新穎抗ｄｒ５抗體

专利摘要:
本發明係關於一種抗體，其係對於癌、自體免疫疾病或炎症性疾病具有治療效果。即，本發明係關於一種抗體，其係對於表現含有死亡區域(death domain)之受體的細胞顯示經由細胞凋亡之細胞毒殺活性。本發明之課題係提供一種醫藥品，其係對於癌具有治療效果。本發明之解決手段係一種新穎抗DR5抗體，其係可對於細胞誘導細胞凋亡，且相較於既有之抗DR5抗體具有顯著之細胞毒殺活性。
公开号:TW201305216A
申请号:TW100139253
申请日:2011-10-28
公开日:2013-02-01
发明作者:Toshiaki Ohtsuka；Takeshi Takizawa；Akiko Oguni；Tatsuji Matsuoka；Hiroko Yoshida；Yumi Matsui
申请人:Daiichi Sankyo Co Ltd；
IPC主号:C07K16-00

专利说明:
新穎抗DR5抗體
本發明係關於一種抗體，其係與參與誘導細胞凋亡之細胞表面受體結合而有用於作為腫瘤之治療及/或予防劑；並關於一種使用該抗體之癌、自體免疫疾病或炎症性疾病之治療及/或預防法。
細胞凋亡係於活體內將不要的細胞或受損傷的細胞予以排除，以保持正常細胞數之生理學處理(process)所必要的現象。由於此細胞凋亡調節機制於癌、免疫疾病中經常已受損、而對於細胞凋亡調節途徑之理解已有所進展，故正進行可利用於治療癌、免疫疾病之新穎細胞凋亡誘導劑之開發。特別期待對於以死亡受體(death receptor)為代表，參與誘導細胞凋亡的細胞表面受體，具有配位體(ligand)或受體結合能力之抗體，其對於此等疾病之治療作用(參照例如非專利文獻1)。作為一種死亡受體之死亡受體5(Death Receptor 5；DR5)亦稱作KILLER、TRICK2A、TRAIL-R2、TRICKB或CD262，且已知複數種對於細胞誘導細胞凋亡之激動劑(agonist)抗體(參照例如非專利文獻2或3、或專利文獻1至6)。目前，作為治療藥物候選者，有幾種抗體正處於臨床開發段階、其專一性、並以激動劑方式作用於表現該受體之細胞(癌細胞‧免疫疾病關連細胞)，以使該等細胞死亡之治療效果受到期待。雖然DR5之表現對於抗體之抗腫瘤作用有其必要性，於前臨床試驗表明作用與表現程度不具相關性(非專利文獻4)。關於此點，細胞反應(response)被認為係由與細胞凋亡途徑相關之卡沛斯酵素-8(caspase-8)或Bcl-2等細胞內訊號分子的表現量等多種因素所決定(非專利文獻5)。 先前技術文獻
非專利文獻1
Cell Death and Differentiation,10：66-75(2003)
非專利文獻2
Journal of Immunology,162：2597-2605(1999)
非專利文獻3
Nature Medicine,7(8)：954-960(2001)
非專利文獻4
Cell Death and Differentiation,10：66-75(2003)
非專利文獻5
Journal of Clinical Oncology,26：3621-3630(2008)
專利文獻1
國際公開第WO98/51793號小冊
專利文獻2
國際公開第WO2001/83560號小冊
專利文獻3
國際公開第WO2002/94880號小冊
專利文獻4
國際公開第WO2003/54216號小冊
專利文獻5
國際公開第WO2006/83971號小冊
專利文獻6
國際公開第WO2007/22157號小冊
本發明之課題係提供一種對於癌具有治療效果之醫藥品的抗體、該抗體之機能性片段、及編碼該抗體或該抗體之機能性片段之核苷酸。
本發明人等，為解決上述課題戮力進行檢討下，發現對於細胞呈現顯著細胞凋亡誘導能力之抗體而完成本發明。藉此，給予即使藉由既有抗體亦未能得到充分治療效果的患者有效之治療效果。
即，本發明係包含以下之發明。
(1)一種抗體或該抗體之機能性片段，其特徵為：重鏈序列係包含具有CDRH1、CDRH2、CDRH3之可變區，前述CDRH1係包含序列編號82所示之胺基酸序列而成、前述CDRH2係包含序列編號83或89所示之任一胺基酸序列而成、前述CDRH3係包含序列編號84所示之胺基酸序列而成；及輕鏈序列係包含具有CDRL1、CDRL2、CDRL3之可變區，前述CDRL1係包含序列編號79、85、86、87或88所示之任一胺基酸序列而成、前述CDRL2係包含序列編號80所示之胺基酸序列而成、前述CDRL3係包含序列編號81所示之胺基酸序列而成。
(2)如(1)記述之抗體或該抗體之機能性片段，其係包含：重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列；該重鏈可變區序列係包含序列編號20所示之胺基酸序列之第20至141個胺基酸残基而成；該輕鏈可變區序列係包含序列編號16所示之胺基酸序列之第21至134個胺基酸殘基而成。
(3)如(1)或(2)記述之抗體或該抗體之機能性片段，其係嵌合抗體。
(4)如(3)記述之抗體或該抗體之機能性片段，其係包含：重鏈序列及輕鏈序列而成；該重鏈序列係包含序列編號20所示之胺基酸序列之第20至471個胺基酸殘基而成；該輕鏈序列係包含序列編號16所示之胺基酸序列之第21至239個胺基酸殘基而成。
(5)如(1)記述之抗體或該抗體之機能性片段，其係經人類化。
(6)如(5)記述之抗體或該抗體之機能性片段，其係抗體或該抗體之機能性片段，且包含：(a)選自於以下之胺基酸序列而成之群組之重鏈可變區序列：a1)包含序列編號42所示之胺基酸序列之第20至141個胺基酸殘基而成之胺基酸序列；a2)包含序列編號70所示之胺基酸序列之第20至141個胺基酸殘基而成之胺基酸序列；a3)與選自於1)或a2)之胺基酸序列至少具有95%同源性之胺基酸序列；a4)與選自於a1)或a2)之胺基酸序列至少具有99%同源性之胺基酸序列；a5)選自於a1)至a2)之任一胺基酸序列中，1至數個胺基酸殘基已經取代、缺失或附加之胺基酸序列；及(b)選自於以下之胺基酸序列而成之群組之輕鏈可變區序列：b1)包含序列編號28所示之胺基酸序列之第21至134個胺基酸殘基而成之胺基酸序列；b2)包含序列編號52所示之胺基酸序列之第21至134個胺基酸殘基而成之胺基酸序列；b3)包含序列編號58所示之胺基酸序列之第21至134個胺基酸殘基而成之胺基酸序列；b4)包含序列編號62所示之胺基酸序列之第21至134個胺基酸殘基而成之胺基酸序列；b5)包含序列編號66所示之胺基酸序列之第21至134個胺基酸殘基而成之胺基酸序列；b6)與選自於b1)至b5)之任一胺基酸序列至少具有95%同源性之胺基酸序列；b7)與選自於b1)至b5)之任一胺基酸序列至少具有99%同源性之胺基酸序列；b8)選自於b1)至b5)之任一胺基酸序列中，1至數個胺基酸殘基已經取代、缺失或附加之胺基酸序列。
(7)如(6)記述之抗體或該抗體之機能性片段，其係包含：重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列；該重鏈可變區序列係包含序列編號42所示之胺基酸序列之第20至141個胺基酸殘基而成；該輕鏈可變區序列係包含序列編號28所示之胺基酸序列之第21至134個胺基酸殘基而成。
(8)如(6)記述之抗體或該抗體之機能性片段，其係包含：重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列；該重鏈可變區序列係包含序列編號70所示之胺基酸序列之第20至141個胺基酸殘基而成；該輕鏈可變區序列係包含序列編號52所示之胺基酸序列之第21至134個胺基酸殘基而成。
(9)如(6)記述之抗體或該抗體之機能性片段，其係包含：重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列；該重鏈可變區序列係包含序列編號70所示之胺基酸序列之第20至141個胺基酸殘基而成；該輕鏈可變區序列係包含序列編號58所示之胺基酸序列之第21至134個胺基酸殘基而成。
(10)如(6)記述之抗體或該抗體之機能性片段，其係包含：重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列；該重鏈可變區序列係包含序列編號70所示之胺基酸序列之第20至141個胺基酸殘基而成；該輕鏈可變區序列係包含序列編號62所示之胺基酸序列之第21至134個胺基酸殘基而成。
(11)如(6)記述之抗體或該抗體之機能性片段，其係包含：重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列；該重鏈可變區序列係包含序列編號70所示之胺基酸序列之第20至141個胺基酸殘基而成；該輕鏈可變區序列係包含序列編號66所示之胺基酸序列之第21至134個胺基酸序列而成。
(12)如(6)記述之抗體或該抗體之機能性片段，其係包含：重鏈序列及輕鏈序列；該重鏈序列係包含序列編號42所示之胺基酸序列之第20至471個胺基酸殘基而成；該輕鏈序列係包含編號28所示之胺基酸序列之第21至239個胺基酸殘基而成。
(13)如(6)記述之抗體或該抗體之機能性片段，其係包含：重鏈序列及輕鏈序列；該重鏈序列係包含序列編號70所示之胺基酸序列之第20至471個胺基酸殘基而成；該輕鏈序列係包含序列編號52所示之胺基酸序列之第21至239個胺基酸殘基而成。
(14)如(6)記述之抗體或該抗體之機能性片段，其係包含：重鏈序列及輕鏈序列；該重鏈序列係包含序列編號70所示之胺基酸序列之第20至471個胺基酸殘基而成；該輕鏈序列係包含序列編號58所示之胺基酸序列之第21至239個胺基酸殘基而成。
(15)如(6)記述之抗體或該抗體之機能性片段，其係包含：重鏈序列及輕鏈序列；該重鏈序列係包含序列編號70所示之胺基酸序列之第20至471個胺基酸殘基而成；該輕鏈序列係包含序列編號62所示之胺基酸序列之第21至239個胺基酸殘基而成。
(16)如(6)記述之抗體或該抗體之機能性片段，其係包含：重鏈序列及輕鏈序列；該重鏈序列係包含序列編號70所示之胺基酸序列之第20至471個胺基酸殘基而成；該輕鏈序列係包含序列編號66所示之胺基酸序列之第21至239個胺基酸殘基而成。
(17)如(1)至(16)中任一項記述之抗體之機能性片段，其係選自於Fab、F(ab’)₂、Fab’、及Fv而成之群組。
(18)一種醫藥組成物，其特徵為：含有如(1)至(17)中任一項記述之抗體或該抗體之機能性片段之至少任一者。
(19)如(18)記述之醫藥組成物，其係癌治療及/或預防用之醫藥組成物。
(20)一種癌治療及/或預防用之醫藥組成物，其特徵為：含有如(1)至(17)記述之抗體或該抗體之機能性片段之至少任一者、及選自於紫杉醇(paclitaxel)、卡鉑定(carboplatin)、CPT-11、或長春花鹼(vinblastin)而成之群組之至少任一者。
(21)如(19)或(20)記述之醫藥組成物，其中癌係選自於肺癌、前列腺癌、甲狀腺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、大腸癌、乳癌、胰臟癌、腎臟癌、子宮癌、黑色素瘤、纖維肉瘤(fibrosarcoma)、神經膠母細胞瘤(glioblastoma)、及血癌而成之群組。
(22)一種癌治療及/或預防方法，其特徵為：投予如(1)至(17)記述之抗體或該抗體之機能性片段之至少任一者。
(23)一種癌治療及/或預防方法，其特徵為：同時或連續投予如(1)至(17)記述之抗體或該抗體之機能性片段之至少任一者、及選自於紫醇、卡鉑定、CPT-11、長春花鹼、及5-FU而成之群組之至少任一者。
(24)如(22)或(23)記述之治療及/或預防方法，其中癌係選自於肺癌、前列腺癌、甲狀腺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、大腸癌、乳癌、胰臟癌、腎臟癌、子宮癌、黑色素瘤、纖維肉瘤、神經膠母細胞瘤、及血癌而成之群組。
(25)一種多核苷酸(polynucleotide)，其係編碼如(2)、(4)或(6)至(16)中任一項記述之抗體。
(26)如(25)記述之多核苷酸，其係包含：包含序列編號19所示之核苷酸序列之第58至423個核苷酸而成之核苷酸序列、及包含序列編號15所示之核苷酸序列之第61至402個核苷酸而成之核苷酸序列。
(27)如(25)記述之多核苷酸，其係包含：包含序列編號19所示之核苷酸序列之第58至1413個核苷酸而成之核苷酸序列、及包含序列編號15所示之核苷酸序列之第61至717個核苷酸而成之核苷酸序列。
(28)如(25)記述之多核苷酸，其係包含：(a)選自於以下之核苷酸序列而成之群組之核苷酸：a1)包含序列編號41所示之核苷酸序列之第58至423個核苷酸而成之核苷酸序列；a2)包含序列編號69所示之核苷酸序列之第58至423個核苷酸而成之核苷酸序列；a3)下列核苷酸序列，該核苷酸序列係保有與包含選自於a1)或a2)之核苷酸序列互補之核苷酸序列而成之多核苷酸於嚴格(stringent)條件下進行雜交之多核苷酸；a4)選自於a1)或a2)之核苷酸序列中，1至數個核苷酸已經取代、缺失或附加之核苷酸序列；及(b)選自於以下之核苷酸序列而成之群組之核苷酸：b1)包含序列編號27所示之核苷酸序列之第61至402個核苷酸而成之核苷酸序列；b2)包含序列編號51所示之核苷酸序列之第61至402個核苷酸而成之核苷酸序列；b3)包含序列編號57所示之核苷酸序列之第61至402個核苷酸而成之核苷酸序列；b4)包含序列編號61所示之核苷酸序列之第61至402個核苷酸而成之核苷酸序列；b5)包含序列編號65所示之核苷酸序列之第61至402個核苷酸而成之核苷酸序列；b6)下列核苷酸序列，該核苷酸序列係保有與包含選自於b1)至b5)之任一核苷酸序列互補之核苷酸序列而成之多核苷酸，於嚴格條件下進行雜交之多核苷酸；b7)選自於b1)至b5)之任一核苷酸序列中，1至數個核苷酸已經取代、缺失或附加之核苷酸序列。
(29)如(28)記述之多核苷酸，其係包含：下列多核苷酸，該多核苷酸係包含：包含序列編號41所示之核苷酸序列之第58至423個核苷酸而成之核苷酸序列而成、及下列多核苷酸，該多核苷酸係包含：包含序列編號27所示之核苷酸序列之第61至402個核苷酸而成之核苷酸序列而成。
(30)如(28)記述之多核苷酸，其係包含：下列多核苷酸，該多核苷酸係包含：包含序列編號69所示之核苷酸序列之第58至423個核苷酸而成之核苷酸序列而成、及下列多核苷酸，該多核苷酸係包含：包含序列編號51所示之核苷酸序列之第61至402個核苷酸而成之核苷酸序列而成。
(31)如(28)記述之多核苷酸，其係包含：下列多核苷酸，該多核苷酸係包含：包含序列編號69所示之核苷酸序列之第58至423個核苷酸而成之核苷酸序列而成、及下列多核苷酸，該多核苷酸係包含：包含序列編號57所示之核苷酸序列之第61至402個核苷酸而成之核苷酸序列而成。
(32)如(28)記述之多核苷酸，其係包含：下列多核苷酸，該多核苷酸係包含：包含序列編號69所示之核苷酸序列之第58至423個核苷酸而成之核苷酸序列而成、及下列多核苷酸，該多核苷酸係包含：包含序列編號61所示之核苷酸序列之第61至402個核苷酸而成之核苷酸序列而成。
(33)如(28)記述之多核苷酸，其係包含：下列多核苷酸，該多核苷酸係包含：包含序列編號69所示之核苷酸序列之第58至423個核苷酸而成之核苷酸序列而成、及下列多核苷酸，該多核苷酸係包含：包含序列編號65所示之核苷酸序列之第61至402個核苷酸而成之核苷酸序列而成。
(34)如(28)記述之多核苷酸，其係包含：下列多核苷酸，該多核苷酸係包含：包含序列編號41所示之核苷酸序列之第58至1413個核苷酸而成之核苷酸序列而成、及下列多核苷酸，該多核苷酸係包含：包含序列編號27所示之核苷酸序列之第61至717個核苷酸而成之核苷酸序列而成。
(35)如(28)記述之多核苷酸，其係包含：下列多核苷酸，該多核苷酸係包含：包含序列編號69所示之核苷酸序列之第58至1413個核苷酸而成之核苷酸序列而成、及下列多核苷酸，該多核苷酸係包含：包含序列編號51所示之核苷酸序列之第61至717個核苷酸而成之核苷酸序列而成。
(36)如(28)記述之多核苷酸，其係包含：下列多核苷酸，該多核苷酸係包含：包含序列編號69所示之核苷酸序列之第58至1413個核苷酸而成之核苷酸序列而成、及下列多核苷酸，該多核苷酸係包含：包含序列編號57所示之核苷酸序列之第61至717個核苷酸而成之核苷酸序列而成。
(37)如(28)記述之多核苷酸，其係包含：下列多核苷酸，該多核苷酸係包含：包含序列編號69所示之核苷酸序列之第58至1413個核苷酸而成之核苷酸序列而成、及下列多核苷酸，該多核苷酸係包含：包含序列編號61所示之核苷酸序列之第61至717個核苷酸而成之核苷酸序列而成。
(38)如(28)記述之多核苷酸，其係包含：下列多核苷酸，該多核苷酸係包含：包含序列編號69所示之核苷酸序列之第58至1413個核苷酸而成之核苷酸序列而成、及下列多核苷酸，該多核苷酸係包含：包含序列編號65所示之核苷酸序列之第61至717個核苷酸而成之核苷酸序列而成。
(39)一種載體，其係包含：如(25)至(38)中記述之任一核苷酸。
(40)一種經轉形(transformed)宿主細胞，其係包含：如(25)至(38)中記述之任一核苷酸。
(41)一種經轉形宿主細胞，其係包含：如(39)記述之載體。
(42)一種如(2)、(4)或(6)至(16)記述之抗體之生產方法，其係包含：將(40)或(41)所記述之宿主細胞予以培養、並自培養產物純化抗體之步驟。
(43)一種抗體或該抗體之機能性片段，其特徵為：與下述抗體結合於相同之抗原決定部位(epitope)，該抗體係包含：包含序列編號20所示之胺基酸序列之第20至471個胺基酸殘基而成之重鏈序列、及包含序列編號16所示之胺基酸序列之第21至239個胺基酸殘基而成之輕鏈序列而成。
(44)一種抗體或該抗體之機能性片段，其特徵為：與下述抗體競爭，該抗體係包含：包含序列編號20所示之胺基酸序列之第20至471個胺基酸殘基而成之重鏈序列、及包含序列編號16所示之胺基酸序列之第21至239個胺基酸殘基而成之輕鏈序列而成。
(45)如(43)或(44)記述之抗體或該抗體之機能性片段，其中經由木瓜酵素消化所調製之Fab片段係與序列編號23所示之重組蛋白質之第26個之甘胺酸(glycine)殘基、第34個之異白胺酸(isoleucine)殘基、第36個之麩胺酸(glutamic acid)殘基、第37個之天冬胺酸(asparticacid)殘基、第38個之甘胺酸殘基、第56個之天冬胺酸殘基、第57個之白胺酸(leucine)殘基、第58個之白胺酸殘基、第59個之苯丙胺酸(phenylalanine)殘基、第61個之白胺酸殘基、及第62個之精胺酸(arginine)殘基，以4以內之距離相鄰接。
(46)如(45)所記述之抗體或該抗體之機能性片段，其中構成序列編號23所示之重組蛋白質之各胺基酸殘基與Fab片段間之距離，係經由使用X射線繞射數據之複合體結構分析而決定。
藉由本發明，可得到一種癌治療劑，其係以對於細胞誘導細胞凋亡為主要作用機制。[發明之實施形態]
又，本說明書中，使用「癌」與「腫瘤」係相同意義。
本說明書中，所謂「基因」之用語，不僅為DNA、亦包含其mRNA、cDNA及其cRNA。
本說明書中，所謂「多核苷酸」之用語，使用上係與核酸相同意義，亦包含：DNA、RNA、探針(probe)、寡核苷酸、及引子(primer)。
本說明書中，「多胜肽(polypeptide)」與「蛋白質」，使用上並無區別。
本說明書中，「RNA部分(RNA fraction)」係指：含有RNA的部分。
本說明書中，「細胞」亦包含：動物個體內之細胞、培養細胞。
本說明書中，「細胞之癌化」係指：細胞喪失對於抑制接觸現象之感受性、或呈現非貼附性(anchorage-independent)增殖等、細胞呈現異常之増殖；並將呈現如此異常増殖之細胞稱為「癌細胞」。
本說明書中，「細胞毒殺(cytotoxicity)」係指：造成細胞某種形態之病理變化，且非僅限於直接外傷、亦用以指稱DNA之斷裂或鹼基二聚物(dimer)之形成、染色體之斷裂、細胞分裂裝置(device)之損傷、各種酵素活性之降低等所有細胞之構造或機能能上之損傷。
本說明書中之「細胞毒殺活性」係指：引起上述細胞毒殺。
本說明書中之「含有死亡區域之受體」係指：於細胞內區域(domain)具有被稱為「死亡區域」之細胞凋亡訊息傳遞區域之受體分子(包含：Fas、TNFRI、DR3、DR4、DR5、及DR6，但不限與此等)，該「死亡區域」顯示與果蠅之自殺基因reaper具有同源性。
本說明書中之「抗體之機能性片段」意指：具有與抗原結合活性之抗體的部分片段、包含：Fab、F(ab’)₂、scFv等。又，F(ab’)₂經於還原條件下處理之抗體之可變區的一價片段Fab’亦包含於抗體之機能性片段。但只要具有抗原結合能力並不限定於此等分子。又，此等機能性片段非僅限於抗體蛋白質之全長分子經適當酵素處理者，亦包含：使用經基因工程改變之抗體基因於適當之宿主細胞所產生之蛋白質。
本說明書中之「Fab’」，如上所述，係F(ab’)₂經於還原條件下處理之抗體之可變區的一價片段Fab’。但使用經基因工程改變之抗體基因所產生之Fab’亦包含於本發明中之Fab’。
本說明書中之「單鏈可變部位抗體」，使用上係與single chain Fv(sc Fv)相同意義。
本說明書中，「抗原決定部位(epitope)」意指：特定抗體所結合之抗原的部分胜肽或部分立體結構。為前述抗原的部分胜肽之抗原決定部位，可藉由進行免疫分析法等該業者廣為所知之方法，例如以下方法而定出。首先，製作抗原之各種部分構造。於製作部分構造時，可使用習知之寡胜肽合成技術。可藉由例如：使用該業者所周知之基因重組技術，製作自抗原之C端或N端以適當長度依序予以截短之一系列多胜肽後，檢討抗體對於該等之反應性、並特定出大致的識別部位後、合成更短的胜肽並檢討與該等胜肽之反應性，以定出抗原決定部位。又，抗原決定部位，其係特定抗體所結合之抗原的部分立體結構，則可藉由經由X射線結構分析所特定出與前述抗體相鄰接之抗原的胺基酸殘基而定出。
本說明書中之「與相同抗原決定部位結合之抗體」意指：與相同之抗原決定部位結合之不同抗體。第二抗體若與第一抗體所結合之部分胜肽或部分立體結構相結合，可判定第一抗體與第二抗體結合於相同的抗原決定部位。又，藉由確認第二抗體對於第一抗體與抗原的結合具有競爭性(即，第二抗體阻礙第一抗體與抗原的結合)，即使未具體特定出抗原決定部位之序列或構造，可判定第一抗體與第二抗體結合於相同的抗原決定部位。進一步，第一抗體與第二抗體結合於相同的抗原決定部位，且第一抗體具有細胞凋亡誘導活性等之特殊效果時，可期待第二抗體亦具有同様活性。
本說明書中之「CDR」意指：互補決定區(CDR：Complementarity determirning region)。已知於抗體分子之重鏈及輕鏈分別具有3處CDR。CDR亦稱為超可變區(hypervariable domain)，係於抗體之重鏈及輕鏈之可變區內，為一次構造之變異性特別高之部位、且於重鏈及輕鏈之多胜肽鏈之一次構造上分別分隔於3處。本說明書中，關於抗體之CDR，係將重鏈之CDR，自重鏈胺基酸序列之胺基端側表記為CDRH1、CDRH2、CDRH3；將輕鏈之CDR，自輕鏈胺基酸序列之胺基端側表記為CDRL1、CDRL2、CDRL3。此等部位於立體結構上相互接近，決定.對於所結合之抗原的專一性。
本說明書中之「二次抗體」係指：與抗體分子專一性結合而將該抗體分子之間予以交聯之抗體。
本說明書中，「於嚴格條件下進行雜交」係指：可藉由於市售之雜交溶液ExpressHyb Hybridization Solution(Clontech公司製)中並於68℃下進行雜交；或使用已固定有DNA之濾紙、於0.7-1.0M之氯化鈉(NaCl)存在下、於68℃下進行雜交後，使用0.1-2倍濃度之SSC溶液(1倍濃度SSC係包含150mM氯化鈉、15mM檸檬酸鈉而成)，於68℃下洗淨而予以鑑定(identify)之條件或於與此相同條件下進行雜交。
本說明書中，有「1或數個胺基酸已經取代、缺失或附加之胺基酸序列」之記述時之「數個」係表示2至10個之任意數量之胺基酸殘基。更具體而言，係於10個以下、5至6個以下、或2至3個以下之胺基酸已經取代、缺失或附加時，使用「數個胺基酸已經取代、缺失或附加」之記述。
本說明書中，例如：「重鏈可變區，其係包含：包含序列編號34之第20至141個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成」之記述、使用上係與「重鏈可變區序列，其係包含序列編號34之第20至141個胺基酸殘基而成」相同意義。又，例如：成為「重鏈，其係包含：包含序列編號34之第20至471個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成」之記述，使用上係與「重鏈序列，其係包含序列編號34之第20至471個胺基酸殘基而成」相同意義。 1.關於細胞凋亡相關基因
關於本發明中之抗體，係被要求與特定抗原結合、且經由該抗原顯示細胞毒殺活性。又，為防止殺傷正常細胞，必須選擇專一性存在於腫瘤細胞之抗原。作為如此抗原群之一例，可列舉：腫瘤細胞壞死因子(本說明書中，以下稱為「TNF」)相關之細胞凋亡誘導配位體(本說明書中，以下稱為「TRAIL」)的受體群。TRAIL為TNF家族蛋白質之成員，它包含Fas配位體及TNF-α(Wiley SR,et al.,Immunity 1995 Dec；3(6)：673-82)。此等蛋白質為細胞凋亡之強力誘導因子。
此等TNF家族蛋白質之受體，係由細胞外區域之富有半胱胺酸之重複序列而賦予其特徴，其中又以作為Fas配位體之受體的Fas、及為TNFα受體之TNF受體I(本說明書中，以下稱為「TNFRI」)，於細胞內區域具有被稱為「死亡區域」之細胞凋亡之訊息傳遞所必要之區域，而被統稱為含有死亡區域之受體，該「死亡區域」係呈現與果蠅之自殺基因reaper(Golstein,P.,et al.(1995)Cell. 81,185-186,White,K,et al.(1994)Science 264,677-683)同源性之區域。
關於TRAIL，已鑑定有5種受體，此等中之2種(DR4(TRAIL-R1)及DR5(TRAIL-R2))可傳遞細胞凋亡訊息、其他3種(DcR1(TRAIL-R3)、DcR2(TRAIL-R4)、及護骨素(osteoprotegerin：OPG)則不傳遞細胞凋亡訊息。與Fas及TNFR I相同，DR4及DR5之兩者的細胞內區段含有死亡區域、且經由包含Fas相關死亡區域蛋白質(本說明書中，以下稱為「FADD」)及卡斯沛酵素8(caspase 8)之途徑傳遞細胞凋亡訊息(Chaudhary PM,et al. Immunity 1997 Dec；7(6)：813-20；Schneider P,et al. Immunity 1997 Dec；7(6)：821-30)。
關於上述之Fas、TNFRI、DR 4、DR5，結合於該分子並作為激動劑產生作用之抗體，已知對於細胞表面保有該分子之細胞，顯示細胞凋亡誘導能力(Journal of Cellular Physiology,209：1221-1028(2006)；Leukemis,Apl；21(4)：805-812(2007)；Blood,99：1666-1675(2002)；Cellular Immunology,Jan；153(1)：184-193(1994))。上述之激動劑抗體的藥效係藉由二次抗體或致效(effector)細胞之交聯而有所増強(Journal of Immunology,149：3166-3173(1992)；Europian Journal of Immunology,Oct；23(10)：2676-2681(1993))。
人類DR5(death receptor 5)基因之核苷酸序列及胺基酸序列已於GenBankden登錄為GI：22547118(登錄編號：NM_147187)。又，DR5基因之核苷酸序列亦包含編碼下列蛋白質之核苷酸序列，該蛋白質係包含DR5之胺基酸序列中，1或數個胺基酸已經取代、缺失或附加之胺基酸序列而成、且具有與DR5相同之生物活性。又，DR5亦包含下述蛋白質：該蛋白質係包含DR5之胺基酸序列中、1或數個胺基酸已經取代、缺失或附加之胺基酸序列而成、且具有與DR5相同之生物活性。 2.抗DR5抗體之製造
本發明之針對DR5的抗體，可使用例行方法，藉由對於動物免疫DR5或選自DR5之胺基酸序列之任意多胜肽、並收集、純化活體內所產生之抗體而得到。成為抗原之DR5之物種並未限定為人類、亦可對於動物免疫源自小鼠、大鼠等人類以外之動物的DR5。該情形時，藉由將所取得之與異種DR5結合之抗體與人類DR5進行交叉性試驗，得以篩選出可適用於人類疾病之抗體。
又，亦可根據習知方法(例如：Kohler and Milstein,Nature(1975)256,p.495-497；Kennet,R. ed.,Monoclonal Antibodies,p.365-367,Plenum Press,N.Y.(1980))，藉由將產生針對DR5之抗體的抗體產生細胞與骨髓瘤細胞融合以建立融合瘤，而得到單株抗體。
又，成為抗原之DR5可藉由將DR5基因經由基因操作使宿主細胞產生而得到。
具體而言，製作可表現DR5基因之載體、將它導入宿主細胞並使該基因表現、並純化所表現之DR5即可。以下，具體說明針對DR5之抗體的取得方法。 (1)抗原之製備
作為用於製作抗DR5抗體之抗原，可列舉：DR5或包含其至少6個連續之部分胺基酸序列而成之多胜肽、或於此等經附加任意之胺基酸序列或載體之衍生物。
DR5可直接使用純化自人類之腫瘤組織或腫瘤細胞，又，亦可藉由於活體外(活體外)合成DR5、或經由基因操作而於宿主細胞產生而得到。
基因操作中，具體而言，可將DR5之cDNA嵌入可表現之載體後，於含有轉錄與轉譯所必要之酵素、基質及能量物質之溶液中合成、或經由使其他原核生物或真核生物之宿主細胞轉形以表現DR5而得到抗原。
又，亦可藉由使連接有膜蛋白質之DR5的細胞外區域與抗體之恆定區之融合蛋白質於適當之宿主‧載體系統中表現而獲得作為分泌蛋白質之抗原。
DR5之cDNA，可藉由例如：使用表現DR5之cDNA的cDNA庫為模板、並使用專一性放大DR5cDNA的引子進行反轉錄聚合酶鏈反應(以下稱為「PCR」)(參照Saiki,R. K.,et al. Science(1988)239,p.487-489)，即所謂PCR法而取得。
作為多胜肽之活體外(活體外)合成，雖可列舉例如：羅氏醫療診斷設備(Roche Diagnostics)公司製造之快速轉譯系統(Rapid Translation System；RTS)，但不以此為限。
作為原核細胞之宿主，可列舉例如：大腸菌(Escherichia coli)或枯草桿菌(Bacillus subtilis)等。為使目的基因於此等宿主細胞內轉形，係以源自可適合於宿主之物種的複製單元(Replicon)-即複製起始點，與包含調節序列之質粒載體(plasmid vector)將宿主細胞予以轉形。又，作為載體，較佳為：具有可賦予轉形細胞表現型(phenotype)選擇性之序列者。
真核細胞之宿主細胞係包含：脊椎動物、昆蟲、酵母菌等之細胞，作為脊椎動物細胞，雖常使用例如：為猴子細胞之COS細胞(Gluzman,Y. Cell(1981)23,p.175-182,ATCC CRL-1650)、小鼠纖維母細胞NIH3T3(ATCC No. CRL-1658)或中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞；ATCC CCL-61)之二氫葉酸還原酶缺損株(Urlaub,G. and Chasin,L. A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1980)77,p.4126-4220)等，但不限於此等。
如上所述而得到之轉形體，可根據例行方法培養，而目的之多胜肽係經由該培養產生於細胞內、或細胞外。
作為該培養所用之培養基，可因應所使用之宿主細胞適當選擇各種慣用者，若為大腸菌，例如：因應必要可於LB培養基中添加青黴素等之抗生素或IPMG後使用。
經由上述培養產生於轉形體之細胞內或細胞外的重組蛋白質，可根據利用該蛋白質之物理性質或化學性質等之各種習知之分離操作法予以分離、純化。
作為該方法，具體而言，可例示例如：經由一般蛋白質沈澱劑之處理、超過濾、分子篩層析(凝膠過濾)，吸附層析、離子交換層析、親和性層析等之各種液體層析、透析法、及此等之組合等。
又，藉由將包含6殘基而成之組胺酸標籤(His-tag)連接於所表現之重組蛋白質，可以鎳離子親和性管柱有效率予以純化。或者，藉由將IgG之Fc區連接於所表現之重組蛋白質，可以蛋白質A管柱(protein A column)有效率予以純化。
藉由將上述方法加以組合得以容易以高收率、高純度大量製造目的之多胜肽。 (2)抗DR5單株抗體之製造
作為與DR5專一性結合之抗體的例子，雖可列舉與DR5專一性結合之單株抗體，但其取得方法係如以下所記述。
於製造單株抗體時，一般而言，需要如下述之操作步驟。
即：
(a)純化作為抗原使用之活體高分子；
(b)藉由注射抗原免疫動物後，採集血液並檢測其抗體力價從而決定摘取脾臟之時期，以製備產生抗體之細胞之步驟；
(c)製備骨髓瘤細胞(以下，稱為「骨髓瘤」)；
(d)抗體產生細胞與骨髓瘤之細胞融合；
(e)產生目的抗體之融合瘤群之篩選；
(f)分離為單一細胞株(選殖(cloning))；
(g)視實際情形，培養用以大量製造單株抗體之融合瘤、或飼養經移植融合瘤之動物；
(h)檢討如此所製造之單株抗體之生理活性、及其結合專一性、或作為標誌試藥之特性之檢測等。
以下，依上述步驟詳述單株抗體之製作方法，但該抗體之製作方法不以此為限，例如亦可使用脾臟細胞以外之抗體產生細胞及骨髓瘤。 (a)抗原之純化
作為抗原，可使用根據如前述方法所製備之DR5或其一部分。
又，亦可使用製備自表現DR5之重組體細胞之膜部分、或表現DR5之重組體細胞本身，進一步，係使用該業者所周知之方法，以經化學合成之本發明之蛋白質的部分胜肽作為抗原。 (b)抗體產生細胞之製備
將步驟(a)所得到之抗原與弗氏完全或不完全佐劑、或如明礬之佐劑予以混合、作為免疫原免疫實驗動物。實驗動物可使用習知用於融合瘤製作方法之動物而無不適。具體而言，可使用例如：小鼠、大鼠、山羊、綿羊、牛、馬等。但就取得與所摘除之抗體產生細胞融合之骨髓瘤細胞之容易性等之觀點而言，較佳係以小鼠或大鼠作為被免疫動物。
又，對於實際上所使用之小鼠及大鼠的品系並無特別限制，於小鼠時，可使用如下各系統：A、AKR、BALB/c、BDP、BA、CE、C3H、57BL、C57BL、C57L、DBA、FL、HTH、HT1、LP、NZB、NZW、RF、R III、SJL、SWR、WB、129等，又於大鼠時，則可使用例如：Wistar、Low、Lewis、Sprague、Dawley、ACI、BN、Fischer等。
其中，若考量與後述之骨髓瘤細胞之融合適性，作為被免疫動物特別佳者，於小鼠係BALB/c系、於大鼠係Wistar及Low系。
又，顧及人類與小鼠之抗原同源性，使用已將去除自體抗體之活體機制予以減弱之小鼠，亦即自體免疫疾病小鼠亦較佳。
又，此等小鼠或大鼠之免疫時的週齡，較佳為5～12週齡、進一步更佳為6～8週齡。
藉由DR5或該重組體免疫動物時，可使用詳載於例如：Weir,D. M.,Handbook of Experimental Immunology(實驗免疫學手冊)Vol. I. II. III.,Blackwell Scientific Publications,Oxford(1987),Kabat,E. A. and Mayer,M. M.,Experimental Immunochemistry(實驗免疫化學),Charles C Thomas Publisher Springfield,Illinos(1964)等之習知方法。
自被免疫動物將包含抗體產生細胞之脾臟細胞或淋巴球以無菌方式取出。此時若測定抗體力價、並使用抗體力價充分變高的動物作為抗體產生細胞之供給源，可提高以後操作之效率。
其中所使用之抗體力價的測定法，雖可列舉例如：RIA法或ELISA法，但不限於此等方法。
自被免疫動物之脾臟細胞或淋巴球分離抗體產生細胞，可根據習知方法(例如：Kohler et al.,Nature(1975)256,p.495,；Kohler et al.,Eur. J. Immunol.(1977)6,p.511,；Milstein et al.,Nature(1977),266,p.550；Walsh,Nature,(1977)266,p.495)進行。 (c)骨髓瘤細胞(以下，稱為「骨髓瘤」)
對於用於細胞融合之骨髓瘤細胞並無特別之限制，可自習知之細胞株予以適當選擇並使用。其中，考慮自融合細胞篩選融合瘤時之便利性，較佳為使用其篩選手段已經確立之HGPRT(次黃嘌呤鳥糞嘌呤核糖磷化轉移酶；Hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase)缺損株。
即，源自於小鼠之X63-Ag8(X63)、NS1-ANS/1(NS1)、P3X63-Ag8.U1(P3U1)、X63-Ag8.653(X63.653)、SP2/0-Ag14(SP2/0)、MPC11-45.6TG1.7(45.6TG)、FO、S149/5XXO、BU.1等、源自於大鼠之210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3)等、源自於人類之U266AR(SKO-007)、GM1500.GTG-A12(GM1500)、UC729-6、LICR-LOW-HMy　2(HMy2)、8226AR/NIP4-1(NP41)等。 (d)細胞融合
抗體產生細胞與骨髓瘤細胞之融合，可根據習知方法(Weir,D. M.,Handbook of Experimental Immunology(實驗免疫學手冊)Vol. I. II. III.,Blackwell Scientific Publications,Oxford(1987),Kabat,E. A. and Mayer,M. M.,Experimental Immunochemistry(實驗免疫化學),Charles C Thomas Publisher Springfield,Illinos(1964)等)，於不使細胞生存率極度降低之程度的條件下適當實施。
如此方法，可使用例如：於聚乙二醇等之高濃度聚合物溶液中將抗體產生細胞與骨髓瘤細胞予以混合之化學方法；利用電力刺激之物理方法等。 (e)融合瘤群之篩選
由上述細胞融合所得到之融合瘤之篩選方法雖無特別限制，但係使用一般HAT(次黃嘌呤、胺蝶呤、胸苷)篩選法(Kohler et al.,Nature(1975)256,p.495；Milstein et al.,Nature(1977)266,p.550)。
此方法在使用於胺蝶呤無法生存之HGPRT缺損株之骨髓瘤細胞而得到融合瘤時有效。
即，藉由將未融合細胞及融合瘤於HAT培養基中培養，可專一性僅使具有胺蝶呤耐性之融合瘤殘存並増殖。 (f)分離為單一細胞株(選殖)
作為融合瘤之選殖法，可使用例如：甲基纖維素法，軟瓊脂糖法，極限稀釋法等之習知方法(參照例如：Barbara,B. M. and Stanley,M. S.：Selected Methods in Cellular Immunology(細胞免疫學篩選法),W. H. Freeman and Company,San Francisco(1980))。此等方法中，特別較佳為甲基纖維素法等之三次元培養法。例如：可藉由將經由細胞融合所形成之融合瘤群懸浮培養於ClonaCell-HY Selection Medium D(幹細胞科技(StemCell Technologies)公司製#03804)等之甲基纖維素培養基，並將所形成之融合瘤株予以回收而取得單株融合瘤。培養所回收之各融合瘤株，並選擇於所得到之融合瘤培養上清液中確認具安定抗體力價者作為DR5單株抗體產生融合瘤株。
作為經此而確立之融合瘤株的例子，可列舉DR5融合瘤B273。又，於本說明書中，係將融合瘤B273所產生之抗體記載為「B273抗體」或僅記載為「B273」。B273抗體之重鏈，具有序列表之序列編號8所示之胺基酸序列。又，B273抗體之輕鏈，具有序列表之序列編號10所示之胺基酸序列。又，於序列表之序列編號8所示之重鏈胺基酸序列中：包含第1至19個胺基酸殘基而成之胺基酸序列為訊號序列；包含第20至141個胺基酸殘基而成之胺基酸序列為可變區；包含第142至465個胺基酸殘基而成之胺基酸序列為恆定區。又，於序列表之序列編號10所示之輕鏈胺基酸序列中：包含第1至19個胺基酸殘基而成之胺基酸序列為訊號序列；包含第20至133個胺基酸殘基而成之胺基酸序列為可變區；包含第134至238個胺基酸殘基而成之胺基酸序列為恆定區。
序列表之序列編號8所示之重鏈胺基酸序列，係由序列表之序列編號7所示之核苷酸序列所編碼。包含序列表之序列編號7所示之核苷酸序列之第1至57個核苷酸而成之核苷酸序列係編碼抗體之重鏈訊號序列，包含第58至423個核苷酸而成之核苷酸序列係編碼抗體之重鏈可變區，而包含第424至1395個核苷酸而成之核苷酸序列係編碼抗體之重鏈恆定區。
序列表之序列編號10所示之輕鏈胺基酸序列，係由序列表之序列編號9所示之核苷酸序列所編碼。包含序列表之序列編號9所示之核苷酸序列之第1至57個核苷酸而成之核苷酸序列係編碼抗體之輕鏈訊號序列，包含第58至399個核苷酸而成之核苷酸序列係編碼抗體之輕鏈可變區，而包含第400至714個核苷酸而成之核苷酸序列係編碼抗體之輕鏈恆定區。 (g)經由培養融合瘤之單株抗體之製備
如此所篩選之融合瘤，藉由將其予以培養，雖可以良好效率得到單株抗體，但於培養前，先篩選(screening)出產生目的單株抗體之融合瘤較佳。
該篩選可採用其本身已知之方法。
本發明中之抗體力價之測定，可藉由例如已於上述(b)項中說明之ELISA法而進行。
經由以上方法而得到之融合瘤，可於液體氮中或-80℃以下之冷凍庫中保存於冰凍狀態。
結束選殖之融合瘤係培養於由HT培養基取代為正常培養基之培養基。
大量培養之進行係藉由使用大型培養瓶之轉瓶培養(roller tube culture)、或旋轉瓶培養。藉由自該大量培養中之上清液，使用凝膠過濾等該業者所周知之方法予以純化，可得到本發明之與蛋白質專一性結合之單株抗體。
又，藉由將融合瘤注射於同品系之小鼠(例如：上述之BALB/c)、或Nu/Nu小鼠的腹腔內，使該融合瘤増殖，可得到含有大量本發明之單株抗體之腹水。
投予於腹腔內之情形時，若於事前(3～7天前)投予2,6,10,14-四甲基十五烷(2,6,10,14-tetramethyl pentadecane)(姥較烷(Pristane))等之礦物油，可得到更大量之腹水。
例如：預先將免抑抑制劑注射於與融合瘤同品系小鼠之腹腔內，將T細胞去活性化後，20天後將10⁶～10⁷個融合瘤株細胞懸浮於不含血清之培養基中(0.5ml)並投予於腹腔內，一般於腹部膨脹、積存有腹水時自小鼠收集腹水。經由此方法，可得相較於培養液中約100倍以上濃度之單株抗體。
經由上述方法而得到之單株抗體，可藉由例如：Weir,D. M.,Handbook of Experimental Immunology(實驗免疫學手冊)Vol. I. II. III.,Blackwell Scientific Publications,Oxford(1978)所記載之方法予以純化。
如此所得到之單株抗體係對於DR5具有高抗原專一性。 (h)單株抗體之測試
定出藉此所得到之單株抗體之同型(isotype)及次型(subclass)，可如以下記載而進行。
首先，可列舉：平板凝膠雙相免疫擴散法(奧克特洛尼法；Ouchterlony法)、ELISA法、或RIA法作為鑑定法。
奧克特洛尼法雖簡便，但單株抗體濃度低時必須濃縮操作。
另一方面，使用ELISA法或RIA法之情形時，可直接使培養上清液與固相吸附抗原反應，再藉由使用對應於各種免疫球蛋白同型、次型之抗體作為二次抗體，鑑定單株抗體之同型、次型。
又，作為更簡便之方法，亦可使用市售之鑑定用套組(例如：小鼠型別套組(Mouse Typer Kit)；伯瑞(Bio Rad)公司製)等。
進一步，蛋白質之定量，可藉由以弗林洛瑞法(Folin‧Lowry method)並由280nm之吸光度(1.4(OD280)=免疫球蛋白1mg/ml]算出之方法進行。
進一步，即使再次施行第(2)項(a)至(h)步驟以另行獨自取得單株抗體時，亦可能取得具有與B273相同細胞毒殺活性之抗體。作為如此抗體之一例，可列舉結合於與B273抗體相同之抗原決定部位的抗體。新製作之單株抗體，只要係結合於B273抗體所結合之部分胜肽或部分立體結構，即可判定該單株抗體結合於與B273抗體相同之抗原決定部位。又，藉由確認該單株抗體對於B273抗體之針對DR5的結合具競爭性(即，該單株抗體阻礙B273抗體與DR5之結合)，即使抗原決定部位之序列或構造並未具體定出，亦可判定該單株抗體結合於與B273抗體相同之抗原決定部位。抗原決定部位經確認為相同時，該單株抗體則強烈被期待具有與B273相同之細胞毒殺活性。
又，如實施例4所示，由抗體之Fab片段與DR5之複合體的X射線繞射數據，可鑑定出鄰近於Fab片段之DR5側之胺基酸殘基。具體而言，源自於任意抗體之Fab片段，與記載於序列表之序列編號23之胺基酸序列之第26個之甘胺酸殘基、第34個之異白胺酸殘基、第36個之麩胺酸殘基、第37個之天冬胺酸殘基、第38個之甘胺酸殘基、第56個之天冬胺酸殘基、第57個之白胺酸殘基、第58個之白胺酸殘基、第59個之苯丙胺酸殘基、第61個之白胺酸殘基、及第62個之精胺酸殘基以4以內之距離相鄰接時，可判斷該抗體具有與B273相同之抗原決定部位專一性。 (3)其他抗體
本發明之抗體，除上述針對DR5之單株抗體外，亦包含：以降低對於人類之異種抗原性等為目的，而經人為改變之基因重組型抗體，例如：嵌合(Chimeric)抗體、人類化(Humanized)抗體、人類抗體等。此等抗體可使用已知方法加以製造。
作為嵌合抗體，係抗體之可變區與恆定區互為異種之抗體，可列舉例如：將源自於小鼠或大鼠之抗體可變區連接於源自於人類之恆定區之嵌合抗體(參照Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,81,6851-6855,(1984))。源自於小鼠抗人類DR5抗體B273之嵌合抗體係包含重鏈及輕鏈而成之抗體；該重鏈係包含重鏈可變區，該重鏈可變區係包含：包含序列編號20之第20至141個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈係包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區係包含：包含序列編號16之第21至134個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成，並可具有任意之恆定區。作為如此嵌合抗體之一例，可列舉：包含重鏈及輕鏈而成之抗體；該重鏈具有：包含序列表之序列編號20之第20至471個胺基酸殘基而成之胺基酸序列；該輕鏈具有：包含序列編號16之第21至239個胺基酸殘基而成之胺基酸序列。又，於序列表之序列編號20所示之重鏈序列中：包含第1至19個胺基酸殘基而成之胺基酸序列為訊號序列；包含第20至141個胺基酸殘基而成之胺基酸序列為可變區；包含第142至471個胺基酸殘基而成之胺基酸序列為恆定區。又，於序列表之序列編號16所示之輕鏈序列中：包含第1至20個胺基酸殘基而成之胺基酸序列為訊號序列；包含第21至134個胺基酸殘基而成之胺基酸序列為可變區；包含第135至239個胺基酸殘基而成之胺基酸序列為恆定區。
序列表之序列編號20所示之重鏈胺基酸序列，係由序列表之序列編號19所示之核苷酸序列所編碼。包含序列表之序列編號19所示之核苷酸序列之第1至57個核苷酸而成之核苷酸序列係編碼抗體之重鏈訊號序列，包含第58至423個核苷酸而成之核苷酸序列係編碼抗體之重鏈可變區，而包含第424至1413個核苷酸而成之核苷酸序列係編碼抗體之重鏈恆定區。
序列表之序列編號16所示之輕鏈胺基酸序列，係由序列表之序列編號15所示之核苷酸序列所編碼。包含序列表之序列編號15所示之核苷酸序列之第1至60個核苷酸而成之核苷酸序列係編碼抗體之輕鏈訊號序列，包含第61至402個核苷酸而成之核苷酸序列係編碼抗體之輕鏈可變區，而包含第403至717個核苷酸而成之核苷酸序列係編碼抗體之輕鏈恆定區。
作為人類化抗體，係僅將互補決定區(CDR；complementarity determining region)嵌入於源自於人類之抗體的抗體(參照Nature(1986)321,p.522-525)，可列舉：根據CDR移植法，除CDR序列外，一部分框架(framework)之胺基酸殘基亦移植於人類抗體之抗體(國際公開小冊WO90/07861)。
但作為源自於B273抗體之人類化抗體，只要保有B273之6種全部的CDR序列，並具有誘導細胞細胞凋亡，並未限定於特定之人類化抗體。又，B273抗體之重鏈可變區保有：包含序列表之序列編號82所示之胺基酸序列而成之CDRH1(GYFMN)、包含序列編號83所示之胺基酸序列而成之CDRH2(RFNPYNGDTFYNQKFKG)、及包含序列編號84所示之胺基酸序列而成之CDRH3(SAYYFDSGGYFDY)。又，B273抗體之輕鏈可變區保有：包含序列表之序列編號79所示之胺基酸序列而成之CDRL1(RSSQSLVHSNGNTYLH)、包含序列編號80所示之胺基酸序列而成之CDRL2(KVSNRFS)、及包含序列編號81所示之胺基酸序列而成之CDRL3(SQSTHVPWT)。
進一步，可使用於上述CDR中，1個至數個胺基酸殘基已經取代、缺失或附加之序列，作為源自於B273抗體之CDR修飾抗體(CDR modified antibody)所具有之CDR序列。作為CDRL1之1個胺基酸殘基取代體的例子，可列舉：包含序列表之序列編號85所示之胺基酸序列而成之序列(RSSQSLVHSNENTYLH)、包含序列編號86所示之胺基酸序列而成之序列(RSSQSLVHSNFNTYLH)、包含序列編號87所示之胺基酸序列而成之序列(RSSQSLVHSNKNTYLH)、或包含序列編號88所示之胺基酸序列而成之序列(RSSQSLVHSNLNTYLH)。又，作為CDRH2之1個胺基酸殘基取代體的例子，可列舉：包含序列編號89所示之胺基酸序列而成之序列(RFNPYNEDTFYNQKFKG)。
一般而言，蛋白質之天冬醯胺脫醯胺化，係於與C端側鄰接之胺基酸之間，形成環狀琥珀醯亞胺過渡狀態而進行(Geiger,T. and Clarke,S.(1987)Deamidation,Isomerizaton,and racemization at asparaginyl and aspartyl residues in peptides.(胜肽中之天冬醯胺醯基與天冬胺醯基之脫醯胺化、異構物化、及消旋化)Succinimide-linked reactions that contribute to protein degradation(促成蛋白質分解之琥珀酸亞醯胺鏈接反應). J. Biol. Chem. 262,785-794)。決定環狀琥珀醯亞胺過渡狀態形成速率為鄰接胺基酸之支鏈的大小，因此，脫醯胺化最快者為側鎖最小的甘胺酸。相反地，藉由將C端側鄰接基取代為具有較大支鏈之胺基酸，可抑制脫醯胺化速度。B273抗體於CDRL1及CDRH2具有易脫醯胺化之-N-G-(天冬醯胺-甘胺酸)序列。因此，本發明人等製作點突變體，其係將鄰接基由甘胺酸變更為具有較大支鏈之離胺酸、苯丙胺酸、白胺酸、麩胺酸。即，分別如下：關於CDRH2，係藉由將-N-G-(天冬醯胺-甘胺酸)序列突變為-N-E-(天冬醯胺-麩胺酸)序列；關於CDRL1，係藉由將-N-G-(天冬醯胺-甘胺酸)序列突變為-N-L-(天冬醯胺-白胺酸)序列、-N-F-(天冬醯胺-苯丙胺酸)序列、-N-K-(天冬醯胺-離胺酸)序列、-N-E-(天冬醯胺-麩胺酸)序列，以抑制抗體之脫醯胺化。
作為包含上述CDR之抗體的實例，可列舉：一種包含重鏈可變區及輕鏈可變區而成之抗體；該重鏈可變區係包含：包含序列表之序列編號82所示之胺基酸序列而成之CDRH1、包含序列編號83所示之胺基酸序列而成之CDRH2、及包含序列編號84所示之胺基酸序列而成之CDRH3；該輕鏈可變區係包含：包含序列表之序列編號79所示之胺基酸序列而成之CDRL1、包含序列編號80所示之胺基酸序列而成之CDRL2、及包含序列編號81所示之胺基酸序列而成之CDRL3；一種包含重鏈可變區及輕鏈可變區而成之抗體；該重鏈可變區係包含：包含序列表之序列編號82所示之胺基酸序列而成之CDRH1、包含序列編號89所示之胺基酸序列而成之CDRH2、及包含序列編號84所示之胺基酸序列而成之CDRH3；該輕鏈可變區係包含：包含序列表之序列編號85所示之胺基酸序列而成之CDRL1、包含序列編號80所示之胺基酸序列而成之CDRL2、及包含序列編號81所示之胺基酸序列而成之CDRL3；一種包含重鏈可變區及輕鏈可變區而成之抗體；該重鏈可變區係包含：包含序列表之序列編號82所示之胺基酸序列而成之CDRH1、包含序列編號89所示之胺基酸序列而成之CDRH2、及包含序列編號84所示之胺基酸序列而成之CDRH3；該輕鏈可變區係包含：包含序列表之序列編號86所示之胺基酸序列而成之CDRL1、包含序列編號80所示之胺基酸序列而成之CDRL2、及包含序列編號81所示之胺基酸序列而成之CDRL3；一種包含重鏈可變區及輕鏈可變區而成之抗體；該重鏈可變區係包含：包含序列表之序列編號82所示之胺基酸序列而成之CDRH1、包含序列編號89所示之胺基酸序列而成之CDRH2、及包含序列編號84所示之胺基酸序列而成之CDRH3；該輕鏈可變區係包含：包含序列表之序列編號87所示之胺基酸序列而成之CDRL1、包含序列編號80所示之胺基酸序列而成之CDRL2、及包含序列編號81所示之胺基酸序列而成之CDRL3；或一種包含重鏈可變區及輕鏈可變區而成之抗體；該重鏈可變區係包含：包含序列表之序列編號82所示之胺基酸序列而成之CDRH1、包含序列編號89所示之胺基酸序列而成之CDRH2、及包含序列編號84所示之胺基酸序列而成之CDRH3；該輕鏈可變區係包含：包含序列表之序列編號88所示之胺基酸序列而成之CDRL1、包含序列編號80所示之胺基酸序列而成之CDRL2、及包含序列編號81所示之胺基酸序列而成之CDRL3。
作為小鼠抗體B273之人類化抗體(包含CDR修飾抗體)之實例，可列舉下列重鏈及輕鏈之任意組合：該重鏈係包含重鏈可變區，該重鏈可變區係包含：包含序列表之序列編號34、36、38、40、42、44、46、48、50或70之第20至141個胺基酸殘基而成之胺基酸序列之任一者而成；該輕鏈係包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區係包含：包含序列編號28、30、32、52、58、62或66之第21至134個胺基酸殘基而成之胺基酸序列之任一者種而成。
作為較佳之組合，可列舉：一種抗體，其特徵為：包含重鏈可變區及輕鏈可變區；該重鏈可變區係包含：包含序列編號34之第20至141個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈可變區係包含：包含序列編號28之第21至134個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；一種抗體，其特徵為：包含重鏈可變區及輕鏈可變區；該重鏈可變區係包含：包含序列編號34之第20至141個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈可變區係包含：包含序列編號30之第21至134個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；一種抗體，其特徵為：包含重鏈可變區及輕鏈可變區；該重鏈可變區係包含：包含序列編號34之第20至141個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈可變區係包含：包含序列編號32之第21至134個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；一種抗體，其特徵為：包含重鏈可變區及輕鏈可變區；該重鏈可變區係包含：包含序列編號36之第20至141個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈可變區係包含：包含序列編號28之第21至134個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；一種抗體，其特徵為：包含重鏈可變區及輕鏈可變區；該重鏈可變區係包含：包含序列編號36之第20至141個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈可變區係包含：包含序列編號30之第21至134個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成，一種抗體，其特徵為：包含重鏈可變區及輕鏈可變區；該重鏈可變區係包含：包含序列編號36之第20至141個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈可變區係包含：包含序列編號32之第21至134個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；一種抗體，其特徵為：包含重鏈可變區及輕鏈可變區；該重鏈可變區係包含：包含序列編號38之第20至141個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈可變區係包含：包含序列編號28之第21至134個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；一種抗體，其特徵為：包含重鏈可變區及輕鏈可變區；該重鏈可變區係包含：包含序列編號38之第20至141個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈可變區係包含：包含序列編號30之第21至134個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；一種抗體，其特徵為：包含重鏈可變區及輕鏈可變區；該重鏈可變區係包含：包含序列編號38之第20至141個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈可變區係包含：包含序列編號32之第21至134個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；一種抗體，其特徵為：包含重鏈可變區及輕鏈可變區；該重鏈可變區係包含：包含序列編號40之第20至141個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈可變區係包含：包含序列編號28之第21至134個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；一種抗體，其特徵為：包含重鏈可變區及輕鏈可變區；該重鏈可變區係包含：包含序列編號42之第20至141個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈可變區係包含：包含序列編號28之第21至134個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；一種抗體，其特徵為：包含重鏈可變區及輕鏈可變區；該重鏈可變區係包含：包含序列編號44之第20至141個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈可變區係包含：包含序列編號28之第21至134個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；一種抗體，其特徵為：包含重鏈可變區及輕鏈可變區；該重鏈可變區係包含：包含序列編號46之第20至141個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈可變區係包含：包含序列編號28之第21至134個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；一種抗體，其特徵為：包含重鏈可變區及輕鏈可變區；該重鏈可變區係包含：包含序列編號48之第20至141個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈可變區係包含：包含序列編號28之第21至134個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；一種抗體，其特徵為：包含重鏈可變區及輕鏈可變區；該重鏈可變區係包含：包含序列編號50之第20至141個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈可變區係包含：包含序列編號28之第21至134個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；一種抗體，其特徵為：包含重鏈可變區及輕鏈可變區；該重鏈可變區係包含：包含序列編號70之第20至141個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈可變區係包含：包含序列編號52之第21至134個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；一種抗體，其特徵為：包含重鏈可變區及輕鏈可變區；該重鏈可變區係包含：包含序列編號70之第20至141個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈可變區係包含：包含序列編號58之第21至134個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；一種抗體，其特徵為：包含重鏈可變區及輕鏈可變區；該重鏈可變區係包含：包含序列編號70之第20至141個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈可變區係包含：包含序列編號62之第21至134個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；或一種抗體，其特徵為：包含重鏈可變區及輕鏈可變區；該重鏈可變區係包含：包含序列編號70之第20至141個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈可變區係包含：包含序列編號66之第21至134個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成。
作為進一步更佳之組合，可列舉：一種抗體，其係包含重鏈及輕鏈而成；該重鏈係包含：包含序列編號34之第20至471個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈係包含：包含序列編號28之第21至239個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；一種抗體，其係包含重鏈及輕鏈而成；該重鏈係包含：包含序列編號34之第20至471個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈係包含：包含序列編號30之第21至239個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；一種抗體，其係包含重鏈及輕鏈而成；該重鏈係包含：包含序列編號34之第20至471個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成：該輕鏈係包含：包含序列編號32之第21至239個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；一種抗體，其係包含重鏈及輕鏈而成；該重鏈係包含：包含序列編號36之第20至471個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈係包含：包含序列編號28之第21至239個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；一種抗體，其係包含重鏈及輕鏈而成；該重鏈係包含：包含序列編號36之第20至471個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈係包含：包含序列編號30之第21至239個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；一種抗體，其係包含重鏈及輕鏈而成；該重鏈係包含：包含序列編號36之第20至471個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈係包含：包含序列編號32之第21至239個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；一種抗體，其係包含重鏈及輕鏈而成；該重鏈係包含：包含序列編號38之第20至471個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈係包含：包含序列編號28之第21至239個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；一種抗體，其係包含重鏈及輕鏈而成；該重鏈係包含：包含序列編號38之第20至471個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈係包含：包含序列編號30之第21至239個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；一種抗體，其係包含重鏈及輕鏈而成；該重鏈係包含：包含序列編號38之第20至471個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈係包含：包含序列編號32之第21至239個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；一種抗體，其係包含重鏈及輕鏈而成；該重鏈係包含：包含序列編號40之第20至471個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈係包含：包含序列編號28之第21至239個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；一種抗體，其係包含重鏈及輕鏈而成；該重鏈係包含：包含序列編號42之第20至471個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈係包含：包含序列編號28之第21至239個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；一種抗體，其係包含重鏈及輕鏈而成；該重鏈係包含：該序列編號44之第20至471個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈係包含：包含序列編號28之第21至239個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；一種抗體，其係包含重鏈及輕鏈而成；該重鏈係包含：包含序列編號46之第20至471個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈係包含：包含序列編號28之第21至239個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；一種抗體，其係包含重鏈及輕鏈而成；該重鏈係包含：包含序列編號48之第20至471個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈係包含：包含序列編號28之第21至239個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；一種抗體，其係包含重鏈及輕鏈而成；該重鏈係包含：包含序列編號50之第20至471個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈係包含：包含序列編號28之第21至239個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；一種抗體，其係包含重鏈及輕鏈而成；該重鏈係包含：包含序列編號70之第20至471個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈係包含：包含序列編號52之第21至239個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；一種抗體，其係包含重鏈及輕鏈而成；該重鏈係包含：包含序列編號70之第20至471個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈係包含：包含序列編號58之第21至239個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；一種抗體，其係包含重鏈及輕鏈而成；該重鏈係包含：包含序列編號70之第20至471個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈係包含：包含序列編號62之第21至239個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；或一種抗體，其係包含重鏈及輕鏈而成；該重鏈係包含：包含序列編號70之第20至471個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈係包含：包含序列編號66之第21至239個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成。
作為更佳之組合，可列舉：一種抗體，其特徵為：包含重鏈可變區及輕鏈可變區；該重鏈可變區係包含：包含序列編號42之第20至141個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈可變區係包含：包含序列編號28之第21至134個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；一種抗體，其特徵為：包含重鏈可變區及輕鏈可變區；該重鏈可變區係包含：包含序列編號70之第20至141個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈可變區係包含：包含序列編號52之第21至134個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；一種抗體，其特徵為：包含重鏈可變區及輕鏈可變區；該重鏈可變區係包含：包含序列編號70之第20至141個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈可變區係包含：包含序列編號58之第21至134個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；一種抗體，其特徵為：包含重鏈可變區及輕鏈可變區；該重鏈可變區係包含：包含序列編號70之第20至141個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈可變區係包含：包含序列編號62之第21至134個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；或一種抗體，其特徵為：包含重鏈可變區及輕鏈可變區；該重鏈可變區係包含：包含序列編號70之第20至141個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈可變區係包含：包含序列編號66之第21至134個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成。
作為最佳組合，可列舉：一種抗體，其係包含重鏈及輕鏈而成，該重鏈係包含：包含序列編號42之第20至471個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈係包含：包含序列編號28之第21至239個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；一種抗體，其係包含重鏈及輕鏈而成，該重鏈係包含：包含序列編號70之第20至471個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈係包含：包含序列編號52之第21至239個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；一種抗體，其係包含重鏈及輕鏈而成，該重鏈係包含：包含序列編號70之第20至471個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈係包含：包含序列編號58之第21至239個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；一種抗體，其係包含重鏈及輕鏈而成，該重鏈係包含：包含序列編號70之第20至471個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈係包含：包含序列編號62之第21至239個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；或一種抗體，其係包含重鏈及輕鏈而成，該重鏈係包含：包含序列編號70之第20至471個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成；該輕鏈係包含：包含序列編號66之第21至239個胺基酸殘基而成之胺基酸序列而成。
藉由將顯示與上述之重鏈胺基酸序列及輕鏈胺基酸序列高同源性之序列予以組合，可篩選出具有與上述各抗體相同細胞毒殺活性之抗體。如此之同源性，一般而言係80%以上之同源性、較佳者為90%以上之同源性、更佳者為95%以上之同源性、最佳者為99%以上之同源性。又，亦可藉由將於重鏈或輕鏈之胺基酸序列中之1至數個胺基酸殘基已經取代，缺失或附加之胺基酸序列予以組合，亦可篩選出具有與上述各抗體相同細胞毒殺活性之抗體。已經取代、缺失或附加之胺基酸殘基數，一般而言係10個胺基酸殘基以下、較佳者為5至6個胺基酸殘基以下、更佳者為2至3個胺基酸殘基以下、最佳者為1個胺基酸殘基。
兩種胺基酸序列之間的同源性，可藉由使用Blast演算法2.2.2版(Blast algorithm version 2.2.2)(Altschul,Stephen F.,Thomas L. Madden,Alejandro A. Schffer,Jinghui Zhang,Zheng Zhang,Webb Miller,and David J. Lipman(1997)，「Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programme(間隙BLAST與特殊位置重複BLAST：新一代蛋白質數據庫檢索程式)」，Nucleic Acids Res. 25：3389-3402)之系統內定參數(default parameter)而決定。Blast演算法亦可經由於網際網路連接至www.ncbi.nlm.nih.gov/blast使用。又，相同性(Identity；或Identities)及陽性(Positivity；或Positivities)之2種百分比數值係經由上述之Blast演算法所算出。前者為當兩種胺基酸序列之間的胺基酸殘基一致時而可求得同源性之數值，後者則為化學結構類似之胺基酸殘基亦經考量下之數值。本說明書中，係以胺基酸殘基一致時之Identity(相同性)數值作為同源性數值。
又，於序列表之序列編號34、36、38、40、42、44、46、48、50或70所示之重鏈胺基酸序列中：包含第1至19個胺基酸殘基而成之胺基酸序列為訊號序列；包含第20至141個胺基酸殘基而成之胺基酸序列為可變區；包含142至471個胺基酸殘基而成之胺基酸序列為恆定區。又，於序列表之序列編號28、30、32、52、58、62或66所示之輕鏈胺基酸序列中，包含第1至20個胺基酸殘基而成之胺基酸序列為訊號序列；包含第21至134個胺基酸殘基而成之胺基酸序列為可變區；包含第135至239個胺基酸殘基而成之胺基酸序列為恆定區。
序列表之序列編號34、36、38、40、42、44、46、48、50或70所示之重鏈胺基酸序列，分別係由序列表之序列編號33、35、37、39、41、43、45、47、49或69所示之核苷酸序列所編碼。包含各核苷酸序列之第1至57個核苷酸而成之核苷酸序列係編碼抗體之重鏈訊號序列，包含第58至423個核苷酸而成之核苷酸序列係編碼抗體之重鏈可變區，而包含第424至1413個核苷酸而成之核苷酸序列係編碼抗體之重鏈恆定區。
序列表之序列編號28、30、32、52、58、62或66所示之輕鏈胺基酸序列，分別係由序列表之序列編號27、29、31、51、57、61或65所示之核苷酸序列所編碼。包含各核苷酸序列之第1至60個核苷酸而成之核苷酸序列係編碼抗體之輕鏈訊號序列，包含第61至402個核苷酸而成之核苷酸序列係編碼抗體之輕鏈可變區，而包含第403至717個核苷酸而成之核苷酸序列係編碼抗體之輕鏈恆定區。
關於此等核苷酸序列與其他抗體之核苷酸序列之間的同源性，亦可藉由Blast演算法而定出。
作為本發明之抗體，進一步可列舉人類抗體，其係結合於與B273抗體相同之抗原決定部位。抗DR5人類抗體意指：僅具有源自於人類染色體之抗體基因序列的人類抗體。抗DR5人類抗體，可藉由使用產生人類抗體之小鼠的方法而取得，該小鼠係具有：包含人類抗體之重鏈與輕鏈之基因的人類染色體片段(參照Tomizuka,K. et al.,Nature Genetics(1997)16,p.133-143,；Kuroiwa,Y. et. al.,Nucl. Acids Res.(1998)26,p.3447-3448；Yoshida,H. et. al.,Animal Cell Technology：Basic and Applied Aspects(動物細胞技術：基礎與應用面)vol. 10,p.69-73(Kitagawa,Y.,Matsuda,T. and Iijima,S. eds.),Kluwer Academic Publishers,1999.；Tomizuka,K. et. al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2000)97,p.722-727等)。
如此之產生人類抗體之小鼠，具體而言，可藉由以基因重組動物製作基因剔除及基因轉殖動物、及使此等動物之間相互交配而製作，該基因重組動物之內源性免疫球蛋白重鏈及輕鏈之基因座已遭破壞，改由經酵母人造染色體(Yeast artificial chromosome；YAC)載體等導入之人類免疫球蛋白重鏈及輕鏈之基因座所取代。
又，亦可藉由基因重組技術，經由以編碼各種如該人類抗體之重鏈及輕鏈之cDNA(較佳者為：包含該cDNA之載體)將真核細胞予以轉形、培養產生基因重組人類單株抗體之轉形細胞，自培養上清液中得到此抗體。
其中，可使用例如：真核細胞(較佳者為：CHO細胞、淋巴球或骨髓瘤等之哺乳動物細胞)作為宿主。
又，已知有取得源自於篩選自人類抗體庫之噬菌體表達群(phage display)之人類抗體的方法(參照Wormstone,I. M. et. al.,Investigative Ophthalmology & Visual Science.(2002)43(7),p.2301-2308；Carmen,S. et. al.,Briefings in Functional Genomics and Proteomics(2002),1(2),p.189-203；Siriwardena,D. et. al.,Ophthalmology(2002)109(3),p.427-431等)。
例如可使用一種噬菌體表達法，其係使人類抗體可變區為單鏈抗體(scFv)表現於噬菌體表面，並篩選與抗原結合之噬菌體(Nature Biotechnology(2005),23,(9),p.1105-1116)。
藉由解析經由與抗原結合所篩選之噬菌體的基因，可定出編碼與抗原結合之人類抗體可變區的DNA序列。
與抗原結合之scFv的DNA序列一經了解，即可藉由製作含有該序列之表現載體、且導入適當之宿主並使其表現而取得人類抗體(WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388、Annu. Rev. Immunol(1994)12,p.433-455、Nature Biotechnology(2005)23(9),p.1105-1116)。
新製作之人類抗體，若結合於B273抗體所結合之部分胜肽或部分立體結構，即可判定該人類抗體結合於與B273抗體相同之抗原決定部位。又，藉由確認該人類抗體對於B273抗體之針對DR5之結合具有競爭性(即，該人類抗體阻礙B273抗體與DR5之結合)，即使並未定出具體之抗原決定部位之序列或結構，亦可判定該人類抗體結合於與B273抗體相同之抗原決定部位。抗原決定部位經確認為相同時，該人類抗體則強烈被期待具有與B273相同之細胞毒殺活性。
又，如實施例4所示，由抗體之Fab片段與DR5之複合體之X射線繞射數據，可特定出與Fab片段相近之DR5側之胺基酸殘基。具體而言，源自於任意抗體之Fab片段，與序列表之序列編號23所記述之胺基酸序列之第26個之甘胺酸殘基、第34個之異白胺酸殘基、第36個之麩胺酸殘基、第37個之天冬胺酸殘基、第38個之甘胺酸殘基、第56個之天冬胺酸殘基、第57個之白胺酸殘基、第58個之白胺酸殘基、第59個之苯丙胺酸殘基、第61個之白胺酸殘基、及第62個之精胺酸殘基以4以內之距離相鄰接時，可判定該抗體結合於與B273相同之抗原決定部位。
藉由以上方法而得到之嵌合抗體、人類化抗體、或人類抗體，可根據實施例3所示之方法等評價對於抗原之結合性、挑選出較佳之抗體。作為比較抗體性質時的其他指標之一例，可列舉抗體之安定性。實施例10所示之示差掃描熱卡計(Differential Scanning Calorimeter；DSC)，係可快速且正確測定熱變性中點(Tm；melting temperature)之裝置，該熱變性中點為蛋白相對結構安定性之良好指標。藉由使用DSC測定Tm值並比較其值，可比較熱安定性之差異。已知抗體之保存安定性與抗體之熱安定性顯示某種程度之相關性(Lori Burton,et. al.,Pharmaceutical Development and Technology(2007)12,p.265-273)，故以熱安定性為指標可挑選出較佳之抗體。作為用於挑選抗體之其他指標，可列舉：於適當之宿主細胞中之收量高，及於水溶液中之凝集性低。由於例如收量最高之抗體未必顯示最高之熱安定性，故必須根據以上所述之指標予以綜合性判斷，以挑選出最適於投予人類之抗體。
又，使用適當之連接器(linker)將抗體之重鏈及輕鏈的全長序列予以連接，以取得單鏈免疫球蛋白(single chain immunoglobulin)之方法亦已為所知(Lee,H-S,et. al.,Molecular Immunology(1999)36,p.61-71；Shirrmann,T. et. al.,mAbs(2010),2,(1)p.1-4)。如此之單鏈免疫球蛋白藉由二聚物化，可保有與本來為四聚物之抗體相類似之結構與活性。又，本發明之抗體亦可為具有單一重鏈可變區，而不具有輕鏈序列之抗體。如此之抗體，被稱為單一區域抗體(single domain antibody：sdAb)或奈米體(nanobody)，實際上於駱駝或駱馬被觀察到，並經報告保有抗原結合能力(Muyldemans S. et. al.,Protein Eng.(1994)7(9),1129-35,Hamers-Casterman C. et. al.,Nature(1993)363(6428)446-8)。上述抗體包含於本發明中之抗體。
又，藉由調節與本發明之抗體鍵結之糖鏈修飾，可增強抗體依賴性細胞毒殺活性。作為調節抗體之糖鏈修飾的技術，雖已知有WO99/54342、WO00/61739、及WO02/31140等，但不限於此等。
抗體基因一經分離後，導入於適當之宿主以製備抗體時，可將適當之宿主與表現載體加以組合使用。作為抗體基因之具體例，可列舉：將本說明書所記述之編碼抗體重鏈序列之基因及編碼輕鏈序列之基因加以組合者。將宿主細胞予以轉形之際，重鏈序列基因與輕鏈序列基因，可嵌入相同之表現載體，又亦可嵌入個別表現載體。使用真核細胞作為宿主時，可使用：動物細胞、植物細胞、及真核微生物。作為動物細胞，可列舉：(1)哺乳類細胞，例如：為猴子細胞之COS細胞(Gluzman,Y. Cell(1981)23,p.175-182；ATCC CRL-1650)、小鼠纖維母細胞NIH3T3(ATCC No. CRL-1658)或中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞；ATCC CCL-61)之二氫葉酸還原酶缺損株(Urlaub,G. and Chasin,L. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(1980)77,p.4126-4220)。又，使用原核細胞時，可列舉例如：大腸菌、枯草桿菌。藉由轉形將目的抗體基因導入此等細胞，藉由將經轉形之細胞於活體外(活體外)培養可得到抗體。於以上之培養法中，有時因抗體序列之故而收量有所不同，故可以收量為指標，自具有相同結合活性之抗體中篩選出容易生產作為醫藥者。
作為本發明之抗體的同型並無限制，雖可列舉例如：IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA(IgA1、IgA2)、IgD或IgE等，但較佳者可列舉為：IgG或IgM、進一步更佳者可列舉為：IgG1或IgG2。
又本發明之抗體亦可為具有抗體之抗原結合部位之抗體的機能性片段或其修飾物。藉由將抗體以木瓜酵素、胃蛋白酶等之蛋白質分解酵素加以處理、或將抗體基因經由遺傳工程學之方法予以改變並使表現於適當之培養細胞，可得到該抗體之片段。於如此之抗體片段中，可將保有抗體全長分子所具有之全部或一部分機能的片段稱為抗體之機能性片段。作為抗體之機能，一般而言，可列舉：抗原結合活性、將抗原活性予以中和之活性、將抗原.活性予以増強之活性、抗體依賴性細胞毒殺活性、補體依賴性細胞毒殺活性、及補體依賴性細胞性細胞毒殺活性。本發明中之抗體之機能性片段所保有之機能係針對DR5之結合活性、而較佳者為：對於細胞誘導細胞凋亡之活性、更佳者為：經由誘導細胞凋亡之對於癌細胞之細胞毒殺活性。但本發明之抗體，除了對於細胞誘導細胞凋亡之活性以外，亦可兼具抗體依賴性細胞毒殺活性、補體依賴性細胞毒殺活性及/或補體依賴性細胞性細胞毒殺活性。
作為抗體之片段，可列舉例如：Fab、F(ab’)₂、Fv、或將重鏈及輕鏈之Fv以適當之連接器予以連接之單鏈Fv(single chain Fv；scFv)、二量抗體(diabody(diabodies))、線狀抗體、及由抗體片段形成之多專一性抗體等。又，抗體之片段亦包含將F(ab’)₂於還原條件下處理之抗體可變區之一價片段，即Fab’。
進一步，本發明之抗體亦可為對於至少2種不同抗原具有專一性之多專一性抗體。一般如此之分子係結合於2種抗原(即，雙專一性抗體(bispecific antibody))，但本發明中之「多專一性抗體」，係包含對於其以上(例如：3種)之抗原具有專一性之抗體。
本發明之多專一性抗體亦可為包含全長而成之抗體、或如此之抗體之片段(例如：F(ab’)₂雙專一性抗體)。雙專一性抗體亦可結合2種抗體之重鏈與輕鏈(HL對)而製作、亦可藉由將產生不同單株抗體之融合瘤予以融合、製作產生雙專一性抗體之融合細胞而製作(Millstein et al.,Nature(1983)305,p.537-539)。
本發明之抗體亦可為單鏈抗體(亦記載為sc Fv)。單鏈抗體，可藉由以多胜肽之連接器將抗體之重鏈可變區與輕鏈可變區予以連接而得到(Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies(單株抗體藥理學),113(Rosenberg及Moore編、Springer Verlag、New York,p.269-315(1994)，Nature Biotechnology(2005),23,p.1126-1136)。又，亦可使用以多胜肽連接器將2種sc Fv予以結合而製作之BiscFv片段作為雙專一性抗體。
製作單鏈抗體之方法為該技術領域所周知(參照例如：美國專利第4,946,778號、美國專利第5,260,203號、美國專利第5,091,513號、美國專利第5,455,030號等)。於此scFv中，重鏈可變區與輕鏈可變區係經由不致形成共軛物(conjugate)之連接器(較佳者為多胜肽)而連接(Huston,J. S. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(1988),85,p.5879-5883)。scFv中之重鏈可變區及輕鏈可變區亦可源自於相同抗體，亦可源自於個別抗體。
作為連接可變區之多胜肽連接器，係使用例如：包含12～19殘基而成之任意的單鏈胜肽。
編碼scFv之DNA係藉由下列步驟而得到：於編碼前述抗體之重鏈或重鏈可變區之DNA、及編碼輕鏈或輕鏈可變區之DNA中，將編碼此等序列中之全部或所欲之胺基酸序列之DNA部分作為模板、並使用定義其兩端之引子對藉由PCR法予以放大，其次，進一步將編碼多胜肽連接器部分之DNA、及定義其兩端得以與各重鏈、輕鏈連接之引子對予以組合並放大。
又，編碼scFv之DNA一經製作後，根據例行方法可得到含有該等之表現載體、及藉由該表現載體而轉形之宿主，又，經由使用該宿主，根據例行方法可得到scFv。此等抗體片段，與前述相同，可取得基因使其表現、並經由宿主而產生。
本發明之抗體，亦可經多量化以提高對於抗原之親和性。作為多量化抗體，亦可為1種抗體、亦可為識別相同抗原之複數個抗原決定部位之複數種抗體。作為將抗體多量化之方法，可列舉：IgG CH3區與2個scFv結合、與卵白素(streptavidin)結合，螺旋-轉角-螺旋(Helix-turn-helix)之導入等。
本發明之抗體亦可為不同胺基酸序列之複數種抗DR5抗體之混合物的多株抗體。作為多株抗體之一例，可列舉不同CDR之複數種抗體的混合物。作為如此之多株抗體，可使用將產生不同抗體之細胞的混合物予以培養，並自該培養物所純化之抗體(參照WO2004/061104號)。
作為抗體之修飾物，亦可使用經鍵結聚乙二醇(polyethylene glycol；PEG)等之各種分子之抗體。
本發明之抗體，進一步亦可為此等抗體與其他藥劑所形成之免疫共軛物(Immunoconjugate)。作為如此抗體之例子，可列舉：該抗體經鍵結放射性物質或具有藥理作用之化合物者(Nature Biotechnology(2005)23,p.1137-1146)。
所得到之抗體，可純化至同型(homogeneous)為止。抗體之分離、純化，只要係使用一般於蛋白質所使用之分離、純化方法均可。只要將例如：管柱層析、過濾器過濾、超過濾、鹽析、透析、製備用聚丙烯醯胺凝膠電泳，等電點電泳等予以適當選擇組合，即可將抗體予以分離、純化(Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual(蛋白質純化與鑑定指南：實驗課程手冊)，Daniel R. Marshak et al. eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996)；Antibodies：A Laboratory Manual(抗體：實驗手冊). Ed Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，但不限定於此等。
作為層析，可列舉：親和層析、離子交換層析、疏水性層析、凝膠過濾層析、逆相層析、吸附層析等。
此等層析可使用HPLC(high performance liquid chromatography；高效液相層析)或FPLC(fast performance liquid chromatography；快速液相層析)等之液相層析而進行。
作為用於親和層析之管柱，可列舉：蛋白質A管柱，蛋白質G管柱。
例如：作為使用蛋白質A管柱之管柱，可列舉：Hyper D、POROS、Sepharose F. F.(安瑪西亞)等。又亦可使用已固定有抗原之載體，利用對於抗原之結合性而將抗體予以純化。 (4)其他抗DR5抗體之具體例
例如：國際公開小冊WO98/51793、WO2001/83560、WO2002/94880、WO2003/54216、WO2006/83971、WO2007/22157記述有誘導DR5表現細胞細胞凋亡之抗DR5抗體。又，關於被稱為Tigatuzumab(CS-1008)、Lexatumumab(HGS-ETR2)、HGS-TR2J、Drozitumab(APOMAB)、Conatumumab(AMG-655)、LBY135之DR5抗體，或臨床試驗正持續中、或過去曾進行過臨床試驗。於本申請案申請日之時，臨床試驗正持續中者為：Tigatuzumab、Lexatumumab、Conatumumab。本說明書所記述之新穎抗DR5抗體，相較於上述之Tigatuzumab、Lexatumumab、Conatumumab及Drozitumab時，具有更優異之活體外(活體外)及/或活體內(invivo)抗腫瘤活性。 3.含有抗DR5抗體之醫藥
以記載於上述「2.抗DR5抗體之製造」之項目的方法所得到之抗體，由於作為激動劑作用於活體內之DR5細胞凋亡相關受體，經由受體對於癌細胞誘導細胞凋亡並顯示細胞毒殺活性之故，可使用作為醫藥，特別是針對癌之治療劑及/或預防劑。
於活體外(活體外)之抗體殺細胞活性，可藉由於過度表現細胞凋亡相關受體之細胞中，抑制細胞增殖之活性而測定。
例如：可培養過度表現DR5之癌細胞株，並於培養系統中添加各種濃度之抗體、測定對於細胞集落形成(focus formation)、細胞群落形成(colony formation)、及球體(spheroid)増殖之抑制活性。
於活體內(invivo)利用實驗動物之抗體對於癌之治療效果，例如：可對於經移植高表現DR5之腫瘤細胞株的裸小鼠投予抗體，並測定癌細胞之變化。
作為癌的種類，可列舉：肺癌、前列腺癌、甲狀腺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、大腸癌、乳癌、胰臟癌，腎臟癌、包含子宮內膜癌之子宮癌、包含黑色素瘤之黑瘤、纖維肉瘤、神經膠母細胞瘤、血癌(白血病、淋巴瘤等)等，但成為治療對象之癌細胞只要係表現有DR5並不限定於此等。
又，已知DR5抗體對於炎症細胞誘導細胞凋亡(J. Clin. Invest. 1996,98(2),271-278；Int. Immunol. 1996,8(10),1595-1602)。因此，本發明之抗體，亦可使用作為自體免疫疾病或炎症性疾病之治療劑。作為該自體免疫或炎症性之疾病的例子，可列舉：全身性紅斑性狼瘡、橋本病、風濕性關節炎、移植物抗宿主病(graft versus host disease)、薛格連氏症候群(Sjgren syndrome)、惡性貧血、青銅色病(addison disease)、厚皮病(pachyderma)、古德帕斯丘症候群(Goodpasture's syndrome)，克隆氏病(Crohn's disease)、自體免疫溶血性貧血、不孕症，重症肌無力症、多發性硬化症、Basedow-Krankheit病、血栓性血小板低下紫斑症、胰島素依賴型糖尿病、過敏、氣喘、異位性疾病、動脈硬化症、心肌炎、心肌病、腎絲球腎炎、再生不良性貧血、臟器移植後之排斥反應。
作為本發明之醫藥組成物中可接受之用於製劑的物質，較佳者為：於投予量或投予濃度，對於投予醫藥組成物者為無毒性者。
本發明之醫藥組成物可包含：為改變或保持pH、浸透壓、黏度、透明度、顏色、等張性、無菌性、安定性、溶解率、緩釋率、吸收率、浸透率之製劑用物質。作為製劑用物質可列舉以下者，但不限於此等：甘胺酸、丙胺酸、麩胺酸、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸等之胺基酸類、抗菌劑、抗壞血酸、硫酸鈉或亞硫酸氫鈉等之抗氧化劑、磷酸、檸檬酸、硼酸緩衝液、碳酸氫鈉、參(羥甲)胺甲烷-鹽酸(Tris-HCl)溶液等之緩衝劑，甘露醇或甘胺酸等之填充劑、乙二胺四乙酸(EDTA)等之螯合劑、咖啡因、聚乙烯吡咯啶酮(Polyvinylpyrrolidone)、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精等之錯合劑，葡萄糖、甘露糖或糊精等之増量劑、單糖類、雙糖類等之其他碳水化合物、著色劑、香味劑、稀釋劑、乳化劑或聚乙烯吡咯啶酮等之親水性聚合物、低分子量多胜肽、鹽形成對離子，氯化苄二甲烴銨(benzalkonium chloride)、苯甲酸、水楊酸、乙汞硫柳酸鈉(thimerosal)、苯乙醇(phenethyl alcohol)、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯已定(chlorhexidine)、山梨酸或過氧化氫等之防腐劑、甘油、丙二醇或聚乙二醇等之溶劑、甘露糖醇或山梨糖醇等之糖醇、懸浮劑、山梨醇酐酯、聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80等之聚山梨醇酯、triton、三木甲胺(tromethamine)、卵磷脂或膽固醇等之界面活性劑、蔗糖或山梨糖醇等之安定化増強劑、氯化鈉、氯化鉀或甘露糖醇‧山梨糖醇等之彈性増強劑、輸送劑、賦形劑、及/或藥學上之輔助劑。此等製劑用之物質的添加量，相對於抗DR5抗體之重量為0.01～100倍，尤其添加0.1～10倍較佳。製劑中之較佳醫藥組成物的組成，可由該業者，因應所適用之疾病、所適用之投予途徑等予以適當決定。
醫藥組成物中之賦形劑或載體亦可為液體亦可為固體。適當之賦形劑或載體亦可為注射用之水或生理食鹽水、人工腦脊髓液或一般用於非經口投予之其他物質。亦可將中性生理食鹽水或含血清白蛋白之生理食塩水作為載體使用。醫藥組成物中可含有：pH7.0-8.5之Tris緩衝液、pH4.0-5.5之乙酸緩衝液、pH3.0-6.2之檸檬酸緩衝液。又，此等緩衝液中亦可含有山梨糖醇或其他化合物。
本發明之醫藥組成物，可列舉：含有抗DR5抗體之醫藥組成物、以及含有抗DR5抗體及至少一種癌治療劑之醫藥組成物，本發明之醫藥組成物，作為一具有經選擇之組成與必要之純度的藥劑，係製備為冷凍乾燥品或液體。含有抗DR5抗體之醫藥組成物、以及含有抗DR5抗體及至少一種癌治療劑之醫藥組成物，亦可使用如蔗糖之適當賦形劑成形為冷凍乾燥品。
於上述之醫藥組成物中，與抗DR5抗體一併含有之癌治療劑，亦可與抗DR5抗體同時地、分別地、或連續地投予，亦可改變各自的投予間隔而進行投予。作為如此之癌治療劑，可列舉：白蛋白紫杉醇(abraxane)、卡鉑定(carboplatin)、順鉑(cisplatin)、健擇(gemcitabine)、愛萊諾迪肯(irinotecan；CPT-11)、紫杉醇(paclitaxel)、愛寧達(pemetrexed)、蕾莎瓦(sorafenib)、長春花鹼(vinblastin)、5-FU(5-fluorouracil；5-氟尿嘧啶)或記載於國際公開第WO2003/038043號小冊之藥劑等，但只要係具有抗腫瘤活性之藥劑，並不限定於上述之藥劑。
本發明之醫藥組成物亦可製備為非經口投予用，亦可製備為經口消化道吸收用。製劑之組成及濃度亦可根據投予方法而決定，又由於本發明之醫藥組成物所含之抗DR5抗體之對於DR5的親和性(亦即，對於DR5之解離係數(Kd值))，親和性愈高(Kd值低)者，即使減少對於人類之投予量亦可發揮藥效之故，亦可根據該結果決定本發明之醫藥組成物對於人的投予量。當對於人類投予人類型抗DR5抗體之際，投予量只要於1～180天之間投予一次，約0.1～100mg/kg即可。
作為本發明之醫藥組成物的形態，可列舉：包含點滴之注射劑、塞劑、經鼻劑、舌下劑、經皮吸收劑等。
以下，例示實施例以具體說明本發明，但本發明不限定於此等實施例。又，於下述實施例中，有關基因操作之各操作只要未特別明示，係依「分子選殖(Molecular Cloning)」(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.及Maniatis,T.著，由冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)於1989年所出版)所記載之方法進行，或使用市售之試藥或套組時，係根據市售品之說明書使用。 [實施例1]小鼠抗體B273之製作 1)-1　人類DR5蛋白質(人類DR5細胞外區域人類Fc融合體)之製備 1)-1-1　表現人類DR5細胞外區域之載體之製作
表現人類DR5蛋白質(同型異構物2：NP_671716)之載體，係藉由將融合有人類DR5細胞外區域與人類IgG1/Fc區之基因配置於CMV啟動子(人類巨細胞病毒啟動子)下游而建構。 1)-1-2　人類DR5蛋白質之製備
將表現載體導入293FreeStyle細胞及回收培養上清液係於Invitrogen公司(現為生命科技(日本)股份有限公司(Life Technologies Japan Ltd))進行。 1)-1-3　人類DR5蛋白質之純化
使用蛋白質A親和性管柱層析純化上述b)所得到之培養上清液。將5L份的培養上清液施加(apply)於經PBS平衡化之「Hitrap ProteinA FF」(GE Healthcare(japan)股份有限公司Cat. No.(型號)：17-5079-01)，並以PBS清洗。其次添加2M精胺酸溶液(pH4.0)，並收集含有人類DR5蛋白質之部分。將該部分添加於離心過濾裝置(Centrifugal Filter Device)(AmiconUltra 4；截留分子量10K；密理博(Millipore)公司)，並進行至換為PBS溶液及濃縮。使最終容量為6ml並作為純化樣品(rDR5-hFc)。純化品之蛋白定量係使用「Micro BCA Protein Assay Kit(Micro BCA蛋白質檢測套組)」(PIERCE#23235)予以定量。標準品係使用套組所含之「Albumin Standard(白蛋白標準品)」。 1)-2免疫
使用5～6週齡的BALB/cAJcl小鼠(日本CLEA公司)。第0天，於小鼠後頸皮下投予經混合有1)-1-3所製備之50μg的rDR5-hFc與弗氏完全佐劑(Freund Complete Ajuvant)(和光純藥公司製)(體積比1：1)者。第14天與第28天，於小鼠背部皮下投予經混合有rDR5-hFc與弗氏不完全佐劑(Freund Incomplete Ajuvant)(和光純藥公司製)(體積比1：1)者。第42天，於小鼠腹腔內投予50μg之rDR5-hFc，第45天摘取小鼠脾臟並用於製作融合瘤。 1)-3　融合瘤之製備
使用PEG 4000(免疫生物研究所公司製)將脾臟細胞與小鼠骨髓瘤P3X63Ag8U.1細胞予以細胞融合，並稀釋培養於ClonaCell-HY Selection Medium D(幹細胞科技公司製#03804)。藉由回收所出現之融合瘤群落以製備單株融合瘤。將所回收之各融合瘤群落予以培養，並使用所得到之融合瘤培養上清液進行產生抗DR5抗體之融合瘤的篩選(screening)。 1)-4　經由Cell-ELISA法之抗體篩選 1)-4-1　表現人類DR5突變體之載體(pcDNA 3.1-DR5M)之建構
將編碼人類DR5蛋白質(同型異構物2：NP_671716)之cDNA選殖於pcDNA3.1(+)載體，以建構表現死亡區域經修飾(modified)之載體pcDNA 3.1-DR5M，其係經設計成得以將位於死亡區域內之第334個胺基酸的L取代表現為D。 1)-4-2　表現抗原基因之細胞之製備
製備HEK293細胞，其係於含有10%FBS(Fetal Bovine Serum；胎牛血清)之DMEM培養基中且7.5x10⁵細胞/ml。使用Lipofectamine 2000(生命科技(日本)公司製)對於該細胞導入：表現死亡區域經修飾(modified)之DR5的載體pcDNA3.1-DR5M或作為對照之pcDNA3.1-mock，分別注入50μl於96孔Half Area Microplate(康寧(Corning)公司製)中，並於含有10%FBS之DMEM培養基中、37℃、5% CO₂的條件下培養一晚。將所得到之導入細胞於黏附狀態下使用於Cell-ELISA。 1)-4-3　Cell-ELISA
將於1)-4-2所製備之導入有表現載體之HEK293細胞的上清液去除後，對於分別導入有pcDNA3.1-DR5M與pcDNA3.1-mock之HEK293細胞添加融合瘤培養上清液，並於4℃下靜置1小時。將孔中之細胞以含有5% FBS的PBS清洗1次後，添加以含有5% FBS的PBS經500倍稀釋之Goat anti-Mouse IgG,Peroxidase Conjugated(山羊抗小鼠IgG抗體-過氧化酶共軛物)(Chemicon公司製#AP181P)，於4℃下靜置1小時。將培養孔中之細胞以含有5% FBS的PBS清洗5次後，添加25μl/孔之OPD顯色液(於OPD溶解液(0.05M檸檬酸三鈉、0.1M磷酸氫二鈉‧十二水pH4.5)中，分別溶解o-苯二胺二鹽酸鹽(和光純藥公司製)、H₂O₂並成為0.4mg/ml、0.6%(v/v))。有時予以攪拌以進行顯色反應，於添加25μl/孔之1M鹽酸(HCl)以結束顯色反應後，以培養盤計數器(ARVO：珀金埃爾默(PerkinElmer)公司)測定490nm之吸光度。為篩選產生與表現於細胞膜表面上之DR5專一性結合之抗體的融合瘤，選擇產生下述培養上清液之融合瘤作為產生抗DR5抗體之陽性株，該培養上清液中，相較於導入pcDNA 3.1-mock之HEK293細胞(對照組)，導入表現pcDNA3.1-DR5M之載體的HEK293細胞顯示較高吸光度。 1)-5經由流式細胞儀(flow cytometry)之抗體篩選 1)-5-1表現抗原基因之細胞之製備
將293T細胞以5×10⁴細胞/cm²接種於225 cm²細胞培養角瓶(flask)(住友酚醛樹脂(Sumitomo Bakelite)公司製)，並於含有10% FBS之DMEM培養基中、37℃、5%CO₂的條件下培養一晚。翌日，使用Lipofectamine 2000將pcDNA3.1-DR5M與作為對照組之pcDNA3.1-mock分別導入於293T細胞，並於37℃、5%CO₂的條件下再培養一晚。翌日，將導入有表現載體之293T細胞以TrypLE Express(生命科技(日本)公司製)加以處理，並以含有10%FBS之DMEM將細胞清洗後，懸浮於含有5% FBS之PBS。將所得到之細胞懸浮液用於流式細胞儀分析。 1)-5-2流式細胞儀分析
將於1)-5-1所製備之293T細胞懸浮液予以離心，並去除上清液後，分別對於導入有pcDNA3.1-DR5M之293T細胞與導入有pcDNA3.1-mock之293T細胞添加融合瘤培養上清液且予以懸浮，並於4℃下靜置1小時。以含有5% FBS之PBS清洗2次後，添加以含有5% FBS之PBS經1000倍稀釋之Fluorescein-conjugated goat IgG fraction to mouse IgG(抗小鼠IgG的山羊IgG部分-螢光素共軛物)(Whole Molecule(全分子))(Cappel公司製#55493)並予以懸浮，並於4℃下靜置1小時。以含有5%FBS之PBS清洗3次後，再懸浮於含有5% FBS之PBS，該FBS含有2μg/ml的7-胺基放射菌素D(7-aminoactinomycin D)(InVitrogen(Molecular Probes)公司製)，並以流式細胞儀(FC500：貝克曼庫爾特(Beckman Coulter)公司)進行檢測。數據分析係以Flowjo(特里司達(TreeStar)公司)進行。製作將7-胺基放射菌素D陽性的死細胞排除於門(gate)後，活細胞之FITC螢光強度的直方圖(histogram)。選擇下述融合瘤作為產生抗DR5抗體之陽性株，該融合瘤所產生之樣品如下，即：相對於導入用以對照之pcDNA3.1-mock之293T細胞的螢光強度直方圖，導入pcDNA3.1-DR5M之293T細胞的直方圖位移至強螢光強度側。 1)-6　殺細胞作用之篩選
使用於1)-5及1)-6選擇作為產生抗DR5抗體之陽性株的融合瘤培養上清液，確認對於源自於人類T細胞淋巴瘤之細胞株Jurkat的細胞死亡誘導作用。將以50 mM Tris-HCl(pH8.5)製備為50μg/ml之AfiniPure Goat anti-mouse IgG Fc specific(親和純化山羊專一性抗小鼠IgG Fc抗體)(傑克森(Jackson)公司製#115-005-071)分別注入25μl於96孔Half Area Microplate(康寧公司製)中並於4℃下靜置1晚。以PBS將培養孔清洗2次後，添加融合瘤培養上清液，並於4℃下靜置1晚。以PBS將各孔清洗2次後，添加25μl/孔之Jurkat細胞並於37℃、5%CO₂的條件下培養20小時。該Jurkat細胞係於含有10% FBS之RPMI 1640培養基中製備為4.0x10⁴細胞/ml。藉由使用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay Kit(CellTiter-Glo冷光細胞存活率檢測套組)(普洛麥格(Promega)公司製#G 7571)定量源自於活細胞之ATP量以評價存在於融合瘤培養上清液中之抗DR5單株抗體的殺細胞作用。其結果建立了產生相對於添加融合瘤培養用培養基，顯示減少8成以上之ATP量之5種單株抗體(B086、B139、B192、B273、B467)的融合瘤。 1)-7　定出單株抗體之同型
單株抗體之同型係藉由小鼠單株分型套組(Mouse monoclonal isotyping kit)(席洛鐵克(Serotech)公司製)而定出。其結果確認B086、B139、B192、B273、B467之同型為IgG1、κ鏈。 1)-8　單株抗體之製備
單株抗體係純化自經移植融合瘤之小鼠的腹水(以下稱為「抗體純化原料」)。
小鼠腹水之製備如下。首先，將7-8週齡之BALB/cAJc1-nu/nu裸小鼠(日本SLC)以姥較烷(Pristane)(西格瑪(Sigma)公司製)處理，約3週後將經生理食鹽水清洗之融合瘤，以每隻小鼠1×10⁷細胞移植於腹腔內。1-2週後收集積存於腹腔內之腹水並通過0.22μm之過濾器滅菌，以作為抗體純化原料使用。
抗體係經由Hitrap MabSelect SuRe(通用電氣醫療生命科學(GE Healthcare Bio-Sciences)公司製)予以純化。即，將抗體純化原料添加於管柱並以PBS清洗後，以2M精胺酸鹽酸(Arginine-HCl)pH4.0溶離。所溶離之抗體溶液於中和後，緩衝液置換為PBS。抗體濃度係藉由將結合於POROS G 20μm Column PEEK,4.6mm×50mm,0.83ml(應用生物系統(Applied Biosystems))之抗體予以溶離，並測定溶離液之吸光度(O.D.280nm)而求得。具體而言，將經PBS稀釋之抗體樣品添加於經平衡化緩衝液(30.6mM磷酸二氫鈉十二水、19.5mM磷酸一鉀、0.15M氯化鈉，pH7.0)平衡化之POROS G 20μm，以平衡化緩衝液將管柱清洗後，以溶離液(0.1%(V/V)HCl、0.15M氯化鈉)溶離結合於管柱之抗體。測定溶離液之吸光度(O.D.280nm)的波峰面積，並以下式算出濃度。抗體樣品濃度(mg/ml)=(抗體樣品之波峰面積)/(標準品(人類IgG1)之波峰面積)×標準品之濃度(mg/ml)×樣品之稀釋倍率。又，所得到之抗體中所含之內毒素濃度，使用和光-鱟ES-II單一試驗(Limulus ES-II Single Test WAKO)(和光純藥工業295-51030含對照標準品內毒素)與Toxinometer(和光純藥工業；ET-301或ET-5000)測定並確認為1EU/mg以下後使用於以下之實驗。 1)-9小鼠抗體B273對於人類癌細胞株之於活體外殺細胞活性
以含有10%FBS之RPMI1640培養基或含有10%FBS之MEM(Minimum Essential Medium)培養基，分別將源自於人類T細胞淋巴瘤之細胞株Jurkat或人類神經膠母細胞瘤細胞株U-87MG製備為4.4x10⁴細胞/ml，並以45μl/孔添加於白色透明底部之96孔微量盤(microplate)(康寧公司製)、於37℃、5%CO₂的條件下培養一晚。將小鼠B273抗體或小鼠IgG1抗體(R & D公司製)與AfiniPure Goat anti-mouse IgG Fc specific(親和純化山羊專一性抗小鼠IgG Fc抗體)(傑克森公司製#115-005-071)等濃度混合後，以5μl/孔添加小鼠B273抗體或小鼠IgG1抗體使最終濃度為10,000～0.01ng/ml，並於37℃、5%CO₂的條件下培養24小時。使用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay Kit(CellTiter-Glo冷光細胞存活率檢測套組)(普洛麥格公司製#G7571)並根據所附上之實驗說明書(Protocol)於冷光儀(luminometer)(珀金埃爾默公司製)測定各孔中源自於活細胞之ATP量、並以取代抗體溶液而添加培養基之培養孔的數值為100%評價殺細胞活性(第1圖)。各圖係將細胞生存率以平均值±標準偏差(n=3)表示。其結果顯示：小鼠B273抗體對於兩細胞株顯示濃度依賴性殺細胞作用。 [實施例2]小鼠抗體B273基因之選殖與人類嵌合抗體基因之製作 2)-1　小鼠抗體B273之cDNA之選殖與定序 2)-1-1　小鼠抗體B273之重鏈及輕鏈之N端胺基酸序列之定序
為將小鼠抗體B273之重鏈及輕鏈之N端胺基酸序列予以定序，以SDS-PAGE將於實施例1-8所純化之小鼠抗體B273予以分離。將凝膠中之蛋白質自分離後之凝膠轉印於PVDF膜(polyvinylidene difluoride membrane；聚偏二氟乙烯膜)(孔徑0.45μm；Invitrogen公司製)，並以清洗緩衝液(25mM氯化鈉、10mM硼酸鈉緩衝液pH8.0)清洗後，浸漬於染色液(50%甲醇、20%乙酸、0.05%考馬斯亮藍(Coomassie Brilliant Blue))染色5分鐘後，以90%甲醇脫色。切取於PVDF膜上可見之相當於重鏈(移動度較小之電泳帶)及輕鏈(移動度較大之電泳帶)的電泳帶(band)部分，使用Procise(註冊商標)cLC蛋白質定序儀492cLC型(cLCd Protein Sequencer Model 492cLC)(應用生物系統)，並根據自動艾德曼法(參照Edman et al.(1967)Eur. J. Biochem. 1,80)嘗試鑑定個別之N端胺基酸序列。其結果為：相當於小鼠抗體B273之重鏈之電泳帶的N端胺基酸序列為EVQLQQSGPELVKPG(序列表之序列編號1)，相當於輕鏈之電泳帶的N端胺基酸序列為DVVMTQTPLSLPVSLGDQAS(序列表之序列編號2)。 2)-1-2　源自於產生小鼠抗體B273之融合瘤的mRNA之製備
為選殖編碼小鼠抗體B273之重鏈及輕鏈的cDNA，使用快速製備mRNA純化套組(Quick Prep mRNA Purification Kit)(通用電氣醫療健康公司)自產生小鼠抗體B273之融合瘤製備mRNA。 2)-1-3　小鼠抗體B273之cDNA之選殖與定序
參考下列事項：自實施例1)-7得知小鼠抗體B273之重鏈及輕鏈的同型為γ1與κ、上述2)-1-1所定序之重鏈及輕鏈之N端胺基酸序列、及根據Kabat等人所製作之抗體胺基酸序列資料庫(參照Kabat,E. A. et al.,(1991)in Sepuences of Proteins of Immunological Interest Vol.I及II,U. S. Department of Health and Human Services)，合成若干分別與抗體基因轉譯區域之5’端及包含終止密碼子(terminal codon)之3’末端部分雜交之寡核苷酸引子，並使用2)-1-2所製備之mRNA與寶酒造單一步驟RNA聚合酶鏈反應套組(AMV)(TakaRa One Step RNA PCR Kit(AMV))(寶酒造生物公司)以放大編碼重鏈及輕鏈之cDNA時，以下述之引子組合得以將編碼抗體之重鏈及輕鏈之cDNA放大。
重鏈用引子組合
5’-aagaattcatgggatggagctgtatc-3’(MH258E1F1：序列表之序列編號3)
5’-aagatatcttatttaccaggagagtgggagag-3’(G1EVR1：序列表之序列編號4)
輕鏈用引子組合
5’-aagaattcatgaagttgcctgttagg-3’(MK19EIF1：序列表之序列編號5)
5’-aagatatcttaacactcattcctgttgaagct-3’(KEVR1：序列表之序列編號6)
分別將經PCR放大之重鏈及輕鏈之cDNA，使用pEF6/V5-His TOPO TA Expression Kit(Invitrogen公司)予以選殖，並將經選殖之重鏈、輕鏈之各核苷酸序列使用基因序列分析装置(「ABI PRISM 3700 DNA Analyzer；應用生物系統」或「Applied Biosystems 3730xl Analyzer；應用生物系統」)予以定序。序列反應係使用GeneAmp 9700(應用生物系統公司)。
將經定序之編碼小鼠抗體B273之重鏈的cDNA之核苷酸序列表示於序列表之序列編號7、胺基酸序列表示於序列編號8。編碼小鼠抗體B273之輕鏈的cDNA之核苷酸序列表示於序列表之序列編號9、胺基酸序列表示於序列表之序列編號10。分別將序列編號7及8之序列記載於第28圖、序列編號9及10之序列記載於第29圖。
又，將重鏈及輕鏈之胺基酸序列，使用抗體之胺基酸序列的資料庫KabatMan(參照PROTEINS：Structure,Function and Genetics(蛋白質：結構、功能與遺傳學),25(1996),130-133.)加以比較檢討之結果：關於小鼠抗體B273之重鏈，明確得知序列表之序列編號8之胺基酸號碼20至141所示之胺基酸序列為可變區。又關於小鼠抗體B273之輕鏈，明確得知序列表之序列編號10之胺基酸號碼20至133所示之胺基酸序列為可變區。 2)-2　表現嵌合抗體B273之載體之製作 2)-2-1　廣用表現載體pEF6KCL及Pef1FCCU之製作 2)-2-1-1　表現嵌合及人類化輕鏈之載體pEF6KCL之建構
藉由以質體pEF6/V5-HisB(Invitrogen公司)作為模板使用下述引子進行PCR，取得緊接於BGHpA之後(序列位置(Sequence Position)2174)，至SmaI(序列位置2958)之DNA片段(包含：f1複製起點(f1 origin of replication)及SV40啟動子與起點(SV40 promotor and origin)之DNA片段，以下表記為「片段A」)。
5’-ccacgcgccctgtagcggcgcattaagc-3’(引子EFF1：序列表之序列編號11)
5’-aaacccgggagctttttgcaaaagcctagg-3’(引子EFsmaR：序列表之序列編號12)
經由重疊表現PCR(Overlap Expression PCR)將所得到之片段A與下述DNA片段(序列編號13；以下表記為「片段B」)結合，該DNA片段包含：編碼人類κ鏈分泌訊息及人類κ鏈恆定區及人類polyA附加訊息之DNA序列。將所得到之結合片段A與片段B之DNA片段以制限酶KpnI及SmaI予以消化，並與經限制酶KpnI及SmaI消化之質體pEF6/V5-HisB(Invitrogen公司)連接(ligate)，建構於EF1啟動子之下游具有訊號序列、選殖位置、人類κ鏈恆定區、及人類polyA附加訊號序列之表現嵌合及人類化輕鏈之載體pEF6KCL。 2)-2-1-2　pEF1/KCL之建構
將根據上述方法而得到之pEF6KCL以限制酶KpnI及SmaI所切出之DNA片段，與經KpnI及SmaI消化之pEF1/myc-HisB(Invitrogen公司)連接，以建構質體pEF1KCL。 2)-2-1-3　表現嵌合及人類化重鏈之載體pEF1FCCU之建構
將包含：編碼人類IgG1訊號序列及恆定區之胺基酸的DNA序列之DNA片段(序列編號14)以限制酶NheI及PmeI予以消化，並與經NheI及PmeI消化之質體pEF1KCL結合，建構於EF 1啟動子之下游具有訊號序列、選殖位置、人類重鏈恆定區、及人類polyA附加訊號序列之表現嵌合及人類化重鏈之載體pEF1FCCU。 2)-2-2　表現B273嵌合型輕鏈之載體之建構
藉由以編碼小鼠抗體B273之輕鏈的cDNA作為模板，以KOD-Plus-(東洋紡績公司)與下述之引子組合將包含編碼輕鏈之可變區的cDNA放大，並將以限制酶NdeI及BsiWI切出之DNA片段，嵌入於將表現嵌合及人類化抗體輕鏈之廣用載體(pEF6KCL)以限制酶NdeI及BsiWI切斷之處，建構表現B273嵌入型輕鏈之載體。將所得到之表現載體命名為「pEF6KCL/B273L」。將B273嵌合型輕鏈之核苷酸序列表示於序列表之序列編號15、胺基酸序列表示於序列編號16。序列編號15及16之序列記載於第30圖。又，記載於序列表之序列編號16之嵌合型輕鏈胺基酸序列之第134個胺基酸殘基為輕鏈可變區之羧基端，雖對應於記載於序列表之序列編號10之小鼠抗體B273之輕鏈胺基酸序列之第133個之丙胺酸殘基，但在記載於序列編號16之胺基酸序列中已由源自於人類抗體輕鏈之蘇胺酸殘基所取代。
輕鏈用引子組合
5’-aaacatatggcgatgttgtgatgacccaaactccactctcc-3’(B273LF：序列表之序列編號17)
5’-aaacgtacgtttgatttccagcttggtgcctccaccgaacg-3’(B273LR：序列表之序列編號18) 2)-2-3表現B273嵌合型重鏈之載體之建構
藉由以編碼小鼠抗體B273之重鏈的cDNA作為模板，以KOD-Plus-(東洋紡公司)與下述之引子組合將包含編碼重鏈可變區之cDNA的部分放大，並將以限制酶BlpI切出之DNA片段，嵌入於將表現嵌合及人類化抗體重鏈之廣用載體(pEF1FCCU)以限制酶BlpI切斷之處，建構表現B273嵌入型重鏈之載體。將所得到之表現載體分別命名為「pEF1FCCU/B273H」。將B273嵌合型重鏈之核苷酸序列表示於序列表之序列編號19、將胺基酸序列表示於序列編號20。序列編號19及20之序列記載於第31圖。
重鏈用引子組合
5’-aaagctgagcgaggttcagctgcagcagtctggacctgagc-3’(B273HF：序列表之序列編號21)
5’-aaagctgagctgactgtgagagtggtgccttggccccagtag-3’(B273HR：序列表之序列編號22) 2)-3　嵌合抗體B273之製備 2)-3-1　嵌合抗體B273之生產
將1.2×10⁹個之對數増殖期的FreeStyle 293F細胞(Invitrogen公司)接種於1.2L新鮮之FreeStyle 293expression medium(FreeStyle 293表現培養基)(Invitrogen公司)，並於37℃、8%CO₂培養箱內以90rpm震盪培養一小時。將3.6mg聚乙烯亞胺(PolyScience #24765)溶解於20ml之Opti-Pro SFM培養基(Invitrogen公司)，其次將使用PureLink HiPure質體套組(PureLink HiPure Plasmid Kit)(Invitrogen公司)所製備之pEF1FCCU/B273H(0.4mg)及pEF6KCL/B273L(0.8mg)懸浮於20ml之Opti-Pro SFM培養基。將表現載體/Opti-Pro SFM混合液20ml添加於20ml之聚乙烯亞胺/Opti-Pro SFM混合液並予以緩慢攪拌，進一步放置5分鐘後添加於FreeStyle 293F細胞中。將於37℃、8%CO₂培養箱中，以90 rpm震盪培養7天而得到之培養上清液以拋棄式囊式過濾器(Disposable Capsule Filter)(艾德凡鐵克(Advantec) #CCS-045-E1H)過濾。
將經由組合pEF1FCCU/B273H與pEF6KCL/B273L而取得之嵌合抗體B273命名為「cB273」。 2)-3-2 cB273之純化
將上述2)-3-1所得到之培養上清液，以重組蛋白質A親和性層析(於4-6℃下)與陶瓷氫氧基磷灰石(室溫下)之2段式步驟予以純化。重組蛋白質A親和性層析純化後與陶瓷氫氧基磷灰石純化後之緩衝液置換步驟係於室溫下進行。起初，將培養上清液1100-1200ml，施佳於經PBS平衡化之MabSelect SuRe(通用電氣醫療生物科學公司製；HiTrap管柱：容積1ml×2連接)。培養液完全進管柱後，以15-30ml PBS將管柱清洗。其次以2M精胺酸鹽酸鹽溶液(pH4.0)溶離，並收集含有抗體之部分。將該部分以脫鹽管柱(通用電氣醫療生物科學公司製；Hitrap脫鹽管柱：容積5ml×2連接)進行置換為5mM磷酸鈉/50mM MES/20mM氯化鈉/pH6.5之緩衝液。進一步將該經置換之抗體溶液，施加於經5mM NaPi/50mM MES/20mM氯化鈉/pH6.5緩衝液平衡化之陶瓷氫氧基磷灰石管柱(日本BioRad；生物等級CHT2-1氫氧基磷灰石管柱：容積2ml)。進行氯化鈉之線性濃度梯度溶離，並收集含有抗體之部分。將該部分以脫鹽管柱(通用電氣醫療生物科學公司製，Hitrap脫鹽管柱：容積5mlx2連接)進行置換為CBS(10mM檸檬酸緩衝液/140mM氯化鈉，pH6.0)溶液。最後以離心式超過濾裝置(Centrifugal UF Filter Device)VIVASPIN 20(截留分子量30K；莎多力斯(Sartorius)公司，於4℃下)濃縮，製備成IgG濃度為1.0mg/ml以上並作為純化樣品。 [實施例3]人類嵌合B273(cB273)抗體之活性測定(活體外) 3)-1 cB273抗體之人類DR5細胞外區域專一性結合性之檢討
經由以下所示之直接ELISA(direct ELISA)法檢討cB273對於人類TRAIL R1～R4及小鼠TRAIL R2細胞外區域蛋白質(研發系統(R&D Systems)公司製)之結合性。首先，將以PBS稀釋為1μg/ml之TRAIL Rs之細胞外區域蛋白質溶液，以50μl/孔分別注入於免疫分析盤(immunoplate)(Nunc公司製#442404)，並藉由於4℃下靜置一晚使蛋白質吸附於分析盤。翌日，去除孔中之液體，以PBS清洗一次後，為抑制非專一性之蛋白質的吸附，以200μl/孔分別注入含3%胎牛血清之PBS，並於室溫下靜置1.5小時。去除孔中之液體，以50μl/孔添加經含3%胎牛血清之PBS稀釋之cB273或可溶性人類TRAIL(ALEXIS公司製#ALX-522-003)。於室溫下靜置1.5小時後，添加PBS後去除孔中之液體，並以PBS將孔清洗2次。於添加有cB273抗體之孔中，以50μl/孔添加經含3%胎兒血清之PBS稀釋2500倍之Goat anti-Human IgG,F(ab’)₂ fragment specific,Peroxidase Conjugated(山羊專一性抗人類IgG,F(ab’)₂片段-過氧化酶共軛物)(傑克森公司製#109-035-097)；於添加有可溶性TRAIL之孔中，以50μl/孔添加經2000倍稀釋之抗FLAG M2單株抗體過氧化酶共軛物(Anti-FLAG M2 monoclonal antibody-Peroxidase Conjugated)，並於室溫下靜置1小時。添加PBS後去除孔中之液體，並以PBS將孔清洗2次後，以100μl/孔添加OPD顯色液使顯色、以100μl/孔添加1M HCl停止顯色反應，並以微量盤計數器測定492nm之吸光度。第2A圖顯示cB273結果、第2B圖顯示可溶性TRAIL結果，圖形係以平均值±標準偏差(n=3)表示。其結果顯示：cB273與人類TRAIL R2細胞外區域專一性結合。 3)-2　經由Biacore(biomolecular interaction analysis；生物分子交互作用分析系統)之cB273抗體之結合活性評價 3)-2-1　人類DR5細胞外區域蛋白質之製備 3)-2-1-1　表現DR5細胞外區域蛋白質之載體之製作 為建構表現包含序列表之序列編號23所示之人類DR5之胺基酸號碼1-130所示之胺基酸序列而成之區域(以下，表記為「sDR5」)之載體，使用sDR5放大用引子組合：DR5 Ndefw：5’-gtggcatatggctctgatcacccaacaa-3’(序列表之序列編號24)及DR5 Xhorv：5’-cgcctcgagtgattctttgtggacaca-3’(序列表之序列編號25)，之引子組合，並以編碼人類DR5細胞外區域之cDNA為模板進行PCR反應。將所得到之PCR產物以NdeI及XhoI切斷，並選殖於pET21b(+)(Novagen公司製)之NdeI/XhoI位置(以下，簡稱為「pET21b(+)-sDR5」。又，以下及圖式中將經由「pET21b(+)-sDR5」所表現之重組蛋白質表記為rsDR5(序列表之序列編號26))。 3)-2-1-2　DR5細胞外區域蛋白質(rsDR5)之製作
以表現質體pET21b(+)-sDR5將大腸菌OrigamiB(DE3)(Novagen公司製)轉形、於已添加100μg/ml之安比西林(ampicillin)(西格瑪公司製)、15μg/ml之卡納黴素(kanamycin)(和光公司製)之2-YT培養基進行培養，並藉由添加0.5mM IPTG進行誘導DR5部分蛋白質之表現。6000rpm離心20分鐘集菌，並懸浮於結合緩衝液(50mM Tris HCl pH7.5、300mM氯化鈉)後，於冰浴中進行超音波破碎。25000rpm離心20分鐘、回收上清液、並供予Ni-NTA(Invitrogen公司製)。以結合緩衝液清洗後，以溶離緩衝液(50mM Tris HCl pH7.5、300Mm氯化鈉、300mM咪唑)予以溶離。溶離樣品以透析緩衝液(50mM Tris HCl pH8.0、20mM氯化鈉)透析後，供予MONO Q，並以溶離緩衝液(50mM Tris HCl pH8.0、1M氯化鈉)使其梯度(gradient)溶離。溶離樣品係以PBS作為溶劑之凝膠過濾管柱層析(Superdex 75 16/60：通用電氣醫療生物科學公司製)進一步予以純化。所得到之重組蛋白的濃度以UV 280(莫耳吸光度常數；14855)測定。 3)-2-2　經由Biacore之結合活性測定
cB273抗體與rsDR5之解離常數測定，係使用Biacore 3000(通用電氣醫療生物科學(股))，以捕捉(capture)法進行，該捕捉法係將抗體捕捉(capture)於經固定化之抗人類IgG(Fc)抗體，將抗原作為分析物(analyte)測定。抗人類IgG(Fc)抗體(Human antibody capture kit；通用電氣醫療生物科學(股))係以胺耦合反應法共價鍵結於感測晶片CM5(sensor chip CM5)(BiAcore,Inc.)約8,000RU。於參考胞(reference cell)亦進行相同之固定化。使用HBS-EP(10mM HEPES pH7.4、0.15M氯化鈉、3mM EDTA、0.05% Surfactant(表面活性劑)P20)作為泳動緩衝液(running buffer)。於固定有抗人類IgG(Fc)抗體之晶片上，以流速10μl/分添加50nM之cB273抗體溶液60秒後，以流速30μl/分添加rsDR5之系列稀釋溶液(0.63-20nM)60秒，並持續監測300秒之間的解離相。以流速10μl/分添加作為再生溶液之3M氯化鎂30秒。數據之分析係使用分析軟體(BIAevaluation software,version 3.1)之1對1結合模式，算出結合速率常數kon、解離速率常數koff、及解離常數(KD；KD=koff/kon)。cB273抗體之Biacore測定結果表示於第3圖。 3)-3 cB273抗體之對於人類癌細胞株之活體外殺細胞作用
根據以下方法檢討cB273抗體之對於各種癌細胞株之殺細胞作用。自ATCC(American Type Culture Collection：美國菌種保存中心)購入A2780、SK-OV-3、SK-CO-1、Caov-3、NIH：OVCAR-5(以上為人類卵巢癌細胞株)，HCT-15、COLO 205、HT29、SW480、SW620、DLD-1、COLO201、WiDr(以上為人類大腸癌細胞株)，NCI-H1975、NCI-H292、NCI-H460、NCI-H358(以上為人類肺癌細胞株)，MDA-MB-231、ZR-75-1(以上為人類乳癌細胞株)。將此等細胞株製備於含10%胎牛血清(HyClone公司製)之培養基(以下培養基)中且1×10⁵細胞/ml，並以50μl/孔分別接種於白色透明底部之96孔微量盤(康寧公司製)。將cB273抗體以1μg/ml之2次抗體溶液(Goatanti-human IgG Fc(山羊抗人類IgG Fc抗體)：MP Biomedicals,LLC.公司製)製備為20000ng/ml後，使用培養基製備2000、200、20、2ng/ml之溶液，並分別添加50μl(抗體最終濃度10000、1000、100、10、1ng/ml)。於37℃、5% CO₂之條件下將微量盤培養72小時後，使用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay Kit(CellTiter-Glo冷光細胞存活率檢測套組)(普洛麥格公司製#G7571)並根據所附之實驗說明書以冷光儀(Berthold公司製)測定各孔中源自於活細胞之ATP量。將經添加培養基與細胞懸浮液之孔作為陰性對照孔、將僅添加培養基之孔作為背景值孔，以算出待測孔之細胞存活率。將經由cB273抗體處理之各來源種類癌細胞存活率之平均值±標準誤差(n=3)表示於第4圖。cB273抗體對於除SK-CO-1以外之細胞株顯示殺細胞活性。
關於對於各種癌細胞株之活體外殺細胞作用，以BxPC-3、MIA Paca-2(以上為人類胰臟癌細胞株)、A2058、A375(以上為人類黑色素瘤細胞株)、U-87MG(人類神經膠母細胞瘤細胞株)、AN3CA(人類子宮內膜癌細胞株)為對象進行檢討。將各細胞株以含10%FBS之培養基製備為4.4x10⁴細胞/ml，以45μl/孔添加於白色透明底部之96孔微量盤(康寧公司製)，並於37℃、5%CO₂之條件下培養一晚。將cB273抗體與Goat anti-human IgG Fc(山羊抗人類IgG Fc抗體)(MP Biomedicals,LLC.公司製)等濃度混合後，添加5μl/孔使cB273抗體之最終濃度為10,000～1ng/ml，並於37℃、5%CO₂之條件下培養24小時。使用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay Kit(CellTiter-Glo冷光細胞存活率檢測套組)(普洛麥格公司製#G7571)並根據所附之實驗說明書，以冷光儀(珀金埃爾默公司製)測定各孔中源自於活細胞之ATP量。各圖形係將細胞存活率以平均值±標準偏差(n=3)表示。其結果為：cB273抗體對於所調查之所有癌細胞株均顯示殺細胞作用(第5圖)。 [實施例4]cB273抗體之抗原決定部位之鑑定 4)-1 cB273 Fab片段之製作
cB273透析於PBS後，以PBS稀釋為2mg/ml並製備17ml。添加1.7ml以PBS製備為0.1mM之半胱胺酸(西格瑪公司製)與2.04ml經PBS稀釋為0.1mg/ml之木瓜酵素(西格瑪公司製)，並使其於37℃下反應5小時。5小時後，添加6.33ml以PBS溶解為120mM之N-乙基馬來醯亞胺(東京化成製)使反應停止。反應液係添加於以50mM Tris-HCl、20 mM氯化鈉平衡化之Superdex 200 26/60(通用電氣醫療公司製)，並回收相當於Fab片段之部分(fraction)14ml。 4)-2 cB273 Fab片段、rsDR5複合體試料之製備
以AmiconUltra 15 MWCO 10K(密理博公司製)將cB273 Fab片段濃縮為9.46mg/ml、並將以AmiconUltra 15 MWCO 3K濃縮為5.6 mg/ml之rsDR5分別以2ml予以混合，並添加於經20 mM Tris HCl、50 mM氯化鈉平衡化之Superdex 200 16/60。
回收相當於複合體之部分(fraction)8ml。 4)-3 cB273 Fab片段與rsDR5複合體之結晶化與結構分析
將所得到之rsDR5與cB273 Fab之複合體濃縮為25mg/ml並用於結晶化。結晶化係使用蒸氣擴散法。將於蛋白質溶液0.45～1.0μl中添加等量沈澱劑溶液(6～8%(w/v)聚乙二醇4000、20%(v/v)異丙醇、0.1M氯化鋰、0.1M檸檬酸緩衝液(pH5.6))之溶液，裝進已添加0.45ml沈澱劑溶液之密閉容器中且不使兩溶液接觸並靜置於22℃。3天後得到0.4mmx0.3mmx0.03mm之片狀晶。
將所得到之結晶浸漬於添加有30%(v/v)甘油之沈澱劑溶液，接著於-180℃之氮氣流下予以凍結。於「高能量加速器研究機構放射光科學研究施設」之BL17A，於95K氮氣流下收集X射線繞射數據。使用HKL 2000軟體(HKL公司製)自所得到之繞射圖將繞射強度予以量化，以求得結晶結構因子。結晶係單斜晶系且晶格群為C2、結晶之單位晶格為：a=152.0、b=75.5、c=116.3、β=110.2。
使用所得到之結構因子與DR5(PDB碼：2H9G)及賀癌平(Herceptin)之Fab(PDB碼：1N8Z)之三次元結構座標進行分子取代法以決定相位。計算係使用phaser軟體(CCP4：Collaborative Computational Project(協同計算計畫)No.4)。結晶係不對稱單位中含有2複合體。
使用CNX軟體(Accerlys Inc.)進行結構之精確化，使用coot軟體進行模型修正。反複進行此操作，得到2.1分解能之最終R值25.0%、R free值28.7%。最終模型係由2複合體而成，包含：cB273 Fab之L鏈胺基酸殘基(2分子皆同)1-218、H鏈胺基酸殘基(2分子皆同)1-222；DR5之2分子之其中1分子為胺基酸殘基18-92及98-127、另1分子為胺基酸殘基21-92及98-127、及324個水分子。DR5之胺基酸殘基93-97、N端之17或20殘基、C端之6殘基與His tag、及cB273 Fab L鏈之C端1殘基、H鏈之C端5殘基，則分別由於不明瞭電子密度而未建構模型。經以Ramachandran plot確認，位於非容許區域之胺基酸僅L鏈之Val(纈胺酸)56，該Val 56係於CDR之L2具有被視為特徴性的構造。
所決定之DR5與cB273 Fab之相互作用，於不對稱單位中之2分子大致相同。位於cB273 Fab 4以內之DR5之胺基酸殘基(各胺基酸殘基之位置對應於序列編號23)如下：Gly(甘胺酸)26、Ile(異白胺酸)34、Glu(麩胺酸)36、Asp(天冬胺酸)37、Gly(甘胺酸)38、Asp(天冬胺酸)56、Leu(白胺酸)57、Leu(白胺酸)58、Phe(苯基丙胺酸)59、Leu(白胺酸)61、Arg(精胺酸)62。分別於第6圖表示複合體整體之帶狀模型(ribbon model)與表面、又於第7圖表示DR5與cB273 Fab之H鏈、L鏈之相互作用。 [實施例5]cB273抗體之人類化(其1) 5)-1 B273之人類化版(hB273)之設計 5)-1-1 B273之可變區之分子模型化(modeling)
B273之可變區之分子模型化，係根據作為同源性模型化一般所習知之方法(Methods in Enzymology,203,121-153,(1991))而進行。將登錄於Protein Data Bank(Nuc. Acid Res. 28,235-242(2000))之人類免疫球蛋白之可變區之1次序列(可獲得推演自X射線結晶結構之三次元結構)，與上文所決定之B273之可變區比較。其結果為：篩選出1T66，其係對於B273之輕鏈之可變區具有最高之序列同源性。又，篩選出1XIW，其係對於B273之重鏈之可變區具有最高之序列同源性。框架區之三次元結構之製作，係經由將對應於B273之輕鏈及重鏈之1T66及1XIW的座標予以組合而得到「框架模型」。B273之CDR係根據Thornton et al.(J. Mol. Biol.,263,800-815,(1996))之分類，分別將CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、及CDRH2分配至群組(cluster)16A、7A、9A、10A、10A。CDRH3係使用H3法則(rule)(FEBS letter 399,1-8(1996))分類於k(11)-。其次，將個別CDR之代表性立體構形(conformation)套入框架模型。
最後，為得到就能量之觀點而言，可能為B273之可變區之分子模型，進行能量計算用以排除不利之原子間接觸。使用市售之蛋白質立體結構預測程式Prime及立體構形探索程式MacroModel(Schrdinger,LLC)進行上述程序。 5)-1-2　對於人類化B273之胺基酸序列之設計
人類化B273抗體之建構，係根據作為CDR移植法(grafting)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86,10029-10033(1989))一般所習知之方法而進行。接受者抗體(acceptor antibody)係根據框架區內之胺基酸同源性所篩選。
將B273之框架區序列與抗體胺基酸序列之Kabat資料庫(Nuc. Acid Res. 29,205-206(2001))中之所有人類框架比較，其結果為：由於HuMc3抗體具框架區76%之序列同源性，而被選為接受者(acceptor)。將HuMc3之框架區的胺基酸殘基，與B273之胺基酸殘基加以序列排比，鑑定使用不同胺基酸之位置。此等殘基之位置，使用上文中所建構之B273之三次元模型加以分析，而應被移植於接受者上之捐贈者(donor)殘基，係根據由Queen等人(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86,10029-10033(1989))所給予之基準而選擇。
經由將所選擇之若干捐贈者殘基移入接受者抗體，建構如以下實施例所記載之人類化B273序列。 5)-1-2 B273輕鏈之人類化 5)-1-2-1 hB273_L1型輕鏈：
將伴隨使序列表之序列編號16所示之cB273輕鏈之胺基酸號碼22(纈胺酸)、27(蘇胺酸)、34(絲胺酸)、35(白胺酸)、37(天冬胺酸)、38(麩胺酸)、70(離胺酸)、108(白胺酸)、110(異白胺酸)、112(苯丙胺酸)、125(甘胺酸)、129(白胺酸)分別取代為異白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、脯胺酸、麩胺酸、脯胺酸、麩胺酸、纈胺酸、纈胺酸、酪胺酸、脯胺酸、纈胺酸所設計之人類化B273輕鏈命名為「hB273_L1型輕鏈」。
編碼hB273_L1型輕鏈之核苷酸序列係記載於序列表之序列編號27。又，hB273_L1型輕鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列編號28。進一步，序列編號27及28之序列亦記載於第32圖。 5)-1-2-2 hB273_L2型輕鏈：
將伴隨使序列表之序列編號16所示之cB273輕鏈之胺基酸號碼37(天冬胺酸)、38(麩胺酸)、108(白胺酸)、110(異白胺酸)、125(甘胺酸)、129(白胺酸)分別取代為麩胺酸、脯胺酸、纈胺酸、纈胺酸、脯胺酸、纈胺酸所設計之人類化B273輕鏈命名為「hB273_L2型輕鏈」。
編碼hB273_L2型輕鏈之核苷酸序列係記載於序列表之序列編號29。又，hB273_L2型輕鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列編號30。進一步，序列編號29及30之序列亦記載於第33圖。 5)-1-2-3　hB273_L3型輕鏈：
將伴隨使序列表之序列編號16所示之cB273輕鏈之胺基酸號碼37(天冬胺酸)、38(麩胺酸)、108(白胺酸)、110(異白胺酸)、129(白胺酸)分別取代為麩胺酸、脯胺酸、纈胺酸、纈胺酸、纈胺酸所設計之人類化B273輕鏈名命為「hB273_L3型輕鏈」。
編碼hB273_L3型輕鏈之核苷酸序列係記載於序列表之序列編號31。又，hB273_L3型輕鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列編號32。進一步，序列編號31及32之序列亦記載於第34圖。 5)-1-3　B273重鏈之人類化 5)-1-3-1　hB273_H1型重鏈：
將伴隨使序列表之序列編號20所示之cB273重鏈之胺基酸號碼20(麩胺酸)、24(麩胺酸)、28(脯胺酸)、30(白胺酸)、31(纈胺酸)、39(異白胺酸)、56(甲硫胺酸)、57(離胺酸)、59(絲胺酸)、60(組胺酸)、62(離胺酸)、63(絲胺酸)、67(異白胺酸)、86(離胺酸)、87(丙胺酸)、95(絲胺酸)、96(蘇胺酸)、99(組胺酸)、103(白胺酸)、106(蘇胺酸)、110(絲胺酸)、114(苯丙胺酸)、116(甘胺酸)、136(蘇胺酸)、137(白胺酸)分別取代為麩胺酸、纈胺酸、丙胺酸、纈胺酸、離胺酸、纈胺酸、纈胺酸、精胺酸、丙胺酸、脯胺酸、甲硫胺酸、甘胺酸、甲硫胺酸、精胺酸、纈胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、酪胺酸、絲胺酸、精胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、丙胺酸、白胺酸、纈胺酸所設計之人類化B273重鏈命名為「hB273_H1型重鏈」。
編碼hB273_H1型重鏈之核苷酸序列係記載於序列表之序列編號33。又，hB273_H1型重鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列編號34。進一步，序列編號33及34之序列亦記載於第35圖。 5)-1-3-2hB273_H2型重鏈：
將伴隨使序列表之序列編號20所示之cB273重鏈之胺基酸號碼20(麩胺酸)、24(麩胺酸)、28(脯胺酸)、30(白胺酸)、31(纈胺酸)、39(異白胺酸)、60(組胺酸)、62(離胺酸)^、95(絲胺酸)、96(蘇胺酸)、99(組胺酸)、103(白胺酸)、106(蘇胺酸)、110(絲胺酸)、116(甘胺酸)、136(蘇胺酸)、137(白胺酸)分別取代為麩胺酸、纈胺酸、丙胺酸、纈胺酸、離胺酸、纈胺酸、脯胺酸、甲硫胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、酪胺酸、絲胺酸、精胺酸、蘇胺酸、丙胺酸、白胺酸、纈胺酸所設計之人類化B273重鏈命名為「hB273_H2型重鏈」。
編碼hB273_H2型重鏈之核苷酸序列係記載於序列表之序列編號35。又，hB273_H2型重鏈之胺基酸序列係編碼於序列表之序列編號36。進一步，序列編號35及36之序列亦記載於第36圖。 5)-1-3-3hB273_H3型重鏈：
將伴隨使序列表之序列編號20所示之cB273重鏈之胺基酸號碼24(麩胺酸)、28(脯胺酸)、30(白胺酸)、31(纈胺酸)、39(異白胺酸)、60(組胺酸)、95(絲胺酸)、96(蘇胺酸)、103(白胺酸)、106(蘇胺酸)、110(絲胺酸)、136(蘇胺酸)、137(白胺酸)分別取代為纈胺酸、丙胺酸、纈胺酸、離胺酸、纈胺酸、脯胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、絲胺酸、精胺酸、蘇胺酸、白胺酸、纈胺酸所設計之人類化B273重鏈命名為「hB273_H3型重鏈」。
編碼hB273_H3型重鏈之核苷酸序列係記載於序列表之序列編號37。又，hB273_H3型重鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列編號38。進一步，序列編號37及38之序列亦記載於第37圖。 5)-2　表現hB273_L1、hB273_L2、及hB273_L3型輕鏈之載體之建構
合成分別表示於序列編號28之胺基酸號碼21至134、序列編號30之胺基酸號碼21至134、及序列編號32之胺基酸號碼21至134之包含編碼hB273_L1、hB273_L2、及hB273_L3型輕鏈可變區之基因的DNA(基因工藝(GENEART)公司，人工基因合成服務)，並藉由將以限制酶NdeI及BsiWI所切出之DNA片段，嵌入於將表現人類化抗體輕鏈之廣用載體(pEF6KCL)以限制酶NdeI及BsiWI切斷之處，建構表現hB273_L1、hB273_L2、及hB273_L3型輕鏈之載體。分別將所得到之表現載體命名為「pEF6KCL/hB273_L1」、「pEF6KCL/hB273_L2」、及「pEF6KCL/hB273_L3」。 5)-3　表現hB273_H1、hB273_H2、及hB273_H3型重鏈之載體之建構
合成分別表示於序列表之序列編號34之胺基酸號碼20至141、序列編號36之胺基酸號碼20至141、及序列編號38之胺基酸號碼20至141之包含編碼hB273_H1、hB273_H2、及hB273_H3型重鏈可變區之基因的DNA(基因工藝公司；人工基因合成服務)，並藉由將以限制酶BlpI所切出之DNA片段，嵌入於將表現人類化抗體重鏈之廣用載體(pEF1FCCU)以限制酶BlpI切斷之處，建構表現hB273_H1、hB273_H2、及hB273_H3型重鏈之載體。分別將所得到之表現載體命名為「pEF1FCCU/hB273_H1」、「pEF1FCCU/hB273_H2」、及「pEF1FCCU/hB273_H3」。 5)-4　人類化抗體之製備 5)-4-1　人類化抗體之生產
將1.2×10⁹個之對數増殖期之FreeStyle 293F細胞(Invitrogen公司)接種於1.2L新鮮之FreeStyle 293表現培養基(Invitrogen公司)，並於37℃、8%CO₂培養箱內以90rpm震盪培養一小時。將3.6mg聚乙烯亞胺(PolyScience #24765)溶解於20ml之Opti-Pro SFM培養基(Invitrogen公司)，其次將使用PureLink HiPure質體套組(Invitrogen公司)所製備之表現H鏈之載體(0.4mg)及表現L鏈之載體(0.8mg)懸浮於20ml之Opti-Pro SFM培養基。於聚乙烯亞胺/Opti-Pro SFM混合液20ml中，添加表現載體/Opti-Pro SFM混合液20ml並緩慢攪拌，進一步放置5分鐘後添加於FreeStyle 293F細胞。3小時後添加Z-VAD-FMK(胜肽機構(PEPTIDE INSTITUTE)公司)使其成為10μM，於37℃、8%CO₂培養箱內以90rpm震盪培養7天，並將所得到之培養上清液以拋棄式囊式過濾器(艾德凡鐵克#CCS-045-E1H)過濾。
將藉由組合pEF1FCCU/hB273_H1與pEF6KCL/hB273_L1而取得之cB273人類化抗體命名為「hB273_H1/hB273_L1」；將藉由組合pEF1FCCU/hB273_H1與pEF6KCL/hB273_L2而取得之cB273人類化抗體命名為「hB273_H1/hB273_L2」；將藉由組合pEF1FCCU/hB273_H1與pEF6KCL/hB273_L3而取得之cB273人類化抗體命名為「hB273_H1/hB273_L3」；將組合pEF1FCCU/hB273_H2與pEF6KCL/hB273_L1而取得之cB273人類化抗體命名為「hB273_H2/hB273_L1」；將藉由組合pEF1FCCU/hB273_H2與pEF6KCL/hB273_L2而取得之cB273人類化抗體命名為「hB273_H2/hB273_L2」；將藉由組合pEF1FCCU/hB273_H2與pEF6KCL/hB273_L3而取得之cB273人類化抗體命名為「hB273_H2/hB273_L3」；將藉由組合pEF1FCCU/hB273_H3與pEF6KCL/hB273_L1而取得之cB273人類化抗體命名為「hB273_H3/hB273_L1」；將藉由組合pEF1FCCU/hB273_H3與pEF6KCL/hB273_L2而取得之cB273人類化抗體命名為「hB273_H3/hB273_L2」；將藉由組合pEF1FCCU/hB273_H3與pEF6KCL/hB273_L3而取得之cB273人類化抗體命名為「hB273_H3/hB273_L3」。 5)-4-2　人類化抗體之純化
將上述5)-4-1)所得到之培養上清液，以重組蛋白質A親和性層析(於4-6℃下)與陶瓷氫氧基磷灰石(室溫下)之2段式步驟予以純化。重組蛋白質A親和性層析純化後與陶瓷氫氧基磷灰石純化後之緩衝液置換步驟係於室溫下進行。起初，將培養上清液1100-1200ml施加於經PBS平衡化之MabSelect SuRe(通用電氣醫療生物科學公司製；HiTrap管柱：容積1ml×2連接)。培養液完全進管柱後，以15-30ml PBS將管柱清洗。其次以2M精胺酸鹽酸鹽溶液(pH4.0)溶離，並收集含有抗體之部分。將該部分以脫鹽管柱(通用電氣醫療生物科學公司製；Hitrap脫鹽管柱：容積5ml×2連接)進行置換為5mM磷酸鈉/50mM MES/20mM氯化鈉/pH6.5之緩衝液。進一步將該經置換之抗體溶液施加於經5mM NaPi/50mM MES/20mM氯化鈉/pH6.5緩衝液平衡化之陶瓷氫氧基磷灰石管柱(日本BioRad；生物等級CHT2-1氫氧基磷灰石管柱：容積2ml)。進行氯化鈉之線性濃度梯度溶離，並收集含有抗體之部分。將該部分以脫鹽管柱(通用電氣醫療生物科學公司製，Hitrap脫鹽管柱：容積5ml×2連接)進行置換為CBS(10mM檸檬酸緩衝液/140mM氯化鈉，pH6.0)溶液。最後以離心式超過濾裝置VIVASPIN 20(截留分子量30K；莎多力斯公司，於4℃下)濃縮，製備成IgG濃度為1.0mg/ml以上並作為純化樣品。 [實施例6]人類化B273(hB273)抗體之活性測定(其1) 6)-1經由Biacore之hB273抗體之結合活性評價
人類化抗DR5抗體與rsDR5之解離常數測定，係使用Biacore T100(通用電氣醫療生物科學(股))，以捕捉(capture)法進行，該捕捉法係將抗體捕捉(capture)於經固定化之抗人類IgG(Fc)抗體，將抗原作為分析物(analyte)測定。抗人類IgG(Fc)抗體(Human antibody capture kit；通用電氣醫療生物科學(股))係以胺耦合反應法共價鍵結於感測晶片CM5(sensor chip CM5)(BIAcore,Inc.)約～10,000RU。於參考胞(reference cell)亦進行相同之固定化。使用HBS-EP(10mM HEPES pH7.4、0.15M氯化鈉、3mM EDTA、0.05% Surfactant(表面活性劑)P20)作為泳動緩衝液(running buffer)。於固定有抗人類IgG(Fc)抗體之晶片上，以流速10μl/分添加約20nM之抗體溶液60秒後，以流速30μl/分添加rsDR5之系列稀釋溶液(3.13-50nM)120秒，並持續監測180秒之間的解離相。以流速10μl/分添加作為再生溶液之3M氯化鎂30秒。數據之分析係使用分析軟體(Biacore T100 Evaluation software,version 2.0.1)之1對1結合模式，算出結合速率常數kon、解離速率常數koff、及解離常數(KD；KD=koff/kon)。9種人類化DR5抗體之Biacore測定結果表示於第8圖。 6)-2 hB273抗體之對於人類癌細胞株之活體外殺細胞活性
將以50mM Tris-HCl(pH8.5)製備為50μg/ml之AfiniPure F(ab’)₂ fragment Goat anti-Human IgG Fc fragment specific(傑克森公司製#109-006-098)分別注入45μl於96孔微量盤(康寧公司製)並於4℃下靜置1晚。將孔內以PBS清洗2次後，以50μl/孔添加5)-4-1使生產有抗體之293F培養上清液、經純化之cB273抗體(實施例2-3-2)、或市售人類IgG(傑克森公司製#009-000-003)使成為150～1.5ng/ml，並於4℃下靜置1晚。將各孔以PBS清洗2次後，以50μl/孔添加Jurkat細胞並於37℃、5%CO₂之條件下培養23小時，該Jurkat細胞係於含10%FBS之RPMI1640培養基中製備為4.0x10⁴細胞/ml。使用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay Kit(CellTiter-Glo冷光細胞存活率檢測套組)(普洛麥格公司製#G7571)測定源自於活細胞之ATP量，並將取代抗體溶液而添加培養基之孔的數值作為100%評價hB273抗體之殺細胞作用。其結果如第9圖所示，關於B273重鏈之人類化，經確認：H1系列之抗體相較於H2或H3，殺細胞作用有稍弱之傾向。另一方面，關於B273輕鏈之人類化，使用所設計之L1、L2、L3之任一輕鏈時，明顯均得以顯示大致相同程度之殺細胞作用。 [實施例7]cB273抗體之人類化(其2) 7)-1　B273之人類化版(hB273)之設計 7)-1-1　針對人類化B273之胺基酸序列之設計
根據實施例5及6所示之人類化抗體之設計(其1)結果，藉由將若干捐贈者殘基移入接受者抗體，如以下實施例所記載建構人類化B273序列。 7)-1-2　針對人類化B273之胺基酸序列之設計 7)-1-2-1　hB273_H1-1型重鏈：
將伴隨使序列表之序列編號20所示之cB273重鏈之胺基酸號碼20(麩胺酸)、24(麩胺酸)、28(脯胺酸)、30(白胺酸)、31(纈胺酸)、39(異白胺酸)、57(離胺酸)、59(絲胺酸)、60(組胺酸)、62(離胺酸)、63(絲胺酸)、67(異白胺酸)、86(離胺酸)、87(丙胺酸)、95(絲胺酸)、96(蘇胺酸)、99(組胺酸)、103(白胺酸)、106(蘇胺酸)、110(絲胺酸)、136(蘇胺酸)、137(白胺酸)分別取代為麩胺酸、纈胺酸、丙胺酸、纈胺酸、離胺酸、纈胺酸、精胺酸、丙胺酸、脯胺酸、甲硫胺酸、甘胺酸、甲硫胺酸、精胺酸、纈胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、酪胺酸、絲胺酸、精胺酸、蘇胺酸、白胺酸、纈胺酸所設計之人類化B273重鏈命名為「hB273_H1-1型重鏈」。
編碼hB273_H1-1型重鏈之核苷酸序列係記載於序列表之序列編號39。又，hB273_H1-1型重鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列編號40。進一步，序列編號39及40之序列亦記載於第38圖。 7)-1-2-2　hB273_H2-1型重鏈：
將伴隨使序列表之序列編號20所示之cB273重鏈之胺基酸號碼24(麩胺酸)、28(脯胺酸)、30(白胺酸)、31(纈胺酸)、39(異白胺酸)、60(組胺酸)、62(離胺酸)、95(絲胺酸)、96(蘇胺酸)、99(組胺酸)、103(白胺酸)、106(蘇胺酸)、110(絲胺酸)、116(甘胺酸)、136(蘇胺酸)、137(白胺酸)分別取代為纈胺酸、丙胺酸、纈胺酸、離胺酸、纈胺酸、脯胺酸、甲硫胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、酪胺酸、絲胺酸、精胺酸、蘇胺酸、丙胺酸、白胺酸、纈胺酸所設計之人類化B273重鏈命名為「hB273-H2-1型重鏈」。
編碼hB273_H2-1型重鏈之核苷酸序列係記載於序列表之序列編號41。又，hB273_H2-1型重鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列編號42。進一步，序列編號41及42之序列亦記載於第39圖。 7)-1-2-3 hB273_H2-2型重鏈：
將伴隨使序列表之序列編號20所示之cB273重鏈之胺基酸號碼20(麩胺酸)、24(麩胺酸)、28(脯胺酸)、30(白胺酸)、31(纈胺酸)、39(異白胺酸)、60(組胺酸)、62(離胺酸)、95(絲胺酸)、96(蘇胺酸)、103(白胺酸)、106(蘇胺酸)、110(絲胺酸)、116(甘胺酸)、136(蘇胺酸)、137(白胺酸)分別取代為麩胺酸、纈胺酸、丙胺酸、纈胺酸、離胺酸、纈胺酸、脯胺酸、甲硫胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、絲胺酸、精胺酸、蘇胺酸、丙胺酸、白胺酸、纈胺酸所設計之人類化B273重鏈命名為「hB273_H2-2型重鏈」。
編碼hB273_H2-2型重鏈之核苷酸序列係記載於序列表之序列編號43。又，hB273_H2-2型重鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列編號44。進一步，序列編號43及44之序列亦記載於第40圖。 7)-1-2-4 hB273_H2-3型重鏈：
將伴隨使序列表之序列編號20所示之cB273重鏈之胺基酸號碼24(麩胺酸)、28(脯胺酸)、30(白胺酸)、31(纈胺酸)、39(異白胺酸)、60(組胺酸)、62(離胺酸)、95(絲胺酸)、96(蘇胺酸)、103(白胺酸)、106(蘇胺酸)、110(絲胺酸)、116(甘胺酸)、136(蘇胺酸)、137(白胺酸)分別取代為纈胺酸、丙胺酸、纈胺酸、離胺酸、纈胺酸、脯胺酸、甲硫胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、絲胺酸、精胺酸、蘇胺酸、丙胺酸、白胺酸、纈胺酸所設計之人類化B273重鏈命名為「hB273_H2-3型重鏈」。
編碼hB273_H2-3型重鏈之核苷酸序列係記載於序列表之序列編號45。又，hB273_H2-3型重鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列編號46。進一步，序列編號45及46之序列亦記載於第41圖。 7)-1-2-5　hB273_H2-4型重鏈：
將伴隨使序列表之序列編號20所示之cB273重鏈之胺基酸號碼20(麩胺酸)、24(麩胺酸)、28(脯胺酸)、30(白胺酸)、31(纈胺酸)、39(異白胺酸)、60(組胺酸)、62(離胺酸)、95(絲胺酸)、96(蘇胺酸)、99(組胺酸)、103(白胺酸)、106(蘇胺酸)、110(絲胺酸)、136(蘇胺酸)、137(白胺酸)分別取代為麩胺酸、纈胺酸、丙胺酸、纈胺酸、離胺酸、纈胺酸、脯胺酸、甲硫胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、酪胺酸、絲胺酸、精胺酸、蘇胺酸、白胺酸、纈胺酸所設計之人類化B273重鏈命名為「hB273_H2-4型重鏈」。
編碼hB273_H2-4型重鏈之核苷酸序列係記載於序列表之序列編號47。又，hB273_H2-4型重鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列編號48。進一步，序列編號47及48之序列亦記載於第42圖。 7)-1-2-6 hB273_H2-5型重鏈：
將伴隨使序列表之序列編號20所示之cB273重鏈之胺基酸號碼20(麩胺酸)、24(麩胺酸)、28(脯胺酸)、30(白胺酸)、31(纈胺酸)、39(異白胺酸)、60(組胺酸)、95(絲胺酸)、96(蘇胺酸)、99(組胺酸)、103(白胺酸)、106(蘇胺酸)、110(絲胺酸)、136(蘇胺酸)、137(白胺酸)分別取代為麩胺酸、纈胺酸、丙胺酸、纈胺酸、離胺酸、纈胺酸、脯胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、酪胺酸、絲胺酸、精胺酸、蘇胺酸、白胺酸、纈胺酸所設計之人類化B273重鏈命名為「hB273_H2-5型重鏈」。
編碼hB273_H2-5型重鏈之核苷酸序列係記載於序列表之序列編號49。又，hB273_H2-5型重鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列編號50。進一步，序列編號49及50之序列亦記載於第43圖。 7)-2表現hB273_H1-1、hB273_H2-1、hB273_H2-2、hB273_H2-3、hB273_H2-4、及hB273_H2-5型重鏈之載體之建構
合成分別表示於序列表之序列編號40之胺基酸號碼20至141、序列編號42之胺基酸號碼20至141、序列編號44之胺基酸號碼20至141、序列編號46之胺基酸號碼20至141、序列編號48之胺基酸號碼20至141、及序列編號50之胺基酸號碼20至141之包含編碼hB273_H1、hB273_H2、及hB273_H3型重鏈可變區之基因的DNA(基因工藝公司人工基因合成服務)，並藉由將以限制酶B1pI所切出之DNA片段，嵌入於將表現人類化抗體重鏈之廣用載體(pEF1FCCU)以限制酶B1pI切斷之處，建構表現hB273_H1-1、hB273_H2-1、hB273_H2-2、hB273_H2-3、hB273_H2-4、及hB273_H2-5型重鏈之載體。分別將所得到之表現載體命名為「pEF1FCCU/hB273_H1-1」、「pEF1FCCU/hB273_H2-1」、「pEF1FCCU/hB273_H2-2」、「pEF1FCCU/hB273_H2-3」、「pEF1FCCU/hB273_H2-4」、及「pEF1FCCU/hB273_H2-5」。 7)-3　人類化抗體之製備 7)-3-1　人類化抗體之生產
將1.2×10⁹個之對數増殖期之FreeStyle 293F細胞(Invitrogen公司)接種於1.2L新鮮之FreeStyle293表現培養基(Invitrogen公司)，並於37℃、8%CO₂之培養箱內，以90rpm震盪培養一小時。將3.6mg聚乙烯亞胺(PolyScience #24765)溶解於20ml Opti-Pro SFM培養基(Invitrogen公司)，其次將使用PureLink HiPure質體套組(Invitrogen公司)所製備之表現H鏈之載體(0.4mg)及表現L鏈之載體(0.8mg)懸浮於20ml之Opti-Pro SFM培養基。於聚乙烯亞胺/Opti-Pro SFM混合液20ml中，添加表現載體/Opti-Pro SFM混合液20ml並緩慢攪拌，進一步放置5分鐘後添加於FreeStyle 293F細胞中。3小時後添加Z-VAD-FMK(胜肽機構公司)並使成為10μM，於37℃、8%CO₂之培養箱內，以90rpm震盪培養7天，並將所得到之培養上清液以拋棄式囊式過濾器(艾德凡鐵克#CCS-045-E1H)過濾。
將藉由組合pEF1FCCU/hB273_H1-1與pEF6KCL/hB273_L1而取得之cB273之人類化抗體命名為「hB273_H1-1/hB273_L1」；將藉由組合pEF1FCCU/hB273_H2-1與pEF6KCL/hB273_L1而取得之cB273之人類化抗體命名為「hB273_H2-1/hB273_L1」；將藉由組合pEF1FCCU/hB273_H2-2與pEF6KCL/hB273_L1而取得之cB273之人類化抗體命名為「hB273_H2-2/hB273_L1」；將藉由組合pEF1FCCU/hB273_H2-3與pEF6KCL/hB273_L1而取得之cB273之人類化抗體命名為「hB273_H2-3/hB273_L1」；將藉由組合pEF1FCCU/hB273_H2-4與pEF6KCL/hB273_L1而取得之cB273之人類化抗體命名為「hB273_H2-4/hB273_L1」；將藉由組合pEF1FCCU/hB273_H2-5與pEF6KCL/hB273_L1而取得之cB273之人類化抗體命名為「hB273_H2-5/hB273_L1」。 7)-3-2　人類化抗體之純化
將上述7)-3-1)所得到之培養上清液，以重組蛋白質A親和性層析(於4-6℃下)與陶瓷氫氧基磷灰石(室溫下)之2段式步驟予以純化。重組蛋白質A親和性層析純化後與陶瓷氫氧基磷灰石純化後之緩衝液置換步驟係於室溫下進行。起初，將培養上清液1100-1200ml施加於經PBS平衡化之MabSelect SuRe(通用電氣醫療生物科學公司製；HiTrap管柱：容積1ml×2連接)。培養液完全進管柱後，以15-30ml PBS將管柱清洗。其次以2M精胺酸鹽酸鹽溶液(pH4.0)溶離，並收集含有抗體之部分。將該部分以脫鹽管柱(通用電氣醫療生物科學公司製；Hitrap脫鹽管柱：容積5ml×2連接)進行置換為5mM磷酸鈉/50mM MES/20mM氯化鈉/pH6.5之緩衝液。進一步將該經置換之抗體溶液施加於經5mM NaPi/50mM MES/20mM氯化鈉/pH6.5緩衝液平衡化之陶瓷氫氧基磷灰石管柱(日本BioRad；生物等級CHT2-1氫氧基磷灰石管柱：容積2ml)。進行氯化鈉之線性濃度梯度溶離，並收集含有抗體之部分。將該部分以脫鹽管柱(通用電氣醫療生物科學公司製，Hitrap脫鹽管柱：容積5mlx2連接)進行置換為CBS(10mM檸檬酸緩衝液/140mM氯化鈉，pH6.0)溶液。最後以離心式超過濾裝置VIVASPIN 20(截留分子量30K；莎多力斯公司，於4℃下)濃縮，製備成IgG濃度為1.0mg/ml以上並作為純化樣品。 [實施例8]人類化B273(hB273)抗體之活性測定(其2) 8)-1　經由Biacore之hB273抗體之結合活性評價
人類化抗DR5抗體與rsDR5之解離常數測定，係使用Biacore T100(通用電氣醫療生物科學(股))，以捕捉(capture)法進行，該捕捉法係將抗體捕捉(capture)於經固定化之抗人類IgG(Fc)抗體，將抗原作為分析物(analyte)測定。抗人類IgG(Fc)抗體(Human antibody capture kit；通用電氣醫療生物科學(股))係以胺耦合反應法共價鍵結於感測晶片CM5(sensor chip CM5)(BIAcore,Inc.)約～10,000RU。於參考胞(reference cell)亦進行相同之固定化。使用HBS-EP(10mM HEPES pH7.4、0.15M氯化鈉、3mM EDTA、0.05% Surfactant(表面活性劑)P20)作為泳動緩衝液(running buffer)。於固定有抗人類IgG(Fc)抗體之晶片上，以流速10μl/分添加約20nM之抗體溶液60秒後，以流速30μl/分添加rsDR5之系列稀釋溶液(3.13-50nM)120秒，並持續監測180秒之間的解離相。以流速10μl/分添加作為再生溶液之3M氯化鎂30秒。數據之分析係使用分析軟體(Biacore T100 Evaluation software,version 2.0.1)之1對1結合模式，算出結合速率常數kon、解離速率常數koff、及解離常數(KD；KD=koff/kon)。6種人類化DR5抗體之Biacore測定結果表示於第10圖。 8)-2 hB273抗體對於人類癌細胞株之活體外殺細胞活性
將以50mM Tris-HCl(pH8.5)製備為50μg/ml之AfiniPure F(ab’)₂ fragment Goat anti-Human IgG Fc fragment specific(傑克森公司製#109-006-098)分別注入45μl於96孔微量盤(康寧公司製)並於4℃下靜置1晚。將孔內以PBS清洗2次後，以50μl/孔添加7)-3-1使生產有抗體之293F培養上清液並使成為150～1.5ng/ml，並於4℃下靜置1晚。將各孔以PBS清洗2次後，以50μl/孔添加Jurkat細胞並於37℃、5%CO₂之條件下培養23小時，該Jurkat細胞係於含10%FBS之RPMI1640培養基中製備為4.0x10⁴細胞/ml。使用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay Kit(CellTiter-Glo冷光細胞存活率檢測套組)(普洛麥格公司製#G7571)測定源自於活細胞之ATP量，並將取代抗體溶液而添加培養基之孔的數值作為100%評價hB273抗體之殺細胞作用。其結果如第11圖所示：確認B273_H1-1/L1抗體相較於據以設計之B273_H1/L1，殺細胞活性具較強之傾向。另一方面，B273_H2-1/L1～B273_H2-5/L1顯示與據以設計之B273_H2/L1相同程度之殺細胞作用。 [實施例9]自cB273抗體CDR去除脫醯胺作用位置(deamidation site) 9)-1　突變體之設計與表現載體之建構 9)-1-1　突變體之設計
一般蛋白質之天冬醯胺脫醯胺化，係與鄰接於C端側之胺基酸之間，形成環狀琥珀酸亞醯胺過渡狀態而進行(Geiger,T. and Clarke,S.(1987)Deamidation,Isomerization,and racemization at asparaginyl and aspartyl residues in peptides(胜肽中之天冬醯胺醯基與天冬胺醯基殘基之脫醯胺化、異構物化及消旋化).Succinimide-linked reactions that contribute to protein degradation(促成蛋白質分解之琥珀醯亞胺鏈接反應). J. Biol. Chem. 262,785-794)。決定環狀琥珀醯亞胺過渡狀態形成速率為鄰接胺基酸之支鏈的大小，因此，脫醯胺化最快者為側鎖最小之甘胺酸。相反地，藉由將C端側鄰接基取代為具有較大支鏈之胺基酸，可抑制脫醯胺化速度。B273抗體於L鏈及H鏈兩者上具有易脫醯胺化之-N-G-(天冬醯胺-甘胺酸)序列。因此，本發明人等製作點突變體，其係將鄰接基由甘胺酸變更為具有較大支鏈之離胺酸、苯丙胺酸、白胺酸、麩胺酸。即，分別如下：關於H鏈，係設計為將-N-G-(天冬醯胺-甘胺酸)序列突變為-N-E-(天冬醯胺-麩胺酸)序列；關於L鏈，係設計為將-N-G-(天冬醯胺-甘胺酸)序列突變為-N-L-(天冬醯胺-白胺酸)序列、-N-F-(天冬醯胺-苯丙胺酸)序列、-N-K-(天冬醯胺-離胺酸)序列、-N-E-(天冬醯胺-麩胺酸)序列。 9)-1-2　表現hB273_L1-NE型輕鏈之載體之建構
以實施例5所製作之表現hB273_L1型輕鏈之載體pEF6KCL/hB273_L1作為模板，經由使用引子組合C之重疊延長PCR(Overlap Extension PCR)將使用引子組合A進行PCR而得到之DNA片段與使用引子組合B進行PCR而得到之DNA片段予以結合。藉由將所得到之DNA片段以限制酶NheI及PmeI切出之DNA片段，嵌入於將表現人類化抗體輕鏈之廣用載體(pEF6KCL)以限制酶NheI及PmeI切斷之處，建構表現序列編號28之胺基酸號碼54之甘胺酸經取代為麩胺酸之hB273_L1-NE型輕鏈之載體。將所得到之表現載體命名為「pEF6KCL/hB273_L1-NE」。
編碼hB273_L1-NE型輕鏈之核苷酸序列係記載於序列表之序列編號51。又，hB273_L1-NE型輕鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列編號52。進一步，序列編號51及52之序列亦記載於第44圖。
引子組合A
5’-aggtaagcttgctagcgccaccatggtgctgc-3’(L-F1：序列表之序列編號53)
5’-ccaatgcaggtaagtgttctcattgctatggaccagtgactg-3’(L-NE-R2：序列表之序列編號54)
引子組合B
5’-cagtcactggtccatagcaatgagaacacttacctgcattgg-3’(L-NE-F2：序列表之序列編號55)
5’-ggatgccacccgtttaaacgggcccctaacac-3’(L-R1：序列表之序列編號56)
引子組合C
5’-aggtaagcttgctagcgccaccatggtgctgc-3’(L-F1：序列表之序列編號53)
5’-ggatgccacccgtttaaacgggcccctaacac-3’(L-R1：序列表之序列編號56) 9)-1-3表現hB273_L1-NF型輕鏈之載體之建構
以實施例5所製作之表現hB273_L1型輕鏈之載體之pEF6KCL/hB273_L1作為模板，經由使用引子組合C之重疊延長PCR(Overlap Extension PCR)將使用引子組合A進行PCR而得到之DNA片段與使用引子組合B進行PCR而得到之DNA片段予以結合。藉由將所得到之DNA片段以限制酶NheI及PmeI切出之DNA片段，嵌入於將表現人類化抗體輕鏈之廣用載體(pEF6KCL)以限制酶NheI及PmeI切斷之處，建構表現序列編號28之胺基酸號碼54之甘胺酸經取代為苯丙胺酸之hB273_L1-NF型輕鏈之載體。將所得到之表現載體命名為「pEF6KCL/hB273_L1-NF」。
編碼hB273_L1-NF型輕鏈之核苷酸序列係記載於序列表之序列編號57。又，hB273_L1-NE型輕鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列編號58。進一步，序列編號57及58之序列亦記載於第45圖。
引子組合A
5’-aggtaagcttgctagcgccaccatggtgctgc-3’(L-F1：序列表之序列編號53)
5’-ccaatgcaggtaagtgttgaaattgctatggaccagtgactg-3’(L-NF-R2：序列表之序列編號59)
引子組合B
5’-cagtcactggtccatagcaatttcaacacttacctgcattgg-3’(L-NF-F2：序列表之序列編號60)
5’-ggatgccacccgtttaaacgggcccctaacac-3’(L-R1：序列表之序列編號56)
引子組合C
5’-aggtaagcttgctagcgccaccatggtgctgc-3’(L-F1：序列表之序列編號53)
5’-ggatgccacccgtttaaacgggcccctaacac-3’(L-R1：序列表之序列編號56) 9)-1-4　表現hB273_L1-NK型輕鏈之載體之建構
以實施例5所製作之表現hB273_L1型輕鏈之載體pEF6KCL/hB273_L1作為模板，經由使用引子組合C之重疊延長PCR(Overlap Extension PCR)將使用引子組合A進行PCR而得到之DNA片段與使用引子組合B進行PCR而得到之DNA片段予以結合。藉由將所得到之DNA片段以限制酶NheI及PmeI切出之DNA片段，嵌入於將表現人類化抗體輕鏈之廣用載體(pEF6KCL)以限制酶NheI及PmeI切斷之處，建構表現序列編號28之胺基酸號碼54之甘胺酸經取代為離胺酸之hB273_L1-NK型輕鏈之載體。將所得到之表現載體命名為「pEF6KCL/hB273_L1-NK」。
編碼hB273_L1-NK型輕鏈之核苷酸序列係記載於序列表之序列編號61。又，hB273_L1-NK型輕鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列編號62。進一步，序列編號61及22之序列亦記載於第46圖。
引子組合A
5’-aggtaagcttgctagcgccaccatggtgctgc-3’(L-F1：序列表之序列編號53)
5’-ccaatgcaggtaagtgttcttattgctatggaccagtgactg-3’(L-NK-R2：序列表之序列編號63)
引子組合B
5’-cagtcactggtccatagcaataagaacacttacctgcattgg-3’(L-NK-F2：序列表之序列編號64)
5’-ggatgccacccgtttaaacgggcccctaacac-3’(L-R1：序列表之序列編號56)
引子組合C
5’-aggtaagcttgctagcgccaccatggtgctgc-3’(L-F1：序列表之序列編號53)
5’-ggatgccacccgtttaaacgggcccctaacac-3’(L-R1：序列表之序列編號56) 9)-1-5　表現hB273_L1-NL型輕鏈之載體之建構
以實施例5所製作之表現hB273_L1型輕鏈之載體pEF6KCL/hB273_L1作為模板，經由使用引子組合C之重疊延長PCR(Overlap Extension PCR)將使用引子組合A進行PCR而得到之DNA片段與使用引子組合B進行PCR而得到之DNA片段予以結合。藉由將所得到之DNA片段以限制酶NheI及PmeI切出之DNA片段，嵌入於將表現人類化抗體輕鏈之廣用載體(pEF6KCL)以限制酶NheI及PmeI切斷之處，建構表現序列編號28之胺基酸號碼54之甘胺酸經取代為白胺酸之hB273_L1-NL型輕鏈之載體。將所得到之表現載體命名為「pEF6KCL/hB273_L1-NL」。
編碼hB273_L1-NL型輕鏈之核苷酸序列係記載於序列表之序列編號65。又，hB273_L1-NL型輕鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列編號66。進一步，序列編號65及66之序列亦記載於第47圖。
引子組合A
5’-aggtaagcttgctagcgccaccatggtgctgc-3’(L-F1：序列表之序列編號53)
5’-ccaatgcaggtaagtgttcagattgctatggaccagtgactg-3’(L-NL-R2：序列表之序列編號67)
引子組合B
5’-cagtcactggtccatagcaatctgaacacttacctgcattgg-3’(L-NL-F2：序列表之序列編號68)
5’-ggatgccacccgtttaaacgggcccctaacac-3’(L-R1：序列表之序列編號56)
引子組合C
5’-aggtaagcttgctagcgccaccatggtgctgc-3’(L-F1：序列表之序列編號53)
5’-ggatgccacccgtttaaacgggcccctaacac-3’(L-R1：序列表之序列編號56) 9)-1-6　表現hB273_H2-1-NE型重鏈之載體之建構
以實施例7所製作之表現hB273_H2-1型重鏈之載體pEF6KCL/hB273_H2-1作為模板，經由使用引子組合C之重疊延長PCR(Overlap Extension PCR)將使用引子組合A進行PCR而得到之DNA片段與使用引子組合B進行PCR而得到之DNA片段予以結合。藉由將所得到之DNA片段以限制酶NheI及PmeI切出之DNA片段，嵌入於將表現人類化抗體輕鏈之廣用載體(pEF1FCCU)以限制酶NheI及PmeI切斷之處，建構表現序列編號42之胺基酸號碼75之甘胺酸經取代為麩胺酸之hB273_H2-1-NE型重鏈之載體。將所得到之表現載體命名為「pEF1FCCU/hB273_H2-1-NE」。
編碼hB273_H2-1-NE型重鏈之核苷酸序列係記載於序列表之序列編號69。又，hB273_H2-1-NE型重鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列編號70。進一步，序列編號69及70之序列亦記載於第48圖。
引子組合A
5’-aggtaagcttgctagcgccaccatgaaacacc-3’(H-F1：序列表之序列編號71)
5’-ctggttgtagaaggtgtcctcgttgtaggggttgaaccggcc-3’(H-NE-R2：序列表之序列編號72)
引子組合B
5’-ggccggttcaacccctacaacgaggacaccttctacaaccag-3’(H-NE-F2：序列表之序列編號73)
5’-ggatgccacccgtttaaacgggcccgatatctc-3’(H-R1：序列表之序列編號74)
引子組合C
5’-aggtaagcttgctagcgccaccatgaaacacc-3’(H-F1：序列表之序列編號71)
5’-ggatgccacccgtttaaacgggcccgatatctc-3’(H-R1：序列表之序列編號74) 9)-2 hB273抗體CDR修飾物之製備 9)-2-1 hB273抗體CDR修飾物之生產
將1.2×10⁹個之對數増殖期的FreeStyle 293F細胞(Invitrogen公司)接種於1.2L新鮮之FreeStyle293表現培養基(Invitrogen公司)，於37℃、8%CO₂之培養箱內，以90rpm震盪培養一小時。將3.6mg聚乙烯亞胺(Polyscience #24765)溶解於20ml之Opti-Pro SFM培養基(Invitrogen公司)，其次將使用PureLink HiPure質體套組(Invitrogen公司)所製備之表現H鏈之載體(0.4mg)及表現L鏈之載體(0.8mg)懸浮於20ml之Opti-Pro SFM培養基。於聚乙烯亞胺/Opti-Pro SFM混合液20ml中，添加表現載體/Opti-Pro SFM混合液20ml並緩慢攪拌，進一步放置5分鐘後添加於FreeStyle 293F細胞。3小時後添加Z-VAD-FMK(胜肽機構公司)並使成為10μM，於37℃、8%CO₂培養箱內以90rpm震盪培養7天，並將所得到之培養上清液以拋棄式囊式過濾器(艾德凡鐵克#CCS-045-E1H)過濾。
將藉由組合pEF1FCCU/hB273_H2-1-NE與pEF6KCL/hB273_L1-NE而取得之cB273人類化抗體命名為「hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NE」；將藉由組合pEF1FCCU/hB273_H2-1-NE與pEF6KCL/hB273_L1-NF而取得之cB273人類化抗體命名為「hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NF」；將藉由組合pEF1FCCU/hB273_H2_1-NE與pEF6KCL/hB273_L1-NK而取得之cB273人類化抗體命名為「hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK」；將藉由組合pEF1FCCU/hB273_H2-1-NE與pEF6KCL/hB273_L1-NL而取得之cB273人類化抗體命名為「hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NL」。 9)-2-2　hB273抗體CDR修飾物之純化
將上述9)-2-1所得到之培養上清液，以重組蛋白質A親和性層析(於4-6℃下)與陶瓷氫氧基磷灰石(室溫下)之2段式步驟予以純化。重組蛋白質A親和性層析純化後與陶瓷氫氧基磷灰石純化後之緩衝液置換步驟係於室溫下進行。起初，將培養上清液1100-1200ml施加於經PBS平衡化之MabSelectSuRe(通用電氣醫療生物科學公司製；HiTrap管柱：容積1ml×2連接)。培養液完全進管柱後，以15-30ml PBS將管柱清洗。其次以2M精胺酸鹽酸鹽溶液(pH4.0)溶離，並收集含有抗體之部分。將該部分以脫鹽管柱(通用電氣醫療生物科學公司製；Hitrap脫鹽管柱：容積5ml×2連接)進行置換為5mM磷酸鈉/50mM MES/20mM氯化鈉/pH6.5之緩衝液。進一步將該經置換之抗體溶液施加於經5mM NaPi/50mM MES/20mM氯化鈉/pH6.5緩衝液平衡化之陶瓷氫氧基磷灰石管柱(日本BioRad；生物等級CHT2-1氫氧基磷灰石管柱：容積2ml)。進行氯化鈉之線性濃度梯度溶離，並收集含有抗體之部分。將該部分以脫鹽管柱(通用電氣醫療生物科學公司製，Hitrap脫鹽管柱：容積5mlx2連接)進行置換為CBS(10mM檸檬酸緩衝液/140mM氯化鈉，pH6.0)溶液。最後以離心式超過濾裝置VIVASPIN 20(截留分子量30K；莎多力斯公司，於4℃下)濃縮，製備成IgG濃度為1.0mg/ml以上並作為純化樣品。 [實施例10]cB273抗體CDR修飾物之活性評價 10)-1　經由Biacore之hB273抗體CDR修飾物之結合活性評價
人類化抗DR5抗體與rsDR5之解離常數測定，係使用Biacore T100(通用電氣醫療生物科學(股))，以捕捉(capture)法進行，該捕捉法係將抗體捕捉(capture)於經固定化之抗人類IgG(Fc)抗體，將抗原作為分析物(analyte)測定。抗人類IgG(Fc)抗體(Human antibody capture kit；通用電氣醫療生物科學(股))係以胺耦合反應法共價鍵結於感測晶片CM5(sensor chip CM5)(Biacore,Inc.)約10,000RU。於參考胞(reference cell)亦進行相同之固定化。使用HBS-EP(10Mm HEPES pH7.4、0.15M氯化鈉、3mM EDTA、0.05%表面活性劑(Surfactant)P20)作為泳動緩衝液(running buffer)。於固定有抗人類IgG(Fc)抗體之晶片上，以流速10μl/分添加約20nM之抗體溶液60秒後，以流速30μl/分添加rsDR5之系列稀釋溶液(3.13-50nM)120秒，並持續監測180秒之間的解離相。以流速10μl/分添加作為再生溶液之3M氯化鎂30秒。數據之分析係使用分析軟體(Biacore T100 Evaluation software,version 2.0.1)之1對1結合模式，算出結合速率常數kon、解離速率常數koff、及解離常數(KD；KD=koff/kon)。4種人類化DR5抗體之Biacore測定結果表示於第12圖。 10)-2使用示差掃描熱卡計(DSC)」之人類化抗DR5抗體及其變異抗體之熱安定性測定
使用示差掃瞄熱卡計(DSC)以進行熱安定性之測定。樣品係以0.5mg/ml之濃度溶解於CBS緩衝液(製備為10mM檸檬酸、140mM氯化鈉、pH6.0)，並分別以400μl作為試料溶液使用於DSC測定。DSC測定條件設定如下。即，初始溫度20℃、最終溫度100℃、升溫速度200℃/1小時、過濾器時間2秒、反饋(feedback)模式為Low。參考液係使用CBS。所有DSC測定装置，係使用美國MicroCal公司(現通用電氣醫療生物科學(股))製造之VP-Capillary DSC Platform。自試料溶液而得到之掃瞄曲線減去基線(於試料胞填充參考溶液而得到之掃瞄曲線)以進行基線修正。將整體示差熱圖(thermogram)之峰頂溫度值作為Fab區之熱變性中點Tm。4種人類化DR5抗體之DSC測定結果示於第13圖。 10)-3　hB273抗體CDR修飾物對於人類癌細胞株之活體外殺細胞活性
將以50mM Tris-HCl(pH8.5)製備為50μg/ml之AfiniPure F(ab’)₂ fragment Goat anti-Human IgG Fc fragment specific(傑克森公司製　#109-006-098)分別注入45μl於96孔微量盤(康寧公司製)並於4℃下靜置1晚。將孔內以PBS清洗2次後，以50μl/孔添加9)-2-1使生產有抗體之293F培養上清液並使為150～1.5ng/ml，並於4℃下靜置1晚。將各孔以PBS清洗2次後，以50μl/孔添加Jurkat細胞並於37℃、5%CO₂之條件下培養23小時，該Jurkat細胞係於含10%FBS之RPMI1640培養基中製備為4.0x10⁴細胞/ml。使用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay Kit(CellTiter-Glo冷光細胞存活率檢測套組)(普洛麥格公司製#G7571)測定源自於活細胞之ATP量，並將取代抗體溶液而添加培養基之孔的數值作為100%評價hB273抗體之殺細胞作用。4種CDR修飾抗體之殺細胞活性示於第14圖。 10)-4　hB273_H2-1-NE/L1-NK抗體對於人類癌細胞株之卡沛斯酵素-3/7(caspase-3/7)活化作用及活體外殺細胞活性
分別以含10%FBS之RPMI 1640培養基或含10%FBS之MEM(Minimum Essential Medium)培養基，將源自於人類大腸癌細胞株HCT-15或人類神經膠母細胞瘤細胞株U-87MG製備為1.1x10⁵細胞/ml，以45μl/孔添加於白色透明底部之96孔微量盤(康寧公司製)，並於37℃、5%CO₂之條件下培養一晚。將hB273_H2-1-NE/L1-NK抗體、cB273抗體或人類IgG(傑克森公司製)與AfiniPure Goat anti-human IgG Fcγ fragment specific(親和純化山羊專一性抗人類IgG Fcγ片段抗體)(傑克森公司製#115-005-071)等濃度混合後，以5μl/孔添加hB273_H2-1-NE/L1-NK抗體、cB273抗體或人類IgG並使最終濃度為10,000～0.1ng/ml，並於37℃、5%CO₂之條件下培養4小時。各孔中之卡沛斯酵素-3/7活性係使用卡沛斯酵素-Glo 3/7測定套組(Caspase-Glo 3/7 Assay kit)(普洛麥格公司製#G8093)，根據所附之實驗說明書於室溫下培養30分鐘後，以冷光儀(珀金埃爾默公司製)測定，並以取代抗體溶液而添加培養基之孔的數值為100%評價卡沛斯酵素-3/7活性。又，活體外殺細胞活性係根據實施例3-3所示之方法，藉由測定抗體處理24小時後之ATP量而評價。其結果表明：hB273_H2-1-NE/L1-NK抗體具有與cB273抗體相同程度之卡沛斯酵素-3/7活化作用及殺細胞作用(第15圖)。 [實施例11]cB273抗體之in vivo抗腫瘤效果 11)-1　cB273抗體之抗腫瘤活性 11)-1-1　於經移植人類大腸癌細胞株COLO205之裸小鼠之抗腫瘤活性
將2×10⁶細胞之人類大腸癌細胞株COLO205(購自ATCC)移植於裸小鼠(CAnN.Cg-Foxnl^nu/CrlCrlj；購自日本查爾斯河實驗室公司(Charles River Laboratories Japan Inc.))之腋窩部皮下。於移植7、14、21天後，以1、3、10mg/kg將cB273抗體投予至載癌小鼠之尾靜脈內(n=10)。每週2次使用電子游標測徑器(Mitutoyo股份有限公司製)測定所移植腫瘤之長徑及短徑，並根據以下所示之算式算出腫瘤體積。
腫瘤體積(mm³)=1/2×短徑²(mm)×長徑²(mm)
結果示於第16圖。cB273抗體投予組於所有個體確認腫瘤完全萎縮。 11)-1-2　於經移植人類胰臟癌細胞株MIAPaCa-2之裸小鼠之抗腫瘤活性
將3×10⁶細胞之人類胰臟癌細胞株MIAPaCa-2(購自ATCC)移植於裸小鼠之腋窩部皮下。移植11、19、26、33天後，以3、10mg/kg將cB273抗體投予至載癌小鼠之尾靜脈內(n=10)。根據上述相同之方法測定所移植腫瘤之長徑及短徑並算出腫瘤體積。
結果示於第17圖。最終測定日(移植39天後)之腫瘤増殖抑制率，於3mg/kg投予組為73.5%、於10mg/kg投予組為77.4%。 11)-1-3於經移植人類神經膠母細胞瘤細胞株U-87MG之裸小鼠之抗腫瘤活性
將5×10⁶細胞之人類神經膠母細胞瘤細胞株U-87MG(購自ATCC)移植於裸小鼠之腋窩部皮下。移植4、11、18、25天後，以1、3、10mg/kg將cB273抗體投予至載癌小鼠之尾靜脈內(n=10)。根據上述相同之方法測定所移植腫瘤之長徑及短徑並算出腫瘤體積。
結果示於第18圖。最終測定日(移植32天後)之腫瘤増殖抑制率，於1mg/kg投予組為99.7%、於3mg/kg投予組為97.8%、於10mg/kg投予組為98.0%，且於1mg/kg投予組10隻中有2隻、於3mg/kg投予組10隻中有5隻、於10mg/kg投予組10隻中有3隻，顯示腫瘤完全萎縮。 11)-1-4於經移植人類肺癌細胞株NCI-H2122之裸小鼠之抗腫瘤活性(紫杉醇(paclitaxel)+卡鉑定(carboplatin)併用)
將5×10⁶細胞之人類肺癌細胞株NCI-H2122(購自ATCC)移植於裸小鼠之腋窩部皮下。於移植13、20天後，以10mg/kg將cB273抗體投予至載癌小鼠之尾靜脈內。紫杉醇係於移植13、14、15、16、17天後以6.25mg/kg進行皮下投予。卡鉑定係於移植13天後以100mg/kg進行腹腔內投予。(n=10)。根據上述相同之方法測定所移植腫瘤之長徑及短徑並算出腫瘤體積。
結果示於第19圖。最終測定日(移植41天後)之腫瘤増殖抑制率，於cB273抗體投予組為99.6%、於紫杉醇、卡鉑定併用投予組為10.2%、於cB273抗體、紫杉醇、卡鉑定併用投予組為99.7%。 11)-1-5於經移植人類肺癌細胞株NCI-H460之裸小鼠之抗腫瘤活性(紫杉醇+卡鉑定併用)
將5×10⁶細胞之人類肺癌細胞株NCI-H460(購自ATCC)移植於裸小鼠之腋窩部皮下。於移植6天後，以10mg/kg將cB273抗體投予至載癌小鼠之腹腔內。紫杉醇係於移植6、7、8、9、10天後以6.25mg/kg進行皮下投予。卡鉑定係於移植6天後以100mg/kg進行腹腔內投予。(n=10)。根據上述相同之方法測定所移植腫瘤之長徑及短徑並算出腫瘤體積。
結果示於第20圖。最終測定日(移植16天後)之腫瘤増殖抑制率，於cB273抗體投予組為43.3%、於紫杉醇、卡鉑定併用投予組為66.4%、於cB273抗體、紫杉醇、卡鉑定併用投予組為79.6%。 11)-1-6　於經移植人類大腸癌細胞株DLD-1之裸小鼠之抗腫瘤活性(CPT-11併用)
將5×10⁶細胞之人類大腸癌細胞株DLD-1(購自ATCC)移植於裸小鼠之腋窩部皮下。於移植35天後，將cB273抗體以10mg/kg投予至載癌小鼠之腹腔內。CPT-11係於移植35、40、43天後以80mg/kg投予至腹腔內(n=10)。根據上述相同之方法測定所移植腫瘤之長徑及短徑並算出腫瘤體積。
結果示於第21圖。最終測定日(移植55天後)之腫瘤増殖抑制率，於cB273抗體投予組為25.9%、於CPT-11投予組為29.5%、於cB273抗體、CPT-11併用投予組為72.7%。 11)-1-7　於經移植人類大腸癌株HCT-15之裸小鼠之抗腫瘤活性(CPT-11併用)
將5×10⁶細胞之人類大腸癌株HCT-15(購自ATCC)移植於裸小鼠之腋窩部皮下。於移植7天後，將cB273抗體以10mg/kg投予至載癌小鼠之尾靜脈內。CPT-11係於移植7、10、14天後以80mg/kg投予至腹腔內(n=10)。根據上述相同之方法測定所移植腫瘤之長徑及短徑並算出腫瘤體積。
結果示於第22圖。最終測定日(移植31天後)之腫瘤増殖抑制率，於cB273抗體投予組為52.8%、於CPT-11投予組為83.5%、於cB273抗體、CPT-11併用投予組為97.8%。 11)-1-8　於經移植人類大腸癌細胞株HCT-116之裸小鼠之抗腫瘤活性(CPT-11併用)
將1×10⁷細胞之人類大腸癌細胞株HCT-116(購自ATCC)移植於裸小鼠之腋窩部皮下。於移植7天後，將cB273抗體以10mg/kg投予至載癌小鼠之尾靜脈內。CPT-11係於移植7、10、14天後以65mg/kg投予至腹腔內(n=10)。根據上述相同之方法測定所移植腫瘤之長徑及短徑並算出腫瘤體積。
結果示於第23圖。最終測定日(移植28天後)之腫瘤増殖抑制率，於cB273抗體投予組為13.9%、於CPT-11投予組為89.8%、於cB273抗體、CPT-11併用投予組為99.7%。 11)-1-9　於經移植人類黑色素瘤細胞株A375之裸小鼠之抗腫瘤活性(長春花鹼(vinblastin)併用)
將2×10⁶細胞之人類黑色素瘤細胞株A375(購自ATCC)移植於裸小鼠之腋窩部皮下。於移植10、17、24天後，將cB273抗體以10mg/kg投予至載癌小鼠之尾靜脈內。長春花鹼係於移植10天後以10mg/kg投予至尾靜脈(n=10)。根據上述相同之方法測定所移植腫瘤之長徑及短徑並算出腫瘤體積。
結果示於第24圖。最終測定日(移植46天後)之腫瘤増殖抑制率，於cB273抗體投予組為53.1%、於長春花鹼投予組為43.6%、於cB273抗體與長春花鹼併用投予組為100%，且於cB273抗體與長春花鹼併用投予組，所有個體顯示腫瘤完全萎縮。 11)-2 cB273抗體與西他土珠(Conatumumab)之抗腫瘤活性之比較 11)-2-1　西他土珠之製備
西他土珠係根據記載於WHO Drug Information(世界衛生組織藥品訊息),Vol.22,No.2,2008,p129-130之輕鏈、及重鏈之胺基酸序列所製作。 11)-2-1-1　表現西他土珠之輕鏈之載體之建構
合成序列編號76之胺基酸號碼21至130所示，包含編碼西他土珠之輕鏈可變區之基因的DNA(基因工藝公司；人工基因合成服務)，並將以限制酶NdeI及BsiWI切出之DNA片段，嵌入於將表現人類化抗體輕鏈之廣用載體(pEF6KCL)以限制酶NdeI及BsiWI切斷之處，以建構表現西他土珠之輕鏈之載體。將所得到之表現載體命名為「pEF6KCL/Conatumumab_L」。 11)-2-1-2　表現西他土珠之重鏈之載體之建構
合成序列表之序列編號78之胺基酸號碼20至141所示，包含編碼西他土珠之重鏈可變區之基因的DNA(基因工藝公司；人工基因合成服務)，並將以限制酶B1pI切出之DNA片段，嵌入於將表現人類化抗體重鏈之廣用載體(pEF1FCCU)以限制酶B1pI切斷之處，以建構表現西他土珠之重鏈之載體。將所得到之表現載體命名為「pEF1FCCU/Conatumumab_H」。 11)-2-1-3　西他土珠之生產
將1.2×10⁹個之對數増殖期的FreeStyle 293F細胞(Invitrogen公司)接種於1.2L新鮮之FreeStyle 293表現培養基(Invitrogen公司)，並於37℃、8%CO₂培養箱內以90rpm震盪培養一小時。將3.6mg聚乙烯亞胺(Polyscience #24765)溶解於20ml之Opti-Pro SFM培養基(Invitrogen公司)，其次將使用PureLink HiPure質體套組(Invitrogen公司)所製備之表現H鏈之載體pEF1FCCU/Conatumumab_H(0.4mg)及表現L鏈之載體pEF6KCL/Conatumumab_L(0.8mg)懸浮於20ml之Opti-Pro SFM培養基。於20ml之聚乙烯亞胺/Opti-Pro SFM混合液中，添加表現載體/Opti-Pro SFM混合液20ml添加並緩慢攪拌，進一步放置5分鐘後添加於FreeStyle 293F細胞中。將於37℃、8%CO ₂培養箱中，以90rpm震盪培養7天而得到之培養上清液以拋棄式囊式過濾器(Disposable Capsule Filter)(艾德凡鐵克#CCS-045-E1H)過濾。 11)-2-1-4　西他土珠之純化
將上述11)-2-1-3所得到之培養上清液，以重組蛋白質A親和性層析(於4-6℃下)與陶瓷氫氧基磷灰石(室溫下)之2段式步驟予以純化。重組蛋白質A親和性層析純化後與陶瓷氫氧基磷灰石純化後之緩衝液置換步驟係於室溫下進行。起初，將培養上清液1100-1200ml施加於經PBS平衡化之MabSelect SuRe(通用電氣醫療生物科學公司製；HiTrap管柱：容積1ml×2連接)。培養液完全進管柱後，以15-30ml PBS將管柱清洗。其次以2M精胺酸鹽酸鹽溶液(pH4.0)溶離，並收集含有抗體之部分。將該部分以脫鹽管柱(通用電氣醫療生物科學公司製；Hitrap脫鹽管柱：容積5ml×2連接)進行置換為5mM磷酸鈉/50mM MES/20mM氯化鈉/pH6.5之緩衝液。進一步將該經置換之抗體溶液施加於經5mM NaPi/50mM MES/20mM氯化鈉/pH6.5緩衝液平衡化之陶瓷氫氧基磷灰石管柱(日本BioRad；生物等級CHT2-1氫氧基磷灰石管柱：容積2ml)。進行氯化鈉之線性濃度梯度溶離，並收集含有抗體之部分。將該部分以脫鹽管柱(通用電氣醫療生物科學公司製，Hitrap脫鹽管柱：容積5mlx2連接)進行置換為CBS(10mM檸檬酸緩衝液/140mM氯化鈉，pH6.0)溶液。最後以離心式超過濾裝置VIVASPIN 20(截留分子量30K；莎多力斯公司，於4℃下)濃縮，製備成IgG濃度為1.0mg/ml以上並作為純化樣品。 11)-2-2　於經移植人類大腸癌細胞株HCT-15之裸小鼠之cB273抗體與西他土珠之抗腫瘤活性之比較
將1×10⁷細胞之人類大腸癌細胞株HCT-15(購自ATCC)移植於裸小鼠之腋窩部皮下。於移植6、13、20天後，將cB273抗體及西他土珠以3、10、30mg/kg投予至載癌小鼠之尾靜脈內(n=10)。根據上述相同之方法測定所移植腫瘤之長徑及短徑並算出腫瘤體積。
結果示於第25圖。最終測定日(移植3天後)之腫瘤増殖抑制率，於cB273抗體之3mg/kg投予組為57.9%、10mg/kg投予組為56.0%、30mg/kg投予組為53.6%、於西他土珠之3mg/kg投予組為27.4%、10mg/kg投予組為26.9%、30mg/kg投予組為20.3%。 11)-2-3　於經移植人類肺癌細胞株NCI-H1975之裸小鼠之cB273抗體與西他土珠之抗腫瘤活性之比較
將3×10⁶細胞之人類肺癌細胞株NCI-H1975(購自ATCC)移植於裸小鼠之腋窩部皮下。於移植12、19、26天後，將cB273抗體及西他土珠以3、10mg/kg投予至載癌小鼠之尾靜脈內(n=10)。根據上述相同之方法測定所移植腫瘤之長徑及短徑並算出腫瘤體積。
結果示於第26圖。最終測定日(移植32天後)之腫瘤増殖抑制率，於cB273抗體之3mg/kg投予組為71.5%、10mg/kg投予組為73.3%、於西他土珠之3mg/kg投予組為13.5%、10mg/kg投予組為12.6%。 [實施例12]hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體之in vivo抗腫瘤效果 12)-1　hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體於經移植人類大腸癌細胞株COLO205之裸小鼠之抗腫瘤活性
將2×10⁶細胞之人類大腸癌株COLO205(購自ATCC)移植於裸小鼠之腋窩部皮下。於移植8、15、22天後，將hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體及cB273抗體以0.3、3mg/kg投予至載癌小鼠之尾靜脈內(n=10)。根據上述相同之方法測定所移植腫瘤之長徑及短徑並算出腫瘤體積。
結果示於第27圖。於hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體之3mg/kg投予組及cB273抗體之0.3mg/kg投予組，經確認所有個體之腫瘤完全萎縮。於hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體之0.3mg/kg投予組10例中有9例、及於cB273抗體之3mg/kg投予組10例中有8例經確認腫瘤完全萎縮。 [實施例13]hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體對於人類癌細胞株之活體外殺細胞活性
NCI-N87、KATOIII、SNU-16(以上為人類胃癌細胞株)，Caki-1、ACHN、786-O(以上為人類腎臟癌細胞株)、Hep3B、SK-HEP-1、HepG2(C3A)(以上為人類肝癌細胞株)、HT-1080(人類纖維肉瘤細胞株)係購自American Type Culture Collection:ATCC。GCIY(人類胃癌細胞株)係購自理化學研究所。HuH-7(人類肝癌細胞株)係購自醫藥基盤研究所。
對於各種細胞株之活體外殺細胞活性係根據以下方法測定。關於胃癌細胞株、腎臟癌細胞株、纖維肉瘤細胞株，係將經適當繼代培養之細胞，以剛果藍(Trypan blue)染色法計數後，以含有10%胎牛血清(HyClone公司製)之培養基(以下作「培養基」)製備為1×10⁵細胞/ml。於培養基中混合20μg/ml之hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體、40μg/ml之2次抗體(山羊抗人類IgG抗體，MP Biomedicals公司製)。進一步，使用培養基予以稀釋，製備為hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體濃度為2000、200、20、2ng/ml之溶液。於透明96孔微量盤(康寧公司製)將各濃度之溶液以每組3連續分別添加50μl，並分別接種50μl之細胞懸浮液(5×10³細胞)(hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體最終濃度10000、1000、100、10、1ng/ml)。
關於肝癌細胞株，係將經適當繼代培養之細胞，以剛果藍染色法計數後，以培養基製備為4×10⁴細胞/ml。於培養基中混合2μg/ml之hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體、4 μg/ml之2次抗體。進一步，使用培養基製備為200、20、2、0.2、0.02ng/ml之溶液。於黑色透明底部之96孔微量盤(康寧公司製)將各濃度之溶液以每組2連續分別添加50μl，並分別接種50μl之細胞懸浮液(2×10³細胞)(抗體最終濃度1000、100、10、1、0.1、0.01ng/ml)。
於37℃、5%二氧化碳存在下，將微量盤培養72小時並測定各孔之ATP量。ATP量測定係使用螢光酵素(uciferase)發光試藥(CellTiter Glo；普洛麥加公司製)，並根據所附之實驗說明書測定。即，於微量盤之各中分別添加100μl之包含細胞溶解成分與發光基質成分而成之試液，攪拌後，以冷光儀測定各孔之發光(Berthold公司製)。關於胃癌細胞株、腎臟癌細胞株、纖維肉瘤細胞株，係分別將100μl之試液，自透明96孔微量盤移至白色96孔微量盤(康寧公司製)後進行發光測定。
以添加培養基與細胞懸浮液之孔作為陰性對照孔、以僅添加培養基之孔作為背景值孔，根據下式算出待測孔之細胞生存率。
細胞生存率(%)=(待測孔之發光強度-背景值孔之平均發光強度)/(陰性對照孔之平均發光強度-背景值孔之平均發光強度)×100
將各細胞株於各抗體處理濃度之細胞生存率之平均值示於第51圖。關於胃癌細胞株，腎臟癌細胞株，纖維肉瘤細胞株，標準誤差係以誤差槓(error bar)表示。hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體對於786-O以外之細胞株，顯示細胞毒殺活性。 [實施例14]併用hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體與化療劑之in vivo活性測定 14)-1 hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體與5-FU之併用於經移植人類大腸癌細胞株HCT-15之裸小鼠之抗腫瘤活性、及與西他土珠之活性比較
將1×10⁷細胞之人類大腸癌細胞株HCT-15(購自ATCC)移植於裸小鼠(CAnN.Cg-Foxnl^nu/CrlCrlj；購自日本查爾斯河實驗室)之腋窩部皮下。於移植7、14、21天後，以3mg/kg將hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體或西他土珠投予至載癌小鼠之尾靜脈內。5-FU係於移植7天後以160mg/kg投予至尾靜脈內。實驗係以n=6進行。每週2次使用電子游標測徑器(Mitutoyo股份有限公司製)測定所移植腫瘤之長徑及短徑，並根據以下所示之算式算出腫瘤體積。
腫瘤體積(mm³)=1/2×短徑²(mm)×長徑²(mm)
結果示於第52圖。最終測定日(移植28天後)之腫瘤増殖抑制率，於hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體投予組為62%、於西他土珠投予組為27%、於5-FU投予組為54%、於hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體與5-FU併用組為91%、於西他土珠與5-FU併用組為78%。即，確認hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體與5-FU之併用效果，進一步，hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體與5-FU併用組，相較於西他土珠與5-FU併用組顯示較強之抗腫瘤活性。 14)-2　hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體與紫杉醇之併用於經移植人類非小細胞肺癌細胞株NCI-H1975之裸小鼠之抗腫瘤活性、及與西他土珠之活性比較
將3×10⁶細胞之人類非小細胞肺癌細胞株NCI-H1975(購自ATCC)移植於裸小鼠之腋窩部皮下。於移植11、18、25天後，以3 mg/kg將hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體或西他土珠投予至載癌小鼠之尾靜脈內。紫杉醇係於移植11、12、13、14天後以6.25mg/kg投予至載癌小鼠之尾靜脈內。實驗係以n=6進行。根據上述相同之方法測定所移植腫瘤之長徑及短徑並算出腫瘤體積。
結果示於第53圖。最終測定日(移植32天後)之腫瘤増殖抑制率，於hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體投予組為66%、於西他土珠投予組為40%、於紫杉醇投予組為49%、於hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體與紫杉醇併用組為91%、於西他土珠與紫杉醇併用組為79%。即，確認hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體與紫杉醇之併用效果，進一步，hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體與紫杉醇併用組，相較於西他土珠與紫杉醇併用組顯示較強之抗腫瘤活性。
<110>　第一三共股份有限公司
<120>　新穎抗DR5抗體
<130>　DSPCT-FP1141
<150>　JP 2010-243549
<151>　2010-10-29
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<170>　PatentIn version 3.4
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<212>　PRT
<213>　小鼠
<400>　2

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<212>　DNA
<213>　人工序列
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<223>　引子MH258E1F1
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　引子G1EVR1
<400>　4

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<212>　DNA
<213>　人工序列
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<220>
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<212>　DNA
<213>　小鼠
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(714)
<400>　9


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<220>
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<400>　12

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<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人類kappa鏈之訊號胜肽之核苷酸序列、Fc區及poly A附加訊號
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<220>
<223>　人類IgG1鏈之訊號胜肽之核苷酸序列及Fc區
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<220>
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<220>
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　編碼B273嵌合體之重鏈之核苷酸序列
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<221>　CDS
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<213>　人工序列
<220>
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<400>　22

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<212>　PRT
<213>　人類
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<212>　DNA
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<223>　編碼hB273_L1之核苷酸序列
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<220>
<223>　編碼hB273_H1之核苷酸序列
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(1413)
<400>　33




<210>　34
<211>　471
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成構築體
<400>　34




<210>　35
<211>　1413
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　編碼hB273_H2之核苷酸序列
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(1413)
<400>　35




<210>　36
<211>　471
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成構築體
<400>　36




<210>　37
<211>　1413
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　編碼hB273_H3之核苷酸序列
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(1413)
<400>　37




<210>　38
<211>　471
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成構築體
<400>38




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<211>　1413
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　編碼hB273_H1-1之核苷酸序列
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(1413)
<400>　39




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<211>　471
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成構築體
<400>　40




<210>　41
<211>　1413
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　編碼hB273_H2-1之核苷酸序列
<220>
<221>　CDS
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<400>　41




<210>　42
<211>　471
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成構築體
<400>　42




<210>　43
<211>　1413
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　編碼hB273_H2-2之核苷酸序列
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(1413)
<400>　43




<210>　44
<211>　471
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成構築體
<400>　44




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<211>　1413
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　編碼hB273_H2-3之核苷酸序列
<220>
<221>　CDS
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<400>　45




<210>46
<211>　471
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成構築體
<400>　46




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<211>　1413
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　編碼hB273_H2-4之核苷酸序列
<220>
<221>　CDS
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<211>　471
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成構築體
<400>　48




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<211>　1413
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　編碼hB273_H2-5之核苷酸序列
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(1413)
<400>　49




<210>　50
<211>　471
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成構築體
<400>　50




<210>　51
<211>　717
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　編碼hB273_L1-NE之核苷酸序列
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(717)
<400>　51


<210>　52
<211>　239
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成構築體
<400>　52


<210>　53
<211>　32
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　引子L-F1
<400>　53

<210>　54
<211>　42
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　引子L-NE-R2
<400>　54

<210>　55
<211>　42
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　引子L-NE-F2
<400>　55

<210>　56
<211>　32
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　引子L-R1
<400>　56

<210>　57
<211>　717
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　編碼hB273_L1-NF之核苷酸序列
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(717)
<400>　57


<210>　58
<211>　239
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成構築體
<400>　58



<210>　59
<211>　42
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　引子L-NF-R2
<400>　59

<210>　60
<211>　42
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　引子L-NF-F2
<400>　60

<210>　61
<211>　717
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　編碼hB273_L1-NK之核苷酸序列
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(717)
<400>　61


<210>　62
<211>　239
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成構築體
<400>　62


<210>　63
<211>　42
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　引子L-NK-R2
<400>　63

<210>　64
<211>　42
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　引子L-NK-F2
<400>　64

<210>　65
<211>　717
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　編碼hB273_L1-NL之核苷酸序列
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(717)
<400>　65



<210>　66
<211>　239
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成構築體
<400>　66



<210>　67
<211>　42
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　引子L-NL-R2
<400>　67

<210>　68
<211>　42
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　引子L-NL-F
<400>　68

<210>　69
<211>　1413
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　編碼hB273_H2-1-NE之核苷酸序列
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(1413)
<400>　69




<210>　70
<211>　471
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成構築體
<400>　70




<210>　71
<211>　32
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　引子H-F1
<400>　71

<210>　72
<211>　42
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　引子H-NE-R2
<400>　72

<210>　73
<211>　42
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　引子H-NE-F2
<400>　73

<210>　74
<211>　33
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　引子H-R1
<400>　74

<210>　75
<211>　705
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　編碼西他土珠(conatumumab)之輕鏈之核苷酸序列
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(705)
<400>　75


<210>　76
<211>　235
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成構築體
<400>　76



<210>　77
<211>　1413
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　編碼西他土珠核之重鏈之苷酸序列
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(1413)
<400>　77




<210>　78
<211>　471
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成構築體
<400>　78




<210>　79
<211>　16
<212>　PRT
<213>　小鼠
<400>　79

<210>　80
<211>　7
<212>　PRT
<213>　小鼠
<400>　80

<210>　81
<211>　9
<212>　PRT
<213>　小鼠
<400>　81

<210>　82
<211>　5
<212>　PRT
<213>　小鼠
<400>　82

<210>　83
<211>　17
<212>　PRT
<213>　小鼠
<400>　83

<210>　84
<211>　13
<212>　PRT
<213>　小鼠
<400>　84


<210>　85
<211>　16
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　hB273_L1-NE CDRL1
<400>　85

<210>　86
<211>　16
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　hB273_L1-NF之CDRL1
<400>　86

<210>　87
<211>　16
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　hB273_L1-NK之CDRL1
<400>　87

<210>　88
<211>　16
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　hB273_L1-NL之CDRL1
<400>　88

<210>　89
<211>　17
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　hB273_H2-1-NE之CDRH2
<400>　89
[第1圖]
第1圖所示為小鼠B273抗體之殺細胞作用之圖。 [第2圖]
第2圖所示為cB273抗體及sTRAIL對於DR5細胞外區域蛋白質之結合活性之圖。 [第3圖]
第3圖所示為經由Biacore之cB273抗體對於人類DR5之結合活性之圖。 [第4圖]
第4圖所示為cB273抗體對於人類癌細胞株之活體外殺細胞作用之圖；A)為關於人類卵巢癌細胞株、B)為關於人類大腸癌細胞株、C)為關於人類肺癌細胞株、D)為關於人類乳癌細胞株之結果。 [第5圖]
第5圖所示為cB273抗體對於人類癌細胞株之活體外殺細胞作用之圖；A)為關於人類胰臟癌細胞株、B)為關於人類黑色素瘤癌細胞株、C)為關於人類神經膠母細胞瘤細胞株、D)為關於人類子宮內膜癌細胞株之結果。 [第6圖]
第6圖所示為DR5與cB273 Fab複合體構造之圖。 [第7圖]
第7圖所示為DR5與cB273 Fab之H鏈、L鏈之相互作用之圖。A)圖係以棒模型(stick model)表示cB273 Fab之H鏈與DR5之間，位於相互距離4以內之胺基酸殘基，圖中左側之Ile(異白胺酸)34、Glu(麩胺酸)36、Asp(天冬胺酸)37、Gly(甘胺酸)38、Asp(天冬胺酸)56、Leu(白胺酸)57、Leu(白胺酸)58、Phe(苯基丙胺酸)59、Leu(白胺酸)61、Arg(精胺酸)62係源自於DR5之胺基酸殘基，各胺基酸殘基號碼對應於序列表之序列編號23所示之胺基酸序列，又，圖中右側之Phe(苯基丙胺酸)33、Arg(精胺酸)50、Asn(天冬醯胺)52、Tyr(酪胺酸)54、Asn(天冬醯胺)55、Phe(苯基丙胺酸)59、Tyr(酪胺酸)101、Tyr(酪胺酸)102、Phe(苯基丙胺酸)103、Asp(精胺酸)104係源自於cB273重鏈之胺基酸殘基，且所賦予之各胺基酸殘基號碼係以序列表之序列編號20之第20個之麩胺酸殘基為起點；B)圖係以棒模型表示cB273 Fab之L鏈與DR5之間，位於相互距離4以內之胺基酸殘基，其他則以帶狀模型(ribbon model)表示，圖中左側之Gly(甘胺酸)26、Glu(麩胺酸)36、Asp(精胺酸)37、Gly(甘胺酸)38係源自於DR5之胺基酸殘基，各胺基酸殘基號碼對應於序列表之序列編號23所示之胺基酸序列，又，圖中右側之His(組胺酸)33、Asn(天冬醯胺)33、Val(纈胺酸)99、Trp(色胺酸)101係源自於cB273輕鏈之胺基酸殘基，且所賦予之各胺基酸殘基號碼係以序列表之序列編號16之第21個之天冬胺酸殘基為起點；位於自cB273 Fab片段4以內距離之DR5之胺基酸殘基為：記載於序列表之序列編號23之胺基酸序列中，第26個之甘胺酸殘基、第34個之異白胺酸殘基、第36個之麩胺酸殘基、第37個之天冬胺酸殘基、第38個之甘胺酸殘基、第56個之天冬胺酸殘基、第57個之白胺酸殘基、第58個之白胺酸殘基、第59個之苯丙胺酸殘基、第61個之白胺酸殘基、及第62個之精胺酸殘基。 [第8圖]
第8圖所示為經由Biacore之hB273抗體對於人類DR5之結合活性之圖。 [第9圖]
第9圖所示為hB273抗體對於源自於人類T淋巴細胞瘤細胞株-Jurkat細胞之活體外殺細胞活性之圖。 [第10圖]
第10圖所示為經由Biacore之hB273抗體對於人類DR5之結合活性之圖。 [第11圖]
第11圖所示為hB273抗體對於源自於人類T淋巴細胞瘤細胞株-Jurkat細胞之活體外殺細胞活性之圖。 [第12圖]
第12圖所示為經由Biacore之hB273抗體CDR修飾物對於人類DR5之結合活性之圖。 [第13圖]
第13圖所示為使用示差掃瞄熱卡計(DSC)之hB273抗體CDR修飾物之熱安定性評價之圖。 [第14圖]
第14圖所示為hB273抗體CDR修飾物對於源自於人類T淋巴細胞瘤細胞株-Jurkat細胞之活體外殺細胞活性之圖。 [第15圖]
第15圖所示為hB273_H2-1-NE/L1-NK抗體對於人類癌細胞株之卡沛斯酵素-3/7(caspase-3/7)活化作用及活體外殺細胞活性之圖。A)係關於人類大腸癌細胞株HCT-15、B)係關於人類神經膠母細胞瘤細胞株U-87MG之結果。 [第16圖]
第16圖所示為cB273抗體於經移植人類大腸癌細胞株COLO205之裸小鼠之in vivo抗腫瘤活性之圖。 [第17圖]
第17圖所示為cB273抗體於經移植人類胰臟癌細胞株MIAPaCa-2之裸小鼠之in vivo抗腫瘤活性之圖。 [第18圖]
第18圖所示為cB273抗體於經移植人類神經膠母細胞瘤細胞株U-87MG之裸小鼠之in vivo抗腫瘤活性之圖。 [第19圖]
第19圖所示為cB273抗體於經移植人類肺癌細胞株NCI-H2122之裸小鼠之in vivo抗腫瘤活性(併用紫杉醇+卡鉑定)之圖。 [第20圖]
第20圖所示為cB273抗體於經移植人類肺癌細胞株NCI-H460之裸小鼠之in vivo抗腫瘤活性(併用紫杉醇+卡鉑定)之圖。 [第21圖]
第21圖所示為cB273抗體於經移植人類大腸癌細胞株DLD-1之裸小鼠之in vivo抗腫瘤活性(併用CPT-11)之圖。 [第22圖]
第22圖所示為cB273抗體於經移植人類大腸癌細胞株HCT-15之裸小鼠之in vivo抗腫瘤活性(併用CPT-11)之圖。 [第23圖]
第23圖所示為cB273抗體於經移植人類大腸癌細胞株HCT-116之裸小鼠之in vivo抗腫瘤活性(併用CPT-11)之圖。 [第24圖]
第24圖所示為cB273抗體於經移植人類黑色素瘤細胞株A375之裸小鼠之in vivo抗腫瘤活性(併用長春花鹼(vinblastin))之圖。 [第25圖]
第25圖所示為於經移植人類大腸癌細胞株HCT-15之裸小鼠比較cB273抗體及西他土珠(Conatumumab)之in vivo抗腫瘤活性之圖。 [第26圖]
第26圖所示為於經移植人類肺癌細胞株NCI-H1975之裸小鼠比較cB273抗體及西他土珠之in vivo抗腫瘤活性之圖。 [第27圖]
第27圖所示為hB273_H2-1-NE/L1-NK抗體(圖中表記為hB273)於經移植人類大腸癌細胞株COLO205之裸小鼠之in vivo抗腫瘤活性之圖。 [第28圖]
第28圖所示為編碼小鼠抗體B273重鏈之cDNA的核苷酸序列，及小鼠抗體B273重鏈之胺基酸序列之圖。 [第29圖]
第29圖所示為編碼小鼠抗體B273輕鏈之cDNA的核苷酸序列，及小鼠抗體B273輕鏈之胺基酸序列之圖。 [第30圖]
第30圖所示為編碼B273嵌合型輕鏈之核苷酸序列，及B273嵌合型輕鏈之胺基酸序列之圖。 [第31圖]
第31圖所示為編碼B273嵌合型重鏈之核苷酸序列，及B273嵌合型重鏈之胺基酸序列之圖。 [第32圖]
第32圖所示為編碼hB273_L1型輕鏈之核苷酸序列，及hB273_L1型輕鏈之胺基酸序列之圖。 [第33圖]
第33圖所示為編碼hB273_L2型輕鏈之核苷酸序列，及hB273_L2型輕鏈之胺基酸序列之圖。 [第34圖]
第34圖所示為編碼hB273_L3型輕鏈之核苷酸序列，及hB273_L3型輕鏈之胺基酸序列之圖。 [第35圖]
第35圖所示為編碼hB273_H1型重鏈之核苷酸序列，及hB273_H1型重鏈之胺基酸序列之圖。 [第36圖]
第36圖所示為編碼hB273_H2型重鏈之核苷酸序列，及hB273_H2型重鏈之胺基酸序列之圖。 [第37圖]
第37圖所示為編碼hB273_H3型重鏈之核苷酸序列，及hB273_H3型重鏈之胺基酸序列之圖。 [第38圖]
第38圖所示為編碼hB273_H1-1型重鏈之核苷酸序列，及hB273_H1-1型重鏈之胺基酸序列之圖。 [第39圖]
第39圖所示為編碼hB273_H2-1型重鏈之核苷酸序列，及hB273_H2-1型重鏈之胺基酸序列之圖。 [第40圖]
第40圖所示為編碼hB273_H2-2型重鏈之核苷酸序列，及hB273_H2-2型重鏈之胺基酸序列之圖。 [第41圖]
第41圖所示為編碼hB273_H2-3型重鏈之核苷酸序列，及hB273_H2-3型重鏈之胺基酸序列之圖。 [第42圖]
第42圖所示為編碼hB273_H2-4型重鏈之核苷酸序列，及hB273_H2-4型重鏈之胺基酸序列之圖。 [第43圖]
第43圖所示為編碼hB273_H2-5型重鏈之核苷酸序列，及hB273_H2-5型重鏈之胺基酸序列之圖。 [第44圖]
第44圖所示為編碼hB273_L1-NE型輕鏈之核苷酸序列，及hB273_L1-NE型輕鏈之胺基酸序列之圖。 [第45圖]
第45圖所示為編碼hB273_L1-NF型輕鏈之核苷酸序列，及hB273_L1-NF型輕鏈之胺基酸序列之圖。 [第46圖]
第46圖所示為編碼hB273_L1-NK型輕鏈之核苷酸序列，及hB273_L1-NK型輕鏈之胺基酸序列之圖。 [第47圖]
第47圖所示為編碼hB273_L1-NL型輕鏈之核苷酸序列，及hB273_L1-NL型輕鏈之胺基酸序列之圖。 [第48圖]
第48圖所示為編碼hB273_H2-1-NE型重鏈之核苷酸序列，及hB273_H2-1-NE型重鏈之胺基酸序列之圖。 [第49圖]
第49圖所示為編碼西他土珠之輕鏈之cDNA的核苷酸序列，及西他土珠之輕鏈的胺基酸序列之圖。 [第50圖]
第50圖所示為編碼西他土珠之重鏈之cDNA的核苷酸序列，及西他土珠之重鏈的胺基酸序列之圖。 [第51圖]
第51圖所示為hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體對於人類癌細胞株之活體外殺細胞活性之圖；A)為關於人類胃癌細胞株、B)為關於人類腎臟癌細胞株、C)為關於人類肝癌細胞株、D)為關於人類纖維肉瘤細胞株之結果。 [第52圖]
第52圖所示為併用hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體(圖中表記為hB273)與5-FU於經移植人類大腸癌細胞株HCT-15之裸小鼠之in vivo抗腫瘤活性、及與西他土珠之活性比較之圖。 [第53圖]
第53圖所示為併用hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗體(圖中表記為hB273)與紫杉醇於經移植人類非小細胞肺癌細胞株NCI-H1975之裸小鼠之in vivo抗腫瘤活性、及與西他土珠之活性比較之圖。

权利要求:
Claims (46)
[1] 一種抗體或該抗體之機能性片段，其特徵為：重鏈序列係包含具有CDRH1、CDRH2、CDRH3之可變區，前述CDRH1係包含序列編號82所示之胺基酸序列而成、前述CDRH2係包含序列編號83或89所示之任一胺基酸序列而成、前述CDRH3係包含序列編號84所示之胺基酸序列而成；及輕鏈序列係包含具有CDRL1、CDRL2、CDRL3之可變區，前述CDRL1係包含序列編號79、85、86、87或88所示之任一胺基酸序列而成、前述CDRL2係包含序列編號80所示之胺基酸序列而成、前述CDRL3係包含序列編號81所示之胺基酸序列而成。
[2] 如申請專利範圍第1項之抗體或該抗體之機能性片段，其係包含：重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列；該重鏈可變區序列係包含序列編號20所示之胺基酸序列之第20至141個胺基酸殘基而成；該輕鏈可變區序列係包含序列編號16所示之胺基酸序列之第21至134個胺基酸殘基而成。
[3] 如申請專利範圍第1或2項之抗體或該抗體之機能性片段，其係嵌合抗體。
[4] 如申請專利範圍第3項之抗體或該抗體之機能性片段，其係包含：重鏈序列及輕鏈序列而成；該重鏈序列係包含序列編號20所示之胺基酸序列之第20至471個胺基酸殘基而成；該輕鏈序列係包含序列編號16所示之胺基酸序列之第21至239個胺基酸殘基而成。
[5] 如申請專利範圍第1項之抗體或該抗體之機能性片段，其係經人類化。
[6] 如申請專利範圍第5項之抗體或該抗體之機能性片段，其係抗體或該抗體之機能性片段，且包含：(a)選自於以下之胺基酸序列而成之群組之重鏈可變區序列：a1)包含序列編號42所示之胺基酸序列之第20至141個胺基酸殘基而成之胺基酸序列；a2)包含序列編號70所示之胺基酸序列之第20至141個胺基酸殘基而成之胺基酸序列；a3)與選自於a1)或a2)之胺基酸序列至少具有95%同源性之胺基酸序列；a4)與選自於a1)或a2)之胺基酸序列至少具有99%同源性之胺基酸序列；a5)選自於a1)或a2)之胺基酸序列中，1至數個胺基酸殘基已經取代、缺失或附加之胺基酸序列；及(b)選自於以下之胺基酸序列而成之群組之輕鏈可變區序列：b1)包含序列編號28所示之胺基酸序列之第21至134個胺基酸殘基而成之胺基酸序列；b2)包含序列編號52所示之胺基酸序列之第21至134個胺基酸殘基而成之胺基酸序列；b3)包含序列編號58所示之胺基酸序列之第21至134個胺基酸殘基而成之胺基酸序列；b4)包含序列編號62所示之胺基酸序列之第21至134個胺基酸殘基而成之胺基酸序列；b5)包含序列編號66所示之胺基酸序列之第21至134個胺基酸殘基而成之胺基酸序列；b6)與選自於b1)至b5)之任一胺基酸序列至少具有95%同源性之胺基酸序列；b7)與選自於b1)至b5)之任一胺基酸序列至少具有99%同源性之胺基酸序列；b8)於選自於b1)至b5)之任一胺基酸序列中，1至數個胺基酸殘基已經取代、缺失或附加之胺基酸序列。
[7] 如申請專利範圍第6項之抗體或該抗體之機能性片段，其係包含：重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列；該重鏈可變區序列係包含序列編號42所示之胺基酸序列之第20至141個胺基酸殘基而成；該輕鏈可變區序列係包含序列編號28所示之胺基酸序列之第21至134個胺基酸殘基而成。
[8] 如申請專利範圍第6項之抗體或該抗體之機能性片段，其係包含：重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列；該重鏈可變區序列係包含序列編號70所示之胺基酸序列之第20至141個胺基酸殘基而成；該輕鏈可變區序列係包含序列編號52所示之胺基酸序列之第21至134個胺基酸殘基而成。
[9] 如申請專利範圍第6項之抗體或該抗體之機能性片段，其係包含：重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列；該重鏈可變區序列係包含序列編號70所示之胺基酸序列之第20至141個胺基酸殘基而成；該輕鏈可變區序列係包含序列編號58所示之胺基酸序列之第21至134個胺基酸殘基而成。
[10] 如申請專利範圍第6項之抗體或該抗體之機能性片段，其係包含：重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列；該重鏈可變區序列係包含序列編號70所示之胺基酸序列之第20至141個胺基酸殘基而成；該輕鏈可變區序列係包含序列編號62所示之胺基酸序列之第21至134個胺基酸殘基而成。
[11] 如申請專利範圍第6項之抗體或該抗體之機能性片段，其係包含：重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列；該重鏈可變區序列係包含序列編號70所示之胺基酸序列之第20至141個胺基酸殘基而成；該輕鏈可變區序列係包含序列編號66所示之胺基酸序列之第21至134個胺基酸殘基而成。
[12] 如申請專利範圍第6項之抗體或該抗體之機能性片段，其係包含：重鏈序列及輕鏈序列；該重鏈序列係包含序列編號42所示之胺基酸序列之第20至471個胺基酸殘基而成；該輕鏈序列係包含序列編號28所示之胺基酸序列之第21至239個胺基酸殘基而成。
[13] 如申請專利範圍第6項之抗體或該抗體之機能性片段，其係包含：重鏈序列及輕鏈序列；該重鏈序列係包含序列編號70所示之胺基酸序列之第20至471個胺基酸殘基而成；該輕鏈序列係包含序列編號52所示之胺基酸序列之第21至239個胺基酸殘基而成。
[14] 如申請專利範圍第6項之抗體或該抗體之機能性片段，其係包含：重鏈序列及輕鏈序列；該重鏈序列係包含序列編號70所示之胺基酸序列之第20至471個胺基酸殘基而成；該輕鏈序列係包含序列編號58所示之胺基酸序列之第21至239個胺基酸殘基而成。
[15] 如申請專利範圍第6項之抗體或該抗體之機能性片段，其係包含：重鏈序列及輕鏈序列；該重鏈序列係包含序列編號70所示之胺基酸序列之第20至471個胺基酸殘基而成；該輕鏈序列係包含序列編號62所示之胺基酸序列之第21至239個胺基酸殘基而成。
[16] 如申請專利範圍第6項之抗體或該抗體之機能性片段，其係包含：重鏈序列及輕鏈序列；該重鏈序列係包含序列編號70所示之胺基酸序列之第20至471個胺基酸殘基而成；該輕鏈序列係包含序列編號66所示之胺基酸序列之第21至239個胺基酸殘基而成。
[17] 如申請專利範圍第1至16項中任一項之抗體之機能性片段，其中選自於Fab、F(ab’)₂、Fab’、及Fv而成之群組。
[18] 一種醫藥組成物，其特徵為：含有如申請專利範圍第1至17項中任一項之抗體或該抗體之機能性片段之至少任一者。
[19] 如申請專利範圍第18項之醫藥組成物，其係用於癌治療及/或預防。
[20] 一種癌治療及/或預防用之醫藥組成物，其特徵為：含有如申請專利範圍第1至17項之抗體或該抗體之機能性片段之至少任一者、及選自於紫杉醇(paclitaxel)、卡鉑定(carboplatin)、CPT-11、或長春花鹼(vinblastin)而成之群組之至少任一者。
[21] 如申請專利範圍第19或20項之醫藥組成物，其中癌係選自於肺癌、前列腺癌、甲狀腺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、大腸癌、乳癌、胰臟癌、子宮癌、黑色素瘤、神經膠母細胞瘤、及血癌而成之群組。
[22] 一種癌治療及/或預防方法，其特徵為：投予如申請專利範圍第1至17項之抗體或該抗體之機能性片段之至少任一者。
[23] 一種癌治療及/或預防方法，其特徵為：同時或連續投予如申請專利範圍第1至17項之抗體或該抗體之機能性片段之至少任一者、及選自於紫杉醇、卡鉑定、CPT-11、長春花鹼、及5-FU而成之群組之至少任一者。
[24] 如申請專利範圍第22或23項之治療及/或預防方法，其中癌係選自於肺癌、前列腺癌、甲狀腺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、大腸癌、乳癌、胰臟癌、腎臟癌、子宮癌、黑色素瘤、纖維肉瘤、神經膠母細胞瘤、及血癌而成之群組。
[25] 一種多核苷酸，其係編碼如申請專利範圍第2、4或6至16項中任一項之抗體。
[26] 如申請專利範圍第25項之多核苷酸，其係包含：包含序列編號19所示之核苷酸序列之第58至423個核苷酸而成之核苷酸序列、及包含序列編號15所示之核苷酸序列之第61至402個核苷酸而成之核苷酸序列。
[27] 如申請專利範圍第25項之多核苷酸，其係包含：包含序列編號19所示之核苷酸序列之第58至1413個核苷酸而成之核苷酸序列、及包含序列編號15所示之核苷酸序列之第61至717個核苷酸而成之核苷酸序列。
[28] 如申請專利範圍第25項之多核苷酸，其係包含：(a)選自於以下之核苷酸序列而成之群組之核苷酸：a1)包含序列編號41所示之核苷酸序列之第58至423個核苷酸而成之核苷酸序列；a2)包含序列編號69所示之核苷酸序列之第58至423個核苷酸而成之核苷酸序列；a3)下列核苷酸序列，該核苷酸序列係保有與包含選自於a1)或a2)之核苷酸序列互補之核苷酸序列而成之多核苷酸，於嚴格條件下進行雜交之多核苷酸；a4)選自於a1)或a2)之核苷酸序列中，1至數個核苷酸已經取代、缺失或附加之核苷酸序列；及(b)選自於以下之核苷酸序列而成之群組之核苷酸：b1)包含序列編號27所示之核苷酸序列之第61至402個核苷酸而成之核苷酸序列；b2)包含序列編號51所示之核苷酸序列之第61至402個核苷酸而成之核苷酸序列；b3)包含序列編號57所示之核苷酸序列之第61至402個核苷酸而成之核苷酸序列；b4)包含序列編號61所示之核苷酸序列之第61至402個核苷酸而成之核苷酸序列；b5)包含序列編號65所示之核苷酸序列之第61至402個核苷酸而成之核苷酸序列；b6)下列核苷酸序列，該核苷酸序列係保有與包含選自於b1)至b5)之任一核苷酸序列互補之核苷酸序列而成之核苷酸於嚴格條件下進行雜交之核苷酸；b7)選自於b1)至b5)之任一核苷酸序列中，1至數個核苷酸已經取代、缺失或附加之核苷酸序列。
[29] 如申請專利範圍第28項之多核苷酸，其係包含：下列多核苷酸，該多核苷酸係包含：包含序列編號41所示之核苷酸序列之第58至423個核苷酸而成之核苷酸序列而成、及下列多核苷酸，該多核苷酸係包含：包含序列編號27所示之核苷酸序列之第61至402個核苷酸而成之核苷酸序列而成。
[30] 如申請專利範圍第28項之多核苷酸，其係包含：下列多核苷酸，該多核苷酸係包含：包含序列編號69所示之核苷酸序列之第58至423個核苷酸而成之核苷酸序列而成、及下列多核苷酸，該多核苷酸係包含：包含序列編號51所示之核苷酸序列之第61至402個核苷酸而成之核苷酸序列而成。
[31] 如申請專利範圍第28項之多核苷酸，其係包含：下列多核苷酸，該多核苷酸係包含：包含序列編號69所示之核苷酸序列之第58至423個核苷酸而成之核苷酸序列而成、及下列多核苷酸，該多核苷酸係包含：包含序列編號57所示之核苷酸序列之第61至402個核苷酸而成之核苷酸序列而成。
[32] 如申請專利範圍第28項之多核苷酸，其係包含：下列多核苷酸，該多核苷酸係包含：包含序列編號69所示之核苷酸序列之第58至423個核苷酸而成之核苷酸序列而成、及下列多核苷酸，該多核苷酸係包含：包含序列編號61所示之核苷酸序列之第61至402個核苷酸而成之核苷酸序列而成。
[33] 如申請專利範圍第28項之多核苷酸，其係包含：下列多核苷酸，該多核苷酸係包含：包含序列編號69所示之核苷酸序列之第58至423個核苷酸而成之核苷酸序列而成、及下列多核苷酸，該多核苷酸係包含：包含序列編號65所示之核苷酸序列之第61至402個核苷酸而成之核苷酸序列而成。
[34] 如申請專利範圍第28項之多核苷酸，其係包含：下列多核苷酸，該多核苷酸係包含：包含序列編號41所示之核苷酸序列之第58至1413個核苷酸而成之核苷酸序列而成、及下列多核苷酸，該多核苷酸係包含：包含序列編號27所示之核苷酸序列之第61至717個核苷酸而成之核苷酸序列而成。
[35] 如申請專利範圍第28項之多核苷酸，其係包含：下列多核苷酸，該多核苷酸係包含：包含序列編號69所示之核苷酸序列之第58至1413個核苷酸而成之核苷酸序列而成、及下列多核苷酸，該多核苷酸係包含：包含序列編號51所示之核苷酸序列之第61至717個核苷酸而成之核苷酸序列而成。
[36] 如申請專利範圍第28項之多核苷酸，其係包含：下列多核苷酸，該多核苷酸係包含：包含序列編號69所示之核苷酸序列之第58至1413個核苷酸而成之核苷酸序列而成、及下列多核苷酸，該多核苷酸係包含：包含序列編號57所示之核苷酸序列之第61至717個核苷酸而成之核苷酸序列而成。
[37] 如申請專利範圍第28項之多核苷酸，其係包含：下列多核苷酸，該多核苷酸係包含：包含序列編號69所示之核苷酸序列之第58至1413個核苷酸而成之核苷酸序列而成、及下列多核苷酸，該多核苷酸係包含：包含序列編號61所示之核苷酸序列之第61至717個核苷酸而成之核苷酸序列而成。
[38] 如申請專利範圍第28項之多核苷酸，其係包含：下列多核苷酸，該多核苷酸係包含：包含序列編號69所示之核苷酸序列之第58至1413個核苷酸而成之核苷酸序列而成、及下列多核苷酸，該多核苷酸係包含：包含序列編號65所示之核苷酸序列之第61至717個核苷酸而成之核苷酸序列而成。
[39] 一種載體，其係包含：如申請專利範圍第25至38項中之任一核苷酸。
[40] 一種經轉形宿主細胞，其係包含：如申請專利範圍第25至38項中之任一核苷酸。
[41] 一種經轉形宿主細胞，其係包含：如申請專利範圍第39項之載體。
[42] 一種如申請專利範圍第2、4或6至16項之抗體之生產方法，其係包含：將如申請專利範圍第40或41項之宿主細胞予以培養，並自培養產物純化抗體之步驟。
[43] 一種抗體或該抗體之機能性片段序列。其特徵為：與下述抗體結合於相同之抗原決定部位，該抗體係包含：包含編號20所示之胺基酸序列之第20至471個胺基酸殘基而成之重鏈序列、及包含序列編號16所示之胺基酸序列之第21至239個胺基酸殘基而成之輕鏈序列而成。
[44] 一種抗體或該抗體之機能性片段序列，其特徵為：與下述抗體競爭，該抗體係包含：包含編號20所示之胺基酸序列之第20至471個胺基酸殘基而成之重鏈序列、及包含序列編號16所示之胺基酸序列之第21至239個胺基酸殘基而成之輕鏈序列而成。
[45] 如申請專利範圍第43或44項之抗體或該抗體之機能性片段，其中經由木瓜酵素消化所製備之Fab片段係與序列編號23所記載之重組蛋白質之第26個之甘胺酸殘基、第34個之異白胺酸殘基、第36個之麩胺酸殘基、第37個之天冬胺酸殘基、第38個之甘胺酸殘基、第56個之天冬胺酸殘基、第57個之白胺酸殘基、第58個之白胺酸殘基、第59個之苯丙胺酸殘基、第61個白胺酸殘基、及第62個之精胺酸殘基，以4以內之距離相鄰接。
[46] 如申請專利範圍第45項之抗體或該抗體之機能性片段，其中構成序列編號23所記載之重組蛋白質之各胺基酸殘基與Fab片段間之距離，係經由使用X射線繞射數據之複合體結構分析而決定。

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法律状态:

优先权:

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申请号 | 申请日 | 专利标题

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JP2010243549||2010-10-29||

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