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    本發明係關於治療C型肝炎病毒(HCV)感染之化合物、組合物及方法。本發明亦揭示含有該等化合物之醫藥組合物及使用此等化合物治療HCV感染之方法。
    公开号:TW201307333A
    申请号:TW101103797
    申请日:2012-02-06
    公开日:2013-02-16
    发明作者:John A Bender；Omar D Lopez；Gan Wang；Makonen Belema；John F Kadow
    申请人:Squibb Bristol Myers Co；
    IPC主号:C07D309-00
    专利说明:
    C型肝炎病毒抑制劑
    本發明大體而言係針對抗病毒化合物，且更特定言之係針對可抑制由C型肝炎病毒(HCV)編碼之NS5A蛋白之功能的化合物、包含該等化合物之組合物及抑制NS5A蛋白之功能的方法。
    本申請案主張2011年3月25日申請之美國臨時申請案第61/467,602號及2011年2月7日申請之美國臨時申請案第61/440,086號之權利。
    HCV為一種主要的人類病原體，全世界估計有1.7億人受感染-約為1型人類免疫缺乏病毒感染人數之5倍。此等HCV感染個體中有相當一部分會發展成嚴重進行性肝臟疾病，包括肝硬化及肝細胞癌。
    當前對於HCV之標準護理為利用聚乙二醇化干擾素與病毒唑之組合，其在達成持續病毒反應方面的成功率並非最佳且會引起許多副作用。因此，明顯且長期需要開發解決此未滿足之醫學需求的有效療法。
    HCV為一種正股RNA病毒。基於推導之胺基酸序列之比較及5'未轉譯區域中之廣泛相似性，已將HCV歸類為黃病毒科(Flaviviridae family)中之獨立屬。黃病毒科之所有成員均具有包膜病毒粒子，該等包膜病毒粒子含有經由轉譯單一不間斷之開放閱讀框架來編碼所有已知病毒特異性蛋白質之正股RNA基因組。
    由於缺乏校對能力之所編碼之RNA依賴性RNA聚合酶的出錯率高，故在整個HCV基因組中，在核苷酸及所編碼之胺基酸序列中存在相當大的異質性。已表徵至少六種主要基因型，且已描述分佈於世界各地的50個以上亞型。HCV之基因異質性的臨床顯著性已顯現在單一療法治療期間出現突變之傾向，因此需要使用其他治療選擇。基因型對發病機制及療法可能存在之調節作用仍難以捉摸。
    單股HCV RNA基因組之長度為約9500個核苷酸且具有編碼含約3000個胺基酸之單一大型聚合蛋白之單一開放閱讀框架(ORF)。在受感染細胞中，此聚合蛋白在多個位點由細胞及病毒蛋白酶裂解以產生結構及非結構(NS)蛋白質。在HCV之情況下，成熟非結構蛋白質(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A及NS5B)之產生由兩種病毒蛋白酶實現。認為第一種病毒蛋白酶為金屬蛋白酶且在NS2-NS3接合點裂解；第二種病毒蛋白酶為NS3之N末端區域內所含之絲胺酸蛋白酶(本文亦稱為NS3蛋白酶)且介導NS3下游之所有後續裂解，在NS3-NS4A裂解位點為順式，而在其餘NS4A-NS4B、NS4B-NS5A、NS5A-NS5B位點為反式。NS4A蛋白似乎藉由充當NS3蛋白酶之輔因子及參與NS3及其他病毒複製酶組分之膜定位來發揮多種功能。形成NS3-NS4A複合物為適當蛋白酶活性所必需的，其使得裂解事件之蛋白水解效率增加。NS3蛋白亦展現核苷三磷酸酶及RNA解螺旋酶活性。NS5B(本文亦稱為HCV聚合酶)為與複製酶複合體中HCV基因組與其他HCV蛋白(包括NS5A)之複製有關之RNA依賴性RNA聚合酶。
    需要適用於治療感染HCV之患者的化合物，其選擇性抑制HCV病毒複製。詳言之，需要有效抑制NS5A蛋白之功能的化合物。HCV NS5A蛋白描述於例如以下參考文獻中：S.L.Tan等人，Virology,284：1-12(2001)；K.-J.Park等人，J.Biol.Chem.,30711-30718(2003)；T.L.Tellinghuisen等人，Nature, 435 ,374(2005)；R.A.Love等人，J.Virol, 83 ,4395(2009)；N.Appel等人，J.Biol.Chem., 281 ,9833(2006)；L.Huang,J.Biol.Chem., 280 ,36417(2005)；C.Rice等人，WO2006093867。
    Bachand等人於2008年2月21日公開之WO2008/021927中揭示適用於治療C型肝炎病毒之一系列聯苯化合物。本發明之新穎化合物屬於WO2008/021927中化學式之定義範疇內但由Bachand等人未對其加以揭示或描述。令人驚奇地，已發現此等化合物具有使其適用於治療C型肝炎病毒之獨特屬性。
    在第一態樣中，本發明提供式(I)化合物： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中：R1係選自氫、甲基及氟；R2係選自氫及甲基；R3及R4各為氫；或R3及R4連同其所連接之碳原子一起形成環丙基環；及R5係選自氫及甲基。
    在第一態樣之第一實施例中，本發明提供一種式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中R1為氫。
    在第一態樣之第二實施例中，本發明提供一種式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中R1為氟。在第三實施例中，R2、R3及R4各為氫且R5為甲基。
    在第一態樣之第四實施例中，本發明提供一種式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中R1為甲基。在第五實施例中，R2、R3及R4各為氫且R5為甲基。
    在第二態樣中，本發明提供一種選自以下之化合物： 或其醫藥學上可接受之鹽。
    在第三態樣中，本發明提供包含式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽及醫藥學上可接受之載劑的組合物。在第三態樣之第一實施例中，該組合物進一步包含一種、兩種或三種具有抗HCV活性之其他化合物。在第三態樣之第二實施例中，至少一種其他化合物為干擾素或病毒唑。在第三實施例中，干擾素係選自干擾素α2B、聚乙二醇化干擾素α、複合干擾素、干擾素α2A、干擾素λ及類淋巴母細胞干擾素τ。
    在第三態樣之第四實施例中，本發明提供一種包含式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之載劑及一種或兩種具有抗HCV活性之其他化合物之組合物，其中至少一種其他化合物係選自介白素2、介白素6、介白素12、增強1型輔助T細胞反應發生之化合物、干擾RNA、反義RNA、咪喹莫特(Imiqimod)、病毒唑、肌苷5'-單磷酸去氫酶抑制劑、金剛胺(amantadine)及金剛乙胺(rimantadine)。
    在第三態樣之第五實施例中，本發明提供一種包含式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之載劑及一種或兩種具有抗HCV活性之其他化合物的組合物，其中至少一種其他化合物有效抑制選自以下之目標之功能以治療HCV感染：HCV金屬蛋白酶、HCV絲胺酸蛋白酶、HCV聚合酶、HCV解螺旋酶、HCV NS4B蛋白、HCV進入、HCV組裝、HCV釋出、HCV NS5A蛋白及IMPDH。
    在第四態樣中，本發明提供一種治療患者之HCV感染之方法，其包含向患者投與治療有效量之式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽。在第四態樣之第一實施例中，該方法進一步包含在投與式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽之前、之後或同時投與一種、兩種或三種具有抗HCV活性之其他化合物。在第五態樣之第二實施例中，至少一種其他化合物為干擾素或病毒唑。在第四態樣之第三實施例中，干擾素係選自干擾素α2B、聚乙二醇化干擾素α、複合干擾素、干擾素α2A、干擾素λ及類淋巴母細胞干擾素τ。
    在第四態樣之第四實施例中，本發明提供一種治療患者之HCV感染之方法，其包含向患者投與治療有效量之式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，且在投與該式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽之前、之後或同時投與一種或兩種具有抗HCV活性之其他化合物，其中至少一種其他化合物係選自介白素2、介白素6、介白素12、增強1型輔助T細胞反應發生之化合物、干擾RNA、反義RNA、咪喹莫特、病毒唑、肌苷5'-單磷酸去氫酶抑制劑、金剛胺及金剛乙胺。
    在第四態樣之第五實施例中，本發明提供一種治療患者之HCV感染之方法，其包含向患者投與治療有效量之式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，且在投與該式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽之前、之後或同時投與一種或兩種具有抗HCV活性之其他化合物，其中至少一種其他化合物有效抑制選自以下之目標的功能以治療HCV感染：HCV金屬蛋白酶、HCV絲胺酸蛋白酶、HCV聚合酶、HCV解螺旋酶、HCV NS4B蛋白，HCV進入、HCV組裝、HCV釋出、HCV NS5A蛋白及IMPDH。
    在另一個態樣中，本發明提供一種以下化合物： 或其醫藥學上可接受之鹽。
    在另一個態樣中，本發明提供一種以下化合物： 或其醫藥學上可接受之鹽。
    本發明之其他實施例可包含兩個或兩個以上本文所揭示之實施例及/或態樣之適當組合。
    根據以下所提供之描述，本發明之其他實施例及態樣將顯而易見。
    本發明化合物亦以互變異構體形式存在；因此本發明亦涵蓋所有互變異構形式。
    本文中，本發明之描述應依照化學鍵結之規律及原理加以解釋。
    應瞭解，本發明所涵蓋之化合物為適當地穩定用作藥劑之彼等化合物。
    本說明書中所引用之所有專利、專利申請案及參考文獻均以全文引用的方式併入本文中。在不一致之情況下，以本發明(包括定義)為準。
    如本說明書所用，以下術語具有所示含義：除非上下文另外明確規定，否則如本文中所用，單數形式「一」及「該」包括複數個指示物。
    本發明化合物中存在不對稱中心。視對掌性碳原子周圍之取代基的組態而定，此等中心由符號「R」或「S」標明。應瞭解，本發明涵蓋所有具有抑制NS5A之能力的立體化學異構形式或其混合物。化合物之個別立體異構體可以合成方式由含有對掌中心之可購得之起始物質製備，或藉由製備立體異構產物之混合物，隨後進行分離，諸如轉化成非對映異構體之混合物，隨後進行分離或再結晶、層析技術或經對掌性層析柱直接分離來製備。具有特定立體化學構型之起始化合物可購得或可藉由此項技術中已知之技術製備及解析。
    本發明之某些化合物亦可以可分離之不同穩定構形形式存在。歸因於圍繞不對稱單鍵之限制性旋轉(例如由於位阻或環應力)之扭轉不對稱性可允許分離不同構象異構體。本發明包括此等化合物之各構形異構體及其混合物。
    術語「本發明化合物」及等效表述意欲涵蓋式(I)化合物及其醫藥學上可接受之對映異構體、非對映異構體及鹽。類似地，在上下文允許之情況下，提及中間物意欲包涵其鹽。
    本發明意欲包括本發明化合物中存在之原子之所有同位素。同位素包括具有相同原子序數但不同質量數之彼等原子。以一般實例說明，但不加以限制，氫之同位素包括氘及氚。碳之同位素包括13C及14C。經同位素標記之本發明化合物通常可藉由熟習此項技術者已知之習知技術或藉由類似於本文所述之方法，使用適當經同位素標記之試劑替代另外使用之未經標記之試劑來製備。該等化合物可具有多種潛在用途，例如用作測定生物活性之標準物及試劑。在穩定同位素之情況下，該等化合物可具有有利地改變生物學、藥理學或藥物動力學特性之潛能。
    本發明化合物可以醫藥學上可接受之鹽形式存在。如本文所用，術語「醫藥學上可接受之鹽」表示本發明化合物之鹽或兩性離子形式，其為水或油溶性或分散性，其在正確醫學判斷範疇內適用於與患者組織接觸而無過度毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症，與合理之益處/風險比相稱，且有效達成其預期用途。該等鹽可在化合物之最終分離及純化期間製備，或分別由適合之氮原子與適合之酸反應來製備。代表性酸加成鹽包括乙酸鹽、己二酸鹽、海藻酸鹽、檸檬酸鹽、天冬胺酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽；二葡糖酸鹽、二氫溴酸鹽、二氫氯酸鹽、二氫碘酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、甲酸鹽、反丁烯二酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙烷磺酸鹽、乳酸鹽、順丁烯二酸鹽、均三甲苯磺酸鹽、甲烷磺酸鹽、萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、2-萘磺酸鹽、草酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、苦味酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、丁二酸鹽、酒石酸鹽、三氯乙酸鹽、三氟乙酸鹽、磷酸鹽、麩胺酸鹽、碳酸氫鹽、對甲苯磺酸鹽及十一烷酸鹽。可用於形成醫藥學上可接受之加成鹽之酸的實例包括無機酸，諸如鹽酸、氫溴酸、硫酸及磷酸；及有機酸，諸如草酸、順丁烯二酸、丁二酸及檸檬酸。
    當有可能將治療有效量之式(I)化合物以及其醫藥學上可接受之鹽作為化學原料投藥以用於療法中時，有可能將活性成分呈現為醫藥組合物形式。因此，本發明進一步提供醫藥組合物，其包括治療有效量之式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。如本文所用，術語「治療有效量」係指足以展現有意義的患者效益(例如：降低病毒量)時之各活性組分之總量。當應用於單獨投與之個別活性成分時，該術語係指該單獨成分。當應用於組合時，該術語係指產生治療效應之活性成分之組合量，無論以組合形式連續或同時投與。式(I)化合物及其醫藥學上可接受之鹽係如上所述。載劑、稀釋劑或賦形劑必須為可接受的，意即與調配物之其他成分相容且對其接受者無害。根據本發明之另一個態樣，亦提供一種製備醫藥調配物之方法，其包括混合式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽與一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。如本文所用，術語「醫藥學上可接受」係指彼等化合物、物質、組合物及/或劑型在正確醫學判斷範疇內適用於與患者組織接觸而無過度毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症，且符合合理之益處/風險比，且可有效達成其預期用途。
    醫藥調配物可以每單位劑量含有預定量之活性成分的單位劑形提供。每天每公斤體重約0.01毫克(「mg/kg」)至約250毫克、較佳每天每公斤體重約0.05毫克至約100毫克之本發明化合物之劑量為用於預防及治療HCV介導疾病之單一療法中的典型劑量。通常，本發明之醫藥組合物每天將投與約1至約5次，或者以連續輸注方式投與。該投藥可用作長期或短期療法。可與載劑物質組合以產生單一劑型之活性成分之量將視所治療之病狀、病狀的嚴重程度、投藥時間、投藥途徑、所用化合物之排泄率、治療持續時間及患者之年齡、性別、體重及健康狀況而變化。較佳單位劑量調配物為含有如上文所述之日劑量或子劑量或其合適分劑量之活性成分的彼等調配物。可以實質上小於最佳劑量之小劑量的化合物開始治療。此後，以小幅增量增加劑量直至達到該等情況下之最佳效應。一般而言，化合物最理想地以通常將提供抗病毒有效結果而不引起任何有害或不利副作用之濃度水準投與。
    當本發明組合物包含本發明化合物與一或多種其他治療劑或預防劑之組合時，該化合物與其他藥劑通常以單一療法方案中一般所投與劑量的約10%至150%，且更佳約10%至80%的劑量存在。
    醫藥調配物可適於藉由任何合適途徑投藥，例如藉由經口(包括頰內或舌下)、經直腸、經鼻、局部(包括頰內、舌下或經皮)、經陰道或非經腸(包括皮下、皮內、肌肉內、關節內、滑膜內、胸骨內、鞘內、病灶內、靜脈內或皮內注射或輸注)途徑投藥。該等調配物可由藥劑學技術中已知之任何方法(例如藉由將活性成分與載劑或賦形劑締合)來製備。經口投藥或藉由注射投藥較佳。
    適於經口投與之醫藥調配物可以個別單位形式提供，諸如膠囊或錠劑；散劑或顆粒；於水性或非水性液體中之溶液或懸浮液；可食用泡沫或泡沫狀物；或水包油型液體乳液或油包水型乳液。
    舉例而言，對於以錠劑或膠囊形式經口投與，可將活性藥物組分與經口、無毒、醫藥學上可接受之惰性載劑(諸如乙醇、甘油、水及其類似物)組合。藉由將化合物粉碎至適合之精細尺寸且與同樣經碾碎之醫藥載劑(諸如可食用碳水化合物，例如澱粉或甘露糖醇)混合來製備散劑。亦可存在調味劑、防腐劑、分散劑及著色劑。
    藉由製備如上所述之粉末混合物且填充已成形明膠殼來製造膠囊。在填充操作之前，可將諸如膠態二氧化矽、滑石、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣或固體聚乙二醇之滑動劑及潤滑劑添加至粉末混合物中。亦可添加諸如瓊脂、碳酸鈣或碳酸鈉之崩解劑或增溶劑以改良攝取膠囊時藥物之可用性。
    此外，需要或必需時，亦可將適合之黏合劑、潤滑劑、崩解劑及著色劑併入混合物中。適合之黏合劑包括澱粉、明膠、天然糖(諸如葡萄糖或β-乳糖)、玉米甜味劑、天然及合成膠(諸如阿拉伯膠、黃蓍膠或海藻酸鈉)、羧甲基纖維素、聚乙二醇及其類似物。此等劑型中所用之潤滑劑包括油酸鈉、氯化鈉及其類似物。崩解劑包括(但不限於)澱粉、甲基纖維素、瓊脂、膨潤土、三仙膠及其類似物。錠劑係例如藉由製備粉末混合物，造粒或成塊(slugging)，添加潤滑劑及崩解劑，及壓成錠劑來調配。粉末混合物係藉由適當碾碎之化合物與如上所述之稀釋劑或基質且視情況與黏合劑(諸如羧甲基纖維素、海藻酸鹽、明膠或聚乙烯吡咯啶酮)、溶解遲延劑(諸如石蠟)、再吸收加速劑(諸如四級鹽)及/或吸收劑(諸如膨潤土、高嶺土或磷酸氫鈣)混合來製備。粉末混合物可用黏合劑(諸如糖漿、澱粉糊、阿卡迪亞黏漿(acadia mucilage)或纖維素或聚合物質之溶液)潤濕及迫使其通過篩網來造粒。作為造粒之替代方法，可使粉末混合物通過壓錠機，結果不完全成形之坯塊碎解為顆粒。可藉由添加硬脂酸、硬脂酸鹽、滑石或礦物油來潤滑顆粒以防止黏附於形成錠劑之模具上。接著將經潤滑之混合物壓成錠劑。亦可將本發明化合物與自由流動之惰性載劑組合及直接壓成錠劑，不經造粒或成塊步驟。可提供由密封蟲膠塗層、糖或聚合物質塗層及拋光蠟塗層組成的透明或不透明保護塗層。可將染料添加至該等塗層中以區分不同單位劑量。
    口服液體，諸如溶液、糖漿及酏劑，可製備呈單位劑型以使得給予量含有預定量之化合物。糖漿可由化合物溶於適當調味之水溶液中製備，而酏劑係經由使用無毒媒劑製備。亦可添加增溶劑及乳化劑(諸如乙氧化異十八醇及聚氧乙烯山梨糖醇醚)、防腐劑、調味添加劑(諸如薄荷油或天然甜味劑、或糖精或其他人造甜味劑)及其類似物。
    適當時，可將用於經口投與之劑量單位調配物裝入微囊中。亦可例如藉由塗佈或包埋顆粒物質於聚合物、蠟或其類似物中來製備調配物以延長或持續釋放。
    式(I)化合物及其醫藥學上可接受之鹽亦可以脂質體傳遞系統(諸如單層小微脂粒、單層大微脂粒及多層微脂粒)形式投藥。脂質體可由多種磷脂(諸如膽固醇、十八烷胺或磷脂醯膽鹼)形成。
    式(I)化合物及其醫藥學上可接受之鹽亦可藉由使用單株抗體作為與化合物分子偶合之個別載體來傳遞。該等化合物亦可與作為可靶向藥物載體之可溶性聚合物偶合。該等聚合物可包括聚乙烯吡咯啶酮、哌喃共聚物、聚羥丙基甲基丙烯醯胺苯酚、聚羥基乙基天冬醯胺苯酚或經棕櫚醯基殘基取代之聚氧化乙烯聚離胺酸。此外，該等化合物可與適用於達成藥物控制釋放之一類生物可降解聚合物偶合，該等聚合物例如聚乳酸、聚ε己內酯、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚縮醛、聚二氫哌喃、聚氰基丙烯酸酯及水凝膠之交聯或兩性嵌段共聚物。
    適於經皮投藥之醫藥調配物可以個別貼片形式提供，其意欲與接受者之表皮保持長時間緊密接觸。舉例而言，活性成分可藉由如Pharmaceutical Research 1986,3(6),318中大致描述之離子導入療法自貼片傳遞。
    適於局部投藥之醫藥調配物可調配為軟膏、乳膏、懸浮液、洗劑、散劑、溶液、糊劑、凝膠、噴霧劑、氣溶膠或油劑。
    適於經直腸投與之醫藥調配物可以栓劑形式或以灌腸劑形式提供。
    適於經鼻投與之醫藥調配物(其中載劑為固體)包括粒度例如介於20微米至500微米範圍內之粗粉末，其以用鼻吸之方式投與，亦即藉由自保持貼近鼻子的粉末容器經由鼻腔快速吸入來投與。適用於以經鼻噴霧劑或滴鼻劑形式投與之調配物(其中載劑為液體)包括活性成分之水溶液或油溶液。
    適於藉由吸入投藥之醫藥調配物包括細粒粉劑或霧劑，其可藉由各種類型之定劑量加壓氣溶膠、噴霧器或吹入器產生。
    適於經陰道投與之醫藥調配物可以子宮托、棉塞、乳膏、凝膠、糊劑、泡沫或噴霧調配物形式提供。
    適於非經腸投與之醫藥調配物包括水性及非水性滅菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑及使得調配物與預定接受者的血液等滲之溶質；及水性及非水性滅菌懸浮液，其可包括懸浮劑及增稠劑。調配物可以單位劑量或多劑量容器(例如密封安瓿及小瓶)提供，且可儲存於冷凍乾燥(凍乾)條件下，僅需要在臨用前添加滅菌液體載劑(例如注射用水)。即用型注射溶液及懸浮液可自滅菌散劑、顆粒及錠劑製備。
    應瞭解，關於所論述調配物之類型，除以上特定提及之成分以外，調配物亦可包括此項技術中習知之其他試劑，例如適用於經口投與之調配物可包括調味劑。
    術語「患者」包括人類與其他哺乳動物。
    術語「治療」係指：(i)防止可能易患疾病、病症及/或病狀但尚未診斷出患病之患者發生該疾病、病症或病狀；(ii)抑制疾病、病症或病狀，亦即遏止其發展；及(iii)緩解疾病、病症或病狀，亦即使疾病、病症及/或病狀消退。
    本發明化合物亦可與環孢素(cyclosporin)(例如環孢素A或經由類似機制起作用之其他類似物)一起投與。臨床試驗中已顯示環孢素A對HCV具有活性(Hepatology 2003,38,1282；Biochem.Biophys.Res.Commun.2004,313,42；J.Gastroenterol.2003,38,567)。
    下表1列舉可與本發明化合物一起投與之化合物之一些說明性實例。本發明化合物可與其他抗HCV活性化合物在組合療法中聯合或分開投與，或藉由將該等化合物組合為組合物來投與。

    本發明化合物亦可用作實驗室試劑。該等化合物可有助於提供用於設計病毒複製分析、驗證動物分析系統及結構生物學研究之研究工具以進一步增強對HCV疾病機制的認識。此外，本發明化合物適用於例如藉由競爭性抑制來建立或確定其他抗病毒化合物之結合位點。
    本發明化合物亦可用以治療或預防物質之病毒污染且因此降低與該等物質接觸的實驗室或醫務人員或患者之病毒感染風險，該等物質例如血液、組織、手術器械及衣服、實驗室器械及衣服，及血液採集或輸血裝置及物質。
    本發明意欲涵蓋藉由合成過程或藉由代謝過程(包括在人類或動物體內(活體內)發生之代謝過程或在活體外發生之過程)製備之式(I)化合物。
    本申請案中所用之縮寫(尤其包括隨後實例中之縮寫)為熟習此項技術者所熟知。一些所用縮寫如下：h、hr或hrs為小時；EtOAc為乙酸乙酯；Hex為己烷；DCM為二氯甲烷；DEAD為偶氮二甲酸二乙酯；Ph3P為三苯基膦；Et2O為乙醚；THF為四氫呋喃；LiHMDS為雙(三甲基矽烷基)胺基鋰；Ph為苯基；DIEA或DIPEA或iPr2EtN為二異丙基乙胺；EtOH為乙醇；MeOH為甲醇；DMSO為二甲亞碸；RT或Rt或rt或Rt為室溫或滯留時間(視情況而定)；ON或o/n為隔夜；min為分鐘；DCM為二氯甲烷；HATU為六氟磷酸O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基；DMF為N,N-二甲基甲醯胺；TFA為三氟乙酸；HOBt或HOBT為羥基苯并三唑；DME為1,2-二甲氧基乙烷；且DMAP為N,N-二甲胺基吡啶。
    將2,6-二甲基-4H-哌喃-4-酮(15 g，121 mmol)溶解於乙醇(300 mL)中且添加10% Pd/C(1.28 g，1.21 mmol)。於帕爾震盪器(Parr shaker)中，在H2(70 psi)下，在室溫下氫化混合物72小時。反應混合物經由矽藻土襯墊(Celite®)過濾且用乙醇洗滌。真空濃縮濾液且殘餘物經由急驟層析(10%至30% EtOAc/Hex)純化。分離出兩種澄清油狀溶離份。最先溶離之溶離份為(2R,4r,6S)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-醇(Cap-1步驟a)與(2R,4s,6S)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-醇(1.2 g)之混合物，而稍後溶離之溶離份僅對應於Cap-1步驟a(10.73 g)。1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ ppm 3.69-3.78(1 H,m),3.36-3.47(2 H,m),2.10(1 H,br.s.),1.88(2 H,dd,J=12.05,4.73 Hz),1.19(6 H,d,J=6.10 Hz),1.10(2 H,q,J=10.70 Hz)。13C NMR(126 MHz,CDCl3)δ ppm 71.44(2 C),67.92(1 C),42.59(2 C),21.71(2 C)。
    將DEAD(166 mL，330 mmol)逐滴添加至Cap-1步驟a(10.73，82 mmol)、4-硝基苯甲酸(48.2 g，288 mmol)及Ph3P(86 g，330 mmol)於苯(750 mL)中之溶液中。偵測熱析出且在周圍溫度下攪拌所得琥珀色溶液18小時。減壓移除溶劑且用Et2O(200 mL)濕磨殘餘物以移除氧化三苯基膦(10 g)。剩餘混合物經由Biotage®(0%至5% EtOAc/Hex；300 g管柱×4)純化。分離出對應於Cap-1步驟b之白色固體(19.36 g)。1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ ppm 8.27-8.32(2 H,m),8.20-8.24(2 H,m),5.45(1 H，五重峰，J=2.82 Hz),3.92(2 H,dqd,J=11.90,6.10,1.53 Hz),1.91(2 H,dd,J=14.80,2.29 Hz),1.57(2 H,dt,J=14.65,3.05 Hz),1.22(6 H,d,J=6.10 Hz)。13C NMR(126 MHz,CDCl3)δ ppm 163.81(1 C),150.55(1 C),135.94(1 C),130.64(2 C),123.58(2 C),70.20(1 C),68.45(2 C),36.95(2 C),21.84(2 C)。LC-MS：[M]+ C14H17NO5之分析計算值為279.11；實驗值為279.12。
    將LiOH(8.30 g，347 mmol)於水(300 mL)中之溶液添加至Cap-1步驟b(19.36 g，69.3 mmol)於THF(1000 mL)中之溶液中，且在周圍溫度下攪拌所得混合物16小時。減壓移除THF且再用水(200 mL)稀釋水層且用EtOAc(3×200 mL)萃取。乾燥(MgSO4)合併之有機層，過濾且真空濃縮。回收具有白色固體之油性殘餘物。用己烷濕磨混合物且藉由過濾移除固體，產生對應於Cap-1步驟c之澄清油狀物(8.03 g)。1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ ppm 4.21(1 H，五重峰，J=2.82 Hz),3.87-3.95(2 H,m),1.72(1 H,br.s.),1.63(2 H,dd,J=14.34,2.14 Hz),1.39-1.47(2 H,m),1.17(6 H,d,J=6.41 Hz)。13C NMR(126 MHz,CDCl3)δ ppm 67.53(2 C),64.71(1 C),39.99(2 C),21.82(2 C)。
    在室溫下將對甲苯磺醯氯(23.52 g，123 mmol)添加至Cap-1步驟c(8.03 g、61.7 mmol)及吡啶(19.96 mL，247 mmol)於CH2Cl2(750 mL)中之溶液中且攪拌36小時。由於反應未完成，故減壓移除CH2Cl2且再持續攪拌48小時。接著將混合物添加至CH2Cl2(100 mL)及水(100 mL)中且在周圍溫度下攪拌2小時。分離混合物且有機層用1 N HCl水溶液(2×50 mL)充分洗滌。接著乾燥(MgSO4)有機層，過濾且濃縮。分離出對應於Cap-1步驟d之黃色油狀物(14.15 g)，其在真空下凝固成灰白色固體。1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ ppm 7.80(2 H,d,J=8.24 Hz),7.35(2 H,d,J=7.93 Hz),4.88(1 H，五重峰，J=2.82 Hz),3.79-3.87(2 H,m),2.46(3 H,s),1.76(2 H,dd,J=14.50,2.59 Hz),1.36(2 H,ddd,J=14.34,11.60,2.75 Hz),1.12(6 H,d,J=6.10 Hz)。13C NMR(126 MHz,CDCl3)δ ppm 144.64(1 C),134.24(1 C),129.82(2 C),127.61(2 C),77.34(1 C),67.68(2 C),37.45(2 C),21.61(1 C),21.57(2 C)。LC-MS：[2M+H]+ C28H41O8S2之分析計算值為569.22；實驗值為569.3。
    在室溫下，在壓力管中將LiHMDS(29.7 mL、29.7 mmol，1 M THF溶液)添加至Cap-1步驟d(7.05 g，24.8 mmol)及2-(二苯基亞甲胺基)乙酸苄酯(8.57 g，26.0 mmol)於甲苯(80 mL)中之溶液中，接著在100℃下攪拌所得混合物5小時。反應物用水(100 mL)淬滅，用EtOAc萃取，用水洗滌，經MgSO4乾燥，過濾且真空濃縮。殘餘物經由Biotage®(0%至15% EtOAc/Hex；240 g管柱)純化且分離出呈外消旋混合物形式之對應於Cap-1步驟e之黃色油狀物(8.76 g)。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ ppm 7.62-7.71(2 H,m),7.30-7.45(11 H,m),7.05(2 H,dd,J=7.65,1.63 Hz),5.13-5.22(2 H,m),3.89(1 H,d,J=6.78 Hz),3.46(2 H，雙五重峰，J=11.27,5.90,2.01 Hz),2.34-2.45(1 H,m),1.58-1.66(1 H,m),1.34-1.43(1 H,m),1.19(3 H,d,J=6.02 Hz),1.03-1.16(4 H,m),0.83-0.97(1 H,m)。13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ ppm 170.84(1 C),170.68(1 C),139.01(1 C),135.96(1 C),135.51(1 C),130.04(1 C),128.49(2 C),128.20(1 C),128.09(4 C),127.97(2 C),127.85(1 C),127.67(2 C),127.47(2 C),72.76(1 C),72.46(1 C),69.77(1 C),65.99(1 C),39.11(1 C),35.90(1 C),35.01(1 C),21.74(1 C),21.65(1 C)。LC-MS：[2M+Na]+ C58H62N2NaO6之分析計算值為905.45；實驗值為905.42。
    將Cap-1步驟e(8.76 g，19.84 mmol)溶解於THF(100 mL)中且用2 N HCl之水溶液(49.6 mL，99 mmol)處理。在周圍溫度下攪拌所得澄清溶液4小時，接著在減壓移除THF。剩餘水層用EtOAc(3×30 mL)萃取且真空濃縮，得到相應粗胺。將殘餘物溶解於CH2Cl2(100 mL)中且裝入DIEA(11.8 mL，67.6 mmol)及氯甲酸甲酯(1.962 mL，25.3 mmol)。在周圍溫度下攪拌所得溶液2小時。用CH2Cl2(50 mL)稀釋反應混合物且用水(100 mL)及鹽水(100 mL)洗滌。乾燥(MgSO4)有機層，過濾且濃縮。經由Biotage®(15%至25% EtOAc/Hex；80 g管柱)純化殘餘物。回收得到對應於外消旋Cap-1步驟f之澄清無色油狀物(5.27 g)。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ ppm 7.32-7.41(5 H,m),5.13-5.28(3 H,m),4.36(1 H,dd,J=8.16,4.64 Hz),3.69(3 H,s),3.30-3.47(2 H,m),2.00-2.16(1 H,m),1.52(1 H,d,J=12.55 Hz),1.33(1 H,d,J=12.30 Hz),1.15(6 H,dd,J=6.02,5.02 Hz),0.88-1.07(2 H,m)。13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ ppm 171.39(1 C),156.72(1 C),135.20(2 C),128.60(2 C),128.57(1 C),128.52(2 C),72.77(1 C),72.74(1 C),67.16(1 C),57.81(1 C),52.40(1 C),38.85(1 C),35.56(1 C),34.25(1 C),21.94(2 C)。LC-MS：[M+H]+ C18H26NO5之分析計算值為336.18；實驗值為336.3。
    開發對掌性方法以經CHIRALPAK® AS-H管柱(50×500 mm，20 μm)藉由使用20%乙醇作為調節劑分離外消旋混合物(波長=220 nm，流速=100 mL/min，歷時22分鐘，溶劑A=0.1%二乙胺之庚烷溶液，溶劑B=EtOH)。分離之兩種異構體對應於(S)-2-((2R,4r,6S)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基)-2-((甲氧羰基)胺基)乙酸苄酯(Cap-1步驟f.1)(Rt=9.8 min，2.2 g)及(R)-2-((2R,4r,6S)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基)-2-((甲氧羰基)胺基)乙酸苄酯(Cap-1步驟f.2)(Rt=16.4 min，2.1 g)，且其各呈現與對應混合物相同之分析數據(參見上文)。 Cap-1
    在裝有10% Pd/C(0.349 g，0.328 mmol)之帕爾瓶中將(S)-2-((2R,4r,6S)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基)-2-((甲氧羰基)胺基)乙酸苄酯(Cap-1步驟f.1)(2.2 g，6.6 mmol)溶解於MeOH(50 mL)中。接著將懸浮液置於帕爾震盪器中且用N2沖洗混合物(3次)，置於40 psi H2下且在室溫下震盪15小時。經由矽藻土襯墊(Celite®)濾出催化劑且減壓移除溶劑，產生對應於Cap-1之琥珀色固體(1.6 g)。1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ ppm 12.74(1 H,br.s.),7.35(1 H,d,J=6.10 Hz),3.85(1 H,br.s.),3.53(3 H,s),3.35(2 H,ddd,J=15.95,9.99,6.10 Hz),1.97(1 H,br.s.),1.48(2 H,t,J=13.28 Hz),1.06(6 H,d,J=6.10 Hz),0.82-1.00(2 H,m)。13C NMR(101 MHz,DMSO-d6)δ ppm 176.93(1 C),156.72(1 C,),72.10(1 C),71.92(1 C),58.54(1 C),51.35(1 C),36.88(1 C),35.82(1 C),34.71(1 C),21.90(2 C)。注意：Cap-1之絕對立體化學構型係藉由由Cap-1及(S)-苯乙醇製備之酯類似物之單晶X射線分析確定。
    (S)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基)-2-(甲氧羰基胺基)乙酸
    參考文獻：S.Danishefsky等人，J.Org.Chem, 1982 ,47,1597。
    在氮氣下將醚合三氟化硼(3.81 mL，30.5 mmol)逐滴添加至(E)-(4-甲氧基丁-1,3-二烯-2-基氧基)三甲基矽烷(5.0 g，29 mmol)及乙醛(3.28 mL，58.0 mmol)於乙醚(100 mL)中之經攪拌且冷卻(-78℃)之溶液中。在-78℃下攪拌反應物2.5小時，接著用飽和NaHCO3水溶液(40 mL)淬滅，使其升溫至室溫且攪拌隔夜。分離各層且用乙醚(2×50 mL)萃取水層。乾燥(MgSO4)合併之有機層，過濾且濃縮，得到黃色/橙色油狀物。粗油狀物用Biotage® Horizon(110 g SiO2，25%至40% EtOAc/己烷)純化，產生呈黃色油狀之外消旋2-甲基-2H-哌喃-4(3H)-酮(Cap-2步驟a)(2.2 g)。1H NMR(400 MHz,CDCl3-d)δ ppm 7.35(d,J=6.0 Hz,1 H),5.41(dd,J=6.0,1.0 Hz,1 H),4.51-4.62(m,1 H),2.41-2.57(m,2 H),1.47(d,J=6.3 Hz,3 H)。
    參考文獻：Reddy,D.S等人，J.Org.Chem. 2004 ,69,1716-1719。
    在0℃下且在氮氣下將1.6 M甲基鋰於乙醚中之溶液(20.9 mL，33.4 mmol)添加至碘化銅(I)(4.25 g，22.30 mmol)於乙醚(30 mL)中之經攪拌漿料中。在0℃下攪拌反應物20分鐘，接著經10分鐘添加含外消旋2-甲基-2H-哌喃-4(3H)-酮(1.25 g，11.2 mmol)之乙醚(12.0 mL)。使反應物升溫至室溫且攪拌2小時。將反應混合物傾入飽和NH4Cl(水溶液)中且攪拌20分鐘。溶液用乙醚(4×60 mL)萃取且合併之有機物用鹽水(約80 mL)洗滌，乾燥(MgSO4)，過濾且濃縮，產生呈橙色油狀之外消旋(2R,6R)-2,6-二甲基二氫-2H-哌喃-4(3H)-酮(Cap-2步驟b)(1.34 g)。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ ppm 4.28-4.39(m,2 H),2.55(ddd,J=14.1,4.8,1.5 Hz,2 H),2.24(ddd,J=14.1,6.5,1.5 Hz,2 H),1.28(d,J=6.3 Hz,6 H)。
    在0℃下將硼氫化鈉(0.354 g，9.36 mmol)逐份添加至外消旋(2R,6R)-2,6-二甲基二氫-2H-哌喃-4(3H)-酮(Cap-2步驟b)(1.2 g，9.4 mmol)於MeOH(30 mL)中之經攪拌溶液中。在0℃下攪拌溶液10分鐘，升溫至室溫且攪拌1小時。將反應物傾入飽和NH4Cl(約50 mL)中，攪拌20分鐘，接著部分濃縮(至約1/2體積)。形成沈澱物，添加水直至均質，接著用DCM(3×60 mL)萃取溶液。水層用1 N HCl酸化，接著用DCM(3×60 mL)萃取。經Na2SO4乾燥合併之有機物，過濾且濃縮，形成混濁黃色油狀物(1.08 g)。將粗油狀物溶解於DCM(8.0 mL)中，接著添加對甲苯磺醯氯(2.68 g，14.0 mmol)及吡啶(1.51 mL，18.7 mmol)，且在室溫下攪拌反應物2.5天。反應物用飽和NH4Cl(約60 mL)稀釋且用DCM(3×30 mL)萃取。乾燥(MgSO4)合併之有機相，過濾且濃縮，得到棕色油狀物。油狀物經Biotage® Horizon(80 g SiO2，10%至25% EtOAc/己烷)純化，產生呈黏性澄清無色油狀之外消旋4-甲基苯磺酸(2R,6R)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基酯(Cap-2步驟c)(1.63 g)。LC-MS滯留時間為3.321分鐘；m/z 284.98[M+H]+。經裝備有Phenomenex-Luna 3μ C18 2.0×50 mm管柱之Shimadzu LC-10AS液相層析儀使用SPD-10AV UV-Vis偵測器在220 nM偵測器波長下記錄LC數據。溶離條件採用：流速：0.8 mL/min，梯度：100%溶劑A/0%溶劑B至0%溶劑A/100%溶劑B，梯度時間：4分鐘，保持時間：1分鐘，及分析時間：5分鐘，其中溶劑A為5% MeOH/95% H2O/10 mM乙酸銨且溶劑B為5% H2O/95% MeOH/10 mM乙酸銨。使用LC Micromass Platform在電噴霧模式下測定MS數據。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ ppm 7.81(d,J=8.3 Hz,2 H),7.36(d,J=8.0 Hz,2 H),4.81-4.92(m,1 H),4.17-4.26(m,1 H),3.78-3.87(m,1 H),2.47(s,3 H),1.91-1.99(m,1 H),1.78-1.86(m,1 H),1.65-1.72(m,1 H),1.46(ddd,J=12.9,9.4,9.3 Hz,1 H),1.20(dd,J=6.5,4.8 Hz,6 H)。
    使用對掌性製備型SFC純化(Chiralpak AD-H製備型管柱，30 mm×250 mm，5 μm，含10% 1：1 EtOH/庚烷之CO2，70 mL/min，歷時10分鐘)經多次注射將外消旋混合物分離成個別對映異構體，產生4-甲基苯磺酸(2R,6R)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基酯(Cap-2步驟c.1)(577 mg)(第一溶離峰)及4-甲基苯磺酸(2S,6S)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基酯(Cap-2步驟c.2)(588 mg)(第二溶離峰)。分離出呈澄清無色油狀之各對映異構體，其靜置時凝固成白色固體。
    在48 mL壓力管中，將4-甲基苯磺酸(2R,6R)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基酯(Cap-2步驟c.1)(575 mg，2.02 mmol)及2-(二苯基亞甲胺基)乙酸苄酯(733 mg，2.22 mmol)於THF(2 mL)及甲苯(10 mL)中攪拌。澄清無色溶液用氮氣沖洗，接著添加LiHMDS(1.0 M THF溶液)(2.22 mL，2.22 mmol)，且密封容器且在100℃下加熱8小時。冷卻反應物至室溫，傾入1/2飽和NH4Cl(水溶液)(約50 mL)中且用EtOAc(3×30 mL)萃取。合併之有機層用鹽水洗滌，乾燥(MgSO4)，過濾且濃縮，得到橙色粗油狀物。油狀物經Biotage® Horizon(40 g SiO2，10%至25% EtOAc/己烷)純化，產生呈橙色油狀之含雜質之所需產物(501 mg)。此物質經Biotage® Horizon(25 g SiO2，6%至12% EtOAc/己烷)再純化，產生呈黏性橙色油狀之非對映異構體之約1：1混合物(Cap-2步驟d)(306 mg)。
    使用對掌性製備型SFC純化(Chiralcel OJ-H製備型管柱，30 mm×250 mm，5 μm，含10% 1：1 EtOH/庚烷之CO2，在150巴下，70 mL/min，歷時10分鐘)經多次注射將混合物分離成個別非對映異構體，產生(R)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基)-2-(二苯基亞甲胺基)乙酸苄酯(Cap-2步驟d.1)(124 mg)(第一溶離峰)及(S)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基)-2-(二苯基亞甲胺基)乙酸苄酯(Cap-2步驟d.2)(129 mg)(第二溶離峰)。分離出呈黏性黃色油狀之各非對映異構體。
    (R)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基)-2-(二苯基亞甲胺基)乙酸苄酯(Cap-2，步驟d.1)之分析數據：1H NMR(400 MHz,D4-MeOH)δ ppm 7.57-7.61(m,2 H),7.41-7.48(m,4 H),7.33-7.40(m,7 H),7.03-7.08(m,2 H),5.22(d,J=12.1 Hz,1 H),5.16(d,J=12.1 Hz,1 H),4.09-4.19(m,1 H),3.84(d,J=6.8 Hz,1 H),3.75-3.83(m,1 H),2.53-2.64(m,1 H),1.58-1.65(m,1 H),1.33-1.43(m,1 H),1.26-1.32(m,1 H),1.24(d,J=7.0 Hz,3 H),1.10(d,J=6.0 Hz,3 H),0.98-1.08(m,1 H)。LC-MS滯留時間為4.28分鐘；m/z 442.16[M+H]+。經裝備有Phenomenex-Luna 3μ C18 2.0×50 mm管柱之Shimadzu LC-10AS液相層析儀使用SPD-10AV UV-Vis偵測器在220 nM偵測器波長下記錄LC數據。溶離條件採用：流速：0.8 mL/min，梯度：100%溶劑A/0%溶劑B至0%溶劑A/100%溶劑B，梯度時間：4分鐘，保持時間：1分鐘，及分析時間：5分鐘，其中溶劑A為5% MeOH/95% H2O/10 mM乙酸銨且溶劑B為5% H2O/95% MeOH/10 mM乙酸銨。使用LC Micromass Platform在電噴霧模式下測定MS數據。
    (S)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基)-2-(二苯基亞甲胺基)乙酸苄酯(Cap-2，步驟d.2)之分析數據：1H NMR(400 MHz,D4-MeOH)δ ppm 7.57-7.61(m,2 H),7.41-7.50(m,4 H),7.33-7.40(m,7 H),7.04-7.08(m,2 H),5.22(d,J=12.1 Hz,1 H),5.16(d,J=12.1 Hz,1 H),4.20(qd,J=6.4,6.3 Hz,1 H),3.86(d,J=6.5 Hz,1 H),3.74-3.83(m,1 H),2.53-2.64(m,1 H),1.60(td,J=12.7,5.6 Hz,1 H),1.38-1.51(m,2 H),1.26(d,J=7.0 Hz,3 H),1.04(d,J=6.0 Hz,3 H),0.79-0.89(m,1 H)。LC-MS滯留時間為4.27分鐘；m/z 442.17[M+H]+。經裝備有Phenomenex-Luna 3μ C18 2.0×50 mm管柱之Shimadzu LC-10AS液相層析儀使用SPD-10AV UV-Vis偵測器在220 nM偵測器波長下記錄LC數據。溶離條件採用：流速：0.8 mL/min，梯度：100%溶劑A/0%溶劑B至0%溶劑A/100%溶劑B，梯度時間：4分鐘，保持時間：1分鐘，及分析時間：5分鐘，其中溶劑A為5% MeOH/95% H2O/10 mM乙酸銨且溶劑B為5% H2O/95% MeOH/10 mM乙酸銨。使用LC Micromass Platform在電噴霧模式下測定MS數據。
    將(S)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基)-2-(二苯基亞甲胺基)乙酸苄酯(Cap-2步驟d.2)(129.6 mg，0.294 mmol)溶解於THF(2 mL)中，接著用2 N HCl之水溶液(1.0 mL，2.1 mmol)處理。攪拌反應物2小時，接著在氮氣流下濃縮隔夜。將粗殘餘物溶解於DCM(2 mL)及DIPEA(0.21 mL，1.2 mmol)中，接著用氯甲酸甲酯(0.032 mL，0.41 mmol)處理且在室溫下攪拌4小時。用水(約2.5 mL)稀釋反應物且用DCM(4×2 mL)萃取。合併之有機相在氮氣流下濃縮隔夜，且殘餘物用Biotage® Horizon(4 g SiO2，10%至50% EtOAc/己烷)純化，產生呈無色玻璃狀之(S)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基)-2-(甲氧羰基胺基)乙酸苄酯(Cap-2步驟e)(56 mg)。LC-MS滯留時間為3.338分鐘；m/z 335.99[M+H]+。經裝備有Phenomenex-Luna 3μ C18 2.0×50 mm管柱之Shimadzu LC-10AS液相層析儀使用SPD-10AV UV-Vis偵測器在220 nM偵測器波長下記錄LC數據。溶離條件採用：流速：0.8 mL/min，梯度：100%溶劑A/0%溶劑B至0%溶劑A/100%溶劑B，梯度時間：4分鐘，保持時間：1分鐘，及分析時間：5分鐘，其中溶劑A為5% MeOH/95% H2O/10 mM乙酸銨且溶劑B為5% H2O/95% MeOH/10 mM乙酸銨。使用LC Micromass Platform在電噴霧模式下測定MS數據。1H NMR(400 MHz,D4-MeOH)δ ppm 7.29-7.42(m,5 H),5.28(d,J=12.0 Hz,1 H),5.09(d,J=12.0 Hz,1 H),4.10-4.20(m,2 H),3.68-3.78(m,1 H),3.65(s,3 H),2.22-2.36(m,1 H),1.42-1.54(m,2 H),1.29-1.38(m,1 H),1.17(d,J=6.8 Hz,3 H),1.04(d,J=6.0 Hz,3 H),0.89-1.00(m,1 H)。 Cap-2
    將(S)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基)-2-(甲氧羰基胺基)乙酸苄酯(Cap-2步驟e)(56 mg，0.167 mmol)溶解於MeOH(4 mL)中，接著用10% Pd/C(12 mg，0.012 mmol)處理。反應混合物用氮氣真空沖洗(4次)，接著用氫氣真空沖洗(4次)，且在氫氣球下攪拌隔夜。反應物經由Celite®過濾且濃縮，產生呈無色油狀之(S)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基)-2-(甲氧羰基胺基)乙酸(Cap-2)(41 mg)。1H NMR(400 MHz,D4-MeOH)δ ppm 4.22(五重峰，J=6.4 Hz,1 H),4.04-4.11(m,1 H),3.78-3.87(m,1 H),3.66(s,3 H),2.26-2.39(m,1 H),1.63(d,J=13.1 Hz,1 H),1.51-1.60(m,1 H),1.42-1.49(m,1 H),1.27(d,J=7.0 Hz,3 H),1.11(d,J=6.3 Hz,3 H),0.97-1.08(m,1 H)。
    注意：Cap-2之絕對立體化學構型藉由由Cap-2((R)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基)-2-((甲氧羰基)胺基)乙酸)及(S)-1-(萘-2-基)乙胺之差向異構體製備之醯胺類似物之單晶X射線分析確定。
    流程-1闡明Cap-2之替代合成。使用所報導之程序的改編執行產生(R)-2-甲基-2H-哌喃-4(3H)-酮之前4個步驟(Anderson,K.R等人，Org.Proc.Res.Dev.2010,14,58)。用所報導之程序之改編使(R)-2-甲基-2H-哌喃-4(3H)-酮轉化成(2R,6R)-2,6-二甲基二氫-2H-哌喃-4(3H)-酮(Reddy,D.S.等人，J.Org.Chem. 2004 ,69,1716)。下文提供其他細節。
    (R)-3-(第三丁基二甲基矽烷氧基)丁酸乙酯
    在氮氣下，在0℃下將第三丁基氯二甲基矽烷(547 g，3.63 mol)添加至(R)-3-羥基丁酸乙酯(400 g，3.03 mol)於DCM(800 mL)中之經攪拌溶液中。經20分鐘逐份添加咪唑(412 g，6.05 mol)至反應混合物中，其間混合物變成稠厚白色漿料。再添加DCM(175 mL)且使混合物升溫至室溫且攪拌16小時。藉由過濾移除白色固體，用DCM(500 mL)沖洗，分配於水(1 L)與DCM(500 mL)之間，且水層再用DCM(500 mL)進一步萃取。濾液與有機層合併且用水(500 mL)及鹽水洗滌，經MgSO4乾燥且過濾。濃縮產物且高真空乾燥，產生含有未鑑別雜質之(R)-3-(第三丁基二甲基矽烷氧基)丁酸乙酯(777.5 g)。粗產物之分析數據與文獻中所報導之數據相符。物質未經額外純化即使用。 (R)-3-(第三丁基二甲基矽烷氧基)-N-甲氧基-N-甲基丁醯胺
    經60分鐘經由套管將2 M氯化異丙基鎂於THF中之溶液(800 mL，1.60 mol)逐滴添加至(R)-3-(第三丁基二甲基矽烷氧基)丁酸乙酯(131 g，532 mmol)及N,O-二甲基羥胺/HCl(80 g，824 mmol)於無水THF(850 mL)中之經攪拌溶液中，同時維持內部溫度在-30℃與-20℃之間。在-20℃與-10℃之間攪拌懸浮液3小時，且趁冷卻時用飽和氯化銨水溶液(400 mL)淬滅。使反應混合物分配於水(200 mL)與乙醚(500 mL)之間，且用乙醚(1 L)進一步萃取水相。合併之有機相用鹽水洗滌，經MgSO4乾燥，過濾，濃縮且高真空乾燥，產生(R)-3-(第三丁基二甲基矽烷氧基)-N-甲氧基-N-甲基丁醯胺。重複該反應6次，產生總計717 g之物質。分析數據與文獻中所報導之數據相符。物質未經額外純化即使用。 N-亞乙基哌啶-1-胺
    相關參考文獻參見：(a)Marques-Lopez,E.等人，Eur.J.Org.Chem. 2008 ,20,3457。(b)Corey,E.等人，Chem.Ber. 1978 ,111,1337。(c)Chudek,J.A.等人，J.Chem.Soc.Perkin Trans 2 1985 ,8,1285。
    經60分鐘將哌啶-1-胺(754 mL，6.99 mol)逐滴添加至維持於0℃之乙醛(304 mL，5.38 mol)中，同時在氮氣下攪拌。[注意： 添加引起放熱。據此，含有哌啶-1-胺之滴液漏斗由於乙醛在滴液漏斗中汽化且凝結而發熱]。在0℃下1小時且在室溫下1小時後，在反應燒瓶上裝備16吋回流冷凝器且升溫至40℃且攪拌20小時。使反應混合物冷卻至室溫且分配於乙醚(700 mL)與鹽水(300 mL)之間。有機層用水洗滌且水層用乙醚(2×500 mL)萃取。合併之有機層用鹽水洗滌，經MgSO4乾燥，過濾，濃縮且高真空乾燥8小時得到呈黃色油狀之(E)-N-亞乙基哌啶-1-胺(772 g)(含有雜質)。分析數據與文獻中所報導之數據相符。物質未經額外純化即使用。 (E)-5-((R)-第三丁基二甲基矽烷氧基)-1-(哌啶-1-基亞胺基)己-3-酮
    在0℃下在氮氣下經40分鐘將正丁基鋰之己烷溶液(2.5 M，644 mL，1.61 mol)添加至二異丙基胺(245 mL，1.72 mol)於無水THF(2.3 L)中之經攪拌溶液中。在0℃下攪拌混合物30分鐘，接著逐滴添加(E)-N-亞乙基哌啶-1-胺(203 g，1.61 mol)於無水THF(100 mL)中之溶液。在0℃下攪拌反應混合物2小時且使懸浮液冷卻至-78℃，且用(R)-3-(第三丁基二甲基矽烷氧基)-N-甲氧基-N-甲基丁醯胺(280.4 g，1.073 mol)於無水THF(100 mL)中之溶液逐滴處理。在-78℃下攪拌反應混合物3小時，使其緩慢升溫至室溫，接著攪拌16小時。使反應混合物分配於水(600 mL)與乙醚(1.5 L)之間，且用乙醚進一步萃取水層。用鹽水洗滌合併之有機層，經MgSO4乾燥，過濾且濃縮，產生琥珀色油狀物。粗油狀物經由短管柱純化(於4 L燒結玻璃漏斗中之3 L矽膠用5% EtOAc/己烷預先平衡，接著將粗油狀物溶解於50 mL DCM/己烷(1：5)中且裝載於矽膠之上，且最終用5%至40% EtOAc/己烷溶離管柱)，產生(E)-5-((R)-第三丁基二甲基矽烷氧基)-1-(哌啶-1-基亞胺基)己-3-酮。合併含雜質溶離份，濃縮且用Biotage® Horizon(300 g SiO2，15%至45% EtOAc/己烷)再純化，產生另外產物(總計230 g)。分析數據與文獻中所報導之數據相符。物質未經額外純化即使用。 (R)-2-甲基-2H-哌喃-4(3H)-酮
    將Amberlyst-15(122 g，372 mmol)(乾燥形式，淡棕色珠粒，Alfa Aesar，儲備編號89079或L14146)整份添加至(E)-5-((R)-第三丁基二甲基矽烷氧基)-1-(哌啶-1-基亞胺基)己-3-酮(121 g，372 mmol)於無水THF(1.2 L)中之經攪拌溶液中。回流混合物2.5小時，冷卻，過濾且濃縮，得到琥珀色液體。粗液體經由短管柱純化(將粗產物溶解於30 mL 5% EtOAc/己烷中且裝載於4 L燒結玻璃漏斗中之用5% EtOAc/hex預先平衡之1.5 L矽膠之上，且管柱用5%至50% EtOAc/己烷溶離)，產生烯酮(R)-2-甲基-2H-哌喃-4(3H)-酮。注意：藉由小心旋轉蒸發移除溶劑(浴溫低於或等於周圍溫度)，但在回收捕集器中偵測到一些所需產物。使用20吋具有蒸餾頭之Vigreux管柱濃縮此物質以移除溶劑，且與原始物質合併。總所需產物進一步藉由蒸餾純化以得到無色油狀物(17.8 g)，其在10 mm Hg下之沸點為68℃-70℃。旋光度：+212.8，在c=0.46 g/100 mL CHCl3下。 (2R,6R)-2,6-二甲基二氫-2H-哌喃-4(3H)-酮
    在氮氣下，經20 min將甲基鋰之乙醚溶液(1.6 M，218 mL，349 mmol)以每份約10 mL逐份添加至碘化銅(I)(44.3 g，233 mmol)於乙醚(350 mL)中之冷卻至0℃之經攪拌漿料中。在0℃下攪拌反應混合物30分鐘，接著經30分鐘逐滴添加含(R)-2-甲基-2H-哌喃-4(3H)-酮(13.5 g，116 mmol)之乙醚(150 mL)。移除冷浴且使反應混合物升溫至室溫且攪拌3小時。將反應混合物緩慢添加(經約5分鐘)至飽和NH4Cl(水溶液)(約750 mL)及冰之經攪拌溶液中。再添加乙醚(約500 mL)及水(約150 mL)，且攪拌含有灰色沈澱物之溶液隔夜。分離各層且水層用乙醚(500 mL)及DCM(500 mL)萃取。乾燥(MgSO4)合併之有機相，過濾且濃縮(旋轉蒸發儀浴溫維持於周圍溫度或低於周圍溫度)，得到橙色油狀物。粗油狀物用Biotage® Horizon(240 g SiO2，含1%至4%乙醚之DCM，管柱用DCM預先平衡)純化，產生呈淺黃色油狀之(2R,6R)-2,6-二甲基二氫-2H-哌喃-4(3H)-酮(13.4 g，根據1H-NMR，純度為86%)。[注意：小心濃縮物質且根據1H-NMR含有10重量% DCM。1H-NMR分析亦指示物質受約2.5%由先前反應帶入之TBDMSOH及1.6% (2R,6S)-2,6-二甲基二氫-2H-哌喃-4(3H)-酮污染]。產物之分析數據與文獻所報導之數據符合，且該物質未經額外純化即使用。1H-NMR(400 MHz,CDCl3)δ 4.41-4.25(m,2H),2.55(ddd,J=14.1,4.8,1.4 Hz,2H),2.24(ddd,J=14.1,6.5,1.5 Hz,2H),1.28(d,J=6.5 Hz,6H)。 2-((2R,6R)-2,6-二甲基-2H-哌喃-4(3H,5H,6H)-亞基)-2-甲醯胺基乙酸乙酯
    將氧化亞銅(2.21 g，15.4 mmol)添加至2-異氰基乙酸乙酯(12.7 mL，116 mmol)於乙醚(300 mL)中之經攪拌溶液中，且用力攪拌漿料10分鐘。經15分鐘添加(2R,6R)-2,6-二甲基二氫-2H-哌喃-4(3H)-酮(15.2 g，103 mmol，純度為87%，含有13重量% DCM)於乙醚(100 mL)中之溶液，且在室溫下攪拌反應混合物2小時。冷卻反應混合物至0℃且用經約15分鐘以每份10 mL逐份添加之1 M KO-tBu之THF溶液(116 mL，116 mmol)處理，接著在0℃下攪拌1小時。添加乙酸(6.66 mL，116 mmol)於DCM(60 mL)中之溶液，且使反應混合物升溫至室溫且攪拌2小時。使粗反應混合物分配於水(約300 mL)與乙醚(約300 mL)之間，且用DCM(300 mL)進一步萃取水層。乾燥(MgSO4)合併之有機相，過濾且濃縮，得到暗紅色油狀物，其在真空下凝固。粗物質用Biotage® Horizon層析(300 g SiO2；使用最小量之DCM裝載於管柱上；用40%至60% EtOAc/己烷溶離，保持於40%歷經4倍管柱體積)純化。所需產物之早期溶離份亦含有目標產物之順式立體異構型式作為雜質。合併此等含雜質溶離份，濃縮，得到8.9 g淺黃色油狀物，用Biotage® Horizon層析(240 g矽膠；用40%至65% EtOAc/己烷溶離，保持於40%歷經5倍管柱體積)再純化。合併來自兩次純化之所有如TLC所測定具有潔淨所需產物的溶離份，濃縮，產生呈淺黃色固體狀之2-((2R,6R)-2,6-二甲基-2H-哌喃-4(3H,5H,6H)-亞基)-2-甲醯胺基乙酸乙酯(18.8 g)，受<1%(HPLC)順式二甲基異構變異體污染。
    純物質之1H-及13C-NMR數據呈現為醯胺旋轉異構體之2：1混合物：1H-NMR(400 MHz,CDCl3)δ 8.24(d,J=1.3 Hz,0.66H),7.98(d,J=11.5 Hz,0.33H),6.71(br.s.,0.66H),6.56(d,J=12.0 Hz,0.33H),4.32-4.00(m,4H),3.05(dd,J=14.3,4.3 Hz,0.33H),2.92(d,J=5.3 Hz,1.33H),2.82(dd,J=14.3,6.5 Hz,0.33H),2.62(dd,J=13.9,3.9 Hz,0.33H),2.45(dd,J=14.1,3.8 Hz,0.66H),2.24(dd,J=13.8,7.3 Hz,0.33H),2.14-2.04(m,0.66H),1.37-1.29(m,3H),1.28-1.18(m,6H)。13C-NMR(101MHz,CDCl3)δ 164.5(0.66C),163.9(0.33C),163.8(0.33C),159.3(0.66C),147.5(0.33C),147.0(0.66C),120.3(0.33C),118.6(0.66C),68.1(0.66C),67.8(0.33C),67.4(0.33C),66.8(0.66C),61.1(0.33C),60.9(0.66C),38.2(0.66C),37.4(0.33C),36.2(0.33C),36.0(0.66C),20.5(0.66C),20.1(0.33C),19.5(0.33C),19.2(0.66C),13.8(s,1C)。LC-MS滯留時間為1.85分鐘；m/z 242.45(M+H)+。經裝備有Phenomenex-Luna 3μ C18 2.0×50 mm管柱之Shimadzu LC-10AS液相層析儀使用SPD-10AV UV-Vis偵測器在220 nM偵測器波長下記錄LC數據。溶離條件採用：流速：0.8 mL/min，梯度：100%溶劑A/0%溶劑B至0%溶劑A/100%溶劑B，梯度時間：4分鐘，保持時間：1分鐘，及分析時間：5分鐘。溶劑A為10%乙腈/90% H2O/0.1%三氟乙酸，且溶劑B為10% H2O/90%乙腈/0.1%三氟乙酸。使用LC Micromass Platform在電噴霧模式下測定MS數據。 (S)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基)-2-甲醯胺基乙酸乙酯
    在2.5 L帕爾氫化容器中，使氮氣鼓泡通過2-((2R,6R)-2,6-二甲基-2H-哌喃-4(3H,5H,6H)-亞基)-2-甲醯胺基乙酸乙酯(17.0 g，70.5 mmol)於MeOH(480 mL)中之溶液10分鐘。接著添加四氟硼酸(-)-1,2-雙((2S,5S)-2,5-二甲基磷基)乙烷(環辛二烯)-銠(I)(0.706 g，1.27 mmol)且密封反應容器，用氮氣真空沖洗(4次)，接著用氫氣真空沖洗(4次)。在60 psi氫氣下震盪反應溶液3天，自震盪器移出且濃縮，得到暗紅色油狀物。粗油狀物用Biotage® Horizon層析(300 g SiO2，50%至75% EtOAc/己烷)純化，產生呈淺黃色黏性油狀之(S)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基)-2-甲醯胺基乙酸乙酯(17.4 g，根據1H-NMR含有5.9重量%溶劑(EtOAc及DCM))。1H-NMR數據指示兩種醯胺旋轉異構體之10：1混合物。1H-NMR(400 MHz,CDCl3)δ 8.26(s,0.9H),8.01(d,J=11.8 Hz,0.1H),6.15(d,J=8.5 Hz,0.9H),5.96-5.84(m,0.1H),4.68(dd,J=9.0,5.0 Hz,0.9H),4.33-4.17(m,3H),3.87(dd,J=10.2,6.4 Hz,0.1H),3.75(dqd,J=11.5,6.0,2.0 Hz,1H),2.41-2.29(m,0.9H),2.29-2.19(m,0.1H),1.72-1.28(m,3H),1.28-1.23(m,6H),1.17-1.10(m,3H),1.09-0.96(m,1H)。13C-NMR(101 MHz,CDCl3)δ 170.6,160.3,68.1,64.0,61.4,54.2,36.0,33.1,30.6,21.9,16.7,13.9。LC-MS滯留時間為1.64分鐘；m/z 244.25(M+H)+。經裝備有Phenomenex-Luna 3μ C18 2.0×50 mm管柱之Shimadzu LC-10AS液相層析儀使用SPD-10AV UV-Vis偵測器在220 nM偵測器波長下記錄LC數據。溶離條件採用：流速：0.8 mL/min，梯度：100%溶劑A/0%溶劑B至0%溶劑A/100%溶劑B，梯度時間：4分鐘，保持時間：1分鐘，及分析時間：5分鐘。溶劑A為10%乙腈/90% H2O/0.1%三氟乙酸，且溶劑B為10% H2O/90%乙腈/0.1%三氟乙酸。使用LC Micromass Platform在電噴霧模式下測定MS數據。 (S)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基)-2-(甲氧羰基胺基)乙酸乙酯
    化學式：C13H23NO5
    分子量：273.33
    在裝備有冷凝器之用隔片塞住且用針開孔之1 L燒瓶中，於預先平衡之油浴中在52℃下加熱(S)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基)-2-甲醯胺基乙酸乙酯(17.6 g，72.3 mmol)於乙醇(409 mL)及1.5 N HCl(水溶液)(409 mL)中之溶液7.5小時。真空移除揮發性組分且使殘餘物與EtOH(2×50 mL)共沸且真空乾燥隔夜，得到白色泡沫狀物。將白色泡沫狀物溶解於DCM(409 mL)中且經10分鐘逐滴添加N,N-二異丙基乙胺(38.0 mL，218 mmol)，之後亦經10分鐘逐滴添加氯甲酸甲酯(8.40 mL 109 mmol)。在周圍溫度下攪拌反應混合物4.5小時，接著小心地用1 N HCl(100毫升)淬滅。分離各層且有機層依序用1 N HCl(50 mL)、鹼性水溶液(50 mL水+2 mL飽和NaHCO3)洗滌。乾燥(MgSO4)有機層，過濾且濃縮。殘餘物用Biotage®(300 g SiO2；用最小量氯仿將樣品裝載於管柱上，且用30% EtOAc/己烷溶離)純化，產生呈黏性黃色油狀之(S)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基)-2-(甲氧羰基胺基)乙酸乙酯(13.8 g)。1H-NMR(400 MHz,CDCl3)δ 5.23(d,J=8.8 Hz,1H),4.34-4.15(m,4H),3.81-3.72(m,1H),3.70(s,3H),2.35-2.23(m,1H),1.63-1.51(m,2H),1.34-1.27(『m』及『t』重疊，J=7.0 Hz,1H & 3H),1.25(d,J=6.8 Hz,3H),1.14(d,J=6.0 Hz,3H),1.11-0.99(m,1H)。LC-MS滯留時間為2.89 min；m/z 296.23(M+Na)+。經裝備有Phenomenex-Luna 3μ C18 2.0×50 mm管柱之Shimadzu LC-10AS液相層析儀使用SPD-10AV UV-Vis偵測器在220 nM偵測器波長下記錄LC數據。溶離條件採用：流速：0.8 mL/min，梯度：100%溶劑A/0%溶劑B至0%溶劑A/100%溶劑B，梯度時間：4分鐘，保持時間：1分鐘，及分析時間：5分鐘。溶劑A為10% MeOH/90% H2O/0.1%三氟乙酸，且溶劑B為10% H2O/90%甲醇/0.1%三氟乙酸。使用LC Micromass Platform在電噴霧模式下測定MS數據。
    另外注意：以上產物藉由SFC層析(每次注射180 mg，輸送量為7.2 g/h)進一步純化，之後進行水解步驟以移除未鑑別之雜質。條件：管柱：ChiralPak AD-H 25×3cm,5μ
    管柱溫度：25℃
    流速：150 mL/min
    移動相：CO2/MeOH=93/7
    注射體積：1.0 mL(180 mg/mL)
    注射模式：疊層式(注射/運作時間(分鐘)=1.47/3.0)
    偵測器波長：220 nm
    樣品溶劑：CH3OH/CH3CN=1：1(v/v) (S)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基)-2-(甲氧羰基胺基)乙酸(Cap-2)
    經65分鐘將含氫氧化鋰水合物(8.51 g，203 mmol)之H2O(270 mL)逐滴添加至(S)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基)-2-(甲氧羰基胺基)乙酸乙酯之經攪拌溶液(27.7 g，101 mmol)於THF(405 mL)中之溶液中，同時維持內部溫度<5℃。於冰浴中攪拌反應混合物40分鐘，接著於水浴中在室溫下攪拌5小時。部分濃縮反應混合物以移除THF，接著分配於水(250 mL)與DCM(250 mL)之間。用1 N HCl(205 mL)將水層調節至pH=2，接著用乙酸異丙酯(7×250 mL)萃取。用鹽水(1×600 mL)洗滌合併之萃取物，乾燥(MgSO4)，過濾且濃縮。所得黏性油狀物用甲苯(100 mL)及乙醚(75 mL)處理，蒸發且真空乾燥，得到呈白色泡沫狀之Cap-2(25.8 g，具有0.33當量甲苯)。對掌性SFC純度>99.9%(Chiralpak AD-H(25 cm×0.46 cm，5 μm)，含5% EtOH之CO2，3 mL/min，35℃，220 nm，100巴)。HPLC純度為95.6%(管柱：Sunfire C8 75 mm×4.6 mm，ID：2.5 μm；40℃；移動相：A=含0.1%甲酸之水；B=含0.1%甲酸之CH3CN)。LC/MS(ES+)228.1(M+H-H2O)+。根據1H-NMR，該物質含有約0.33當量之甲苯。1H-NMR(400 MHz,CDCl3)δ 5.29(d,J=8.6 Hz,1H),4.46-4.25(m,2H),3.82(dd,J=9.7,5.9 Hz,1H),3.74(s,3H),2.46-2.30(m,1H),1.76-1.55(m,2H),1.51-1.35(m,1H),1.29(d,J=6.8 Hz,3H),1.18(d,J=6.2 Hz,3H),1.18-1.06(m,1H)。13C-NMR(101 MHz,CDCl3)δ 174.1,156.7,68.3,64.4,57.5,52.2,35.8,32.6,30.3,21.6,16.7。
    (4,4'-聯苯二基雙(1H-咪唑-4,2-二基((2S,5S)-5-甲基-2,1-吡咯啶二基)((1S)-1-((2R,6R)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基)-2-側氧基-2,1-乙二基)))雙胺基甲酸二甲酯
    以上化合物根據文獻方案(J.Med.Chem.,2006,49,3520)，純化作出以下修改而合成：在周圍溫度下自EtOAc/己烷再結晶粗物質，得到呈白色晶體狀之實例1步驟a。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ ppm 4.32(br m,1H),3.89(br m,1H),2.40(br m,1H),2.00(m,2H),1.65(m,1H),1.45(s,9H),1.20(d,J=5.6,3H)。LC/MS：[M+Na]+ C11H20NO4Na之分析計算值為252.12；實驗值為252.21。
    向實例1步驟a(7.12 g，31.1 mmol)及1,1'-(聯苯-4,4'-二基)雙(2-溴乙酮)(6.0 g，15 mmol)於乙腈(100 mL)中之混合物中逐滴添加i-Pr2EtN(5.56 mL，31.8 mmol)，且在室溫下攪拌反應物3小時。真空移除揮發性組分且使殘餘物分配於CH2Cl2(100 mL)與飽和NaHCO3水溶液(100 mL)之間。分離有機層且用水及鹽水洗滌，乾燥(Na2SO4)，過濾且真空濃縮，得到呈白色泡沫狀之實例1步驟b(9.83 g)，其未經純化即用於下一步驟。1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ ppm 8.01(4 H,t,J=7.32 Hz),7.73(4 H,d,J=6.71 Hz),5.18-5.66(4 H,m),4.51(1 H,t,J=7.17 Hz),4.42(1 H,t,J=7.32 Hz),4.06(1 H,d,J=3.36 Hz),3.95(1 H,d,J=5.19 Hz),2.27-2.37(4 H,m),2.01-2.17(2 H,m),1.67-1.82(2 H,m),1.39-1.52(18 H,m),1.32(6 H,t,J=6.56 Hz)。LC-MS：[M+H]+ C38H49N2O10之分析計算值為693.34；實驗值為693.34。
    於壓力管中在140℃下加熱實例1步驟b(9.83 g，14.19 mmol)及乙酸銨(10.94 g，142 mmol)於二甲苯(160 mL)中之混合物4小時。真空移除揮發性組分且使殘餘物分配於CH2Cl2(140 mL)與水(100 mL)之間。用飽和NaHCO3(100 mL)洗滌有機層，乾燥(Na2SO4)且真空濃縮。所得粗物質經由Biotage®(20%至50% EtOAc/Hex；300 g管柱)純化，得到呈淺棕色固體狀之實例1步驟c(4.3 g)。1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ ppm 11.73(2 H,br.s.),7.83(3 H,d,J=7.63 Hz),7.62-7.76(5 H,m),7.27-7.55(2 H,m),4.82(2 H,br.s.),3.89(2 H,br.s.),2.10(6 H,d,J=15.26 Hz),1.58-1.89(2 H,m),1.11-1.52(24 H,m)。LC/MS：[M+H]+ C38H49N6O4之分析計算值為653.37；實驗值為653.60。
    替代程序：在80℃下加熱實例1步驟b(157 g，227 mmol)、乙酸銨(332 g，4310 mmol)及咪唑(54.1 g，795 mmol)於甲苯(1.2 L)中之混合物1小時，同時用氮氣吹掃頂部空間。使溫度升至85℃且攪拌反應混合物18小時。移除溶劑且使殘餘物溶解於DCM(2 L)中，用水(1 L)及飽和NaHCO3(3 L)洗滌，接著乾燥(MgSO4)，過濾且濃縮。將殘餘物溶解於MeOH(4 L)中，濃縮至約900 mL且在室溫下靜置。在2小時之後，藉由過濾收集沈澱之固體，用MeOH洗滌且乾燥，產生白色固體。自甲醇(溶解於4 L中，接著減少至約0.9 L)再結晶此物質且乾燥，得到呈白色固體狀之實例1步驟c(99.5 g)。來自母液之粗化合物藉由矽膠層析(300 g SiO2，20%至50% EtOAc/己烷)純化，產生呈白色固體狀之另外產物(13.0 g)。
    將4 N HCl之二噁烷溶液(8.23 mL，32.9 mmol)逐滴添加至實例1步驟c(4.3 g，6.6 mmol)之CH2Cl2(100 mL)溶液中，且在室溫下攪拌反應混合物3小時。真空移除揮發性組分，得到呈黃色固體狀之實例1步驟d之鹽酸鹽(3.6 g)。1H NMR(400 MHz,DMSO-d 6)δ ppm 10.55(2 H,br.s.),9.73(2 H,br.s.),8.12-8.26(2 H,m),8.03(4 H,d,J=8.03 Hz),7.92(4 H,d,J=6.02 Hz),5.07(2 H,m,J=7.53 Hz),3.82(2 H,br.s.),2.53-2.65(4 H,m),2.27(2 H,dd,J=12.42,6.40 Hz),1.85-1.99(2 H,m),1.45(6 H,d,J=6.27 Hz)。LC/MS：[M+H]+ C28H33N6之分析計算值為453.28；實驗值為453.21。
    以上脫除保護基之產物的純度可藉由應用以下再結晶程序來提高：在60℃攪拌下經15分鐘經由加料漏斗將2-丙醇(242 mL)添加至實例1步驟d(60.5 g，HPLC純度為98.9%)於水(121 mL)中之溶液中，同時維持內部溫度在50℃與60℃之間。再攪拌溶液5分鐘，移除加熱套且在周圍溫度下攪拌混合物隔夜。藉由過濾收集沈澱之固體，用2-丙醇洗滌且在室內真空下乾燥隔夜，得到HPLC純度為99.7%之黃色固體(54.4 g)(管柱：BEH C18 150 mm(L)×2.1 mm(ID)，1.7 μm，移動相：A：含0.05% TFA之水；B：含0.05% TFA之ACN)。KF 15.3重量%(6.0 mol H2O)。 實例1
    將HATU(1.60 g，4.21 mmol)添加至實例1步驟d之鹽酸鹽(1.2 g，2.0 mmol)、Cap-1(1.01 g，4.11 mmol)及DIEA(2.1 mL，12 mmol)於DMF(20 mL)中之溶液中，且在室溫下攪拌所得黃色溶液3小時。混合物用EtOAc(75 mL)稀釋，且用水(100 mL)洗滌。水層用EtOAc(75 mL)反萃取，且合併之有機層用50%飽和NaHCO3水溶液(100 mL)、水(100 mL)及鹽水(100 mL)洗滌。接著乾燥(無水MgSO4)，過濾且濃縮。剩餘殘餘物用CH3OH稀釋且進行逆相HPLC純化：溶劑A：5% MeCN/95%水/10 nM NH4OAc；溶劑B：95% MeCN/5%水/10 nM NH4OAc；管柱：Sunfire製備型C18 50 mm×300 mm 10μ；波長：220 nM；流速：150 ml/min；梯度：經25分鐘0% B至70% B，保持時間為5分鐘。真空濃縮，產生呈灰白色泡沫狀之(4,4'-聯苯二基雙(1H-咪唑-4,2-二基((2S,5S)-5-甲基-2,1-吡咯啶二基)((1S)-1-((2R,6R)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基)-2-側氧基-2,1-乙二基)))雙胺基甲酸二甲酯(實例1)(1.2 g)。自EtOAc/石油醚結晶得到非晶形灰白色固體。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)(關於TFA鹽)δ 7.92(br.s.,8H),7.59(d,J=7.9 Hz,2H),5.03(t,J=8.5 Hz,2H),4.69-4.60(m,2H),4.00(t,J=8.4 Hz,2H),3.55(s,6H),3.36(br.s.,1H),3.33-3.26(m,2H),3.21(br.s.,2H),2.37(br.s.,1H),2.26(d,J=11.3 Hz,1H),1.95-1.81(m,3H),1.65(d,J=10.7 Hz,2H),1.48(d,J=6.4 Hz,6H),1.28-1.23(m,4H),1.10-0.99(m,16H),0.90-0.75(m,4H)。
    LC/MS：[M+H]+ C50H67N8O8之分析計算值為907.51；實驗值為907.8。在以下LC條件下Rt=3.99分鐘且均質度指數>95%：管柱：Phenomenex-Luna 2.0×50 mm 3 μm；起始B%=0；最終B%=100；梯度時間=10分鐘；流速=4 mL/Min；波長=220；溶劑A=H2O：ACN 95%：5% 10 mm乙酸銨；溶劑B=H2O：ACN 5%：95% 10 mm乙酸銨。
    (4,4'-聯苯二基雙(1H-咪唑-4,2-二基((2S,5S)-5-甲基-2,1-吡咯啶二基)((1S)-1-((2R,6R)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基)-2-側氧基-2,1-乙二基)))雙胺基甲酸二甲酯
    將HATU(63.6 mg，0.167 mmol)添加至(S)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基)-2-(甲氧羰基胺基)乙酸(Cap-2)(41 mg，0.17 mmol)及實例1步驟d之鹽酸鹽(45.5 mg，0.076 mmol)於DMF(0.9 mL)及DIPEA(0.11 mL，0.61 mmol)中之經攪拌溶液中。在室溫下攪拌反應混合物4小時，接著在氮氣流下濃縮隔夜。將殘餘物溶解於MeOH中，過濾且藉由製備型HPLC(Phenomenex Luna C18(2)100×30 mm，10微米；MeOH/水)純化，得到呈淺黃色固體狀之(4,4'-聯苯二基雙(1H-咪唑-4,2-二基((2S,5S)-5-甲基-2,1-吡咯啶二基)((1S)-1-((2R,6R)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基)-2-側氧基-2,1-乙二基)))雙胺基甲酸二甲基酯之TFA鹽(實例2)(62.5 mg)。1H NMR指示存在旋轉異構體之混合物；對於主要旋轉異構體：1H NMR(400 MHz,MeOH-d4)δ 8.02-7.93(m,3H),7.88(br s,7H),5.18(dd,J=10.7,7.2 Hz,2H),4.77(五重峰，J=6.6 Hz,2H),4.27-4.17(m,2H),4.15(d,J=9.3 Hz,2H),3.72-3.66(m,2H),3.67(s,6H),2.72-2.50(m,2H),2.48-2.16(m,6H),1.99(dd,J=12.2,5.6 Hz,2H),1.76-1.59(m,2H),1.57(d,J=6.5 Hz,6H),1.52-1.40(m,2H),1.30(dd,J=9.7,6.7 Hz,2H),1.22(d,J=6.8 Hz,6H),1.06(d,J=6.0 Hz,6H),0.97(明顯q,J=12.0 Hz,2H)。LC-MS滯留時間為3.84分鐘；m/z 905.38[M-H]-。經裝備有Phenomenex-Luna 3μ C18 2.0×50 mm管柱之Shimadzu LC-10AS液相層析儀使用SPD-10AV UV-Vis偵測器在220 nM偵測器波長下記錄LC數據。溶離條件採用：流速：0.8 mL/min，梯度：100%溶劑A/0%溶劑B至0%溶劑A/100%溶劑B，梯度時間：4分鐘，保持時間：1分鐘，及分析時間：5分鐘，其中溶劑A為5% MeOH/95% H2O/10 mM乙酸銨且溶劑B為5% H2O/95% MeOH/10 mM乙酸銨。使用LC Micromass Platform在電噴霧模式下測定MS數據。或者，實例2可如下製備：在室溫下攪拌(S)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基)-2-(甲氧羰基胺基)乙酸(Cap-2)(25.1 g，91.0 mmol)、2-羥基吡啶1-氧化物(10.12 g，91 mmol)及EDC(19.0 g，99.0 mmol)於DMSO(400 mL)中之混合物1小時。向此溶液中添加實例1步驟d(鹽酸鹽；29.2 g，41.4 mmol)且用水/冰浴冷卻所得黃色溶液至10℃。接著將i-Pr2EtN(26.7 g，207 mmol)添加至反應混合物中，且添加完成後，移除冰浴。在周圍溫度下攪拌反應混合物25.5小時，之後藉由傾入冰(1600 g)及水(400 mL)混合物中淬滅。在周圍溫度下攪拌混合物3小時。經布赫納漏斗(Bunchner funnel)經由過濾收集白色固體，接著在室內真空下用通過過濾漏斗上方之氮氣流乾燥隔夜，得到濕潤固體(124 g)。將濕潤固體溶解於DCM(500 mL)中，用水(3×250 mL)洗滌，乾燥(MgSO4)，過濾且濃縮，得到淺棕色固體(39.5 g)。將此物質與來自另一批之類似物質合併(總計44.4 g)，且藉由層析使用ISCO裝置(2×330 g矽膠，0%至30% MeOH/DCM)純化，得到呈棕色固體狀之實例-2(38.1 g)，HPLC純度為98.6%。如下使物質脫色：將43.1 g物質溶解於EtOH(500 mL)中，接著用活性炭(8.6 g)處理。在50℃下加熱混合物1小時，藉由過濾移除木炭(3層濾紙)且再用EtOH(300 mL)沖洗濾餅。蒸發濾液至乾燥且用溫水浴真空乾燥，得到灰白色固體(43.0 g)。產物可藉由利用SFC方案進一步純化：SFC純化條件：
    輸送量：1.2 g/h
    每次注射量 30 mg
    管柱：Princeton CN，25×3 cm，5μ
    管柱溫度：45℃
    流速：200 mL/min
    移動相：CO2/[MeOH/DCM=1：1(以v/v計)]=80/20
    注射體積：2.5 mL(12 mg/mL)
    注射模式：疊層式(注射/運作時間(分鐘)=1.5/3.2)
    偵測器波長：316 nm
    樣品溶劑：CH3OH/DCM=1：1(v/v)
    ((3-甲基-4,4'-聯苯二基)雙(1H-咪唑-4,2-二基((2S,5S)-5-甲基-2,1-吡咯啶二基)((1S)-1-((2R,6R)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基)-2-側氧基-2,1-乙二基)))雙胺基甲酸二甲酯
    在室溫下向4-溴-2-甲基苯甲酸(10 g，46.5 mmol)於DMF(150 mL)中之溶液中依序添加N,O-二甲基羥胺鹽酸鹽(5.44 g，55.8 mmol)、HOBT(8.55 g，55.8 mmol)。接著依序添加EDC(10.7 g，55.8 mmol)、DIPEA(24.4 mL，140 mmol)且在室溫下攪拌反應混合物12小時。反應混合物接著用EtOAc(150 mL)稀釋，用水(3×250 mL)及鹽水(150 mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，過濾且真空濃縮，得到粗實例3步驟a(9.5 g)，其以原樣用於下一步驟。1H NMR(CDCl3,δ=7.26 ppm,400 MHz)：δ 7.37(d,J=1.6 Hz,1H),7.34(dd,J=8.0,1.6 Hz,1H),7.14(d,J=8.0 Hz,1H),3.47(s,3H),3.30(s,3H),2.31(s,3H)。LC/MS：[M+H]+ C10H13 81BrNO2之分析計算值為260.01；實驗值為260.0。
    將實例3步驟a(9.5 g，36.8 mmol)溶解於乙醚(150 mL)中且冷卻至0℃。接著經10分鐘逐滴添加碘化甲基鎂(3.0 M乙醚溶液，24.54 mL，73.6 mmol)。在40℃下攪拌反應物6小時，接著達到室溫且攪拌12小時。反應混合物冷卻至0℃，用冰接著用1.5 N HCl(50 mL)淬滅。分離有機層且水層用甲基第三丁基醚(2×100 mL)萃取，經Na2SO4乾燥且減壓濃縮。粗物質藉由急驟層析(矽膠，60至120，EtOAc：石油醚，2：98)純化，得到呈淡黃色液體狀之實例3步驟b(6.25 g)。1H NMR(CDCl3,δ=7.26 ppm,400 MHz)：δ 7.55(d,J=8.0 Hz,1H),7.41(s,1H),7.40(d,J=8.0 Hz,1H),2.55(s,3H),2.50(s,3H)。
    將4-乙醯苯基酸(5.39 g，32.9 mmol)添加至含有含實例3步驟b(7.0 g，32.9 mmol)之MeOH(75.0 mL)之密封管中且用氮氣淨化反應混合物10分鐘。接著依序添加K2CO3(9.08 g，65.7 mmol)、Pd(Ph3P)4(1.139 g，0.986 mmol)，且再用氮氣淨化反應混合物10分鐘。將反應混合物加熱至75℃維持12小時。接著減壓濃縮反應混合物且殘餘物用EtOAc(100 mL)稀釋，且用水(2×100 mL)、鹽水(50 mL洗滌，經Na2SO4乾燥，過濾且減壓濃縮。殘餘物藉由combiflash(Silicycle，SiO2，10%至15% EtOAc/石油醚)純化，得到呈白色固體狀之實例3步驟c(6.5 g)。1H NMR(CDCl3,δ=7.26 ppm,400 MHz)：δ 8.06-8.04(m,2H),7.81(d,J=8.0 Hz,1H),7.72-7.70(m,2H),7.54-7.49(m,2H),2.65(s,3H),2.63(s,6H)。
    在10℃下將溴(1.12 mL，21.8 mmol)(用10 mL二噁烷稀釋)緩慢(經10分鐘)添加至實例3步驟c(2.75 g，10.90 mmol)於二噁烷(50 mL)中之溶液中，且在室溫下攪拌混合物2小時。用10% NaHCO3(25 mL)淬滅反應物且用DCM(50 mL)萃取。經Na2SO4乾燥有機相且減壓濃縮，得到粗實例3步驟d(5.0 g)，其未經純化即以原樣用於下一步驟。LC/MS：[M+H]+ C17H15 79/81Br2O2之分析計算值為410.94；實驗值為411.0。
    在0℃下向粗實例3步驟d(5.1 g，12 mmol)於乙腈(75 mL)中之溶液中依序添加(2S,5S)-1-(第三丁氧羰基)-5-甲基吡咯啶-2-甲酸(實例1步驟a)(5.70 g，24.9 mmol)、DIPEA(8.69 mL，49.7 mmol)。10分鐘後，溫度升高至室溫且攪拌2小時。接著用EtOAc(100 mL)稀釋反應混合物，且用10% NaHCO3(50 mL)、鹽水(50 mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，過濾且減壓濃縮。殘餘物藉由combiflash(Silieyele，SiO2，25%至30% EtOAe/石油醚)純化，得到呈淡黃色油狀之實例3步驟e(5.8 g)。1H NMR(CDCl3,δ=7.26 ppm,400 MHz)：δ 8.00(明顯bd,2H),7.71(明顯d,3H),7.53-7.51(m,2H),5.61-5.34(m,2H),5.29-5.04(m,2H),4.51-4.36(m,2H),4.09-3.91(m,2H),2.59(s,3H),2.35-2.21(m,4H),2.15-2.04(m,2H),1.80-1.63(m,2H),1.47/1.44(s,18H),1.35-1.27(m,6H)。LC/MS：[M-H]- C39H49N2O10之分析計算值為705.35；實驗值為705.30。
    向實例3步驟e(5.6 g，7.92 mmol)於二甲苯(75 mL)中之溶液中添加NH4OAc(12.21 g，158 mmol)，且用氮氣淨化反應混合物10分鐘。在130℃下加熱18小時後，使反應混合物冷卻至室溫且減壓移除揮發性組分。接著用EtOAc(100 mL)稀釋反應混合物，且用10% NaHCO3(50 mL)、鹽水(50 mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，過濾且減壓濃縮。殘餘物藉由combiflash(Redi Sep，C-18管柱，30%至40%乙腈：10 mM碳酸氫銨)純化，得到呈淡黃色固體狀之實例3步驟f(2.3 g)。1H NMR(DMSO-d6,δ=2.50 ppm,400 MHz)：δ 12.27/12.0/11.77/11.71(s,2H),7.92-7.63(m,5H),7.58-7.47(m,3H),7.24(br s,1H),4.90-4.75(m,2H),3.92-3.84(m,2H),2.54(s,3H),2.20-2.01(m,6H),1.73-1.65(m,2H),1.48-1.12(m,24H)。LC/MS：[M-H]- C39H49N6O4之分析計算值為665.39；實驗值為665.4。
    向實例3步驟g(1.55 g，2.32 mmol)於MeOH(10 mL)中之溶液中添加HCl/MeOH(4 N，58.1 mL)且在室溫下攪拌2小時。真空移除揮發性組分，且殘餘物與DCM(3×25 mL)共蒸發。使所得固體曝露於高真空，得到呈淡黃色固體狀之實例3步驟g之鹽酸鹽(1.3 g)。1H NMR(MeOD,δ=3.34 ppm,400 MHz)：δ 8.06(br s,1H),7.98(d,J=8.4 Hz,2H),7.90(d,J=8.4 Hz,2H),7.86(br s,1H),7.78(br s,1H),7.74(d,J=8.4 Hz,1H),7.71(d,J=8.4 Hz,1H),5.27-5.20(m,2H),4.04-4.00(m,2H),2.80-2.67(m,4H),2.59(s,3H),2.55-2.46(m,2H),2.15-2.06(m,2H),1.60(d,J=6.4,6H)。LC/MS：[[M+H]+ C29H35N6之分析計算值為467.28；實驗值為467.2。 實例3
    將HATU(60.5 mg，0.159 mmol)添加至(S)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基)-2-(甲氧羰基胺基)乙酸(Cap-2)(39 mg，0.16 mmol)及實例3步驟g之鹽酸鹽(44.3 mg，0.072 mmol)於DMF(0.9 mL)及DIPEA(0.10 mL，0.58 mmol)中之經攪拌溶液中。在室溫下攪拌反應混合物2小時且在氮氣流下濃縮隔夜。殘餘物用MeOH稀釋，過濾且藉由製備型HPLC(Phenomenex Luna C18(2)100×30 mm，10微米；MeOH/水，含TFA緩衝液)純化，得到呈灰白色固體狀之((3-甲基-4,4'-聯苯二基)雙(1H-咪唑-4,2-二基((2S,5S)-5-甲基-2,1-吡咯啶二基)((1S)-1-((2R,6R)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基)-2-側氧基-2,1-乙二基)))雙胺基甲酸二甲酯之TFA鹽(實例3)(60.2 mg)。1H NMR(400MHz,MeOH-d4)δ 8.01-7.84(m,5H),7.78-7.54(m,4H),5.75(d,J=6.0 Hz,0.4H),5.19(ddd,J=10.7,6.9,4.0 Hz,1.6H),4.84-4.72(m,2H),4.36-4.12(m,4H),3.85-3.58(m,8H),2.69-1.95(m,13H),1.75-1.40(m,10H),1.37-1.02(m,14H),0.96(明顯q,J=12.2 Hz,2H)。LC-MS滯留時間為4.050分鐘；m/z 461.31[1/2M+H]+。經裝備有Phenomenex-Luna 3μ C18 2.0×50 mm管柱之Shimadzu LC-10AS液相層析儀使用SPD-10AV UV-Vis偵測器在220 nM偵測器波長下記錄LC數據。溶離條件採用：流速：0.8 mL/min，梯度：100%溶劑A/0%溶劑B至0%溶劑A/100%溶劑B，梯度時間：4分鐘，保持時間：1分鐘，及分析時間：5分鐘，其中溶劑A為5% MeOH/95%水/10 mM乙酸銨且溶劑B為5%水/95% MeOH/10 mM乙酸銨。使用LC Micromass Platform在電噴霧模式下測定MS數據。
    ((3-氟-4,4'-聯苯二基)雙(1H-咪唑-4,2-二基((2S,5S)-5-甲基-2,1-吡咯啶二基)((1S)-1-((2R,6R)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基)-2-側氧基-2,1-乙二基)))雙胺基甲酸二甲酯
    在冰水浴中在0℃下向1-(4-溴-2-氟苯基)乙酮(5.0 g，23 mmol)於二噁烷(150 mL)及乙醚(150 mL)中之溶液中逐滴添加溴(1.18 mL，23.0 mmol)。攪拌反應物1小時，使其升溫至室溫且攪拌16小時。使混合物分配於EtOAc(50 mL)與飽和NaHCO3(50 mL)之間，且有機層用水洗滌且經Na2SO4乾燥。真空蒸發揮發性組分，且真空乾燥固體隔夜，得到呈白色固體狀之實例4步驟a(6.94 g)。1H NMR(DMSO-d6,δ=2.5 ppm,400 MHz)：7.87-7.79(m,2H),7.62-7.60(m,1H),4.84(s,2H)。
    向實例4步驟a(2.58 g，8.72)及(2S,5S)-1-(第三丁氧羰基)-5-甲基吡咯啶-2-甲酸(2.00 g，8.72 mmol)於乙腈(50 mL)中之溶液中添加DIEA(2.285 mL，13.08 mmol)，在室溫下攪拌混合物64小時。真空移除溶劑且使殘餘物分配於EtOAc(40 mL)與水(30 mL)之間。有機層用飽和NaHCO3及鹽水洗滌，用Na2SO4乾燥且真空蒸發，得到呈黃色固體狀之實例4步驟b(3.8 g)。1H NMR(CDCl3,400 MHz)：7.87(m,1H),7.44(m,2H),5.42-5.09(m,2H),4.53-4.40(m,1H),4.10-3.95(m,1H),2.31(m,2H),2.09(m,1H),1.75(m,1H),1.49-1.46(兩個單峰，9H),1.33(m,3H)。LC/MS：[M+Na]+ C19H24 BrNNaO5之分析計算值為466.06；實驗值為466.03。
    向含有實例4步驟b(3.8 g，8.6 mmol)於二甲苯(40 mL)中之溶液的壓力管中添加乙酸銨(6.59 g，86 mmol)且對反應容器加蓋且在140℃下加熱6小時。真空蒸發揮發性組分且使殘餘物分配於DCM(80 mL)與水(50 mL)之間。分離有機層且用飽和NaHCO3洗滌且用Na2SO4乾燥。真空移除溶劑產生紅色油狀物，藉由急驟層析(0%至40% EtOAc/己烷)純化得到呈棕色固體狀之實例4步驟c(2.3 g)。1H NMR(DMSO-d6,δ=2.5 ppm,400 MHz)：7.98(明顯t,J=8.4 Hz,1H),7.65(dd,J=11,1.9 Hz,1H),7.45(dd,J=8.3,2,1H),7.36(m,1H),4.85(m,1H),3.90(m,1H),2.15-2.07(m,3H),1.73(m,1H),1.40-1.17(m,12H)。LC/MS：[M+Na]+ C19H23 79BrFN3NaO2之分析計算值為446.09；實驗值為446.00。
    向2-溴-1-(4-溴苯基)乙酮(2.425 g，8.72 mmol)及(2S,5S)-1-(第三丁氧羰基)-5-甲基吡咯啶-2-甲酸(2 g，8.72 mmol)於乙腈(50 mL)中之溶液中添加DIEA(1.524 mL，8.72 mmol)，且在室溫下攪拌混合物16小時。真空移除溶劑且使殘餘物分配於EtOAc(40 mL)與水(30 mL)之間。有機相用飽和NaHCO3及鹽水洗滌，且用Na2SO4乾燥。真空移除揮發性組分，得到呈淺黃色固體狀之實例4步驟d(1.74 g)，其未經進一步純化即使用。1H NMR(DMSO-d6,δ=2.5 ppm,400 MHz)：7.95-7.90(m,2H),7.81(m,1H),7.79(m,1H),5.63-5.44(m,2H),4.36(m,1H),3.99(m,1H),2.27(m,1H),2.09(m,2H),1.63(m,1H),1.41-1.37(兩個單峰，9H),1.19(m,3H)。LC/MS：[M+Na]+ C19H24BrNNaO5之分析計算值為448.07；實驗值為448.06。
    向含有實例4步驟d(3.4 g，8.0 mmol)於二甲苯(40 mL)中之溶液之壓力管中添加乙酸銨(6.15 g，80 mmol)，且在140℃下加熱混合物6小時。真空移除揮發性組分，使殘餘物小心分配於DCM(60 mL)與飽和NaHCO3(30 mL)之間，且分離有機層且用Na2SO4乾燥。真空移除溶劑，得到紅色固體，藉由急驟層析(5%至50% EtOAc/己烷)純化得到呈淺棕色固體狀之實例4步驟e(2.65 g)。1H NMR(DMSO-d6,δ=2.5 ppm,400 MHz)：7.73-7.71(m,2H),7.59-7.50(m,3H),4.80(m,1H),3.89(m,1H),2.10(m,3H),1.71(m,1H),1.40-1.17(m,12H)。LC/MS：[M+Na]+ C19H24BrN3NaO2之分析計算值為428.09；實驗值為428.07。
    向實例4步驟e(2.64 g，6.50 mmol)及4,4,4',4',5,5,5',5'-八甲基-2,2'-聯(1,3,2-二氧硼)(3.30 g，13.0 mmol)於二噁烷(40 mL)中之溶液中添加乙酸鉀(1.594 g，16.24 mmol)。混合物藉由用氮氣鼓泡除氣10分鐘，添加Pd(Ph3P)4(0.375 g，0.325 mmol)且再繼續除氣15分鐘。接著密封反應容器且在80℃下加熱16小時。真空蒸發揮發性組分且使殘餘物分配於DCM(100 mL)與半飽和NaHCO3(50 mL)之間。分離有機層，用Na2SO4乾燥且真空蒸發，得到粗紅色油狀物，藉由急驟層析(10%至90% EtOAc/己烷)純化。獲得呈黃色泡沫狀之實例4步驟f(2.7 g)。1H NMR(DMSO-d6,δ=2.5 ppm,400 MHz)：7.77(d,J=8.3 Hz,2H),7.64-7.53(m,3H),4.80(m,1H),3.88(m,1H),2.09(m,3H),1.73(m,1H),1.43-1.08(m,24H)。LC/MS：[M+H]+ C25H37BrBN3O4之分析計算值為454.29；實驗值為454.23。
    向含有實例4步驟f(2.70 g，5.96 mmol)及實例4步驟c(2.30 g，5.42 mmol)於DME(70 mL)中之溶液之壓力管中添加水(17.50 mL)及碳酸氫鈉(2.27 g，27.1 mmol)。混合物藉由用氮氣鼓泡除氣15分鐘，且添加Pd(Ph3P)4(0.313 g，0.271 mmol)且再繼續除氣15分鐘。密封反應容器且在80℃下加熱15小時。真空蒸發溶劑且使殘餘物分配於DCM(100 mL)與水(50 mL)之間。分離有機層，用Na2SO4乾燥且真空移除揮發性組分，且所得紅色粗固體藉由急驟層析(30%至100% EtOAc/己烷)純化。獲得呈黃色固體狀之實例4步驟g(1.95 g)。1H NMR(DMSO-d6,δ=2.5 ppm,400 MHz)：8.10(m,1H),7.87-7.71(m,4H),7.61-7.55(m,3H),7.37(m,1H),4.85(m,2H),3.91(m,2H),2.11(m,6H),1.76(m,2H),1.42-1.08(m,24H).LC/MS：[M+H]+ C35H48FN6O4之分析計算值為671.37；實驗值為671.35。
    向實例4步驟g(1.95 g，2.91 mmol)於二噁烷(10 mL)中之懸浮液中添加4 N HCl之二噁烷溶液(9.72 mL，320 mmol)，且在室溫下攪拌混合物6小時。添加甲醇(1 mL)且繼續攪拌1小時。真空移除揮發性組分且高真空乾燥殘餘物隔夜。取得呈黃色固體狀之實例4步驟h之鹽酸鹽(1.7 g)。1H NMR(DMSO-d6,δ=2.5 ppm,400 MHz)：10.34/10.29/9.43/9.08(4個寬單峰，約4H),8.16(t,J=8.3 Hz,1H),8.10(br s,1H),8.00(d,J=8.3 Hz,2H),7.92(d,J=8.3 Hz,2H),7.78-7.72(m,3H),4.99-4.89(m,2H),3.80(m,2H),2.53-2.42(m,4H),2.25(m,2H),1.87(m,2H),1.44(d,J=6.5,3H),1.43(d,J=6.5,3H)。LC/MS：[M+H]+ C28H32FN6之分析計算值為471.27；實驗值為471.17。 實例4
    將HATU(59.4 mg，0.156 mmol)添加至(S)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基)-2-((甲氧羰基)胺基)乙酸(Cap-2)(38.3 mg，0.156 mmol)及實例4步驟h之鹽酸鹽(43.8 mg，0.071 mmol)於DMF(0.9 mL)及DIPEA(0.10 mL，0.57 mmol)中之經攪拌溶液中。在室溫下攪拌反應溶液2小時且在氮氣流下濃縮隔夜。將殘餘物溶解於MeOH(3 mL)中，過濾且藉由製備型HPLC(Phenomenex Luna C18(2)100×30 mm，10微米；MeOH/水，含TFA緩衝液)純化，得到呈灰白色固體狀之((3-氟-4,4'-聯苯二基)雙(1H-咪唑-4,2-二基((2S,5S)-5-甲基-2,1-吡咯啶二基)((1S)-1-((2R,6R)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基)-2-側氧基-2,1-乙二基)))雙胺基甲酸二甲酯之TFA鹽(實例4)(67.2 mg)。1H NMR(400 MHz,MeOH-d4)δ 8.10-7.84(m,7H),7.77-7.69(m,2H),5.78-5.71(m,0.4H),5.19(td,J=10.6,7.2 Hz,1.6H),4.83-4.74(m,2H),4.36-4.12(m,4H),3.85-3.62(m,8H),2.72-1.95(m,10H),1.76-1.40(m,10H),1.35-1.02(m,14H),0.96(明顯q,J=12.2 Hz,2H)。LC-MS滯留時間為4.031 min；m/z 463.28[1/2M+H]+。經裝備有Phenomenex-Luna 3μ C18 2.0×50 mm管柱之Shimadzu LC-10AS液相層析儀使用SPD-10AV UV-Vis偵測器在220 nM偵測器波長下記錄LC數據。溶離條件採用：流速：0.8 mL/min，梯度：100%溶劑A/0%溶劑B至0%溶劑A/100%溶劑B，梯度時間：4分鐘，保持時間：1分鐘，及分析時間：5分鐘，其中溶劑A為5% MeOH/95%水/10 mM乙酸銨且溶劑B為5%水/95% MeOH/10 mM乙酸銨。使用LC Micromass Platform在電噴霧模式下測定MS數據。
    (4,4'-聯苯二基雙(1H-咪唑-4,2-二基((1R,3S,5R)-5-甲基-2-氮雜雙環[3.1.0]己-3,2-二基)((1S)-1-((2R,6R)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基)-2-側氧基-2,1-乙二基)))雙胺基甲酸二甲酯
    以上酯係根據Tetrahedon Letters, 2003 ,3203-3205中所述之程序，由(S)-5-側氧基吡咯啶-1,2-二甲酸1-第三丁酯2-甲酯製備成非對映異構混合物。
    經10分鐘向實例5步驟a(4.75 g，18.5 mmol)之冷卻(-50℃)甲苯(45 mL)溶液中逐滴添加Superhydride(19.20 mL 1 M THF溶液，19.20 mmol)。添加休尼格氏鹼(Hunig's base)(13.6 mL，78 mmol)且攪拌10分鐘；添加呈固體狀之DMAP(0.122 g，0.997 mmol)，攪拌15分鐘；且經15分鐘逐滴添加三氟乙酸酐(2.98 mL，21.1 mmol)，移除冷卻浴，且繼續攪拌4小時，同時使其升溫至室溫。反應混合物用水(50 mL)、飽和NaCl(30 mL)洗滌，且真空濃縮有機相。所得粗物質用急驟層析(8%至60% EtOAc/己烷)純化，得到呈黃色油狀之實例5步驟b(2.85 g)。1H NMR(CDCl3,400 MHz)：6.36(s,0.5H),6.25(s,0.5H),4.70-4.57(m,1H),3.78(s,3H),2.96(m,1H),2.54(m,1H),1.70(s,3H),1.50(s,4.5H),1.44(s,4.5H)。
    經20分鐘將二乙基鋅(1.1 M甲苯溶液、59.1 mL，65.0 mmol)逐滴添加至實例5步驟b(5.23 g，21.7 mmol)之冷卻(-23℃)甲苯(60 mL)溶液中且攪拌10分鐘。經10分鐘逐滴添加氯碘甲烷(9.44 mL，130 mmol)，且在-21℃下攪拌反應混合物16小時。將飽和NaHCO3(60 mL)添加至反應混合物中，移除冷卻浴，且攪拌混合物10分鐘。接著過濾，且用甲苯(50 mL)洗滌濾餅。分配濾液，且用Na2SO4乾燥有機層，且真空濃縮。所得粗物質用急驟層析(2%至10% EtOAc/己烷)純化，得到實例5步驟c.1(第一溶離物；無色油狀物；2.88 g)及實例5步驟c.2(第二溶離物；無色油狀物；1.01 g)。相對立體化學指定係基於NOE研究進行。實例5步驟c.1：1H NMR(CDCl3,400 MHz)：4.65-4.52(m,1H),3.72(s,3H),3.28-3.17(m,1H),2.44-2.32(m,1H),2.16-2.10(m,1H),1.51-1.42(兩個單峰，9H),1.24(s,3H),1.07(m,1H),0.69-0.60(m,1H)。實例5步驟c.2：1H NMR(CDCl3,400 MHz)：4.0(m,1H),3.76(s,3H),3.32-3.16(m,1H),2.43(m,1H),2.01(m,1H),1.44(s,9H),1.35(s,3H),0.76-0.66(m,2H)。
    向實例5步驟c.1(2.88 g，11.3 mmol)於乙醇(20 mL)中之溶液中添加LiOH(0.324 g，13.5 mmol)於水(10.00 mL)中之溶液，且在室溫下攪拌反應混合物6小時。真空移除大部分揮發性組分且使殘餘物分配於水(20 mL)與乙醚(20 mL)之間。於冰水浴中冷卻水層，用1 N HCl酸化至pH值範圍2，且用EtOAc(30 mL，4次)萃取。用Na2SO4乾燥合併之有機相且真空蒸發，得到呈黏性固體狀之實例5步驟d.1(2.55 g)。1H NMR(CDCl3,400 MHz)：4.64(m,1H),3.25(明顯s,1H),2.70-2.40(m,1H),2.14(m,1H),1.54-1.44(m,9H),1.27(s,3H),1.10-0.80(m,1H),0.67(m,1H)。實例5步驟d.2係由實例5步驟c.2類似地製備。1H NMR(CDCl3,400 MHz)：4.13(明顯br s,1H),3.06(明顯br s,1H),2.55/2.41(重疊明顯br s,2H),1.51(s,9H),1.27(s,3H),0.76(明顯t,J=5.6 Hz,1H),0.60(明顯br s,1H)。
    向實例5步驟d.2(1.09 g，4.52 mmol)及1,1'-(聯苯-4,4'-二基)雙(2-溴乙酮)(0.869 g，2.19 mmol)於乙腈(40 mL)中之懸浮液中添加DIEA(0.789 mL，4.52 mmol)，且在室溫下攪拌混合物4小時。真空移除揮發性組分且使殘餘物分配於EtOAc(70 mL)與水(50 mL)之間。有機層用飽和NaHCO3(50 mL)洗滌，用Na2SO4乾燥，真空蒸發且真空乾燥得到呈白色泡沫狀之實例5步驟e(1.54 g)。1H NMR(DMSO-d6,δ=2.5 ppm,400 MHz)：8.13(d,J=8.3 Hz,4H),7.99(d,J=8.5 Hz,4H),5.70-5.54(m,4H),4.17(m,2H),3.13-3.11(m,2H),2.58-2.46(m,2H),2.19(m,2H),1.42-1.37(兩個單峰，18H),1.24(s,6H),0.76-0.70(m,4H)。LC/MS：[M+Na]+ C40H48N2NaO10之分析計算值為739.32；實驗值為739.52。
    向含有實例5步驟e(1.54 g，2.15 mmol)於二甲苯(40 mL)中之溶液之壓力管中添加乙酸銨(1.656 g，21.48 mmol)，且對容器加蓋且在140℃下加熱5小時。真空移除揮發性組分且使殘餘物小心分配於DCM(50 mL)與水(50 mL)之間，同時添加足夠飽和NaHCO3溶液，以便在分配結束時水相為中性或鹼性。用Na2SO4乾燥有機層，真空蒸發且所得粗物質藉由急驟層析(10%至100% EtOAc/己烷)純化，得到呈棕色固體狀之實例5步驟f(0.65 g)。1H NMR(DMSO-d6,δ=2.5 ppm,400 MHz)：7.84-7.65(m,8H),7.55-7.54(m,1.7H),7.32-7.30(m,0.3H),4.60(m,2H),3.20(m,2H),2.48-2.43(m,2H),2.12(m,2H),1.45-1.07(m,24H),0.77(m,2H),0.69(m,2H)。LC/MS：[M+H]+ C40H49N6O4之分析計算值為677.38；實驗值為677.45。
    向實例5步驟f(0.65 g，0.960 mmol)於二噁烷(5 mL)中之溶液中添加4 N HCl之二噁烷溶液(5.84 mL，192 mmol)，且在室溫下攪拌混合物6小時。真空移除揮發性組分，且真空乾燥隔夜，得到呈棕色固體狀之實例5步驟a之鹽酸鹽(0.6 g)。1H NMR(DMSO-d6,δ=2.5 ppm,400 MHz)：10.5-10(br s，約3.2H),7.99(br s,2H),7.95(d,J=8.5,4H),7.85(d,J=8.5 Hz,4H),4.76(m,2H),3.18(m,2H),2.61-2.46(m,4H；與溶劑信號重疊)，1.35(s,6H),1.30(m,2H),0.82(明顯br t,J=7.1,2H)。LC/MS：[M+H]+ C30H33N6之分析計算值為477.28；實驗值為477.22。 實例5
    將HATU(68.2 mg，0.179 mmol)添加至(S)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基)-2-((甲氧羰基)胺基)乙酸(Cap-2)(44 mg，0.18 mmol)及實例5步驟g之鹽酸鹽(50.8 mg，0.083 mmol)於DMF(0.8 mL)及DIPEA(0.12 mL，0.67 mmol)中之經攪拌溶液中。在室溫下攪拌反應溶液3小時且在氮氣流下濃縮隔夜。將殘餘物溶解於MeOH(約2.5 mL)中，過濾且藉由製備型HPLC(Phenomenex Luna C18(2)100×30 mm，10微米；MeOH/水，含TFA緩衝液)純化，得到呈黃色固體狀之(4,4'-聯苯二基雙(1H-咪唑-4,2-二基((1R,3S,5R)-5-甲基-2-氮雜雙環[3.1.0]己-3,2-二基)((1S)-1-((2R,6R)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基)-2-側氧基-2,1-乙二基)))雙胺基甲酸二甲酯之TFA鹽(實例5)(49.5 mg)。1H NMR(400 MHz,MeOH-d4)δ 7.93(s,2H),7.90-7.82(m,8H),5.02(t,J=8.5 Hz,2H),4.48(d,J=8.0 Hz,2H),4.26-4.18(m,2H),3.80-3.71(m,2H),3.68(s,6H),3.60(d,J=3.3 Hz,2H),2.77(dd,J=13.4,9.2 Hz,2H),2.28(dd,J=13.1,7.8 Hz,4H),1.56-1.44(m,6H),1.42(s,6H),1.25(d,J=6.8 Hz,6H),1.09(d,J=6.0 Hz,6H),1.06-0.91(m,6H)。LC-MS滯留時間為3.900分鐘；m/z 466.29[1/2M+H]+。經裝備有Phenomenex-Luna 3μ C18 2.0×50 mm管柱之Shimadzu LC-10AS液相層析儀使用SPD-10AV UV-Vis偵測器在220 nM偵測器波長下記錄LC數據。溶離條件採用：流速：0.8 mL/min，梯度：100%溶劑A/0%溶劑B至0%溶劑A/100%溶劑B，梯度時間：4分鐘，保持時間：1分鐘，及分析時間：5分鐘，其中溶劑A為5% MeOH/95%水/10 mM乙酸銨且溶劑B為5%水/95% MeOH/10 mM乙酸銨。使用LC Micromass Platform在電噴霧模式下測定MS數據。
    (4,4'-聯苯二基雙(1H-咪唑-4,2-二基(2S)-2,1-吡咯啶二基((1S)-1-((2R,6R)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基)-2-側氧基-2,1-乙二基)))雙胺基甲酸二甲酯
    將HATU(81 mg，0.212 mmol)添加至4,4'-雙(2-((S)-吡咯啶-2-基)-1H-咪唑-5-基)-1,1'-聯苯之鹽酸鹽(WO 2008/021927中製備)(56.2 mg，0.099 mmol)及(S)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基)-2-((甲氧羰基)胺基)乙酸(Cap-2)(52 mg，0.21 mmol)於DMF(1.0 mL)及DIPEA(0.14 mL，0.79 mmol)中之經攪拌溶液中。在室溫下攪拌反應溶液3小時，接著在氮氣流下濃縮。將殘餘物溶解於MeOH(約5 mL)中，過濾且藉由製備型HPLC(Phenomenex Luna C18(2)100×30 mm，10微米；MeOH/水，含TFA緩衝液)純化，得到呈淺黃色固體狀之(4,4'-聯苯二基雙(1H-咪唑-4,2-二基(2S)-2,1-吡咯啶二基((1S)-1-((2R,6R)-2,6-二甲基四氫-2H-哌喃-4-基)-2-側氧基-2,1-乙二基)))雙胺基甲酸二甲酯之TFA鹽(實例6)(83 mg)。1H NMR(400 MHz,MeOH-d4)δ 7.96(s,2H),7.91-7.84(m,8H),5.26(t,J=7.5 Hz,2H),4.24-4.09(m,6H),3.93-3.84(m,2H),3.74-3.68(m,2H),3.67(s,6H),2.63-2.55(m,2H),2.39-2.12(m,8H),1.57(d,J=11.0 Hz,2H),1.51-1.41(m,2H),1.32-1.25(m,2H),1.22(d,J=7.0 Hz,6H),1.05(d,J=6.0 Hz,6H),0.98(明顯q,J=12.3 Hz,2H)。LC-MS滯留時間為1.660分鐘；m/z 879.8[M+H]+。經裝備有Phenomenex-Luna 3μ C18 2.0×50 mm管柱之Shimadzu LC-10AS液相層析儀使用SPD-10AV UV-Vis偵測器在220 nM偵測器波長下記錄LC數據。溶離條件採用：流速：0.8 mL/min，梯度：100%溶劑A/0%溶劑B至0%溶劑A/100%溶劑B，梯度時間：4分鐘，保持時間：1分鐘，及分析時間：5分鐘，其中溶劑A為10%乙腈/90%水/0.1%三氟乙酸且溶劑B為10%水/90%乙腈/0.1%三氟乙酸。使用LC Micromass Platform在電噴霧模式下測定MS數據。生物活性
    在本發明中使用HCV複製子分析，且如共同擁有之PCT/US2006/022197及O'Boyle等人，Antimicrob Agents Chemother. 2005 年4月；49(4)：1346-53中所述製備、進行及驗證。亦如商業來源(Apath.com)所描述，使用合併有螢光素酶報導體之推薦分析方法。
    使用HCV新型複製子細胞及於NS5A區中含有抗性取代之複製子細胞，測試當前所述之化合物族群。測出該等化合物對含有突變之細胞的抑制活性相對於針對野生型細胞之相應抑制效力具有不同程度的降低。因此，本發明化合物可有效抑制HCV NS5A蛋白之功能且應理解為其組合形式如同先前在申請案PCT/US2006/022197及共同擁有之WO 04/014852中所述般有效。應瞭解本發明化合物可抑制多種HCV基因型。表2展示本發明之代表性化合物針對HCV基因型1b野生型、HCV基因型1b LV/YH雙重抗性突變體、HCV基因型1a及基因型-1a YH單抗性突變體的EC50(有效50%抑制濃度)值。
    本發明化合物可藉由NS5A抑制作用外加其他機制或藉由不同於NS5A抑制作用之機制來抑制HCV。在一個實施例中，本發明化合物抑制HCV複製子且在另一個實施例中，本發明化合物抑制NS5A。本發明化合物可抑制含有NS5A序列之多種變異體之多種HCV基因型。 大鼠中靜脈內及經口單次給藥藥物動力學研究
    在雄性史泊格多利大鼠(Sprague-Dawley rat)(260 g至310 g)中分析徵實例1至實例6及化合物-A(WO2008/021927)之藥物動力學特徵(參見表2)。在此等研究中，兩組動物(每組N=3)分別藉由經頸靜脈之靜脈內(IV)輸注方式(2 mg/kg，經10分鐘)或藉由經口管飼方式(5 mg/kg)接受含於100% PEG 400或90：5：5 PEG 400：乙醇：TPGS之媒劑中之化合物。經口給藥組中之大鼠禁食隔夜。在給藥後0.17(僅IV組)、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8及24小時連續取得血液樣品。自頸靜脈收集血液樣品(約0.3 mL)至含有K3EDTA之試管中，接著在4℃(1500 xg至2000 xg)下離心獲得血漿。血漿樣品儲存於-20℃下直至藉由LC/MS/MS分析。
    開發一種依序利用液相層析分離法及串聯之質譜偵測法(LC/MS/MS)之生物分析方法，用於分析大鼠血漿中化合物。使用所選反應監測法進行偵測。在四偶極(quadrupole)1中選擇代表前驅體(M+H)+物質之離子，且用N2碰撞解離，產生特定產物離子，隨後藉由四偶極3監測。製備雄性大鼠血漿中之標準曲線，且依與測試樣品相同之方式處理，產生定量數據。
    使用非室體模型方法，藉由Kinetica計算藥物動力學參數值。計算中不使用低於定量下限(LLOQ)的值。使用線性梯形法則計算曲線下面積(AUC)。
    权利要求:
    Claims (21)
    [1] 一種式(I)化合物： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中：R1係選自氫、甲基及氟；R2係選自氫及甲基；R3及R4各為氫；或R3及R4連同其所連接之碳原子一起形成環丙基環；及R5係選自氫及甲基。
    [2] 如請求項1之化合物，或其醫藥學上可接受之鹽，其中R1為氫。
    [3] 如請求項1之化合物，或其醫藥學上可接受之鹽，其中R1為氟。
    [4] 如請求項3之化合物，或其醫藥學上可接受之鹽，其中：R2、R3及R4各為氫；及R5為甲基。
    [5] 如請求項1之化合物，或其醫藥學上可接受之鹽，其中R1為甲基。
    [6] 如請求項5之化合物，其中：R2、R3及R4各為氫；及R5為甲基。
    [7] 一種化合物，其係選自： 或其醫藥學上可接受之鹽。
    [8] 一種化合物，其為： 或其醫藥學上可接受之鹽。
    [9] 一種化合物，其為： 或其醫藥學上可接受之鹽。
    [10] 一種組合物，其包含如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，及醫藥學上可接受之載劑。
    [11] 如請求項10之組合物，其進一步包含一種、兩種或三種具有抗HCV活性之其他化合物。
    [12] 如請求項11之組合物，其中至少一種其他化合物為干擾素或病毒唑(ribavirin)。
    [13] 如請求項12之組合物，其中該干擾素係選自干擾素α2B、聚乙二醇化干擾素α、複合干擾素、干擾素α2A、干擾素λ及類淋巴母細胞干擾素τ。
    [14] 如請求項11之組合物，其中至少一種其他化合物係選自介白素2、介白素6、介白素12、增強1型輔助T細胞反應發生之化合物、干擾RNA、反義RNA、咪喹莫特(Imiquimod)、病毒唑、肌苷5'-單磷酸去氫酶抑制劑、金剛胺(amantadine)及金剛乙胺(rimantadine)。
    [15] 如請求項11之組合物，其中至少一種其他化合物有效抑制選自以下之目標的功能，以治療HCV感染：HCV金屬蛋白酶、HCV絲胺酸蛋白酶、HCV聚合酶、HCV解螺旋酶、HCV NS4B蛋白、HCV進入、HCV組裝、HCV釋出、HCV NS5A蛋白及IMPDH。
    [16] 一種如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其係用於治療HCV感染。
    [17] 如請求項16之用途，其中該藥劑係在投與一種、兩種或三種具有抗HCV活性之其他化合物之前、之後或同時投與。
    [18] 如請求項17之用途，其中至少一種其他化合物為干擾素或病毒唑。
    [19] 如請求項18之用途，其中該干擾素係選自干擾素α2B、聚乙二醇化干擾素α、複合干擾素、干擾素α2A、干擾素λ及類淋巴母細胞干擾素τ。
    [20] 如請求項17之用途，其中至少一種其他化合物係選自介白素2、介白素6、介白素12、增強1型輔助T細胞反應發生之化合物、干擾RNA、反義RNA、咪喹莫特、病毒唑、肌苷5'-單磷酸脫氫酶抑制劑、金剛胺及金剛乙胺。
    [21] 如請求項17之用途，其中至少一種其他化合物有效抑制選自以下之目標的功能，以治療HCV感染：HCV金屬蛋白酶、HCV絲胺酸蛋白酶、HCV聚合酶、HCV解螺旋酶、HCV NS4B蛋白、HCV進入、HCV組裝、HCV釋出、HCV NS5A蛋白及IMPDH。
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    AU2012214767B2|2016-06-02|
    US9340520B2|2016-05-17|
    TWI542585B|2016-07-21|
    IL227789D0|2013-09-30|
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    法律状态:
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    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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    US201161467602P| true| 2011-03-25|2011-03-25||
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