除層析交換緩衝液之樣本載入陰離子交換層析之管柱。以Q瓊脂糖凝膠樹脂(高效能，GE healthcare)填充該管柱。待以平衡緩衝液A(20mM Tris pH8.0+2 mM苯甲脒)平衡該管柱後，以15倍管柱體積，線性梯度為20%至35%之溶析緩衝液B(20mM Tris pH8.0+2 mM苯甲脒+1M NaCl)，使用梯度溶析溶析所載入之樣本。因子VII與pH5.5之20mM磷酸鉀配置在一起而通過尺寸排除層析法。所有步驟於4℃進行。如上所述，因子VII可在純化後以非活化態儲存。若有需要，因子VII可轉化為活化態因子VIIa，如下文實施例6所述。 實施例6：經純化因子VII之活化
    將經純化因子VII之樣本載入陰離子交換層析管柱，該管柱事先以平衡緩稱液A(20mM Tris pH8.0+2 mM苯甲脒)平衡，以活化因子VII。以Source 15Q樹脂(GE Healthcare)填充該管柱。待以緩衝液A平衡後，使用濃度為5%之溶析緩衝液B(20mM Tris pH8.0+2 mM苯甲脒+0.1M NaCl+35mM CaCl2)，使該樣本透過管柱上活化(on-column activation)40分鐘，接著使用溶析緩衝液B以無梯度溶析(isocratic elution)來溶析該蛋白質。因子VII之活化於室溫進行。
    為了說明之目的，雖然本發明之較佳具體實例已被揭示，然而，本領域之技術人員可理解在不背離本發明所揭示之範圍及精神與申請專利範圍下，多種修飾、添加及置換是可行的。
    <110>　韓美控股股份有限公司
    <120>　因子VII/VIIa之量產方法
    <130>　OPA11139
    <150>　KR10-2010-0104403
    <151>　2010-10-26
    <160>　3
    <170>　KopatentIn 1.71
    <210>　1
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    <213>　人造序列
    <220>
    <223>　前置引子(VIIBHISS)
    <400>　1

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    <212>　DNA
    <213>　人造序列
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    <223>　反置引子(VIIXhoIAS)
    <400>　2

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    <212>　DNA
    <213>　人類
    <400>　3





    第1圖顯示一種hFVII表現載體之建構過程及其圖譜。
    第2圖為顯示經hFVII表現載體轉形之細胞株所形成之菌落之hFVII表現量圖，其係以ELISA測量。
    該代表圖無元件符號及其代表之意義。
    权利要求:
    Claims (12)
    [1] 一種人類凝血因子VII之量產方法，其包括：a)建構一種表現載體，其攜帶：i)二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase)啟動子，係於其富含GC之區域缺少一個或多個CCGCCC重複序列，以及與其操作性連接的二氫葉酸還原酶(DHFR)基因，及ii)巨細胞病毒(CMV)啟動子，以及與其操作性連接的人類凝血因子VII；b)將步驟a)之表現載體轉染(transfect)至動物細胞株；c)在二氫葉酸還原酶抑制劑存在下培養步驟b)之經轉染之動物細胞株，以選擇高效率表現人類凝血因子VII之細胞；以及d)添加丁酸鈉至步驟c)之經選擇之動物細胞。
    [2] 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該富含GC之區域含有至多或少於一個CCGCCC重複序列。
    [3] 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該人類凝血因子VII具有序列編號3之鹼基序列。
    [4] 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該表現載體為第1圖所示之pX0GC-FVII。
    [5] 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，步驟b)之細胞株係選自中國倉鼠卵巢細胞瘤(CHO)細胞、猴子腎細胞(COS7)、NSO細胞、SP2/0細胞、W138細胞、倉鼠嬰兒腎(BHK)細胞、MDCK細胞、骨髓瘤細胞、HuT 78細胞及293細胞所組成之群組。
    [6] 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中，該動物細胞株缺少二氫葉酸還原酶基因。
    [7] 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，步驟c)之經選擇之細胞為HMF708(登錄編號：KCTC 11779BP；BCRC 960443)。
    [8] 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項所述之方法，其中，步驟d)之丁酸鈉之濃度範圍為0.1至3.0mM。
    [9] 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中，丁酸鈉之濃度範圍為0.3至1.5mM。
    [10] 如申請專利範圍第1項所述之方法，係進一步包括純化人類凝血因子VII。
    [11] 如申請專利範圍第1項所述之方法，係進一步包括活化人類凝血因子VII。
    [12] 一種用於生產人類凝血因子VII之細胞株，HMF708，其登錄編號為KCTC 11779BP(BCRC 960443)。
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