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    本發明之主題係一種用於製造L-肉毒鹼之方法，其中將4-(鹵甲基)環氧丙烷-2-酮之β-內酯轉化成L-肉毒鹼，其中該方法包含將β-內酯發酵轉化成(R)-4-鹵-3-羥基丁酸或(R)-4-鹵-3-羥基丁酸酯。
    公开号:TW201305345A
    申请号:TW101126708
    申请日:2012-07-25
    公开日:2013-02-01
    发明作者:Manuela Avi；Ellen Klegraf
    申请人:Lonza Ag；
    IPC主号:C12P13-00
    专利说明:
    從ß-內酯發酵製造肉毒鹼之方法
    本發明係關於製造L-肉毒鹼之方法。
    肉毒鹼(維生素Bt；3-羥基-4-三甲銨基-丁酸鹽)係一種生合成自離胺酸和甲硫胺酸之季銨鹽化合物。在活細胞中，脂肪裂解產生代謝能之過程中需要從細胞質(cytosol)傳遞脂肪酸至粒腺體。其被用作為一營養補充品。肉毒鹼存在兩種立體異構物。生物活性型者為L-肉毒鹼，同時其鏡像異構物D-肉毒鹼則不具生物活性。當於一工業方法製造L-肉毒鹼時，較佳為製造高純度之生物活性L-型。
    已描述各種用於工業生產L-肉毒鹼之方法。微生物學方法已為人所習知，其係直接利用細菌製造L-肉毒鹼。其他方法為藉由有機合成法製造一外消旋物然後接著分離成鏡像異構物。
    此外，已嘗試直接從掌性前驅物合成L-肉毒鹼。旋光環內酯(chiral cyclic lactones)為一群可能前驅物。由於原則上已知獲得旋光內酯之方法，因此於水解內酯環之後可獲得L-肉毒鹼。
    US 5,473,104揭示一種用於從(S)-3-羥基丁內酯製備L-肉毒鹼之方法。此過程係一種兩階段法，其中第一階段(S)-3-羥基丁內酯被轉化成對應羥活化內酯，而同時維持著環狀構造。在第二階段中，打開活化內酯環然後以三甲胺導入三甲銨基團。整體而言，由於需要活化具有刺激性化學物質之中間物因而此反應極為複雜。
    CH 680,588 A5揭示一種用於從β-內酯前驅物製備L-肉毒鹼之方法，其中一掌性2-氧雜環丁酮(2-oxetanone)於兩階段過程中被轉化成L-肉毒鹼。在第一階段中，進行水解4-(氯甲基)-2-氧雜環丁酮之步驟，此時其環被打開並且獲得4-氯-3-羥丁酸。於後續步驟中，以三甲胺將該酸轉化成L-肉毒鹼。然而，製造掌性β-內酯需要極複雜重金屬催化劑並且其產量通常不足。
    Nelson和Spencer(J.Org.Chem.2000,65,1227-1230)揭示一種藉由脂肪酶酵素分割法從β-內酯外消旋物獲得富含鏡像異構β-內酯之方法。所使用介質係不同烷基-和芳基-β-內酯外消旋物。如摘錄於表1，其產量僅足以用於有限數量之反應。其鏡像異構物選擇性強烈依賴β-內酯之取代基並且該甲基之小取代基鏡像異構物產量極低(表1)。此反應需要有機溶劑如芐醇，在環境因素上其並不適合被應用於工業。其反應時間極長(最常為72小時)。
    US 2006/0046286揭示藉由酵素酯化從β-內酯獲得掌性β-丁內酯和3-羥基羧酸酯之方法。至於用於Nelson和Spencer時建議使用脂肪酶。此反應需要有機溶劑如甲苯，以及長達約16小時之較長反應時間。其介質為β-丁內酯。大部分實驗中，該介質非為一外消旋物而是光學活性(R)-β-丁內酯。此特定反應大部分產生高鏡像異構物純度之(R)-β-丁內酯，同時若有的話亦僅可獲得極少量之(S)-3-羥丁酸酯(實例1、6、7)。
    由於純化鏡像異構L-肉毒鹼係一種重要工業產品，因此較佳為進一步提供更有效之製造方法。明確而言，其較佳為以高總產量和鏡像異構物產量之極簡單方式提供製造L-肉毒鹼之方法。 本發明之基本問題
    本發明之基本問題係提供一種可克服上述缺點以用於製造L-肉毒鹼之方法。明確而言，該問題係提供一種用於製造L-肉毒鹼之有效和簡單方法。
    其必需具有高總產量以及掌性產量。製程步驟之數目必需為極少並且製程不需複雜儀器。整體而言，此方法必需具有高原子經濟性(atom economy)以及成本和人工效率。所使用化學品必需隨時可取得並且不得過於昂貴。
    本發明進一步之基本問題係提供一種溫和製程，其必需避免嚴苛的條件和刺激性化學物質。必需避免使用影響環境之化學物質例如有機溶劑或重金屬，或可能影響工人健康者例如芳香族溶劑。必需移除重金屬催化劑，但是儘管如此產品內仍然必需避免可能殘留之微量雜質。明確而言，不使用含有貴金屬例如鉑之昂貴催化劑。必需具有低總能量輸入。明確而言，該反應之進行必需在極低溫下並且於極短反應時間內完成。
    出人意料地，根據申請專利範圍之製程可解決本發明之基本問題。本發明進一步具體實施例已揭示於全部說明。
    本發明之主題係一種用於製造L-肉毒鹼之方法，其中4-(鹵甲基)環氧丙烷-2-酮之β-內酯被轉化成L-肉毒鹼，其中該方法包含將β-內酯發酵轉化成(R)-4-鹵-3-羥基丁酸或(R)-4-鹵-3-羥基丁酸酯。
    該肉毒鹼係L-肉毒鹼((R)-肉毒鹼；左旋肉毒鹼)。L-肉毒鹼係肉毒鹼之生理上活性立體異構物。視是否於水性介質或醇內進行發酵轉化，該發酵轉化之反應產物為(R)-4-鹵-3-羥基丁酸或其酯。此中間產物可於後續步驟中被轉化成L-肉毒鹼。該酸或酯之對掌性碳的構型為(R)，其如同對應之L-肉毒鹼。因此，簡單地藉由親核取代作用以三甲銨基團取代該鹵原子可於後續中被轉化成L-肉毒鹼，同時仍保留其旋光性。
    在本發明特定具體實施例中，該β-內酯係4-(氯甲基)環氧丙烷-2-酮、4-(溴甲基)環氧丙烷-2-酮或4-(碘甲基)環氧丙烷-2-酮。其中以使用4-(氯甲基)環氧丙烷-2-酮較佳。
    該發酵較佳為對β-內酯之(R)-異構物具有立體異構選擇性。換言之，該發酵較佳為能完全或至少主要地將(R)-內酯轉化成對應(R)-酸或酸酯。因此，當介質為β-內酯外消旋物或至少含有(S)-內酯和(R)-內酯時，該酵素選擇性地將(R)-β-內酯轉化成(R)-酸或酸酯，同時該(S)-β-內酯仍維持無或基本上無影響。因而其對應(S)-β-內酯仍存留和積聚於反應混合物內。此外，產物內將富含該(S)-β-內酯。由於其於水和有機溶劑內具有不同溶解度，因此可分離該兩種化合物。當從β-內酯外消旋物開始時，一理想發酵反應將產生50% Mol-%之(R)-酸或酸酯(100%光學純度)以及50% Mol-%之殘留(S)-β-內酯，其隨後可從該混合物被移除。
    在本發明一較佳具體實施例中，該β-內酯係一外消旋物。較佳為可獲得過量鏡像異構物之(R)-4-鹵-3-羥基丁酸或(R)-4-鹵-3-羥基丁酸酯。該過量鏡像異構物(相對(S)-4-鹵-3-羥基丁酸或酯)較佳為高於80%，更佳為高於90%、95%或99%等。
    於存在溶劑之下進行該發酵轉化。該溶劑較佳為含有水。水可存在於單相系或雙相系內。存在水之下，可獲得(R)-4-鹵-3-羥基丁酸。該發酵轉化係一種酵素水解作用。酵素水解的結果可獲得(R)-4-氯-3-羥基丁酸、(R)-4-溴-3-羥基丁酸或(R)-4-碘-3-羥基丁酸。
    該溶劑較佳為完全為水。當利用水作為溶劑時，其初步反應混合物為一溶液或懸浮液。在此具體實施例中，該反應混合物較佳為一單相系，其於水相之間分離出一清徹相並且未發現液態有機相。
    在本發明另一較佳具體實施例中，於一雙相系內進行該發酵轉化，其中水相內富含(R)-4-鹵-3-羥基丁酸。於一雙相系內，有機相內富含相對無極性β-內酯介質，同時水相內富含該離子酸產物。因此完成反應之後，該相可被分離並且水相內已含有極純化產物。該有機相可含有任何溶劑，其中該β-內酯為高度可溶性以及該酸為低溶解性。相較之下，該水性介質內單相系整體而言僅需較少有機溶劑並且在經濟和環境原因上較具有優勢。
    溶劑之實例包括碳氫化物，例如脂肪族烴諸如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、癸烷和環己烷；芳族羥諸如甲苯和二甲苯；鹵化羥諸如二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、氯仿、四氯化碳和鄰二氯苯；醚類諸如二乙醚、二異丙醚、第三丁基甲醚、二甲氧基乙烷、乙二醇二乙醚、四氫呋喃、1,4-二(口咢)烷和1,3-二(口咢)烷；醯胺類諸如甲醯胺；亞碸諸如二甲亞碸。
    本發明另一具體實施例中，該溶劑為醇類，較佳之醇包含1至5個碳原子，更佳為甲醇、乙醇或丙醇。當於醇以及無水環境內進行發酵轉化時，其產物為直鏈酯。接著當該酯被去酯化而轉化成L-肉毒鹼。
    在本發明一較佳具體實施例中，於發酵轉化之後從溶液移除該殘留β-內酯。較佳為藉由溶劑萃取法移除該殘留β-內酯。例如，當該溶液於單相系內進行時，可藉由酯諸如乙酸乙酯或以已烷萃取該殘留β-內酯。較佳為以極少量溶劑進行多次萃取。
    在一較佳具體實施例中，該酵素係一種水解酶(酵素EC編號3)。水解酶可藉由水解從介質產生兩種產物。該水解酶較佳為一種酯解酶(EC3.1)或胜肽酶(EC 3.4)。一酯解酶係一種水解酵素諸如脂肪酶，其可將酯水解成酸以及醇。一胜肽酶(蛋白酶)係一種執行蛋白水解，亦即水解一胜肽鍵之酵素。
    在本發明一較佳具體實施例中，該酵素係一種脂肪酶。該脂肪酶為選擇性用於(R)-β-內酯。該脂肪酶較佳為來自真菌、酵母或細菌。此意指其為可產生脂肪酶之生物。然而，該脂肪酶可為一種人工，特別指重組脂肪酶。此類脂肪酶可購得自市面，例如來自Novozymes、Amano Enzyme或Nagase酵素公司。
    該酵素較佳為一種三酸甘油酯脂肪酶。此類酵素3.1.1.3之脂肪酶可將三酸甘油酯催化水解成脂肪酸和甘油。
    來自真菌、酵母或細菌之脂肪酶通常於活體內合成非活性前體。這些前體被秘密地進行。此類脂肪酶通常為細胞外脂肪酶。藉由切斷N-端胜肽可產生成熟蛋白質，例如訊號胜肽(signal peptides)或前肽(propeptides)。根據本發明，該脂肪酶較佳為一種成熟脂解酶。換言之，其較佳為活性型。本發明較佳為一種活體外之方法。
    該脂肪酶可含有絲胺酸-組胺酸-天冬胺酸之催化三元體。例如，此類脂肪酶被發現於酵母菌內，如念珠菌屬(Candida)。
    在本發明較佳具體實施例中，該脂肪酶係來自念珠菌屬、假單胞菌屬(Pseudomonas)、麴菌屬(Aspergillus)、桿菌屬(Bacillus)或嗜熱菌屬(Thermomyces)。該脂肪酶可衍生自此類脂肪酶，較佳為具有至少75%，較佳為至少90%序列一致性。
    該脂肪酶較佳為來自念珠菌屬、假單胞菌屬或麴菌屬。該脂肪酶更佳為來自洋蔥假單胞菌(P.cepacia)、螢光假單胞菌(P.fluorescens)或南極念珠菌(C.antarctica)。該脂肪酶可衍生自此類脂肪酶，較佳為具有至少75%，較佳為至少90%序列一致性。
    藉由胺基酸置換、剔除、插入或修飾可獲得衍生物。較佳為藉由重組DNA修飾法獲得衍生物。此類重組脂肪酶具有較高安定性並且與其天然前體較為類似。
    最佳為來自洋蔥假單胞菌之脂肪酶及/或來自南極念珠菌之脂肪酶B。已發現這些酵素可提供所欲高總量和鏡像異構物產量之產品。
    在一極佳具體實施例中，該酵素係來自洋蔥假單胞菌序列辨識編號：1之脂肪酶(UniProt編號P22088[45-364]；Joergensen等人；J.Bacteriol.1991；173：第559-557頁)。該成熟蛋白係一種具有320個胺基酸之蛋白質。其係衍生自含有一訊號胜肽和一前肽之364個胺基酸前體。
    在另一較佳具體實施例中，該酵素係脂肪酶其來自不同於序列辨識編號：1胺基酸序列洋蔥假單胞菌之酵素。洋蔥假單胞菌含有數種高度類似序列辨識編號：1胺基酸序列之脂肪酶。例如，該酵素可為洋蔥假單胞菌鹼性脂肪酶(NCBI登錄號：ABX71757.1；Dalal等人；J.Biotechnol.Appl.Biochem.2008；51：第23-31頁)。此鹼性脂肪酶與序列辨識編號：1脂肪酶具有約98%序列一致性。該酵素亦可為洋蔥假單胞菌脂肪酶(Genbank：ABN09945.1；Yang等人；J.Mol.Catal.B Enzym.2007；45：第91-96頁)。此脂肪酶與序列辨識編號：1脂肪酶具有約92%序列一致性。
    來自南極念珠菌序列辨識編號：2之脂肪酶B(UniProt編號P41365[26-342])係一種具有317個胺基酸之蛋白質。其成熟蛋白係衍生自含有一訊號胜肽和一前肽之342個胺基酸前體。
    該衍生物較佳為衍生自洋蔥假單胞菌序列辨識編號：1之脂肪酶及/或衍生自南極念珠菌序列辨識編號：2之脂肪酶B，與序列辨識編號：1及/或序列辨識編號：2相比較佳為具有至少75%，更佳為至少90%之序列一致性。如此處所述，測定序列一致性時較佳為藉由根據標準參數之局部序列比對程式(BLAST)。藉由胺基酸置換、剔除、插入或修飾可獲得此類脂肪酶之衍生物，以及獲得此類衍生物之方法已為技藝中所習知。例如，來自洋蔥假單胞菌之脂肪酶B衍生物具有較高催化活性以及其製造方法已被討論於Puech-Guenot等人；J.Biomol.Screen.2008；13(1)：第72-79頁。來自南極念珠菌之脂肪酶B衍生物具有較高催化活性以及其製造方法已揭示於Qian等人；J.Mol.Biol.2009；393：第191-201頁。
    在本發明一較佳具體實施例中，溫度於0℃和50℃之間進行該發酵轉化，較佳為於20℃和40℃之間，特別指約25℃或約30℃。視所使用之特定酵素調節其溫度。
    在本發明一較佳具體實施例中，於含有0.1至50重量% β-內酯之水溶液內進行該發酵轉化，更佳為於0.1和10重量%之間或0.5和3重量% β-內酯之間。
    於適當緩衝液內進行該反應。該緩衝液適用於所使用特定酵素。其酸鹼度(pH)大部分接近中性，例如介於5和9之間，或7和8之間。需要時，於反應期間可藉由加入鹼或酸調節其pH以維持安定性。
    在一較佳具體實施例中，其反應混合物係由緩衝液、酵素和β-內酯所組成。可加入添加劑，例如可提高安定性或發酵轉換率例如鹽、金屬離子或輔因子之物質。整體而言，該反應僅需要少數之化學品以及可於常溫下以極簡單方法進行。
    當獲得所欲量之酸或酸酯時即終止該反應。可藉由移除酵素，例如藉由過濾法而終止該反應。當使用β-內酯外消旋物作為介質以及高選擇性酵素時，高達50%之β-內酯可被轉化成對應(R)-酸或(R)-酸酯。移除和分離之後，殘留(S)-β-內酯可被用於其他反應。
    其反應時間可介於1至50小時之間，較佳為介於2至20小時之間。已發現以某些酵素時可於10小時，特別指8小時內達到有效轉化。
    用於進行本發明開環反應之單鹵化β-內酯已為技藝中所習知。鑑於酵素之立體選擇性(stereoselectivity)，本發明方法中可使用一β-內酯外消旋物。可獲得單鹵化β-內酯，例如藉由對應環氧化物之低壓羰化反應如揭示於US 2007/0213524 A1或開始於利用路易士酸(Lewis acid)和次氯酸鹽之不飽和酸如述於Lopez-Lopez,Jose；Tetrahedron Letters；2007；48(10)：第1749-1752頁。
    在本發明一較佳具體實施例中，藉由存在催化劑下之[2+2]環化加成反應可獲得掌性4-(鹵甲基)環氧丙烷-2-酮。在本發明一特定具體實施例中，其係使用掌性β-內酯。此可於本發明之反應中增加鏡像異構物產量。存在掌性催化劑之下，可藉由乙烯酮(ketene)與甲醛X-CH2-CHO之[2+2]環化加成反應獲得掌性β-內酯，其中X係選自氯、溴和碘。乙烯酮(ethenone；分子式C2H2O)係一種無色氣體，其由於分子內含有兩個相鄰雙鍵而具有極高反應性。
    在本發明一較佳具體實施例中，發酵轉化過程中獲得之4-鹵-3-羥基丁酸或(R)-4-鹵-3-羥基丁酸酯隨後以三甲胺(TMA)被轉化成L-肉毒鹼。該鹵素原子於親核取代反應中被一三甲胺基團所取代。該TMA於存在一鹼基下與β-內酯相接觸。該鹼基於β-內酯接觸TMA之後被加入。於本發明一較佳實施例中，β-內酯透過二階段轉化為L-肉毒鹼，在第一階段中，進行4-(氯甲基)-2-氧雜環丁酮之酵素水解，此時β-內酯環被打開以及獲得4-氯-3-羥丁酸。於後續步驟中，該酸、酯以三甲胺被轉化成L-肉毒鹼。
    用於合成L-肉毒鹼之本發明一範例方法示於下列圖解1。此方法包含乙烯酮(ketene)與式Cl-CH2-CHO甲醛之[2+2]環化加成反應。所形成β-內酯外消旋物1進行酵素環裂解反應而產生對應(R)-酸2a(水之溶劑內)或(R)-酸酯2b(乙醇內)。然後以TMA將該酸2a或酯2b轉化成L-肉毒鹼。
    在本發明一較佳具體實施例中，該TMA於製程期間被回收。由於TMA係呈氣態，因此其可通過反應液體被收集和再回收。反應介質內，於反應完成之後可從混合物分離該已溶解TMA(如藉由蒸餾法)並且再導入製程內。該TMA較佳為以循環過程再導入反應路徑內。TMA可於市面上購得其純氣體(Fluka化學公司)或10至40重量%之水溶液。反應混合物內之TMA數量可介於1和3當量之間，較佳為介於1和2.5當量之間。然而，由於反應期間其可被再循環並且再導入反應室內，因此與金屬氫氧化物用量比較過量之TMA較不重要。
    本發明之另一主題為一種用於製造(R)-4-鹵-3-羥基丁酸或(R)-4-鹵-3-羥基丁酸酯之方法，其中該方法包含將4-(鹵甲基)環氧丙烷-2-酮之β-內酯發酵轉化成(R)-4-鹵-3-羥基丁酸或(R)-4-鹵-3-羥基丁酸酯。這些反應產物為用於製造L-肉毒鹼之有價值中間物。其可在一簡單親核取代作用內被轉化成L-肉毒鹼，其中旋光度將不受影響。此外，其可被用於合成L-肉毒鹼之其他有機化合物或衍生物。
    在本發明一較佳具體實施例中，根據最初β-內酯之總量該發酵轉化中(R)-4-鹵-3-羥基丁酸或(R)-4-鹵-3-羥基丁酸酯之總產量為介於40%和50%之間，及/或該(R)-4-鹵-3-羥基丁酸或(R)-4-鹵-3-羥基丁酸酯之鏡像異構物純度為至少90%，更佳為至少95%。
    本方法能解決本發明基本上之問題。此方法極為簡單和經濟並且僅需要極少數之製程步驟。因此可避免其副反應並且具有高總產量和鏡像異構物產量。由於發酵轉化可利用酵素分解法，因此可從β-內酯外消旋物開始進行。因而其不需使用昂貴對掌性試劑。
    由於不需刺激性化學物質如重金屬催化劑或是大量有機溶劑，因此具有溫和反應條件。此方法需要極少量用於加熱之能源。原則上，僅需要使用酵素作為添加劑，其可輕易地被移除並且通常無毒害。因此其中間物特別適合用於製造食品級添加用L-肉毒鹼。
    在一單相水性系內進行酵素分解。所使用介質為4-(氯甲基)環氧丙烷-2-酮外消旋物，其如下列圖解2所描述被轉化成(R)-4-氯-3-羥基丁酸和殘留(S)-β-內酯之混合物。
    圖解2：根據實例酵素分解β-內酯外消旋物 分析學
    於Lipodex E管柱上藉由氣相色譜層析(GC)監控該反應。於Lipodex E管柱上藉由氣相色譜層析法分析4-(氯甲基)-2-氧雜環丁酮1。利用掌性螢光試劑形成4-氯-3-羥基丁酸2。利用ODS-管柱和螢光偵測法藉由HPLC分析該反應混合物。 實例1
    將50 mg之4-(氯甲基)-2-氧雜環丁酮1加入5.0 mL磷酸鉀緩衝液內12.5 mg酵素之溶液或懸浮液，然後於30℃攪拌其反應混合物。以0.5 M之氫氧化鉀不斷地將pH調整至7.5。定期地取出200 μL之樣本，以400 μL乙酸乙酯萃取、過濾以及藉由旋光氣相色譜層析儀分析。在完成該(R)-鏡象異構物分解之後，離心移除酵素然後以5.0 mL乙酸乙酯將該反應混合物萃取兩次。獲得(R)-4-氯-3-羥基丁酸2之水溶液。如下列表1所摘錄，以不同脂肪酶進行5次反應。轉化程度和鏡像異構物純度示於表1。(S)-1和(R)-2均可獲得高鏡像異構物之純度。其於30℃之反應時間僅需4至8小時。
    <110> Lonza股份有限公司
    <120> 用於發酵製造L-肉毒鹼之方法
    <130> LO1709WO
    <150> EP11006163.7
    <151> 2011-07-27
    <150> US61/512032
    <151> 2011-07-27
    <160> 2
    <170> BiSSAP 1.0
    <210> 1
    <211> 320
    <212> PRT
    <213> 洋葱伯克霍爾德氏菌(B.cepacia)
    <220>
    <221> 來源
    <222> 1..320
    <223> /mol_type="蛋白質" /note="成熟蛋白質" /生物="洋葱伯克霍爾德氏菌"
    <400> 1
    <210> 2
    <211> 317
    <212> PRT
    <213> 南極念珠菌(C.antarctica)
    <220>
    <221> 來源
    <222> 1..317
    <223> /mol_type="蛋白質" /note="成熟蛋白質" /生物="南極念珠菌"
    <400> 2
    权利要求:
    Claims (15)
    [1] 一種用於製造L-肉毒鹼之方法，其中4-(鹵甲基)環氧丙烷-2-酮之β-內酯被轉化成L-肉毒鹼，其中該方法包含將β-內酯發酵轉化成(R)-4-鹵-3-羥基丁酸或(R)-4-鹵-3-羥基丁酸酯。
    [2] 根據前述申請專利範圍第1項所述之方法，其中該β-內酯係一種外消旋物。
    [3] 根據前述申請專利範圍第2項所述之方法，其中可獲得過量鏡像異構物之(R)-4-鹵-3-羥基丁酸或(R)-4-鹵-3-羥基丁酸酯。
    [4] 根據前述申請專利範圍中任一項所述之方法，其中於水性介質內進行該發酵轉化以及獲得(R)-4-鹵-3-羥基丁酸。
    [5] 根據前述申請專利範圍中任一項所述之方法，其中於雙相溶液內進行該發酵轉化，其中於水相內富含(R)-4-鹵-3-羥基丁酸。
    [6] 根據前述申請專利範圍中任一項所述之方法，其中於發酵轉化之後從該溶液移除殘留β-內酯。
    [7] 根據前述申請專利範圍第6項所述之方法，其中藉由溶劑萃取移除該殘留β-內酯。
    [8] 根據前述申請專利範圍中任一項所述之方法，其中該酵素係脂肪酶。
    [9] 根據前述申請專利範圍中任一項所述之方法，其中該脂肪酶係來自念珠菌屬、假單胞菌屬、麴菌屬、桿菌屬或嗜熱菌屬，或具有至少75%，較佳為至少90%序列一致性之此類脂肪酶衍生物。
    [10] 根據前述申請專利範圍中任一項所述之方法，其中該脂肪酶係來自洋蔥假單胞菌、螢光假單胞菌或南極念珠菌，該脂肪酶較佳為具有序列辨識編號：1或序列辨識編號：2之胺基酸序列，或具有至少75%，較佳為至少90%序列一致性之此類脂肪酶衍生物。
    [11] 根據前述申請專利範圍中任一項所述之方法，其中於溫度介於0℃和50℃，較佳為介於20℃和40℃之間進行該發酵轉化，及/或其中於含有0.1至10重量%β-內酯之水溶液內進行該發酵轉化。
    [12] 根據前述申請專利範圍中任一項所述之方法，其係藉由乙烯酮與甲醛X-CH2-CHO之[2+2]環化加成反應於前述步驟內合成β-內酯，其中X係選自氯、溴和碘。
    [13] 根據前述申請專利範圍中任一項所述之方法，其中於發酵轉化中所獲得(R)-4-鹵-3-羥基丁酸或(R)-4-鹵-3-羥基丁酸酯以三甲胺被轉化成L-肉毒鹼。
    [14] 根據前述申請專利範圍中任一項所述之方法，其中根據最初β-內酯之總量該發酵轉化中(R)-4-鹵-3-羥基丁酸或(R)-4-鹵-3-羥基丁酸酯之總產量為介於40%和50%之間，及/或其中該(R)-4-鹵-3-羥基丁酸或(R)-4-鹵-3-羥基丁酸酯之鏡像異構物純度為至少90%。
    [15] 一種用於製造(R)-4-鹵-3-羥基丁酸或(R)-4-鹵-3-羥基丁酸酯之方法，其中該方法包含將4-(鹵甲基)環氧丙烷-2-酮之β-內酯發酵轉化成(R)-4-鹵-3-羥基丁酸或(R)-4-鹵-3-羥基丁酸酯。
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