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    本發明係有關於一種用以篩選與磷酸酶作用分子之系統及方法，用以篩選與磷酸酶作用分子之螢光蛋白檢測系統，包括：結構次單元；調節次單元；催化次單元；第一螢光蛋白，包括一第一區域、及一第二區域，其中第一區域及第二區域係相互分離，且第一區域係與該結構次單元連接；以及第二螢光蛋白，其中第二螢光蛋白之放射光譜係與第一螢光蛋白之激發光譜重疊。當第一螢光蛋白之第二區域與調節次單元連接時，第二螢光蛋白與催化次單元連接，而當第一螢光蛋白之第二區域與催化次單元連接時，第二螢光蛋白與調節次單元連接。
    公开号:TW201300541A
    申请号:TW101121313
    申请日:2012-06-14
    公开日:2013-01-01
    发明作者:Chi-Wu Chiang；Shu-Ting Mo；Shang-Ju Chiang
    申请人:Univ Nat Cheng Kung；
    IPC主号:C12Q1-00
    专利说明:
    用以篩選與磷酸酶作用分子之系統及方法
    本發明係關於一種用以篩選與磷酸酶作用分子之系統及方法，尤指一種結合雙分子螢光互補作用及螢光共振能量轉移方法之與磷酸酶作用分子之篩選系統。
    磷酸酶(protein phosphatase)係一種用以去磷酸化之酵素，不同於將蛋白質磷酸化之蛋白質激酶(protein kinase)。磷酸酶可區分為酪氨酸磷酸酶(tyrosine phosphatase)和蘇氨酸/絲氨酸磷酸酶(serine/threonine phosphatase)，其中蘇氨酸/絲氨酸磷酸酶可更分為PPM和PPP兩大家族。再者，PPP家族包括PP1、PP2A、PP2B、PP4、PP5、PP6、及PP7；PPM家族包括PP2C和丙酮酸去氫酶(pyruvate dehydrogenase)。
    於生物學中，有許多過程係藉由蛋白質-蛋白質相互作用而產生，因此，這些蛋白質-蛋白質相互作用的特徵和型態變化，即為研究分子機制之重要方向。目前觀察蛋白質-蛋白質相互作用的方法，包括酵母菌雙雜合系統(yeast two-hybrid system)、哺乳類雙雜合系統、共同免疫沉澱法(co-immunoprecipitation)、及親合力色層分析法(pull down assay)等。
    雖然這些方法可以用來確認蛋白質間之相互作用，但仍不清楚次細胞的位置，以及相互作用後之結構轉變。因此，可利用以螢光為基礎的方法來解決上述問題，如雙分子螢光互補(Bimolecular fluorescence complementation,BiFC)及螢光共振能量轉移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)方法。然而，對於有三個次單元之磷酸酶結構，於磷酸酶次單元相互作用之研究中，必須進行兩次以上之BiFC或FRET方法，才能夠確認蛋白質特徵和型態變化。因此，若能發展出一種方法，其係能在活細胞中一次觀察到三個次單元之蛋白質變化情形，將有助於觀察蛋白質相互作用之動態結合與分布狀態，並可應用於新藥之開發。
    本發明之主要目的係在提供一種用以篩選與磷酸酶作用分子之螢光蛋白檢測系統，俾能有助於磷酸酶次單元間之相互作用之研究。
    本發明之另一目的係在提供一種用以篩選與磷酸酶作用分子之方法，俾能有效篩選與磷酸酶次單元有相互作用之分子以應用於新藥開發。
    本發明之用以篩選與磷酸酶作用分子之螢光蛋白檢測系統，包括：一結構次單元；一調節次單元；一催化次單元；一第一螢光蛋白，包括一第一區域、及一第二區域，其中該第一區域及該第二區域係相互分離，且該第一區域係與該結構次單元連接；以及一第二螢光蛋白，其中該第二螢光蛋白之放射光譜係與該第一螢光蛋白之激發光譜重疊；其中，當該第一螢光蛋白之該第二區域與該調節次單元連接時，該第二螢光蛋白係與該催化次單元連接，而當該第一螢光蛋白之該第二區域與該催化次單元連接時，該第二螢光蛋白係與該調節次單元連接。
    於本發明之螢光蛋白檢測系統中，該磷酸酶係為磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)。PP2A係包含結構次單元、調節次單元、及催化次單元，其中結構次單元和催化次單元可以形成一穩定的聚合體作為酵素中心，其佔整個PP2A全酵素結構之三分之一。再者，各種調節次單元再結合至此酵素中心，並決定PP2A之專一性與分佈在細胞中的位置。此外，於磷酸酶2A中，結構次單元一般係以A表示；調節次單元一般係以B表示；且催化次單元一般係以C表示。
    此外，調節次單元可為B家族單元、B’家族單元、B”家族單元、B'''家族單元、或其他分子(例如：腫瘤病毒SV40的t抗原分子(small t)、磷酸化酪氨酸酶活化分子(PTPA))，較佳為B55 β 2及B56 γ 3；其中B55 β 2及B56 γ 3的在細胞中的活性已廣被探討。更詳細而言，B家族單元和細胞分化有關，包括B55 α、B55 β、B55 γ、及B55 δ，其中B55 β 2分佈於粒腺體中並促進細胞凋亡；B’家族單元和細胞週期進展(cell cycle progression)相關，包括B56 α、B56 β、B56 γ、B56 δ、及B56 ε，其中B56 γ 3調節腫瘤抑制基因p53的活性，並往返於細胞核與細胞質間，並提升p27之表現量；B”家族單元參與細胞週期之調控；B'''家族單元係參與於細胞骨架之重組。另外，PP2A同時也是一種腫瘤抑制基因，故本發明之螢光蛋白檢測系統係能應用於開發新穎PP2A調節分子之篩選，以開發癌症或其他PP2A調節失調引發之疾病之治療新藥；其中該分子係為促進或抑制磷酸酶PP2A聚合體形成。
    此外，當該第一螢光蛋白之第一區域為一N端區域時，該第二區域可為一C端區域；當該第一螢光蛋白之第二區域為一N端區域時，該第一區域可為一C端區域。並且，該第一螢光蛋白可為一黃光螢光蛋白，且該黃光螢光蛋白之激發光譜波長可為450-500 nm，較佳為480 nm；放射光譜波長可為500-550 nm，較佳為530 nm。再者，該第二螢光蛋白可為一青藍光螢光蛋白，且藍光螢光蛋白之激發光譜波長可為400-450 nm，較佳為430 nm；放射光譜波長可為450-500 nm，較佳為480 nm。藉此，融合螢光蛋白後的結構變化，係必須分別測試不同的分子以N端區域或C端區域的方向性、或螢光蛋白的N端區域或C端區域融合，以判定為良好之螢光蛋白檢測系統。
    另外，本發明更提供一種用以篩選與磷酸酶作用分子之方法，包括下列步驟：(A)提供一用以篩選與磷酸酶作用分子之螢光蛋白檢測系統，包括：一結構次單元；一調節次單元；一催化次單元；一第一螢光蛋白，包括一第一區域、及一第二區域，其中該第一區域及該第二區域係相互分離，且該第一區域係與該結構次單元連接；以及一第二螢光蛋白，其中該第二螢光蛋白之放射光譜係與該第一螢光蛋白之激發光譜重疊，且當該第一螢光蛋白之該第二區域與該調節次單元連接時，該第二螢光蛋白係與該催化次單元連接，而當該第一螢光蛋白之該第二區域與該催化次單元連接時，該第二螢光蛋白係與該調節次單元連接；(B)將一待測物質與該螢光蛋白檢測系統混合，以得到一混合物；(C)分別以該第一螢光蛋白之激發光照射該混合物、及該螢光蛋白檢測系統，並分別檢測該混合物及該螢光蛋白檢測系統所發出之放射光，當該螢光蛋白檢測系統與該混合物所放出之放射光訊號有差異時，代表該待測物質影響該結構次單元、該調節次單元、及該催化次單元之相互作用。即，利用上述螢光蛋白檢測系統用以篩選與磷酸酶作用分子，其係為促進或抑制磷酸酶PP2A聚合體形成，以應用於開發癌症或其他PP2A調節失調引發之疾病之治療新藥。
    再者，於本發明之用以篩選與磷酸酶作用分子之方法中，當該混合物所放出之放射光訊號大於該螢光蛋白檢測系統時，表示該待測物質可促進該結構次單元、該調節次單元、及該催化次單元之相互作用，且當該混合物所放出之放射光訊號小於該螢光蛋白檢測系統時，表示該待測物質可抑制該結構次單元、該調節次單元、及該催化次單元之相互作用。
    此外，BiFC方法展現靈敏且穩定之螢光表現，但具有反應為不可逆之缺點；FRET方法能顯示蛋白質間之動態結合，但反應受限於蛋白質間之距離。藉此，本發明之篩選與磷酸酶作用分子之螢光蛋白檢測系統與方法，將上述兩方法合併，並捨棄兩者之缺點，發展出一種全新的螢光蛋白檢測系統與方法。因此，透過本發明之檢測系統與方法，其係能在活細胞中一次觀察到三個次單元之蛋白質變化情形，有助於觀察蛋白質相互作用之動態結合與分布狀態，並可有效應用於癌症或其他PP2A失調相關疾病之新藥開發。
    請參閱圖1，其為本發明之螢光蛋白檢測系統之示意圖。圖1顯示有結構次單元1、調節次單元2、催化次單元3、及第一螢光蛋白4，其包括N端之第一區域41、及C端之第二區域42，且第一區域41及第二區域42為彼此相互分離。接著，第一區域41與結構次單元1連接，且第二區域42與調節次單元2連接。然後，當結構次單元1和調節次單元2結合時，相互分離的第一區域41及第二區域42會重新組合成完整的第一螢光蛋白4。之後，與催化次單元3連接之第二螢光蛋白5，其中催化次單元3會和結構次單元1、調節次單元2結合。此時，使用430 nm波長之激發光激發第二螢光蛋白5，其會放射出480 nm波長之放射光，而此480 nm波長之放射光成為第一螢光蛋白4之激發光，使第一螢光蛋白4放射出530 nm波長之放射光。因此，透過本發明之螢光蛋白檢測系統，可以偵測放射螢光訊號，以觀察與磷酸酶作用分子。
    於本實驗之實施例中，第一螢光蛋白4係使用YFP蛋白；第二螢光蛋白5係使用CFP蛋白。再者，對於磷酸酶2A之次單元而言，A係表示結構次單元；B係表示調節次單元；及C係表示催化次單元。 [NIH3T3纖維母細胞之轉染]
    本發明之實施例係使用NIH3T3纖維母細胞，其培養於DMEM培養液，該培養液添加有10%牛血清(BS)、1%盤尼西林(10 U/μl)/鏈黴素(10 μg/μl)、及1% L-穀胺醯胺(200 mM)。上述品項皆購買自GIBCO公司。
    於轉染前一天將NIH3T3細胞種在合適的培養盤中，例如：在24孔盤中，每孔種入7×104個細胞；在6cm培養盤中，每孔種入106個細胞；在10 cm培養盤中，每盤種入3×106個細胞。經過12~16小時後，準備兩個1.5 ml之微量離心管，分別製備DNA混合物和Lipofectamine 2000混合物：各自加入50 μl Opti-MEM(GIBCO)後，質體DNA(μg)與Lipofectamine 2000(μl)以1：2的比例分別加入微量離心管。接著，將DNA混合物緩慢加入Lipofectamine 2000混合物後靜置20分鐘。之後，將該混合物緩慢加入細胞培養盤中，培養4~6小時後，置換新鮮的DMEM培養液再培養24小時。 [實驗例1]
    利用含有A α或C α之cDNA質體作為模板，其兩邊包含EcoRI和NheI之限制酶切位，以PCR產出A α和C α之cDNA，再將cDNA轉殖到pFLAG-CMV2-YFPN；以及利用含有A α或C α之cDNA質體作為模板，其兩邊包含EcoRI和KpnI之限制酶切位，以PCR產出A α和C α之cDNA，再將cDNA轉殖到pCMV2-HA-YFPC。其中，pFLAG-CMV2-A α-YFPN係使用SEQ ID NO：1所示序列之順向引子、及SEQ ID NO：2所示序列之反向引子所建立；pFLAG-CMV2-C α-YFPN係使用SEQ ID NO：3所示序列之順向引子、及SEQ ID NO：4所示序列之反向引子所建立；pCMV2-HA-A α-YFPC係使用SEQ ID NO：5所示序列之順向引子、及SEQ ID NO：6所示序列之反向引子所建立；pCMV2-HA-C α-YFPC係使用SEQ ID NO：7所示序列之順向引子、及SEQ ID NO：8所示序列之反向引子所建立。
    實驗組別如圖2所示，第一螢光蛋白之第一區域41為N端，其係以YFPN表示；第一螢光蛋白之第二區域42為C端，其係以YFPC表示。並且，結構次單元1為A α，催化次單元3為C α，實驗組別共八組組合如下所示：(a)YFPN-A α+YFPC-C α、(b)YFPN-C α+YFPC-A α、(c)A α-YFPN+C α-YFPC、(d)C α-YFPN+A α-YFPC、(e)A α-YFPN+YFPC-C α、(f)C α-YFPN+YFPC-A α、(g)YFPN-A α+C α-YFPC、(h)YFPN-C α+A α-YFPC。
    將24孔盤置入塗佈有0.01%多聚賴氨酸(poly-L-lysine)之玻璃片，於室溫靜置15分鐘。以上述轉染方法將載體轉染至NIH3T3細胞。24小時後，將細胞以PBS清洗3次，再使用4%三聚甲醛(paraformaldehyde)/0.025%戊二醛(glutaraldehyde)固定細胞15分鐘。以PBS清洗3次後，使用5 μM之DAPI染色5分鐘。再以PBS清洗3次後，將玻璃片夾起反轉至滴有封片膠之玻片上，並以指甲油縫合。將玻片置於螢光顯微鏡(Zeiss,Axio observer Z1)下觀察。實驗結果顯示：各組皆可觀察到螢光表現，尤其以(a)YFPN-A α+C α-YFPC之組合具有最好的螢光效果。並且，該組合物在細胞中主要分佈於於細胞質，仍有少數位於細胞核中。 [實驗例2]
    本實驗例所使用之載體如下所述：YFPN-B56 γ 3：使用限制酶BamHI和XhoI切割pcDNA3.1/Zeo(+)-B56 γ 3-HA(由本實驗室利用含有B56 γ 3之cDNA質體作為模板並以PCR方法產生帶有HA的產物再轉植入pcDNA3.1/Zeo(+))，再轉植入pcDNAI-YFPN，以得到BiFC之表現載體。
    YFPC-A α：使用限制酶BamHI和NotI切割pcDNA3.1/Zeo(+)-A α(由本實驗室利用含有A α之cDNA質體作為模板並以PCR方法產生帶有HA的產物再轉植入pcDNA3.1/Zeo(+))，再轉植入pcDNAI-YFPC，以得到BiFC之表現載體。
    CFP-C α：利用含有C α之cDNA質體作為模板，其兩邊包含BamHI和EcoRI之限制酶切位，以PCR產出帶有Flag C α之cDNA，再將C α之cDNA轉植入CFP表現載體(pECFP-N1/C1)之N端或C端。其中，pECFP-N1-Flag-C α係使用SEQ ID NO：9所示序列之順向引子、及SEQ ID NO：10所示序列之反向引子所建立。ST及STmt：pCMV5-small T係以ST表示，及pCMV5-small T mt係以STmt表示，兩者皆由Dr.Estelle Sontag(現任職於澳洲紐卡索大學)所提供之。其中，ST用以干擾結構次單元和調節次單元之結合，而STmt係在第110個氨基酸之後的序列產生截斷突變，使其無法干擾結構次單元和調節次單元之結合。
    依實驗組別分別以上述轉染方法將載體轉染至NIH3T3細胞，玻片製作方法如實驗例1所述。將玻片置於螢光顯微鏡(Zeiss,Axio observer Z1)下觀察，並以Zeiss AxioVision軟體之Youvan’s方法分析螢光效能。
    四組分別為A組：YFPN+YFPC-A α+CFP-C α；B組：YFPN-B56 γ 3+YFPC-A α+CFP-C α；C組：YFPN-B56 γ 3+YFPC-A α+CFP-C α+ST；及D組：YFPN-B56 γ 3+YFPC-A α+CFP-C α+STmt，實驗結果如圖3所示。實驗結果顯示：B組呈現出高螢光強度，表示YFPN-B56 γ 3、YFPC-A α、及CFP-C α三個次單元有良好的結合；而由A組呈現的螢光表現，可推知本發明之螢光檢測系統具有高度專一性；當抑制A、B次單元結合之ST存在下，C組幾乎沒有螢光表現；而STmt存在下，不會影響D組的螢光表現。 [實驗例3]
    本實驗例所使用之載體如下所述：YFPN-A α、C α-YFPC：其係如同實驗例1中所述實驗方法所建立。
    B55 β 2/B55 β 2mt-CFP：利用含有B55 β 2/B55 β 2mt之cDNA質體作為模板，其兩邊包含BamHI和SalI之限制酶切位，以PCR產出B55 β 2/B55 β 2mt之cDNA，再將B55 β 2/B55 β 2mt之cDNA轉植入CFP表現載體(pECFP-N1/C1)之N端或C端。其中，pECFP-N1-Flag-B55 β 2、pECFP-C1-Flag-B55 β 2、pECFP-N1-Flag-B55 β 2mt、及pECFP-C1-Flag-B55 β 2 mt係使用SEQ ID NO：11所示序列之順向引子、及SEQ ID NO： 12所示序列之反向引子所建立。其中，B55 β 2mt係在167及168兩位點從精氨酸突變成谷氨酸，使其無法與結構次單元有良好的結合。
    ST及STmut：其來源及用途係如同實驗例2中所述之。
    依實驗組別分別以上述轉染方法將載體轉染至NIH3T3細胞，玻片製作方法如實驗例1所述。將玻片置於螢光顯微鏡(Zeiss,Axio observer Z1)下觀察，並以Zeiss AxioVision軟體之Youvan’s方法分析螢光效能。
    五組分別為A組：YFPN+C α-YFPC+B55 β 2-CFP；B組：YFPN-A α+C α-YFPC+B55 β 2-CFP；C組：YFPN-A α+C α-YFPC+B55 β 2-CFP+ST；及D組：YFPN-A α+C α-YFPC+B55 β 2-CFP+STmt；及E組：YFPN-A α+C α-YFPC+B55 β 2mt-CFP，實驗結果如圖4所示。實驗結果顯示：B組呈現出高螢光強度，表示YFPN-A α、C α-YFPC、及B55 β 2-CFP三個次單元有良好的結合；而由A組呈現的弱螢光表現，可推知本發明之螢光檢測系統具有高度專一性；當抑制A、B次單元結合之ST存在下，C組僅有微弱的螢光表現；而STmt存在下，不會影響D組的螢光表現；若將B組之B55 β 2-CFP取代為B55 β 2mt-CFP，E組可觀察到其螢光表現明顯降低。
    此外，與粒腺體指標相比，B組在螢光顯微鏡下呈現與粒腺體指標有相似的細胞位置分佈情形，表示B55 β 2接上螢光蛋白CFP後，並不會影響原本B55 β 2之功能。
    藉此，綜合以上實驗結果，本發明之用以篩選與磷酸酶作用分子之螢光蛋白檢測系統，其能夠靈敏的偵測磷酸酶次單元結合後的螢光表現，有助於研究與磷酸酶作用分子之相互作用。
    上述實施例僅係為了方便說明而舉例而已，本發明所主張之權利範圍自應以申請專利範圍所述為準，而非僅限於上述實施例。
    1‧‧‧結構次單元
    2‧‧‧調節次單元
    3‧‧‧催化次單元
    4‧‧‧第一螢光蛋白
    41‧‧‧第一區域
    42‧‧‧第二區域
    5‧‧‧第二螢光蛋白
    圖1係本發明之螢光蛋白檢測系統之示意圖。
    圖2係本發明實驗例1之第一螢光蛋白與次單元之組合圖。
    圖3係本發明實驗例2之螢光強度結果圖。
    圖4係本發明實驗例3之螢光強度結果圖。
    <110> 國立成功大學
    <120> 用以篩選與磷酸酶作用分子之系統及方法/System and method for selecting molecule interacting with protein phosphatase
    <130> C3737_100-193BP
    <160> 12
    <170> PatentIn version 3.3
    <210> 1
    <211> 23
    <212> DNA
    <213> Artificial
    <220>
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    <223> Artificial
    <400> 12
    1‧‧‧結構次單元
    2‧‧‧調節次單元
    3‧‧‧催化次單元
    4‧‧‧第一螢光蛋白
    41‧‧‧第一區域
    42‧‧‧第二區域
    5‧‧‧第二螢光蛋白
    权利要求:
    Claims (17)
    [1] 一種用以篩選與磷酸酶作用分子之螢光蛋白檢測系統，包括：一結構次單元；一調節次單元；一催化次單元；一第一螢光蛋白，包括一第一區域、及一第二區域，其中該第一區域及該第二區域係相互分離，且該第一區域係與該結構次單元連接；以及一第二螢光蛋白，其中該第二螢光蛋白之放射光譜係與該第一螢光蛋白之激發光譜重疊；其中，當該第一螢光蛋白之該第二區域與該調節次單元連接時，該第二螢光蛋白係與該催化次單元連接，而當該第一螢光蛋白之該第二區域與該催化次單元連接時，該第二螢光蛋白係與該調節次單元連接。
    [2] 如申請專利範圍第1項所述之螢光蛋白檢測系統，其中該磷酸酶係為磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)。
    [3] 如申請專利範圍第1項所述之螢光蛋白檢測系統，其中當該第一螢光蛋白之第一區域為一N端區域時，該第二區域係為一C端區域。
    [4] 如申請專利範圍第1項所述之螢光蛋白檢測系統，其中當該第一螢光蛋白之第二區域為一N端區域時，該第一區域係為一C端區域。
    [5] 如申請專利範圍第1項所述之螢光蛋白檢測系統，其中該第一螢光蛋白係為一黃光螢光蛋白。
    [6] 如申請專利範圍第5項所述之螢光蛋白檢測系統，其中該黃光螢光蛋白之激發光譜波長係為450-500 nm；放射光譜波長係為500-550 nm。
    [7] 如申請專利範圍第1項所述之螢光蛋白檢測系統，其中該第二螢光蛋白係為一青藍光螢光蛋白。
    [8] 如申請專利範圍第7項所述之螢光蛋白檢測系統，其中該青藍光螢光蛋白之激發光譜波長係為400-450 nm；放射光譜波長係為450-500 nm。
    [9] 一種用以篩選與磷酸酶作用分子之方法，包括下列步驟：(A)提供一用以篩選與磷酸酶作用分子之螢光蛋白檢測系統，包括：一結構次單元；一調節次單元；一催化次單元；一第一螢光蛋白，包括一第一區域、及一第二區域，其中該第一區域及該第二區域係相互分離，且該第一區域係與該結構次單元連接；以及一第二螢光蛋白，其中該第二螢光蛋白之放射光譜係與該第一螢光蛋白之激發光譜重疊，且當該第一螢光蛋白之該第二區域與該調節次單元連接時，該第二螢光蛋白係與該催化次單元連接，而當該第一螢光蛋白之該第二區域與該催化次單元連接時，該第二螢光蛋白係與該調節次單元連接；(B)將一待測物質與該螢光蛋白檢測系統混合，以得到一混合物；(C)分別以該第一螢光蛋白之激發光照射該混合物、及該螢光蛋白檢測系統，並分別檢測該混合物及該螢光蛋白檢測系統所發出之放射光，當該螢光蛋白檢測系統與該混合物所放出之放射光訊號有差異時，代表該待測物質影響該結構次單元、該調節次單元、及該催化次單元之相互作用。
    [10] 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中當該混合物所放出之放射光訊號大於該螢光蛋白檢測系統時，表示該待測物質可促進該結構次單元、該調節次單元、及該催化次單元之相互作用，且當該混合物所放出之放射光訊號小於該螢光蛋白檢測系統時，表示該待測物質可抑制該結構次單元、該調節次單元、及該催化次單元之相互作用。
    [11] 如申請專利範圍第9項所述之螢光蛋白檢測系統，其中該磷酸酶係為磷酸酶2A。
    [12] 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中該第一螢光蛋白之第一區域為一N端區域時，該第二區域係為一C端區域。
    [13] 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中當該第一螢光蛋白之第二區域為一N端區域時，該第一區域係為一C端區域。
    [14] 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中該第一螢光蛋白係為一黃光螢光蛋白。
    [15] 如申請專利範圍第14項所述之方法，其中該黃光螢光蛋白之激發光譜波長係為450-500 nm；放射光譜波長係為500-550 nm。
    [16] 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該第二螢光蛋白係為一青藍光螢光蛋白。
    [17] 如申請專利範圍第16項所述之方法，其中該青藍光螢光蛋白之激發光譜波長係為400-450 nm；放射光譜波長係為450-500 nm。
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    US20130004981A1|2013-01-03|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    WO2017189751A1|2016-04-26|2017-11-02|The University Of Utah Research Foundation|Target-binding activated split reporter systems for analyte detection and related components and methods|
    法律状态:
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    US201161498005P| true| 2011-06-17|2011-06-17||
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