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    本發明提供(例如)用於治療免疫與發炎病症(包括腫瘤及癌症)之調節細胞激素活性的方法。本發明亦提供投與IL-33及IL-33受體之激動劑或拮抗劑之方法。
    公开号:TW201304802A
    申请号:TW101117025
    申请日:2005-02-16
    公开日:2013-02-01
    发明作者:Jochen Schmitz；Martin Oft；Robert A Kastelein；J Fernando Bazan
    申请人:Schering Corp；
    IPC主号:G01N33-00
    专利说明:
    調節細胞激素活性之方法及相關藥劑
    本發明通常而言係關於哺乳動物細胞激素之用途。更特定而言，本發明揭示使用IL-33，及IL-33之受體的方法。
    免疫系統保護個體避免傳染媒介(例如，細菌、多細胞有機體、以及癌症)。該系統包括數類淋巴及骨髓細胞諸如單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞(DC)、嗜酸性細胞、T細胞、B細胞，及嗜中性細胞。該等淋巴及骨髓細胞經常生成已知為細胞激素之訊號蛋白。免疫反應包括發炎，意即，全身或於身體特定位置中之免疫細胞的積聚。為反應傳染媒介或外來物質，免疫細胞分泌細胞激素，該細胞激素(依次)調節免疫細胞之增生、生長、分化，或轉移。免疫反應有時導致病理結果，即是，發炎病症。該等發炎病症(其涉及免疫細胞與細胞激素)包括(例如)牛皮癬、類風濕性關節炎、克羅恩氏症(Crohn's disease)、多發性硬化，及動脈粥樣硬化(參見例如Abbas，等人。(eds.)(2000)Cellular and Molecular Immunology,W.B.Saunders Co.,Philadelphia,PA；Oppenheim與Feldmann(eds.)(2001)Cytokine Reference,Academic Press,San Diego,CA；Kaufmann，等人。(2001)Immunobiol.204：603-613；Saurez與Schultz-Cheery(2000)Dev.Comp.Immunol.24：269-283；van Reeth與Nauwynck(2000)Vet.Res.31：187-213；Garcia-Sastre(2001)Virology 279：375-384；Katze，等人(2002)Nat.Rev.Immunol.2：675-687；van Reeth(2000)Vet.Microbiol.74：109-116；Tripp(2003)Curr.Pharm.Des.9：51-59)。
    細胞激素之介白素-1(IL-1)族對發炎病症及增生性症狀(例如，關節炎與癌症)之病理學有影響。IL-1族之細胞激素包括IL-1α、IL-1β、IL-1δ、IL-1ε、基本纖維原細胞增長因子、IL-18、CREG及CREG2。IL-1α與IL-1β作為31 kDa多肽而生化合成，將該等多肽進一步處理為成熟17 kDa形態，而IL-1δ與IL-1ε看來不擁有明顯前形式(參見例如Debets，等人。(2001)J.Immunol.167：1440-1446；McMahon，等人。(1997)J.Biol.Chem.272：28202-28205；Irikura，等人。(2002)New Engl.J.Med.169：393-398；Kim，等人。(2002)J.Biol.Chem.277：10998-11003)。
    IL-1族亦包括IL-1受體，意即，IL-1RI、IL-1RII、及IL-1R附屬蛋白(分別a.k.a.IL-1R1、IL-1R2，及IL-1R3)。IL-1α與IL-1β藉由與IL-1R1結合而觸發細胞訊號，而IL-1RII可作為吸收循環配位子之分子而運行。IL-1受體拮抗劑(IL-1Ra)(另一IL-1族之蛋白)與IL-1受體結合而未傳輸訊號且用作IL-1之抑制劑。IL-1ra與IL-1δ於經受體在對抗訊號中起類似作用，意即，IL-1ra經由IL-1R1對抗IL-1α調節之訊號，而IL-1δ經由IL-1R6對抗IL-1ε調節之訊號(參見例如You，等人。(2001)New Engl.J.Med.193：101-109)。Debets，等人。(2001)J.Immunol.167：1440-1446；Apte與Voronov(2002)Sem.Cancer Biol.12：277-290；Wong，等人。(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：227-232)。
    IL-1族成員於發炎症狀中(例如，類風濕性關節炎、牛皮癬、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、膿毒症，及發炎腸病(IBD))起作用。類風濕性關節炎(RA)為特徵係關節(例如，滑膜、軟骨，及骨骼)退化的常見慢性發炎病症。該病症發作於總人口之1%中且無法治癒。IL-1刺激了許多涉及關節發炎之細胞，例如纖維原細胞、破骨細胞、軟骨細胞，及嗜中性細胞，該等細胞可能表現出異常增生且釋放出導致關節破壞之酶(參見例如Debets，等人。(1997)J.Immunol.158：2955-2963；Lacey，等人。(2003)Arthritis Rheum.48：103-109；Chung(2001)Eur.Resp.J.Suppl.34：50s-59s；Freeman與Buchman(2001)Expert Opin.Biol.Ther.1：301-308；Dinarello(2000)Chest 118：503-508).Krause，等人。(2002)J.Immunol.169：6610-6616；Choy與Panayi(2001)New Engl.J.Med.344：907-916；Woolley(2003)New Engl.J.Med.348：1709-1711；Williams，等人(2000)New Engl.J.Med.164：7240-7245；Feldmann與Maini(2001)Annu.Rev.Immunol.19：163-196；Lacey，等人.，如上；Niki，等人。(2001)J.Clin.Invest.107：1127-1135；Attur，等人。(2000)J.Biol.Chem.51：40307-40315)。
    增生性病症為美國第二大導致死亡之普通原因(Anderson(2002)National Vital Statistics Reports 50：1-86；Toribara與Sleisenger(2003)New Engl.J.Med.332：861-867；Janne與Mayer(2000)New Engl.J.Med.342：1960-1968；Fuchs與Mayer(1995)New Engl.J.Med.333：32-41)。IL-1族之細胞激素已涉及於增生性病症(意即，癌症)之控制與病理學中。IL-1藉由(例如)改變細胞週期素依賴激酶及細胞週期素依賴激酶抑制蛋白之表現而調節了細胞週期之前進速度。高劑量之IL-1β促進了腫瘤擴散，而低劑量可促進腫瘤之免疫根除(見(例如)Zeisler，等人。(1998)Eur.J.Cancer 34：931-933；Yoshida，等人。(2002)Brit.J.Cancer 86：1396-1400；Nesbit，等人。(1999)Oncogene 18：6469-6476；Dinarello，等人。(1998)J.Leuko.Biol.63：658-664；Apte與Voronov，如上；Saijo，等人。(2002)New Engl.J.Med.169：469-475；Murai，等人。(2001)J.Biol.Chem.276：6797-6806；Koudssi，等人.(1998)J.Biol.Chem.273：25796-25803；Zeki，等人。(1999)J.Endocrinol.160：67-73；Osawa，等人。(2000)J.Biochem.127：883-893)。
    對於治療發炎及免疫病症存在未滿足之需要。本發明藉由提供使用IL-33或IL-33受體之激動劑與拮抗劑之方法實現了該需要。
    本發明部分基於一發現，該發現為IL-33或IL-33受體(先前已知為IL-100及IL-100受體)之激動劑或拮抗劑調節許多免疫與發炎病症之反應。
    本發明提供一種調節免疫病症或症狀之方法，其包含投與有效量之IL-33或IL-33R錯合物之激動劑或拮抗劑。本發明亦提供如上之方法，其中該病症或症狀包含：a)先天反應；b)哮喘或過敏症；c)多發性硬化；d)發炎腸病；e)關節炎；f)傳染；g)癌症或腫瘤。本發明進一步提供如上之方法，其中該傳染包含：a)細胞內病原體；b)細菌；c)寄生蟲；或d)病毒，及如上之方法，其中該細胞內病原體為：a)利什曼原蟲；b)分支桿菌；c)利斯特菌；d)弓形蟲；e)血吸蟲或f)呼吸道病毒。此外，本發明提供如上之方法，其中該免疫病症或症狀包含TH1-型反應或TH2-型反應；及如上之方法，其中該TH2-型反應包含TH2-型反應中之早期事件；以及如上之方法，其中該關節炎包含類風濕性關節炎；骨關節炎；或牛皮癬性關節炎。
    於另一實施例中，本發明提供如上之方法，其中該激動劑包含IL-33或核酸；以及如上之方法，其中該核酸將IL-33編碼；及如上之方法，其中該拮抗劑包含來自與IL-33或IL-33、T1/ST2及SIGIRR(IL-33R)之錯合物特定結合的抗體之結合組合物。於又一實施例中，本發明提供如上之方法，其中來自抗體之結合組合物包含多株抗體；單株抗體；人源化抗體，或其片段；Fab、Fv，或F(ab')2片段；抗體之肽擬似物；或可偵測標記物。本發明亦提供如上之方法，其中該拮抗劑包含a)可溶性IL-33R；b)小分子；或c)核酸；及如上之方法，其中該核酸特定而言與將IL-33編碼之多核苷酸雜交；以及如上之方法，其中該核酸包含反義核酸或小干擾RNA(siRNA)。
    於另一態樣中，本發明提供一種調節血細胞數量之方法，該方法包含投與有效量之IL-33之激動劑或拮抗劑；及如上之方法，其中該IL-33激動劑增加總白血球；嗜中性細胞；淋巴細胞；或嗜酸性細胞之數量；以及如上之方法，其中該IL-33拮抗劑增加血小板之數量；及如上之方法，其中該IL-33拮抗劑減少白血球；嗜中性細胞；淋巴細胞；或嗜酸性細胞之總數量。
    本發明之又一態樣提供一種診斷如上注意之免疫症狀或病症的方法，該方法包含將結合組合物與生物樣本接觸(其中該結合化合物特定地與IL-33結合)，及量測或測定組合物與生物樣本之結合的具體結合度。本發明亦提供一種用於請求項1之免疫症狀或病症的診斷之套組，其包含一容器及一特定地與IL-33；IL-33R錯合物；IL-33及IL-33R之錯合物；或將IL-33編碼之核酸結合之結合組合物。
    如本文(包括附屬申請專利範圍)所使用，單詞之單數形式諸如"一"、"一個"，及"此"包括其相應複數參照，除非本文另行明確指出。
    所有本文引用之參考案本文以引用之方式併入本文中，該引用之程度如同已特定地及個別地將各個公開案或專利申請案以引用之方式併入一般。 I.定義
    "活化"、"刺激"與"治療"(如其應用於細胞或受體)可具有相同之含義(例如，具有配位子之細胞或受體的活化、刺激，或治療)，除非由本文或明確另行指出。"配位子"包括天然與合成配位子，例如，細胞激素、細胞激素變體、類似物、突變蛋白，及衍生自抗體之結合組合物。"配位子"亦涵蓋小分子，例如，細胞激素之肽擬似物及抗體之肽擬似物。"活化"可意謂如由內部機制以及由外部或環境因素所調節之細胞活化。例如細胞、組織、器官，或有機體之"反應"涵蓋生化或生理行為(例如，生物代謝區中之濃度、密度、黏附力，或移動、基因表現之速率、分化之狀態、)中之變化，其中變化與活化、刺激、或治療相聯繫，或與內部設計諸如遺傳編程相聯繫。
    分子之"活性"可描述為或係指分子與配位子或受體之結合度(對於催化活性)；刺激基因表現或基因訊號分化，或成熟之能力(對於抗原活性)；其它分子之活性的調節，及類似之能力。分子之"活性"亦可係指調節或保持細胞-細胞相互作用(例如，黏附)之活性，或於保持細胞結構(例如，細胞膜或細胞骨架)之活性。"活性"亦可意謂特定活性，例如，[催化活性]/[mg蛋白]，或[免疫學活性]/[mg蛋白]、生物代謝區中之濃度，及類似物。"增生活性"包括一種活性，其促進(為其需要)，或其特定而言與(例如)普通細胞分裂以及癌症、腫瘤、發育不良、細胞轉化、轉移及血管生成相關。
    "投藥"與"治療"(當其應用IL-33之激動劑或拮抗劑於(例如)動物、人類、實驗對象、細胞、組織、器官，或生物體液的投藥時)意謂外來之醫藥、治療、診斷藥劑、化合物，或組合物與動物、人類、對象、細胞、組織、器官，或生物體液之接觸。"投藥"與"治療"可係指(例如)治療、安慰治療、藥物動力學、診斷、研究，及實驗方法。"細胞之治療"涵蓋藥劑與細胞之接觸，以及藥劑與液體之接觸，其中該液體與細胞接觸。"投藥"與"治療"亦意謂(例如)細胞由藥劑、診斷、結合組合物或由另一細胞之活體外(in vitro及ex vivo)治療。"治療"(當其使用於人類、牲畜、或研究對象時)意為治療學治療、預防疾病或預防性量測、研究及診斷應用。"治療"(當其使用於人類、牲畜，或研究對象，或細胞、組織，或器官時)涵蓋IL-33激動劑或IL-33拮抗劑與人類或牲畜、細胞、組織、生理代謝區，或生理體液之接觸。"細胞之治療"亦涵蓋如下情況，其中IL-33激動劑或IL-33拮抗劑與IL-33受體(T1/ST2)(例如於流體相或膠體相中)接觸以及如下之情況，其中激動劑或拮抗劑與液體接觸，例如其中該液體與細胞或受體接觸，但其中並未證明激動劑或拮抗劑與該細胞或受體接觸。
    "結合組合物"係指一分子、小分子、大分子、抗體、其類似物的片段，或可溶性受體，其能夠與對象結合，其中對象為例如IL-33或IL-33R。"結合組合物"亦可係指一分子錯合物(例如非共價錯合物)、離子化分子，及共價或非共價改質分子(例如，由磷酸化、醯化、交聯、環化，或有限裂解所改質，其能夠與目標物結合)。"結合組合物"亦可係指與穩定劑、賦形劑、鹽、緩衝劑、溶劑或添加劑組合的分子，其能夠與目標物結合。"結合"可定義為結合組合物與目標物之聯合，其中該聯合導致結合組合物之正常布朗運動(Brownian motion)的減少，於某些情況中，其中該結合組合物可溶解或懸浮於溶液中。
    "保守改質變體"使用於胺基酸與核酸序列。關於特定之核酸序列，保守改質變體意謂將相同或大體相同之胺基酸序列編碼的核酸或(其中核酸不將胺基酸序列編碼)大體相同之核酸序列。由於遺傳密碼之退化，很多功能相同之核酸可將任何給定之蛋白質編碼。
    對於胺基酸序列，熟習此項技術者將認識到核酸、肽、多肽或蛋白質序列的單獨取代為"保守改質變體"，該取代為取代保守胺基酸的編碼序列中之胺基酸或較小胺基酸百分數。提供功能相似之胺基酸的保護性取代表為此項技術中所習知的。一保守取代之實例為胺基酸於如下群中之一胺基酸至同群中另一胺基酸的交換。(頒予Lee，等人之美國專利第5,767,063號；Kyte與Doolittle(1982)J.Mol.Biol.157：105-132)：(1)疏水性：正亮胺酸、Ile、Val、Leu、Phe、Cys，或Met；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：Asn、Gln、His、Lys、Arg；(5)影響鏈定向之殘基：Gly、Pro；(6)芳香性：Trp、Tyr、Phe；(7)小型胺基酸：Gly、Ala、Ser。
    "衍生"可使用於描述(例如)將肽、低聚肽，或多肽之結構自母體肽、低聚肽，或多肽(諸如抗體)而衍生。在本文中，衍生涵蓋(例如)肽結構，其中肽具有與在母體中發現之序列相同的序列，(例如)其中該肽與母體相同但於母體之N-末端、C-末端，或N-末端與C-末端兩者處具有切斷，或切斷與融合，或僅具有融合。衍生亦意謂肽具有如於母體中發現之相同序列，但具有保守性胺基酸變化，或具有刪除或插入，其中刪除或插入保護肽中母體原有之生物特性。"衍生"涵蓋如下情況，其中肽或多肽使用母體作為起始化合物合成，且其中肽或多肽使用母體之結構作為引導重新合成。
    本發明之IL-33的激動劑或拮抗劑之"有效量"或"治療上有效量"意謂足以改善病症或生理症狀之徵兆或跡象的量或足以允許或促進病症或生理症狀之診斷的量。特定患者或牲畜對象之有效量依賴於諸如待治療之症狀、患者之全面健康狀況、投藥之方法途徑與劑量及副作用之嚴重程度(參見例如頒予Netti等人之美國專利第5,888,530號)的因素而改變。有效量可為避免顯著毒副作用之最大劑量或服藥規定。該作用將由至少5%(通常至少10%、更通常至少20%、最通常至少30%、較佳至少40%、更佳至少50%、最佳至少60%、理想地至少70%、更理想至少80%、且最理想至少90%)而導致診斷量測、參數或可偵測訊號之改進，其中100%定義為由正常對象所顯示之診斷參數(參見例如Maynard，等人。(1996)A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice,Interpharm Press,Boca Raton,FL；Dent(2001)Good Laboratory and Good Clinical Practice,Urch Publ.,London,UK)。
    "外生"係指有機體、細胞或人體(根據本文)外製造之物質。"內生"係指細胞、有機體或人體(根據本文)內製造之物質。
    "病症"係指病理狀態，或與病理狀態相聯繫或偏向於病理狀態之症狀。"傳染病症"係指(例如)由微生物、細菌、寄生體、病毒及類似物引起之病症以及係指對該病症之不適當、無效或病理免疫的反應。"致癌病症"涵蓋癌症、轉化細胞、腫瘤、發育不良、血管生成、轉移及類似病症，以及對病症之不適當、無效或病理免疫的反應。
    "有效量"意謂(例如)IL-33激動劑、IL-33拮抗劑、結合化合物或結合組合物足以改善病症、症狀或生理狀態之徵兆或跡象的量。"有效量"亦關於IL-33激動劑、拮抗劑或結合化合物或組合物足以允許或促進病症、症狀或生理狀態之診斷的量。
    "抑制劑"與"拮抗劑"或"活化劑"與"激動劑"係指(分別地，例如)用於(例如)配位子、受體、輔助因子、基因、細胞、組織，或器官之活化的抑制或活化分子。例如基因、受體、配位子或細胞之調節劑為改變基因、受體、配位子或細胞之活性的分子，其中活性可以該分子之調節特性而活化、抑制、或改變。調節劑可單獨作用，或其可使用輔助因子(例如，蛋白質、金屬離子、或小分子)。抑制劑為減少、阻礙、預防、推遲活化、失活、去敏感化、或向下調節(例如)基因、蛋白質、配位子、受體、或細胞之化合物。活化劑為增加、活化、促進、增強活化、敏感化，或向上調節(例如)基因、蛋白質、配位子、受體或細胞之化合物。抑制劑亦可定義為減少、阻礙、或使組成性活性失活之組合物。"激動劑"為與目標物相互作用以引起或促進目標物活性增加之化合物。"拮抗劑"為與激動劑之作用相反的化合物。拮抗劑預防、減少、抑制或中和激動劑之活性。拮抗劑亦可預防、抑制或減少目標物(例如，目標受體)之組成性活性，儘管其中不存在確定之激動劑。
    為檢查抑制之程度(例如)，包含給定之(例如)蛋白質、基因、細胞或有機體的樣本或檢定以可能之活化劑或抑制劑處理且與無抑制劑之對照樣本比較。對照樣本(意即，未以拮抗劑處理)賦值為100%之相對活性值。抑制當相對於對照組之活化值為約90%或更低時(一般85%或更低、更一般80%或更低、最一般75%或更低、通常70%或更低、更通常65%或更低、最通常60%或更低、一般55%或更低、通常50%或更低、更通常45%或更低、最通常40%或更低、較佳35%或更低、更佳30%或更低、又更佳25%或更低、且最佳低於25%)達到。活化當相對於對照組之活化值為約110%時(通常至少120%、更通常至少140%、更通常至少160%、經常至少180%、更經常至少2倍、最經常至少2.5倍、通常至少5倍、更通常至少10倍、較佳至少20倍、更佳至少40倍、且最佳超過高於40倍)達到。
    活化或抑制中之終點可如下監控。例如細胞、生理體液、組織、器官及動物或人類對象之活化、抑制及處理之反應可由終點監控。終點可包含預定量或百分數之(例如)發炎、致瘤性或細胞失粒或分泌(諸如細胞激素、有毒氧或蛋白酶之釋放)之標誌。終點可包含(例如)預定量之粒子流量或傳輸；細胞移動；細胞黏附；細胞增生；轉移之潛力；細胞分化；及顯型之改變(例如，關於發炎、細胞凋零、轉化、細胞週期或轉移之基因表現的變化)(參見例如Knight(2000)Ann.Clin.Lab.Sci.30：145-158；Hood與Cheresh(2002)Nature Rev.Cancer 2：91-100；Timme，等人。(2003)Curr.Drug Targets 4：251-261；Robbins與Itzkowitz(2002)Med.Clin.North Am.86：1467-1495；Grady與Markowitz(2002)Annu.Rev.Genomics Hum.Genet.3：101-128；Bauer，等人。(2001)Glia 36：235-243；Stanimirovic與Satoh(2000)Brain Pathol.10：113-126)。
    抑制之終點通常為對照組之75%或更低(較佳對照組之50%或更低、更佳對照組之25%或更低、最佳對照組之10%或更低)。通常而言，活化之終點為對照組之至少150%(較佳對照組之至少2倍、更佳對照組之至少4倍、最佳對照組之至少10倍)。
    "表現"係指由特定基因編碼之mRNA或多肽的量測。表現之單位可為(例如)於由細胞、組織、細胞提取物或組織提取物之表現的量測中之mRNA或多肽之分子數量/mg蛋白質、mRNA或多肽之分子數量/細胞的量測。表現之單位可相對為(例如)自對照組與實驗哺乳動物之訊號的比較或與特定用於mRNA或多肽之試劑的訊號對於非特異之試劑的訊號之比較。
    "雜交"通常當經至少約30個核苷之伸展後至少約55%之同源(約25個核苷之伸展後至少約75%較佳，且約20個核苷之伸展後至少約90%最佳)時特定或選擇地發生(參見例如Kanehisa(1984)Nucleic Acids Res.12：203-213)。例如在第一核酸至第二核酸之嚴格條件下的雜交為：(1)採用低離子強度與高溫用以洗滌，例如，0.015 M氯化鈉/0.0015 M檸檬酸鈉/0.1%硫酸十二烷基鈉於50℃下；(2)於雜交期間使用變性劑，諸如甲醯胺，例如，50%(體積/體積)甲醯胺與0.1%牛血清蛋白/0.1% Ficoll®(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)/0.1%聚乙烯吡咯啶酮/50 mM磷酸鈉緩衝液於pH值6.5下以750 mM氯化鈉、75 mM檸檬酸鈉於42℃下；(3)使用50%甲醯胺、5 X SSC(0.75 M NaCl、0.075 M檸檬酸鈉)、50 mM磷酸鈉(pH 6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5 X Denhardt氏溶液、超聲波處理之鮭魚精DNA(50 ng/ml)、0.1% SDS、與10%硫酸葡聚糖於42℃下，以於42℃下在0.2X SSC與0.1% SDS中洗滌；或(4)使用10%硫酸葡聚糖緩衝液、2X SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)、與50%甲醯胺於55℃下、繼而於55℃下由含EDTA之0.1X SSC組成之高嚴格度洗滌(頒予Botstein等人之美國專利第6,387,657號)。
    用於核酸之雜交的嚴格條件為鹽、溫度、有機溶劑及離液劑(chaotropic agent)之函數。嚴格溫度條件通常包括超過約30℃之溫度(更通常超過約37℃、一般超過約45℃、更一般超過約50℃、較佳超過約65℃，且更佳超過約70℃)。嚴格鹽條件平常低於約1 M(更平常低於約500 mM、通常低於約400 mM、更通常低於約300 mM、一般低於約200 mM、較佳低於約100 mM，且更佳低於80 mM、甚至低至低於約20 mM)。然而參數之組合較之任何單一參數之量測更為重要(Wetmur與Davidson(1968)J.Mol.Biol.31：349-370)。
    "免疫症狀"或"免疫病症"涵蓋(例如)病理發炎、發炎病症，及自體免疫病症或疾病。"免疫症狀"亦係指傳染、持續性傳染，及增生症狀，諸如癌症、腫瘤，及血管生成(包括抵抗由於根除免疫系統的傳染、腫瘤，及癌症)。"癌症症狀"包括(例如)癌症、癌細胞、腫瘤、血管生成，及癌症前期症狀諸如發育不良。"發炎病症"意謂一病症或病理症狀，其中病理學(全部或部分)由免疫系統細胞數量之改變、移動速率之改變或活化之改變而產生。免疫系統之細胞包括(例如)T細胞、B細胞、單核細胞或巨噬細胞、抗原呈遞細胞(APC)、樹突狀細胞、小膠質細胞、NK細胞、NKT細胞、嗜中性細胞、嗜酸性細胞、肥大細胞，或任何其它與免疫學具體相關聯之細胞(例如，生成細胞激素之內皮或上皮細胞)。
    "發炎病症"意為一病症或病理症狀，其中病理學(全部或部分)由免疫系統細胞數量之增加及/或活化之增加而產生，例如，T細胞、B細胞、單核細胞或巨噬細胞、肺泡巨噬細胞、樹突狀細胞、NK細胞、NKT細胞、嗜中性細胞、嗜酸性細胞，或肥大細胞。
    本文所使用之"IL-33受體"、"IL-33R"，或"IL-33R錯合物"應意謂聯合兩種IL-1R族成員(T1/ST2與SIGIRR)以形成反應於IL-33之刺激的受體錯合物。
    "配位子"係指(例如)小分子、肽、多肽，及膜聯合或膜結合之分子，或彼等之錯合物，其可作為受體之激動劑或拮抗劑而作用。"配位子"亦涵蓋不為激動劑或拮抗劑之試劑，但其可與受體結合而不顯著影響其生物學特性(例如，訊號或黏附)。此外，"配位子"包括膜結合配位子，其可由(例如)化學或重組方法而改變為膜結合配位子之可溶性變體。由慣例，其中配位子膜結合於第一細胞上，受體通常出現於第二細胞上。第二細胞可具有與第一細胞相同或不同之特性。配位子或受體可完全於細胞內，即是，其可駐留於細胞質、核，或某些其它細胞內代謝區內。配位子或受體可改變其位置(例如，自細胞內代謝區至質膜之外表面)。配位子與受體之錯合物被稱為"配位子受體錯合物"。當配位子與受體包括於訊號路徑中時，配位子出現於訊號路徑之上游位置且受體出現於下游位置。
    "第一多肽鏈"與"第二多肽鏈"係指兩條未經由經典肽鍵共同相連之多肽鏈。一般而言，第一多肽鏈包含N-末端與C-末端，且第二多肽鏈包含另一N-末端與另一C-末端，即是，總而言之存在兩個N-末端與兩個C-末端。第一多肽鏈可由第一載體編碼，而第二多肽鏈可由第二因子編碼。第一多肽鏈與第二多肽鏈可由一個載體編碼，其中第一促進劑可與第一多肽鏈操作相連且第二促進劑可與第二多肽鏈操作相連或(於另一實施例中)第一與第二多肽鏈兩者之表現可與相同促進劑操作相連。
    "敏感性"(例如，受體對於配位子之敏感性)意謂配位子與受體之結合導致與受體中或於與受體特定聯合之作用或分子中的可偵測變化(例如，構形改變、磷酸化，與受體相聯合之蛋白質的本性或數量)，或由受體或與受體相關之遺傳表現之變化。
    提供"小分子"用於腫瘤與癌症之生理學及疾病的治療。"小分子"定義為具有小於10 kD分子量(一般而言小於2 kD，且較佳小於1 kD)之分子。小分子包括(但不限於)無機分子、有機分子、含無機組份之有機分子、含放射性原子之分子、合成分子、肽擬似物、及抗體擬似物。作為治療劑，小分子對於細胞可更具有滲透性更不易退化，且較大分子更不易引起免疫反應。描述小分子(諸如抗體與細胞激素之肽擬似物)以及小分子毒素(參見例如Casset等人(2003)Biochem.Biophys.Res.Commun.307：198-205；Muyldermans(2001)J.Biotechnol.74：277-302；Li(2000)Nat.Biotechnol.18：1251-1256；Apostolopoulos等人(2002)Curr.Med.Chem.9：411-420；Monfardini等人(2002)Curr.Pharm.Des.8：2185-2199；Domingues等人(1999)Nat.Struct.Biol.6：652-656；Sato與Sone(2003)Biochem.J.371：603-608；頒予Stewart等人之美國專利第6,326,482號)。
    "可溶性受體"係指為水溶性且出現於(例如)細胞外液體、細胞內液體，或與膜較弱結合之受體。可溶性受體進一步係指設計為水溶性之受體。對於T1/ST2，可溶性或細胞外區域定義為SEQ ID NO：6(人類)之殘基1-337與SEQ ID NO：8(小鼠)之殘基1-342。對於SIGIRR，可溶性或細胞外區域定義為SEQ ID NO：10(人類)之殘基1-118與SEQ ID NO：12(小鼠)之殘基1-117。
    "結合之特異性"、"結合之選擇性"及類似表示法係指預定配位子與預定受體間的結合相互作用，該相互作用使吾人能夠區別預定配位子與其它配位子，或預定受體與其它受體。"特異性"或"選擇性"結合(當係指配位子/受體、抗體/抗原、或其它結合對時)指示一結合反應，其決定蛋白質於異質蛋白質及其它生物製劑中的存在。從而，於指定條件下，特定配位子與特定受體結合且不以顯著量與其它存在於樣本中之蛋白質結合。抗體(或衍生自抗體之抗原結合點的結合組合物)與其抗原以親合力結合，該親合力為與任何其它抗原結合之親合力之至少兩倍以上(較佳至少10倍以上，更佳至少20倍以上，且最佳至少100倍以上)。於一較佳實施例中抗體具有大於約109公升/mol之親合力(參見例如Munsen等人(1980)Analyt.Biochem.107：220-239)。 II.一般情況
    本發明提供用於許多免疫症狀與病症之調節或治療的方法。特定而言，本發明提供IL-33之激動劑與拮抗劑用於(例如)哮喘、過敏症、關節炎，及對於細胞內病原體(諸如寄生蟲)之反應，及對於涉及肉芽瘤之病症(肺結核、肉狀瘤病，及克羅恩氏症)的反應之治療與診斷。
    自然T細胞看來在其表面上未表現T1/ST2，然而表現在分化TH2效應細胞上之與抗原接觸後而引起。使用T1/ST2作為TH2-型T細胞之標記物。T1/ST2亦在肥大細胞及纖維原細胞上表現。
    T1/ST2敲除小鼠之研究表現為說明T1/ST2並未於自然CD4+ T細胞至TH2-型T細胞之分化中起作用，儘管該等結果看來為所使用檢定之本質功能(例如，將病源有機體用於攻毒研究中，或研究TH2-反應之階段)。證據亦說明T1/ST2於TH2-反應中之早期變異中的作用(參見例如Kropf，等人。(2002)Infect.Immunity 70：5512-5520；Hoshino，等人。(1999)J.Exp.Med.190：1541-1547；Senn，等人。(2000)Eur.J.Immunol.30：1929-1938；Townsend，等人。(2000)J.Exp.Med.191：1069-1075)。
    抗-T1/ST2抗體已用於許多處理T1/ST2在免疫功能中之作用的研究中，而其它研究已檢查用以免疫反應之T1/ST2表現動物模型。以抗-T1/ST2抗體處理導致TH2-型免疫反應之減少。抗體抑制嗜酸性細胞之滲透、IL-5之生成，及IgE-之生成。由血吸蟲之傳染激發T1/ST2之向上調節(例如，如評定肺與肝臟肉芽瘤中之表現所測定)。用於哮喘之動物模型(例如，以家塵蟎提取物或以卵清蛋白處理)導致CD4+ T細胞中T1/ST2之表現增長，其指出T1/ST2在過敏或哮喘反應中之作用。BALB/c小鼠之研究顯示以抗-T1/ST2抗體處理引起更高之TH1-型反應，其增強CD4+ T細胞反應IL-12之能力。抗-T1/ST2抗體亦減少歸因於碩大利什曼原蟲傳染，及TH2-型細胞激素減少之表現的損害。一關節炎之動物模型(膠原質引起之關節炎；CIA)由抗-T1/ST2抗體而惡化。特定而言，T1/ST2運行於TH2-型反應之發生中的早期變異中。對於多種過敏原之慢性曝露導致CD4+ T細胞之T1/ST2增長。T1/ST2會影響調節先天反應，相當於抗-T1/ST2抗體加劇脂多糖(LPS)之毒性作用。T1/ST2之抗體亦調節病毒(呼吸道融合瘤病毒)之免疫反應(參見例如Xu，等人。(1998)J.Exp.Med.187：787-794；Lohning，等人。(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：6930-6935；Coyle，等人。(1999)J.Exp.Med.190：895-902；Lohning，等人。(1999)J.Immunol.162：3882-3889；Johnson，等人。(2003)Am.J.Respir.Crit.Care Med.169：378-385；Kropf，等人。(2003)Infect.Immunity 71：1961-1971；Xu，等人。(1998)J.Exp.Med.187：787-794；Kropf，等人。(2002)Eur.J.Immunol.32：2450-2459；Swirski，等人。(2002)J.Immunol.169：3499-3506；Sweet，等人。(2001)J.Immunol.166：6633-6639；Walzl，等人。(2001)J.Exp.Med.193：785-792.)。
    IL-1族成員一般與IL-1受體族之異二聚體成員結合。已顯示另一已知之IL-1R族成員(SIGIRR(單一IgLI-1受體相關蛋白))與TI/ST2錯合以形成IL-33之功能受體錯合物。SIGIRR最初發現為孤立IL-1R成員(參見例如Garlanda，等人。(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.101：3522-3526；Clark，等人。(2003)Genome Res.13：2265-2270；Thomassen等人。(1999)Cytokine 11：389-399；GenBank Accession No.NP_068577；GenBank Accession No.NM_021805；GenBank Accession No.NP_075546；及GenBank Accession No.NM_0230459)。SIGIRR為一廣泛表現之IL-1R受體。
    於沉澱實驗中使用經結合生物素成熟人類IL-33(SEQ ID NO：2之殘基112-270)、T1/ST2-Fc融合，及SIGIRR-Fc融合之，顯示IL-33可與兩種受體融合蛋白結合，然而，IL-33與SIGIRR之結合較之IL-33與T1/ST2結合更弱。為測試一或兩種受體之訊號能力，運行一NF-B-依賴之檢定。TI/ST2與SIGIRR兩者之共表現為既必需又足以於刺激IL-33中活化NF-B訊號與MAP激酶。亦觀察到JNK激酶之活化。 III.激動劑、拮抗劑，及結合組合物
    本發明提供IL-33之激動劑與拮抗劑，包括與IL-33或IL-33受體錯合物(T1/ST2及SIGIRR)特定結合之結合組合物。結合組合物包括抗體、抗體片段，及可溶性受體。本發明涵蓋與IL-33或IL-33R結合之阻斷抗體，或經由IL-33R錯合物刺激訊號之拮抗性抗體。本發明之結合組合物亦包括與將IL-33或IL-33R編碼之核酸(例如，反義核酸及小干擾RNA(siRNA))特定雜交之核酸。亦可使用抗獨特型抗體。人類IL-33由GenBank NM_033439所揭示。增強之抗原性(適宜用以製備抗-IL-33抗體)之區域出現於(例如)GenBank NM_033439之胺基酸1-23；30-38；61-78；84-93；99-106；127-133；139-144；148-158；166-180；196-204；231-237；及252-257處，其根據使用矢量NTI®套組(Informax,Inc,Bethesda,MD)之Parker圖。
    基於該等細胞外區域之受體不限於該等準確N-末端與C-末端胺基酸，而可更長或更短(例如，一、二、三，或更多個胺基酸)，只要基本保持配位子結合特性。亦涵蓋基於可溶性受體之融合蛋白用於促進純化或穩定或用於提供功能域(例如，毒性多肽)。
    可製備單株、多株，及人源化抗體(參見例如Sheperd與Dean(eds.)(2000)Monoclonal Antibodies,Oxford Univ.Press,New York,NY；Kontermann與Dubel(eds.)(2001)Antibody Engineering,Springer-Verlag,New York；Harlow與Lane(1988)Antibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,pp.139-243；Carpenter，等人。(2000)J.Immunol.165：6205；He，等人。(1998)J.Immunol.160：1029；Tang，等人。(1999)J.Biol.Chem.274：27371-27378；Baca，等人。(1997)J.Biol.Chem.272：10678-10684；Chothia，等人。(1989)Nature 342：877-883；Foote與Winter(1992)J.Mol.Biol.224：487-499；頒予Vasquez，等人之美國專利第6,329,511號)。涵蓋抗體之突變蛋白與變體及可溶性蛋白(例如聚乙二醇化或突變形成)以除去或代替去醯胺基化之Asn殘基中。
    抗原之純化對於抗體之產生並非必需。免疫可由DNA載體免疫執行(參見例如Wang，等人。(1997)Virology 228：278-284)。或者，動物可以承受相關抗原的細胞而免疫化。脾細胞可隨後自免疫動物體內分離，且脾細胞可與骨髓瘤細胞株融合以產生融合瘤(Meyaard，等人.(1997)Immunity 7：283-290；Wright，等人。(2000)Immunity 13：233-242；Preston，等人。(1997)Eur.J.Immunol.27：1911-1918)。合成融合瘤可篩選而用於所需抗體之生成，該篩選藉由功能檢定或生物學檢定，即是，不依賴於純化抗原之佔有的檢定而完成。以細胞之免疫對於抗體產生可證明為優於以純化抗原之免疫(Kaithamana，等人。(1999)J.Immunol.163：5157-5164)。
    抗體通常與至少一約10-3 M之KD結合(更通常至少10-6 M、一般至少10-7 M、更一般至少10-8 M、較佳至少約10-9 M、且更佳至少10-10 M，且最佳至少約10-11 M)(參見例如Presta，等人。(2001)Thromb.Haemost.85：379-389；Yang，等人。(2001)Crit.Rev.Oncol.Hematol.38：17-23；Carnahan，等人。(2003)Clin.Cancer Res.(Suppl.)9：3982s-3990s)。
    可製備包含IL-33受體錯合物(T1/ST2與SIGIRR)之細胞外區域之可溶性受體(如細胞質、橫跨膜)，且可識別每一子單元之細胞外區域(參見例如Lecart，等人。(2002)Eur.J.Immunol.32：2979-2987；Mitcham，等人。(1996)J.Biol.Chem.271：5777-5783；且該序列如下列出)。
    可溶性受體可根據標準方法製備與使用(參見例如Jones，等人。(2002)Biochim.Biophys.Acta 1592：251-263；Prudhomme，等人。(2001)Expert Opinion Biol.Ther.1：359-373；Fernandez-Botran(1999)Crit.Rev.Clin.Lab Sci.36：165-224)。本發明亦提供用於siRNA干擾之組合物(參見例如Arenz與Schepers(2003)Naturwissenschaften 90：345-359；Sazani與Kole(2003)J.Clin.Invest.112：481-486；Pirollo，等人。(2003)Pharmacol.Therapeutics 99：55-77；Wang，等人。(2003)Antisense Nucl.Acid Drug Devel.13：169-189)。 IV.治療組合物、方法
    本發明提供用於治療及診斷先天反應、哮喘、過敏症，及關節炎之方法。
    為製備包括IL-33之激動劑或拮抗劑之醫藥或無菌組合物，該藥劑與醫藥上可接受之載劑或賦形劑混合。治療及診斷之試劑的配方可藉由與生理學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑以(例如)凍乾粉末、漿狀物、水溶液、洗液，或懸浮液之形式混合(參見例如Hardman，等人。(2001)Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,NY；Gennaro(2000)Remington：The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams與Wilkins,New York,NY；Avis，等人。(eds.)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms：Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY；Lieberman，等人。(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets,Marcel Dekker,NY；Lieberman，等人。(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Disperse Systems,Marcel Dekker,NY；Weiner與Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY)。
    選擇用於治療劑之投藥方式依賴於數種因素，包括於生物體基質中實體之血清或組織代謝速率、徵兆之水平、實體之免疫原性、對象細胞之可接近性。較佳而言，投藥方式使傳遞至患者之治療劑量最大化，該量與副作用之可接受含量相一致。因此，傳遞之生物藥劑之量部分依賴於特定實體及待治療症狀之嚴重程度。選擇適當劑量之抗體、細胞激素，及小分子之指導是有用的(參見例如Wawrzynczak(1996)Antibody Therapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK；Kresina(ed.)(1991)Monoclonal Antibodies,Cytokines and Arthritis,Marcel Dekker,New York,NY；Bach(ed.)(1993)Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases,Marcel Dekker,New York,NY；Baert，等人。(2003)New Engl.J.Med.348：601-608；Milgrom，等人。(1999)New Engl.J.Med.341：1966-1973；Slamon，等人。(2001)New Engl.J.Med.344：783-792；Beniaminovitz，等人。(2000)New Engl.J.Med.342：613-619；Ghosh，等人。(2003)New Engl.J.Med.348：24-32；Lipsky，等人。(2000)New Engl.J.Med.343：1594-1602)。
    抗體、抗體片段，及細胞激素可由持續灌輸，或由劑量於(例如)每日、每週之間隔，或每週1-7次而提供。劑量可經靜脈內、皮下、局部、經口、鼻腔內、直腸、肌肉內、腦內，或由吸入而提供。較佳之劑量規定為包括防止顯著不良之副作用的最大劑量或劑量頻率之劑量規定。總每週劑量通常而言為至少0.05 μg/kg體重，更通常至少0.2 μg/kg體重，最通常至少0.5 μg/kg體重，一般而言至少1 μg/kg體重，更一般至少10 μg/kg體重，最一般至少100 μg/kg體重，較佳至少0.2 mg/kg體重，更佳至少1.0 mg/kg體重，最佳至少2.0 mg/kg體重，理想地至少10 mg/kg體重，更理想至少25 mg/kg體重，且最理想至少50 mg/kg體重)(參見例如Yang，等人。(2003)New Engl.J.Med.349：427-434；Herold，等人。(2002)New Engl.J.Med.346：1692-1698；Liu，等人。(1999)J.Neurol.Neurosurg.Psych.67：451-456；Portielji，等人。(20003)Cancer Immunol.Immunother.52：133-144)。小分子治療劑(例如，肽擬似物、自然產物，或有機化學藥劑)之所需劑量約為與抗體或多肽的劑量相同(基於莫耳/kg體重)。小分子治療劑之所需離子濃度約為與抗體的濃度相同(基於莫耳/kg體重)。
    用於特殊患者之有效量可依賴於諸如待治療之症狀、患者之整體健康狀況、投藥之方法途徑與劑量及副作用之嚴重程度的因素而變化(參見例如Maynard，等人。(1996)A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice,Interpharm Press,Boca Raton,FL；Dent(2001)Good Laboratory and Good Clinical Practice,Urch Publ.,London,UK)。
    一般牲畜、實驗，或研究對象包括猴、狗、貓、大鼠、小鼠、兔、豚鼠、馬，及人類。
    適當劑量之測定由臨床醫師(例如)使用此項技術中已知或懷疑影響治療或預測為影響治療之參數或因素而確定。通常而言，劑量以略微小於最適宜劑量之量開始且其以較小增量增加，其後直至達到相對於任何消極副作用之所需或最佳效果。重要診斷量測包括對(例如)發炎的徵兆或產生之發炎細胞激素的含量的量測。較佳而言，所用生物體衍生自治療之目標動物的相同種類，從而最小化對於藥劑之體液反應。
    用於第二治療學試劑(例如，細胞激素、類固醇、化學治療劑、抗生素，或放射物)之共投藥或治療方法為此項技術中所熟知(參見例如Hardman，等人。(eds.)(2001)Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,10th ed.,McGraw-Hill,New York,NY；Poole與Peterson(eds.)(2001)Pharmacotherapeutics for Advanced Practice：A Practical Approach,Lippincott,Williams & Wilkins,Phila.,PA；Chabner與Longo(eds.)(2001)Cancer Chemotherapy and Biotherapy,Lippincott,Williams & Wilkins,Phila.,PA)。治療劑之有效量一般而言減少至少10%之徵兆(通常至少20%、較佳至少約30%、更佳至少40%，且至少50%最佳)。
    投藥之途徑為(例如)經局部或皮膚施用，經靜脈內、腹膜內、腦內、肌肉內、眼內、動脈內、腦脊髓內、患處內，或肺部途徑注射或灌輸，或經持續釋放系統或移植物(參見例如Sidman等人。(1983)Biopolymers 22：547-556；Langer，等人。(1981)J.Biomed.Mater.Res.15：167-277；Langer(1982)Chem.Tech.12：98-105；Epstein，等人。(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688-3692；Hwang，等人。(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4030-4034；美國專利第6,350466與6,316,024號)。 V.套組與診斷藥劑
    基於抗體、核酸雜交，及PCR方法之用於發炎病症(例如，牛皮癬、克羅恩氏症、類風濕性關節炎、哮喘或過敏症、動脈粥樣硬化，及癌症)的診斷方法是有用的。
    本發明提供IL-33、其片段、IL-33之核酸，及其片段的多肽，該等多肽在(例如)用於病毒病症(包括流行性感冒A)，及呼吸道及黏膜組織之病毒性病症的診斷之診斷套組中。本發明亦提供用於IL-33之偵測的結合化合物(包括抗體或抗體片段)，及其代謝物與降解產物。一般而言，套組具有一含IL-33多肽或其之抗原片段的容器，此外一結合組合物，或一核酸(諸如核酸探針、引子或分子信標)(參見例如Rajendran，等人。(2003)Nucleic Acids Res.31：5700-5713；Cockerill(2003)Arch.Pathol.Lab.Med.127：1112-1120；Zammatteo，等人。(2002)Biotech.Annu.Rev.8：85-101；Klein(2002)Trends Mol.Med.8：257-260)。
    一診斷方法可包含將取自對象(例如，測試對象)之樣本與同IL-33或IL-33受體之多肽或核酸結合之結合化合物接觸。方法可進一步包含將取自對照組對象、正常對象，或來自測試對象之正常組織或液體的樣本與結合組合物接觸。此外，該方法可另外包含將組合物與測試對象之特定結合與組合物與正常對象、對照組對象，或自測試對象之正常組織或液體之特定結合相對比。測試樣本或測試對象之表現或活性可與對照組樣本或對照組對象相對比。對照組樣本可包含(例如)取自遭受免疫病症之患者體內未受影響或未發炎之組織的樣本。自對照組對象或對照組樣本之表現或活性可作為預定值(例如，來自一對照組對象之令人滿意地適當群)而提供。
    套組可包含(例如)藥劑與容器、藥劑與使用說明，或具有容器之試劑與使用說明。該藥劑可包含IL-33或其抗原片段的激動劑或拮抗劑、結合組合物，或正義及/或反義定向之核酸。用於測定測試化合物(例如，來自生物樣本或來自化合物庫)之結合之套組可包含對照化合物、標記化合物，及用於自結合標記化合物中分離自由標記化合物之方法。對照化合物可包含IL-33或IL-33受體之片段或將IL-33或IL-33受體編碼之核酸。該片段可包含零、一、二，或更多個抗原片段。
    經"標記"之組合物藉由分光鏡、光化學、生物化學、免疫化學，或化學方法而為可偵測(直接或間接)的。例如，有用之標記包括32P、33P、35S、14C、3H、125I、穩定同位素、螢光染料、富電子藥劑、基質、抗原決定部位標記，或酶(例如，如使用於酶連接之免疫分析，或仿氟(fluorette))(Rozinov與Nolan(1998)Chem.Biol.5：713-728)。
    診斷分析可以生物基質(諸如活細胞、細胞提取物、細胞溶胞物、固定細胞、細胞培養物、體液，或法醫樣本)而使用。有用於診斷或套組目的之共軛抗體，包括與染料、同位素、酶，及金屬偶合之抗體，參見例如Le Doussal，等人。(1991)New Engl.J.Med.146：169-175；Gibellini，等人。(1998)J.Immunol.160：3891-3898；Hsing與Bishop(1999)New Engl.J.Med.162：2804-2811；Everts，等人。(2002)New Engl.J.Med.168：883-889。存在不同檢定形式，諸如放射性免疫檢定(RIA)、ELISA，及切片上之實驗(美國專利第6,176,962與6,517,234號)。
    基因表現資料在疾病與病理症狀之診斷與治療中為有用之工具(參見例如Li與Wong(2001)Genome Informatics 12：3-13；Lockhart，等人。(1996)Nature Biotechnol.14：1675-1680；Homey，等人。(2000)J.Immunol.164：3465-3470；Debets，等人。(2000)J.Immunol.165：4950-4956)。 VI.使用
    本發明提供用於發炎與免疫病症(包括對於傳染之不適當或無效反應)之治療與診斷的方法。本發明提供關於例如哮喘、過敏症、關節炎、涉及嗜酸性細胞之病症，及涉及病原或無效TH2-型反應之病症的方法。
    本發明提供用於刺激對抗細菌、寄生蟲，及病毒、細胞內病原體，及癌症與腫瘤之免疫防禦。本發明提供治療細胞內細菌之方法。細胞內細菌種類包括沙門氏菌、志賀氏菌、利斯特菌、弗朗西絲菌、分枝桿菌(肺結核；麻瘋病)、軍團菌、立克次體、東方體、埃立克體、微粒孢子蟲、新立克次體、衣原體，及柯克斯體。此外，IFNγ調節對於寄生蟲(例如，弓形蟲(瘧疾)、弓形蟲、利什曼原蟲、錐體蟲、隱孢子蟲)之反應。本發明提供治療病毒(例如，HIV、原痘病毒(orthopoxviruse)(諸如天花病毒及牛痘病毒(天花))，及疱疹病毒，其包括α疱疹病毒(例如單純疱疹病毒)與β疱疹病毒(例如細胞巨化病毒))之方法。本發明亦提供用於慢性發炎病症之治療的方法(參見例如Kent，等人(2000)Vaccine 18：2250-2256；Ismail，等人。(2002)FEMS Microbiol.Lett.207：111-120；Kaufmann(2001)Nature Revs.Immunol.1：20-30；Goebel與Gross(2001)TRENDS Microbiol.9：267-273；Heussler，等人。(2001)Int.J.Parasitol.31：1166-1176；Luder，等人。(2001)Carsten，等人。(2001)TRENDS Parasitol.17：480-486；Rook，等人。(2001)Eur.Resp.J.17：537-557；Stenger與Rollinghoff(2001)Ann.Rheum.Dis.60：iii43-iii46；Haas，等人。(2002)Am.J.Dermatopathol.24：319-323；Dorman與Holland(2000)Cytokine Growth Factor Revs.11：321-333；Smith，等人.(2002)J.Gen.Virol.83(Pt.12)2915-2931；Cohrs與Gilden(2001)Brain Pathol.11：465-474；Tannenbaum與Hamilton(2002)Sem.Cancer Biol.10：113-123；Ikeda，等人。(2002)Cytokine Growth Factor Revs.13：95-109；Klimp，等人。(2002)Crit.Rev.Oncol.Hematol.44：143-161；Frucht，等人。(2001)TRENDS Immunol.22：556-560)。
    本發明提供治療或診斷增生性症狀或病症之方法，該等症狀或病症為(例如)子宮、宮頸、乳腺、前列腺、睾丸、陰莖、胃腸道(例如，食道、咽喉、胃、小或大腸、結腸，或直腸)、腎、腎細胞、膀胱、骨、骨髓、皮膚、頭或頸、皮膚、肝臟、膽囊、心臟、肺臟、胰腺、唾腺、腎上腺、甲狀腺、腦、神經中樞、中樞神經系統(CNS)與周圍神經系統(PNS)，及免疫系統(例如脾或胸腺)之癌症。本發明提供治療(例如)免疫原腫瘤、非免疫原腫瘤、潛伏性腫瘤、病毒引起之癌症(例如，上皮細胞癌、內皮細胞癌、鱗狀細胞癌、乳頭狀瘤病毒)、腺癌、淋巴瘤、癌、黑色素瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤、畸胎癌、化學藥品引起之癌症、轉移、血管生成。本發明亦涵蓋(例如)藉由調節調整T細胞(Treg)之活性來降低腫瘤細胞或癌細胞抗原之耐受性(參見例如Ramirez-Montagut，等人。(2003)Oncogene 22：3180-3187；Sawaya，等人。(2003)New Engl.J.Med.349：1501-1509；Farrar，等人。(1999)J.Immunol.162：2842-2849；Le，等人。(2001)J.Immunol.167：6765-6772；Cannistra與Niloff(1996)New Engl.J.Med.334：1030-1038；Osborne(1998)New Engl.J.Med.339：1609-1618；Lynch與Chapelle(2003)New Engl.J.Med.348：919-932；Enzinger與Mayer(2003)New Engl.J.Med.349：2241-2252；Forastiere，等人。(2001)New Engl.J.Med.345：1890-1900；Izbicki，等人。(1997)New Engl.J.Med.337：1188-1194；Holland，等人。(eds.)(1996)Cancer Medicine Encyclopedia of Cancer,4th ed.,Academic Press,San Diego,CA)。
    本發明提供用於以IL-33之激動劑或拮抗劑，以至少一種額外之治療或診斷試劑治療增生性症狀、癌症、腫瘤，或癌症前期症狀(諸如發育不良)之方法。至少一種額外之治療學或診斷試劑可選自(例如)細胞激素或細胞激素拮抗劑(諸如干擾素α)，或抗-表皮生長因子受體、阿黴素、表阿黴素、抗-葉酸(例如，甲胺喋呤或氟尿嘧啶)、伊立替康(irinotecan)、環磷醯胺、放射線療法、激素或抗-激素療法(例如，雄性激素、雌性激素、抗雌激素、氟他胺，或己烯雌酚)、外科手術、他莫西芬(tamoxifen)、異環磷醯胺、二溴衛矛醇、烷烴化劑(例如美法侖(melphalan)或順鉑)、依託泊苷、長春瑞賓(vinorelbine)、長春鹼、長春地辛(vindesine)、糖皮質激素、組織胺受體拮抗劑、血管生成抑制劑、放射線、放射線感光劑、蒽環黴素(anthracycline)、長春花生物鹼(vinca alkaloid)、紫杉烷(taxane)(例如，紫杉醇及多烯紫杉醇)、細胞週期抑制劑(例如依賴細胞週期之激酶抑制劑)、單株抗體、單株抗體與毒素之錯合物、T細胞佐劑、骨髓移植，或抗原呈遞細胞(例如，樹突狀細胞療法)。疫苗可作為(例如)可溶性蛋白或作為將蛋白編碼之核酸提供(參見例如Le，等人.，如上；Greco and Zellefsky(eds.)(2000)Radiotherapy of Prostate Cancer,Harwood Academic,Amsterdam；Shapiro與Recht(2001)New Engl.J.Med.344：1997-2008；Hortobagyi(1998)New Engl.J.Med.339：974-984；Catalona(1994)New Engl.J.Med.331：996-1004；Naylor與Hadden(2003)Int.Immunopharmacol.3：1205-1215；The Int.Adjuvant Lung Cancer Trial Collaborative Group(2004)New Engl.J.Med.350：351-360；Slamon，等人。(2001)New Engl.J.Med.344：783-792；Kudelka，等人。(1998)New Engl.J.Med.338：991-992；van Netten，等人。(1996)New Engl.J.Med.334：920-921)。
    許多用於記錄發炎病症(例如牛皮癬、克羅恩氏症，及類風濕性關節炎)之生物標誌物及方法可用(參見例如Bresnihan(2003)Arthritis Res.Ther.5：271-278；Barnero與Delmas(2003)Curr.Opin.Rheumatol.15：641-646；Gionchetti，等人。(2003)Dig.Dis.21：157-167；Wiik(2002)Autoimmune Rev.1：67-72；Sostegni，等人。(2003)Aliment Pharmacol.Ther.17(Suppl.2)：11-17)。
    亦描述用於記錄癌症之生物標誌物及方法(Alison(ed.)(2001)The Cancer Handbook,Grove's Dictionaries,Inc.,St.Louis,MO；Oldham(ed.)(1998)Principles of Cancer Biotherapy,3rd.ed.,Kluwer Academic Publ.,Hingham,MA；Thompson，等人。(eds.)(2001)Textbook of Melanoma,Martin Dunitz,Ltd.,London,UK；Devita，等人。(eds.)(2001)Cancer：Principles and Practice of Oncology,6th ed.,Lippincott,Phila,PA；Holland，等人。(eds.)(2000)Holland-Frei Cancer Medicine,BC Decker,Phila.,PA；Garrett與Sell(eds.)(1995)Cellular Cancer Markers,Humana Press,Totowa,NJ；MacKie(1996)Skin Cancer,2nd ed.,Mosby,St.Louis；Moertel(1994)New Engl.J.Med.330：1136-1142；Engleman(2003)Semin.Oncol.30(3 Suppl.8)：23-29；Mohr，等人。(2003)Onkologie 26：227-233)。
    本發明之廣闊範疇以如下實例來理解最佳，其並不將本發明限制於具體實施例。 實例 I.一般方法
    描述生物化學及分子生物學中之標準方法(參見例如Maniatis，等人。(1982)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Sambrook與Russell(2001)Molecular Cloning,3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Wu(1993)Recombinant DNA,Vol.217,Academic Press,San Diego,CA).標準方法亦出現於Ausbel，等人。(2001)Current Protocols in Molecular Biology,Vols.1-4,John Wiley與Sons,Inc.New York,NY中，其描述細菌細胞中之選殖及DNA之突變形成(Vol.1)、哺乳動物細胞及酵母中之選殖(Vol.2)、糖共軛及蛋白質表現(Vol.3)及生物信息學(Vol.4)。
    描述包括免疫沉澱、層析法、電泳、離心法，及結晶之用於蛋白質之純化的方法(Coligan，等人。(2000)Current Protocols in Protein Science,Vol.1,John Wiley與Sons,Inc.,New York)。描述化學分析、化學修飾、轉譯後修飾、融合蛋白之生成、蛋白之糖基化為描述(見(例如)Coligan，等人。(2000)Current Protocols in Protein Science,Vol.2,John Wiley與Sons,Inc.,New York；Ausubel，等人。(2001)Current Protocols in Molecular Biology,Vol.3,John Wiley與Sons,Inc.,NY,NY,pp.16.0.5-16.22.17；Sigma-Aldrich,Co.(2001)Products for Life Science Research,St.Louis,MO；pp.45-89；Amersham Pharmacia Biotech(2001)BioDirectory,Piscataway,N.J.,pp.384-391)。描述用於多株與單株抗體之製備、純化，及破裂的方法(Coligan，等人。(2001)Current Protcols in Immunology,Vol.1,John Wiley與Sons,Inc.,New York；Harlow與Lane(1999)Using Antibodies,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Harlow and Lane，如上)。用於將配位子/受體相互作用特徵化之標準技術有用(參見例如Coligan，等人。(2001)Current Protcols in Immunology,Vol.4,John Wiley,Inc.,New York)。
    用於包括螢光活化細胞分類(FACS)之流式細胞術的方法有用(參見例如Owens，等人。(1994)Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice,John Wiley與Sons,Hoboken,NJ；Givan(2001)Flow Cytometry,2nd ed.；Wiley-Liss,Hoboken,NJ；Shapiro(2003)Practical Flow Cytometry,John Wiley與Sons,Hoboken,NJ)。適用於修飾核酸(包括核酸引子與探針)、多肽及抗體的螢光藥劑用作例如診斷藥劑是有用的(參見例如Molecular Probes(2003)Catalogue,Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR；Sigma-Aldrich(2003)Catalogue,St.Louis,MO)。
    描述免疫系統之組織學的標準方法(參見例如Muller-Harmelink(ed.)(1986)Human Thymus：Histopathology and Pathology,Springer Verlag,New York,NY；Hiatt，等人。(2000)Color Atlas of Histology,Lippincott,Williams，與Wilkins,Phila,PA；Louis，等人。(2002)Basic Histology：Text and Atlas,McGraw-Hill,New York,NY)。
    用於使用動物模型(例如敲除小鼠)之方法，及用於診斷、治療學，及醫藥學試劑之測試、評估，及篩選的細胞基檢定有用(參見例如Car與Eng(2001)Vet.Pathol.38：20-30；Kenyon，等人。(2003)Toxicol.Appl.Pharmacol.186：90-100；Deurloo，等人(2001)Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.25：751-760；Zuberi，等人。(2000)J.Immunol.164：2667-2673；Temelkovski，等人。(1998)Thorax 53：849-856；Horrocks，等人。(2003)Curr.Opin.Drug Discov.Devel.6：570-575；Johnston，等人。(2002)Drug Discov.Today 7：353-363)。
    用於測定(例如)抗原片段、引導序列、蛋白質折疊、功能區域、糖基化位點，及序列比對之軟體包與資料庫為可用(參見例如GenBank,Vector NTI® Suite(Informax,Inc,Bethesda,MD)；GCG Wisconsin Package(Accelrys,Inc.,San Diego,CA)；DeCypher®(TimeLogic Corp.,Crystal Bay,Nevada)；Menne，等人。(2000)Bioinformatics 16：741-742；Menne，等人。(2000)Bioinformatics Applications Note 16：741-742；Wren，等人。(2002)Comput.Methods Programs Biomed.68：177-181；von Heijne(1983)Eur.J.Biochem.133：17-21；von Heijne(1986)Nucleic Acids Res.14：4683-4690)。 II.介白素-100
    人類IL-33之胺基酸序列與IL-1族之其它成員的類似處如下。與IL-1Ra為34%類似；IL-1δ為36%；IL-1F10為36%；IL-1ζ為9%；IL-1F8為32%；IL-1ε為40%；且IL-1F9為31%。
    介白素-100藉由使用計算序列分析法而發現且由與IL-1族成員(分別為IL-1β與IL-18)之二級結構比較而確定為一新穎IL-1族成員。IL-1族成員為免疫系統之高發炎調節劑，其於病原進攻之反應中釋放。識別人類與小鼠之IL-33同族體，以及大鼠與狗之IL-33。基因表現分析顯示，人類IL-33於上皮細胞、平滑肌細胞，及系膜細胞中表現。在IL-1β與TNF-α刺激下，於初級正常人類真皮及肺臟纖維原細胞及於支氣管平滑肌細胞中高度誘導人類IL-33 mRNA含量。IL-33mRNA於牛皮癬皮膚樣本及於肺泡蛋白質沉積症中之表現顯著提高。
    類似於IL-1與IL-18，IL-33無訊號肽。然而，將IL-33製備或分泌為一較大之原前蛋白，該原前蛋白需要充分處理以釋放成熟的、生物活性類型。原前IL-33很可能由卡斯蛋白酶(caspase)處理。吾人於蛋白質序列中識別卡斯蛋白酶斷裂位點且顯示於活體內轉化人類IL-33由重組構成活性之卡斯蛋白酶-1來裂解。為研究IL-33之假定生物學作用，重組蛋白於大腸桿菌中表現且純化。因此，將IL-33基因選殖入pET3a細菌表現因子。重組蛋白之N-末端藉由將IL-33之成熟序列於IL-1β及IL-18對比而選擇以使成熟的、生物學活性蛋白缺乏原域。完全長度蛋白質之胺基酸112被選擇為N-末端胺基酸。重組蛋白於大腸桿菌中表現且純化。進行活體內研究。對於小鼠(C57BL/6J)之重組人類IL-33的腹膜內(IP)注射(劑量為5 μg/日或50 μg/日)於7日後導致劇烈嗜酸性細胞增多及脾腫大。於第3日與第7日測試數種細胞激素之血清中含量。第3日觀察到於50 μg rhIL-33/日之群中IL-5等於10000pg/ml且於5 μg rhIL-33/日之群中等於1000 pg/ml之誘導。於50 μg rhIL-33/日之群中IL-5之血清中含量減少至1100 pl/ml且於5 μg rhIL-33/日之群中減少至500 pg/ml。IL-13之血清中含量於以5 μg或50 μg IL-33/日處理後第7日亦為可探測為30 pg/ml與100 pg/ml(分別地)。於PBS-處理之控制群中探測到無IL-5與IL-13。此外，於IL-33處理之小鼠或於控制群中未探測到IFN-γ、TNF-α、IL-12、IL-10、IL-6、IL-4、IL-2或MCP-1含量提高。
    在50 μg rhIL-33/日IP注射2天後收集肝淋巴細胞。將細胞置於具有2×10e6/ml之培養基的培養皿中且以50 ng/ml PMA與1 μM離子黴素刺激4小時。於後2小時期間，加入Brefelding A(一分泌抑制劑)。細胞對於CD3與NK1.1表面染色且對於IL-5或IL-4細胞內染色且由FACS分析。得自以IL-33處理2日之小鼠的CD3/NK1.1陽性肝淋巴細胞顯示IL-5與IL-4之積聚。該等結果顯示IL-33活化NKT細胞以分泌IL-4與IL-5。
    為測試IL-33是否與NKT細胞結合，將經結合生物素之IL-33用於結合實驗。人類NKT細胞(衍生自PBMC)以Strepdavidin-PE或經結合生物素之rhIL-33與Strepdavidin-PE而培育。經染色之細胞由FACS分析。觀察到rhIL-33與人類NKT細胞之結合。該等結合可與未經結合生物素之rhIL-33競爭。
    IL-1族成員藉由與細胞表面受體相互作用而發揮出彼等之生物學反應。吾人已識別孤立之IL-1受體ST2/T1為IL-33之細胞受體。利用ST2/T1-特異性單株抗體之小鼠肥大細胞株的FACS染色顯示該等肥大細胞株表現ST2/T1受體。該染色可藉由將肥大細胞株以IL-33蛋白培育而特定及依賴劑量完成。
    NKT細胞對於小鼠哮喘模型中之氣道發炎及IL-4與IL-13於過敏原導致之氣道高反應性中的製備較重要。IL-5與IL-13於NKT細胞中由IL-33之誘導顯示IL-33可影響該等疾病之誘導。中和IL-33之治療學抗體的產生可於該等疾病之治療中有益。
    NKT細胞牽涉許多疾病。IL-33作為NKT細胞之調節劑的識別顯示IL-33可影響其它疾病，諸如狼瘡、多發性硬化、惡性腫瘤、氣道發炎及傳染病。由IL-33之Th2細胞激素誘導(諸如IL-5與IL-13)可有助於抵抗微生物傳染之保護或抵抗腫瘤之保護。
    IL-1族成員一般與兩IL-1受體族之不同成員結合以形成完全受體錯合物。IL-33與ST2/T1作為組成IL-33受體之子單元之一的識別使得檢定第二IL-33受體子單元為可能。完全IL-33受體之識別將允許由IL-33引起之生物學反應的詳細識別。
    使用Taqman之實時PCR分析揭示IL-33由許多細胞及組織所表現。本發明提供IL-33之激動劑與拮抗劑，該等試劑用以發炎及自體免疫病症及症狀(例如，牛皮癬、哮喘、過敏症)及發炎性腸病(例如，胃炎、潰瘍性結腸炎、克羅恩氏症、腹腔病症，及大腸急躁症候群)之調節。

    將藉由IL-1β加TNF-α(8小時)之IL-33誘導與以單獨介質之IL-33誘導相比較。於所示之細胞類型中研究誘導(表2)。
    發現活體外轉譯之人類IL-33可由卡斯蛋白酶-1裂解。未經卡斯蛋白酶處理，藉由SDS PAGE之分析顯示約32 kDa之帶，此對應於前-人類IL-33。以卡斯蛋白酶-1於37°下處理1小時導致兩條約相等強度之帶，一條帶對應於前-IL-33，且另一條帶於約20-22 kDa處遷移(成熟人類IL-33)。於37°下處理2小時導致兩條相同的帶，但其中約2/3之蛋白質於約22 kDa處遷移。類似研究證明活體外轉譯之人類IL-33亦可由彈性蛋白酶或由組織蛋白酶G裂解成於約20-22 kDa處遷移之物種，而於所使用之條件下進行MMP-3處理並不會導致裂解。據信IL-33之胺基酸112位於裂解位置，由於與其它IL-1族組員同源其產生成熟IL-33。
    T1/ST2經識別為人類IL-33受體之至少一子單元。T1/ST2之表現如下(表3)。
    於pET3a載體中選殖人類IL-33，且於大腸桿菌中表現。所選殖之蛋白質以胺基酸112開始，且為158個胺基酸之長度(18 kDa)。IPTG用於誘導之表現，且發現蛋白質為水溶性。使用A-管柱及Sephadex凝膠過濾來純化經表現之蛋白質。測試經純化之製劑之內毒素，其中結果證明每微克蛋白質約0.023 EU。藉由SDS PAGE使用非還原條件分析顯示至少95%蛋白質於18 kDa之單一分子量下遷移。
    將IL-33經腹膜內(i.p.)注射入B6/Balb/c小鼠中。使用三組小鼠：(1)以磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)注射；(2)hIL-33(5微克/日)；及(3)hIL-33(50微克/日)。該實驗方案亦涉及包括注射(i.p.)3日(於3日之治療後犧牲)、或注射(i.p.)7日(於7日之治療後犧牲)。執行血液、血清、血塗片、白血球分化、組織學。藉由FACS分析法分析胸腺/脾細胞懸浮液。
    IL-33治療誘導IL-5與IL-13，如藉由量測IL-5與IL13之血清含量所測定(表4)。亦於以IL-33投與之多種器官中量測細胞激素IL-4、IL-5、及IL-13。所測試之器官為胸腺、肺、脾及肝臟。發現誘導了所有該等三種細胞激素，如以IL-33治療治療7日後所測定。兩種含量之IL-33(5與50微克IL-33)中皆發現增加。例如，於肺中，以鹽水處理之IL-4、IL-5，及IL-13表現為約1.0或更低。但以IL-33(50微克)治療，IL-4之表現為8.0；IL-5之表現為11.0；且IL-13之表現為41.0。IL-33治療亦引起血清IgE與IgA之增長。藉由7日治療，IgE含量為30,000 ng/ml(PBS)與17,000 ng/ml(50微克IL-33)。藉由7日治療，IgA含量為90 ng/ml(PBS)與420 ng/ml(50微克IL-33)。IL-33治療亦導致脾腫大，其中於PBS(對照)治療之小鼠體內之脾質量為約80 mg，5微克IL-33治療7日(150 mg脾)、及50微克IL-33治療7日(190 mg脾)。IL-33治療亦於脾中產生髓外造血、及胸腺發育不良(胸腺尺寸減小)、及胸腺皮質之發育不良。

    將轉化與非轉化細胞注射入小鼠中，接著於小鼠中培育細胞一段時期，並取回並純化所注射之細胞，並評定T1/ST2表現(表5)。使用非轉化乳腺細胞及ras-轉化乳腺細胞。藉由將ras-轉化之細胞注射入宿主免疫缺乏之裸小鼠中，ras-轉化之細胞以增加的含量表現T1/ST2，即表現為103(表5)。藉由將ras-轉化之細胞注射入一具有完整免疫系統之宿主小鼠中，取回轉化細胞及Taqman®分析顯示T1/ST2表現之更大的增加。據信，TI/ST2表現之該等增加反映可溶性T1/ST2之增加，其中可溶性T1/ST2充當誘餌。當可溶性T1/ST2充當誘餌時，其結合至IL-33，且抑制宿主產生對抗腫瘤細胞之TH2-型免疫反應。所使用之具有完整免疫系統的宿主小鼠為Xtb小鼠與XBalb小鼠(表6)。可溶型T1/ST2(亦稱為Fit 1)已有描述(例如，參見Bergers等人(1994)EMBO J.13：1176-1188；Reikerstorfer等人(1995)J.Biol.Chem.270：17645-17648)。
    將IL-33投與患有4T1乳癌之小鼠。所投與之IL-33克有效減小腫瘤尺寸(表6)。本發明提供用以治療增生性症狀(包括癌症及腫瘤)之IL-33激動劑，例如IL-33或編碼IL-33之核酸。
    人類組織樣本之Taqman分析顯示於各種癌症(例如，乳癌及卵巢癌)中IL-33減少之表現(表7)。結果指示，腫瘤細胞制止產生IL-33，以避免活化免疫系統，從而產生抗腫瘤反應(表7)。
    IL-33治療延長了實驗性自體免疫腦炎(一多發性硬化之動物模型)。藉由蛋白脂質蛋白(PLP)誘導EAE(Kjellen等人(2001)J.Neuroimmunol.120：25-33；Laman等人。(2001)J.Neuroimmunol.119：124-130；Fife等人(2001)J.Immunol.166：7617-7624)。使用三組小鼠用以注射PBS、0.5微克IL-33、或2.0微克IL-33，自第0日至第12日每日i.p.注射。於第7日至第23日評定疾病記錄(表8)。結果證明，於PBS-治療之小鼠中，疾病自然恢復。然而，藉由以任一劑量之IL-33治療，疾病延長，高於PBS處理中之發現，且其本身保持在介於2.5至3.0之間的疾病記錄(表8)。本發明提供一種用以治療自體免疫病症(包括中樞神經系統之自體免疫病症，例如多發性硬化)之IL-33拮抗劑。
    IL-33治療導致NKT細胞中之IL-5誘導。藉由NK1.1標記物及CD3標記物兩者之存在識別NKT細胞。以PBS或50微克/日之IL-33治療黑色-6小鼠兩日。分離肝臟淋巴細胞，且以PMA離子黴素再次刺激3小時，且以佈雷菲德菌素(brefeldin)再次刺激1小時。結果證明，IL-33在NKT細胞中誘導了IL-5。
    測試抗-T1/ST2抗體結合野生型肥大細胞(WTMC)之能力，及增加的IL-33對該抗體與肥大細胞之結合的影響。加入IL-33消除了抗-T1/ST2抗體結合肥大細胞之能力，從而證明IL-33之受體為T1/ST2。 III. IL-33抗體治療之活體內效應
    使用此項技術中熟知之方法養育抵抗人類IL-33之小鼠單株抗體(見上)。為測試該抗體對抗IL-33活性之能力，在第0日，在Balb/c小鼠中皮下注射0.2 mg抗-IL-33抗體。於第1日，在小鼠中腹膜內注射100 ng mIL-33。於第2日收集血清，且量測IL-5含量。相較於以IL-33單獨治療之小鼠及以同型對照抗體與IL-33治療之小鼠，以抗-IL-33抗體處理導致極小甚至未產生IL-5(參見圖1)。 IV.膠原誘導之關節炎(CIA)之治療
    在已知易患CIA之B10.RIII小鼠中注射於弗氏完全佐劑(Difco)中之II型牛膠原(bovine CII；Sigma)。在小鼠之尾根部上方注射100 μl之1 mg/ml bovine CII乳液。於第21日投與第二促進劑量。藉由下列臨床等級評定小鼠：0=正常；1=一關節/部位為紅色及/或腫脹；2=多於一關節/部位為紅色及/或腫脹；且3=整個爪子為紅色及/或腫脹。CIA誘導之小鼠具有70-90%之疾病發作百分比。
    於第23日以1 mg抗-IL-33抗體或同型對照抗體治療小鼠。每隔7日投與抗體，持續額外兩次治療。抗-IL-33治療之小鼠顯示減少之疾病記錄及更低百分比之疾病發作發生率(參見圖2與3)。抗-IL-33治療之小鼠亦具有更低平均數之患關節炎爪(參見圖4)。 V.實驗性自體免疫腦炎(EAE)之治療
    以50 μg髓磷脂寡突細胞糖蛋白(MOG)肽使C57BL/6小鼠免疫以誘導EAE。疾病之臨床評定記錄如下：1=柔弱尾部；2=後肢虛弱；3=右側無力+單一後肢虛弱；4=右側無力+單一後肢麻痹；5=雙側後肢麻痹；6=雙側後肢麻痹+腹部萎陷；及7=6+垂死。以100 mg抗-IL-33抗體或同型對照抗體經皮下治療EAE小鼠。抗-IL-33治療之小鼠比對照組顯示出更低之疾病記錄及更低疾病發生率(參見圖5與6)。 VI.為識別IL-33R錯合物之沉澱檢定
    以EX-LINK Supho-NHS-Biotin(Pierce)生物素化(biotinylated)IL-33。於500 μl RIPA-溶解緩衝液(Upstate細胞訊號溶液)中以50μl瓊脂糖結合Avidin D(Agarose bound Avidin D)之50%漿料(Vector Laborities)執行2 μg生物素化IL-33之攫取。使用5 μg重組細胞外ST2-Fc(R&D系統)或SIGIRR-Fc(R&D系統)。在4℃下培育一夜後，以3×500 μl RIPA-溶解緩衝液洗滌沉澱物。藉由SDS-Page分離經沉澱之蛋白質，電漬，且藉由西方墨點法/與特定對抗ST2(R&D系統)或SIGIRR(R&D系統)之抗體的ECL反應而可視化。以ST2-Fc或SIGIRR-Fc之生物素化IL-33之沉澱以如上相同之方式執行，僅使用蛋白質G-瓊脂糖凝膠(Amersham Bioscience)代替瓊脂糖結合Avidin D。經由Streptavidin-HRP共軛(Streptavidin-HRP conjugate)(Pierce)及ECL反應使IL-33之存在可視化。 VII. NF-B與MAP激酶之磷酸化
    先前已描述了肥大細胞株WTMC(例如，參見Wright等人(2003).J.Immunol.171：3034-3046.)。於含有完全迷你型蛋白酶抑制劑雞尾酒(Roche)與10 mM Na3VO4之RIPA溶解緩衝液(Upstate)中溶解細胞。藉由SDS-Page分離蛋白質，將其轉移至Immobilon-P膜(Millipore)，且使用磷酸化p65 NF-B、p65 NF-B、磷酸化p44/42 MAP激酶、p44/42 MAP激酶、磷酸化p38 MAP激酶及p38 MAP激酶之抗體(所有抗體來自Cell Signaling Technology)免疫轉漬。 VIII.瞬時轉染與報導基因分析
    接種HEK293FT細胞，然後藉由NF-B.驅動之GFP報導基因構造(pNF-B-hrGFP；Stratagene)及藉由為ST2、或SIGIRR或兩者編碼之多種質體的組合轉染，根據製造商之建議如Fugene-6(Roche)所指示。轉染後分裂細胞24小時。24小時後，不處理細胞或以50 ng/ml濃度之小鼠IL-33刺激。刺激後16小時，藉由FACS分析細胞之GFP表現。
    本文中之所有引用以引用之方式併入本文中，該引用之程度就如同已特定地及個別地將各個單獨公開案、專利申請案，或專利案以包括所有圖及圖表之引用方式併入本文一般。
    對熟習此項技術者顯而易見的是可作出本發明之許多修改及變更以適應特殊情形、材料、物質之組合物、方法、方法步驟或步驟以保持本發明之目的、精神及範疇。所有該等修改係於本文附加之申請專利範圍的範疇內，且未脫離本發明之精神與範疇。本文描述之特定實施例僅由實例來提供，且本發明由附加之申請專利範圍限制，連同該等申請專利範圍授權之等價物的全部範疇；且本發明不受由實例在本文中表現之特定實施例而限制。
    圖1顯示於IL-33+抗-IL-33抗體治療之小鼠對IL-33單獨與同型對照組抗體治療之小鼠中的IL-5生成。
    圖2顯示抗-IL-33與同型對照組治療之小鼠的CIA疾病記錄。
    圖3顯示於抗-IL-33與同型對照組治療之小鼠中CIA之發病率。
    圖4顯示於以抗-IL-33抗體或同型對照組抗體治療之小鼠中患關節炎爪的平均數。
    圖5顯示抗-IL-33與同型對照組治療之小鼠的EAE疾病記錄。
    圖6顯示於抗-IL-33與同型對照組治療之小鼠中EAE之發病率。
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    权利要求:
    Claims (20)
    [1] 一種IL-33或IL-33受體錯合物(IL-33R)之激動劑或拮抗劑之用途，其係用於製造調節免疫病症或症狀之藥物。
    [2] 如請求項1之用途，其中該免疫病症或症狀包含：a)先天反應；b)哮喘或過敏；c)多發性硬化；d)發炎性腸病；e)關節炎；f)傳染；g)癌症或腫瘤。
    [3] 如請求項2之用途，其中該傳染包含：a)細胞內病原體；b)細菌；c)寄生蟲；或d)病毒。
    [4] 如請求項3之用途，其中該細胞內病原體為：a)利什曼原蟲(Leishmania sp.)；b)分支桿菌；c)利斯特菌(Listeria sp.)；d)弓形蟲；e)血吸蟲；或f)呼吸道病毒。
    [5] 如請求項1之用途，其中該免疫病症或症狀包含：a)TH1-型反應；或b)TH2-型反應。
    [6] 如請求項5之用途，其中該TH2-型反應包含TH2-型反應中之早期變異。
    [7] 如請求項2之用途，其中該關節炎包含：a)類風濕性關節炎；b)骨關節炎；或c)牛皮癬性關節炎。
    [8] 如請求項1之用途，其中該激動劑包含：a)IL-33；或b)核酸。
    [9] 如請求項8之用途，其中該核酸編碼IL-33。
    [10] 如請求項1之用途，其中該拮抗劑包含來自一抗體之結合組合物，其中該抗體特定結合於：a)IL-33；b)IL-33R錯合物；或c)IL-33與IL-33R之錯合物。
    [11] 如請求項10之用途，其中該來自一抗體之結合組合物包含：a)多株抗體；b)單株抗體；c)人源化抗體或其片段；d)Fab、Fv、或F(ab')2片段；e)抗體之肽擬似物；或f)可偵測標記。
    [12] 如請求項1之用途，其中該拮抗劑包含：a)可溶性IL-33R；b)小分子；或c)核酸。
    [13] 如請求項12之用途，其中該核酸特定與一編碼IL-33之多核苷酸雜交。
    [14] 如請求項13之用途，其中該核酸包含：a)反義核酸；或b)小干擾RNA(siRNA)。
    [15] 一種IL-33之激動劑或拮抗劑之用途，其係用於製造調節血細胞計數之藥物。
    [16] 如請求項15之用途，其中該IL-33激動劑增加以下細胞之計數：a)全部白血球；b)嗜中性細胞；c)淋巴細胞；或d)嗜酸性細胞。
    [17] 如請求項15之用途，其中該IL-33拮抗劑增加血小板之計數。
    [18] 如請求項15之用途，其中該IL-33拮抗劑減少以下細胞之計數：a)全部白血球；b)嗜中性細胞；c)淋巴細胞；或d)嗜酸性細胞。
    [19] 一種特定結合至IL-33之結合組合物之用途，其係用於製造診斷免疫症狀或病症之藥物。
    [20] 一種用於診斷免疫症狀或病症之套組，其包含一代謝區與一結合組合物，該結合組合物特定結合於：a)IL-33；b)IL-33R錯合物；c)IL-33與IL-33R之錯合物；或d)編碼IL-33之核酸。
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    法律状态:
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    US54573004P| true| 2004-02-17|2004-02-17||
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