Ｎ−カルボン酸無水物（ｕｎｃａ）を使用するペプチド合成方法

专利摘要:
遊離アミノ酸または遊離ペプチドとウレタン保護アミノ酸Ｎ−カルボン酸無水物（ＵＮＣＡ）溶液とを反応させる少なくとも１つの工程を含む、ペプチドまたはペプチド誘導体の調製方法。
公开号:JP2011513456A
申请号:JP2010550148
申请日:2009-03-06
公开日:2011-04-28
发明作者:ローラン カレン；ローレン ジェニン
申请人:ソルヴェイ（ソシエテ アノニム）；
IPC主号:C07K1-02

专利说明:

[0001] 本発明は、ペプチドまたはペプチド誘導体の合成方法に関する。]
背景技術

[0002] 合成ペプチドは、特に医薬品中の活性成分として大規模に適用される。
ペプチド合成は、一般に、使用前に保護されしかも活性化されているアミノ酸の使用を必要とする。このストラテジーは、最も簡単なものでもなく最も経済的なものでもない。
任意選択で保護されるアミノ酸Ｎ−カルボン酸無水物（以下ではＮＣＡまたはロイヒ（Ｌｅｕｃｈ）無水物と称する）は、従来のペプチドカップリングの有利な代替手段である。一般にアミノ酸のホスゲン化により得られるＮＣＡは、非常に反応性のある化合物であって、二次生成物を特に再配列によって形成しない化合物であり、その唯一の反応副生成物は二酸化炭素である。ウレタン基で置換されているアミノ酸Ｎ−カルボン酸無水物（ＵＮＣＡ）は、文献に、特にペプチド合成の分野において記載されている。]
[0003] １００種超のＵＮＣＡ誘導体が、これまで記載されている（例えば、ウィリアムＤ．フラー（Ｗｉｌｌｉａｍ Ｄ． Ｆｕｌｌｅｒ）ら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、１９９０、１１２、７４１４〜７４１６と、ウィリアムＤ．フラーら、Ｕｒｅｔｈａｎｅ−ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ａｌｐｈａ−ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ Ｎ−ｃａｒｂｏｘｙａｎｈｙｄｒｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、バイオポリマーズ（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ）、１９９６、４０、１８３〜２０５とを参照されたい）。第１級アミン官能基を有するアミノ酸のみがその対応するＵＮＣＡ誘導体に転化し得ることは注目すべきである。
ウィリアムＤ．フラーらは、（Ｕｒｅｔｈａｎｅ−ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ａｌｐｈａ−ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ Ｎ−ｃａｒｂｏｘｙａｎｈｙｄｒｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、バイオポリマーズ、１９９６、４０、１８３〜２０５において）固相と液相の双方でのペプチド合成におけるＵＮＣＡの種々の適用を概説し、ＵＮＣＡの使用に関連する利点および欠点について解説した。
著者のジュ（Ｚｈｕ）およびフラーは、エステル保護またはアミド保護されたカルボキシル官能基を有するジペプチド断片からのトリペプチドの迅速合成について記載している（テトラへドロンレターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ）、Ｖｏｌ．３６、Ｎｏ．６、８０７〜８１０、１９９５）。]
発明が解決しようとする課題

[0004] 本発明の目的は特に、高純度、とりわけ高光学純度を有するペプチドまたはペプチド誘導体を合成するための効率的で迅速かつ経済的な方法であって、産業で容易に使用できる方法を提供することである。特に、本発明による方法は、ジペプチド、トリペプチドまたはテトラペプチドなどの短ペプチドの大規模合成を行うことを可能にする。]
課題を解決するための手段

[0005] 本出願人は、意外なことに、本発明による方法が、以前使用されていた、カルボキシル官能基上で保護されたアミノ酸またはペプチドの代わりに、遊離アミノ酸または遊離ペプチドを使用して、光学的に純粋なペプチドを高収率で得るのを可能にすることを見出した。さらには、この方法を使用して得られたペプチドまたはペプチド誘導体は、一般に精製を必要としないか、または相当少なくみても容易に精製できる。
したがって、本発明は、遊離アミノ酸または遊離ペプチドとウレタン保護アミノ酸Ｎ−カルボン酸無水物（ＵＮＣＡ）溶液とを反応させる少なくとも１つの工程を含む、ペプチドまたはペプチド誘導体の調製方法に関する。]
[0006] 表現「アミノ酸」は、本発明の場合、ＮＨ2アミン基であることが好ましい少なくとも１つのＮＲ1Ｒ2基と、少なくとも１つのカルボキシル基と、を含む任意の化合物を意味することが理解される。本発明のアミノ酸は、天然または合成起源のものであり得る。グリシンは別として、天然アミノ酸は、キラル炭素原子を含有する。本発明に使用されるアミノ酸は、鏡像異性的に純粋な（ｅｎａｎｔｉｏｐｕｒｅ）アミノ酸であることが好ましい。表現「鏡像異性的に純粋なアミノ酸」は、１つの鏡像異性体から主になるキラルアミノ酸を意味することが理解される。鏡像体過剰率（ｅｅ）は、ｘ1＞ｘ2としてｅｅ（％）＝１００（ｘ1−ｘ2）／（ｘ1＋ｘ2）と定義され、ｘ1およびｘ2はそれぞれ混合物中の鏡像異性体１または２の含量を表す。天然または非天然のアミノ酸を使用することが可能である。アミノ酸は、ＤまたはＬ配置を有し得る。使用し得るある種のアミノ酸の残基は、以下の３文字表記：アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リシン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、およびバリン（Ｖａｌ）に準じて省略される。本発明による方法では、求核側鎖を有するアミノ酸は、その使用前に側鎖において有利に保護される。]
[0007] 表現「保護基」は、それが結合している原子または基、例えば酸素または窒素原子が合成中に望ましくない反応に関与するのを防止する、任意の種類の基を意味することが理解される。保護基には、側鎖保護基と、普通、アミン保護基および酸保護基と称されるＣ−またはＮ−末端を保護する基と、が挙げられる。]
[0008] アミン保護基の非限定例として、ベンゾイル（Ｂｚ）、アセチル（Ａｃ）、トリフルオロアセチル（Ｔｆａ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル（２ＣｌＺ）、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル（２ＢｒＺ）、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、ベンズヒドリルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンゼンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニル、または２−ニトロベンゼンスルホニルの基を特に挙げることができる。]
[0009] 酸保護基の非限定例として、メトキシメチル、メチルチオメチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−ハロエチル、２−（トリメチルシリル）エチル、ｔ−ブチル、アリール、アルキル、アラルキル、アリル、ベンジル、トリフェニルメチル（トリチル）、ベンズヒドリル、ｐ−ニトロベンジル、ｐ−メトキシベンジル、およびトリメチルシリルエーテル、トリエチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、またはイソプロピルジメチルシリルなどのトリアルキルシリル基などの、アルキル、アリール、アラルキルまたはシリルの種類の基を挙げることができる。]
[0010] 本発明の場合、用語「ペプチド」は、そのモノマーがアミド型共有結合により共に結合されているアミノ酸であるポリマーを指す。]
[0011] ペプチド誘導体は、１つまたは複数の原子が置換または付加された、元のペプチドに類似する化合物を示す。ペプチド誘導体の典型例は、側基が活性化もしくは保護されたペプチド、末端基が活性化もしくは保護されたペプチド、環状型のペプチド、または環状アミノ酸を含むペプチドから選択することができる。ペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含む。ペプチド鎖中のアミノ酸の数は、３以上であることが好ましい。ペプチド鎖は、しばしば、１００以下のアミノ酸を含む。ペプチド鎖中のアミノ酸の数は、２０以下であることが好ましい。ペプチド鎖中のアミノ酸の数は、１５以下であることが特に好ましい。本発明による方法は、ジペプチド、トリペプチド、およびテトラペプチドの合成、とりわけ大規模の合成に特に適する。この方法はさらに、例えばペンタペプチド、ヘキサペプチド、またはヘプタペプチドを作製するのに有利である。
加えて、すべてのペプチド配列は、配向が通常の方向にある、左から右までに及ぶ、すなわちアミン末端からカルボキシル末端までに及ぶ式によって表される。]
[0012] 本発明による方法は、高度のジアステレオマー純度を示すペプチドおよびペプチド誘導体の合成に特に適することが見出された。
本発明による方法において得られるペプチドおよびペプチド誘導体が一般に示す、所望のジアステレオマー重量含有率として定義されるジアステレオマー純度は、９８％以上である。しばしば、ジアステレオマー純度は９９％以上である。ジアステレオマー純度は、９９．５％以上であることが好ましい。ジアステレオマー純度は、９９．９％以上であることが特に好ましい。
したがって、本発明による方法は、ＵＮＣＡ形態の１つのアミノ酸と、もう一つの遊離アミノ酸または遊離ペプチドとのカップリングを可能にする。]
[0013] 本発明の場合、用語「カップリング」は、特に、アミノ酸のカルボキシル基またはペプチドのＣ末端のカルボキシル基と、もう一つのアミノ酸のアミノ基または第二のペプチドのＮ末端との反応を指す。
本発明の場合、用語「Ｃ末端」は、カルボキシル（−ＣＯＯＨ）基により終端されているペプチドのアミノ酸鎖の末端または末端を示す。加えて、用語「Ｎ末端」は、アミノ（−ＮＨ2）基により終端されているペプチドのアミノ酸鎖の終端部または末端を指す。本発明の場合、遊離アミノ酸または遊離ペプチドは、−ＣＯＯＨの形態である少なくとも１つのカルボキシル基、適当な場合Ｃ末端基、を有するアミノ酸またはペプチドを示す。より特には、遊離アミノ酸または遊離ペプチドでは、アミノ基、適当な場合Ｎ末端基は、−ＮＨ2の形態である。さらにより特には、「遊離アミノ酸」または「遊離ペプチド」は、非保護アミノ酸または非保護ペプチドを示す。遊離のアミノ酸またはペプチドの内部塩も、適当な場合、この定義に含まれることが理解される。
本発明の文脈では、略語「ＮＣＡ」はアミノ酸Ｎ−カルボン酸無水物を示し、「ＵＮＣＡ」はウレタン保護アミノ酸Ｎ−カルボン酸無水物を示す。]
[0014] 本発明による方法では、遊離アミノ酸または遊離ペプチドと反応するウレタン保護アミノ酸Ｎ−カルボン酸無水物（ＵＮＣＡ）溶液は、一般に、ＵＮＣＡを適切な溶媒中に溶解することによって得られる。
本発明による方法に使用されるＵＮＣＡは、Ｂｏｃ、ＦｍｏｃまたはＺの基を含むＵＮＣＡであることが好ましい。ＵＮＣＡは、Ｂｏｃ基を含むことがより特に好ましい。
保護ＵＮＣＡが使用される際に得られる保護ペプチドは、脱保護されていてもよく、所望によっては、本発明による方法に従って特に行われる後続のペプチド合成工程用の出発生成物として使用されてもよい。]
[0015] 本発明による方法では、遊離アミノ酸または遊離ペプチドが少なくとも部分的に可溶性である溶媒中で、遊離アミノ酸または遊離ペプチドとＵＮＣＡ溶液とを反応させることが有利である。したがって、固体形態の遊離アミノ酸または固体形態の遊離ペプチドを、ＵＮＣＡ溶液と接触させてもよい。
本発明による方法では、溶媒は、遊離アミノ酸または遊離ペプチドが、反応を開始するために溶媒中で十分な溶解性を有するように選択されることが好ましい。溶液中に存在するＵＮＣＡの、カップリング生成物への転化が、２４時間以下の反応時間内で少なくとも５０％達成されるのを可能にする溶媒が好ましい。より特には、溶媒は、１２時間以下または６時間以下でさえもの反応時間内でこの転化が達成されるのを可能にする。]
[0016] より特には、溶媒は、とりわけ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、ホルムアミドおよびスルホラン（ｓｕｌｐｈｏｌａｎｅ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ならびにアセトニトリルから選択され得る非プロトン性極性溶媒である。優れた結果は、ジメチルスルホキシドを使用して得られる。
溶媒として、イオン液体、例えばアルキル化イミダゾールの液体塩を使用することも可能である。]
[0017] 本発明による方法では、反応は、一般に液体媒体中で行われる。この媒体は、均質であり得る。しばしば、反応媒体は、とりわけ初期では非均質であり、例えばＵＮＣＡ溶液中の遊離アミノ酸または遊離ペプチドの懸濁物であり得る。反応媒体は、ＵＮＣＡ溶液中に浸漬される遊離アミノ酸または遊離ペプチドからなる固形物質からなってもよい。
液体媒体は、実質的に無水であることが好ましい。一般に、液体媒体中の水分含量は液体媒体１ｋｇ当たり最大で水１０００ｍｇに維持される。しばしば、この含量は液体媒体１ｋｇ当たり最大で水５００ｍｇである。この含量は液体媒体１ｋｇ当たり最大で水２５０ｍｇであることが好ましい。しばしば、液体媒体中の水分含量は、液体媒体１ｋｇ当たり水１０ｍｇ以上または液体媒体１ｋｇ当たり水５０ｍｇ以上さえもある。]
[0018] 本方法によって遊離アミノ酸とＵＮＣＡ溶液とを反応させる場合、鏡像異性的に純粋な遊離アミノ酸、すなわち１つの鏡像異性体から主になるキラルアミノ酸がしばしば使用され、その鏡像体過剰率は９９％以上である。９９．５％以上の鏡像体過剰率を有する鏡像異性的に純粋なアミノ酸は、好ましい。９９．９％以上の鏡像体過剰率を有する鏡像異性的に純粋なアミノ酸が使用されることは、特に好ましい。
本方法によって遊離ペプチドとＵＮＣＡ溶液とを反応させる場合、９８％以上のジアステレオ純度を特徴とするジアステレオ純粋な（ｄｉａｓｔｅｒｅｏｍｅｒｉｃａｌｌｙ ｐｕｒｅ）遊離ペプチドが一般に使用される。しばしば、ジアステレオ純度は９９％以上である。ジアステレオ純度は、９９．５％以上であることが好ましい。ジアステレオ純度は、９９．９％以上であることが特に好ましい。]
[0019] 本発明による方法では、遊離アミノ酸または遊離ペプチドがＵＮＣＡに対して化学量論的に若干過剰にあるような比率で、遊離アミノ酸または遊離ペプチドとＵＮＣＡ溶液とを有利に反応させる。一般には、１〜１．５当量の遊離アミノ酸または遊離ペプチドが使用される。使用される遊離アミノ酸または遊離ペプチドの量は、約１．１当量以上であることが好ましい。]
[0020] 本発明による方法では、１５℃〜９０℃の温度で遊離アミノ酸または遊離ペプチドとＵＮＣＡ溶液とを有利に反応させる。しばしば、２０℃以上の温度で反応が行われる。温度は、３０℃以上であることが好ましい。しばしば、８０℃以下の温度で反応が行われる。温度は、６０℃以下であることが好ましい。
本発明による方法により得られるペプチドおよびペプチド誘導体が一般に示す、所望のジアステレオマー重量含有率として定義されるジアステレオマー純度は、９８％以上である。しばしば、ジアステレオマー純度は９９％以上である。ジアステレオマー純度は、９９．５％以上であることが好ましい。ジアステレオマー純度は、９９．９％以上であることが特に好ましい。]
[0021] 圧力は、一般に、反応媒体、特にＵＮＣＡ溶液を液体状態に保持するように選択される。
一実施形態によれば、大気圧（約１０１．３ｋＰａ）および大気圧より高い圧力は、特に適切である。
別の実施形態によれば、大気圧未満の圧力が使用される。しばしば、この実施形態では、圧力は４００ｍｂａｒ（４０ｋＰａ）以上である。しばしば、圧力は５００ｍｂａｒ（５０ｋＰａ）以下である。
大気圧（約１０１．３ｋＰａ）およびとりわけ大気圧未満の圧力は、反応により形成される二酸化炭素を排除するのに特に適する。]
[0022] 本発明による方法では、０．５〜１０時間に及び得る反応時間にわたって、遊離アミノ酸または遊離ペプチドとＵＮＣＡ溶液とを有利に反応させる。一般には、この時間は１〜３時間である。
反応の終了時に、未反応の遊離アミノ酸または未反応の遊離ペプチドは、一般に、固液分離操作、例えば遠心分離によって、または好ましくはろ過によって回収することができる。必要ならば、この実施形態では、反応媒体中に存在する溶媒または溶媒の混合物より極性の低い第二の有機溶媒で反応媒体を希釈することが有利となり得る。適切な第二の溶媒の例として、アルキルエステル、例えば酢酸エチル、または好ましくは酢酸イソプロピルを挙げることができる。
必要ならば、遊離アミノ酸または遊離ペプチドの回収後、反応媒体は一般に水で処理され、得られるペプチドまたはペプチド誘導体は抽出により回収することができる。]
[0023] 作製されるペプチドは、例えば、適切な沈殿用溶媒、典型的にはシクロヘキサン、石油エーテルおよびｎ−ヘプタンから特に選択されるアルカン中での沈殿により単離することができる。アンモニウム塩、例えばＤＣＨＡ（ジシクロヘキシルアミン）またはＣＨＡ（シクロヘキシルアミン）の塩の形成によって、作製されるペプチドを単離することもできる。
本発明による方法は、典型的に８０％超である収率でペプチドおよびペプチド誘導体を得ることを可能にする。]
[0024] 以下の実施例は、本発明を例示することを意図しているが、本発明を限定するものではない。
実施例１：Ｂｏｃ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＯＨの合成
４５ｍｌのＤＭＳＯ、さらには６．３０ｇ（１．２当量）のＨ−Ｌｅｕ−ＯＨを、懸濁物を得るために２５０ｍｌの丸底フラスコ中に導入した。反応媒体を６０℃にしてから１０．２９ｇ（１．０当量）のＢｏｃ−Ｉｌｅ ＵＮＣＡをそれに添加した。２時間反応させた後、反応媒体からの試料をＨＰＬＣで分析した。反応媒体を、周囲温度に冷却してから３６０ｍｌの酢酸イソプロピルで希釈した。
０．１当量のジメチルアミノプロピルアミン（ＤＭＡＰＡ）を添加し、約１０分間反応媒体を周囲温度で撹拌した。]
[0025] 次いで、有機相を連続的に：
１．０当量のＫＨＳＯ4（５．４５ｇ）を含有する３００ｍｌの５％ＮａＣｌ水溶液、
３００ｍｌの５％ＮａＣｌ水溶液、および
３００ｍｌの脱塩水
で洗浄した。
有機相を蒸発により濃縮し、酢酸イソプロピルで共沸乾燥操作を行った（全部で３００ｍｌ）。冷却の過程で、ジペプチドは結晶化し始めた。これを１５０ｍｌのシクロヘキサンで希釈し、蒸発を続けた。懸濁物を、０±５℃に冷却した。ろ過し、得られた固体を７０ｍｌのシクロヘキサンで洗浄し、乾燥した後、１２．８ｇの所望のペプチドを得た。
（ＮＭＲに基づく）収率＝９３％。]
[0026] 実施例２〜６
一連の化合物を、実施例１に類似する方法に従って合成した。以下の表は、Ｂｏｃ−Ｉｌｅ ＵＮＣＡに関して行われる一連の試験について得られた結果を概略する。]
実施例

[0027] ]

权利要求:

請求項1
遊離アミノ酸または遊離ペプチドとウレタン保護アミノ酸Ｎ−カルボン酸無水物（ＵＮＣＡ）溶液とを反応させる少なくとも１つの工程を含む、ペプチドまたはペプチド誘導体の調製方法。
請求項2
前記遊離アミノ酸または前記遊離ペプチドが少なくとも部分的に可溶性である溶媒中で、前記遊離アミノ酸または前記遊離ペプチドと前記ＵＮＣＡ溶液とを反応させる、請求項１に記載の方法。
請求項3
前記溶媒が、前記遊離アミノ酸または前記遊離ペプチドがその溶媒において溶解性を有する溶媒であって、それによって、前記溶液中に存在するＵＮＣＡの、カップリング生成物への転化が２４時間以下の反応時間内で少なくとも５０％達成され得る溶媒である、請求項２に記載の方法。
請求項4
前記溶媒が非プロトン性極性溶媒である、請求項３に記載の方法。
請求項5
前記非プロトン性極性溶媒が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、ホルムアミドおよびスルホラン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ならびにアセトニトリルから選択される、請求項４に記載の方法。
請求項6
前記溶媒がＤＭＳＯである、請求項５に記載の方法。
請求項7
１５〜９０℃の温度で前記遊離アミノ酸または前記遊離ペプチドと前記ＵＮＣＡ溶液とを反応させる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
請求項8
前記ＵＮＣＡがＢｏｃ、ＦｍｏｃまたはＺの基を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
請求項9
形成された二酸化炭素が取り除かれる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
請求項10
前記遊離アミノ酸または前記遊離ペプチドが固体形態で使用される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
請求項11
前記反応媒体が前記ＵＮＣＡ溶液中の遊離アミノ酸または遊離ペプチドの懸濁物である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
請求項12
未反応の遊離アミノ酸または遊離ペプチドが前記反応の終了時に固液分離操作によって回収される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
請求項13
前記固液分離の前に、前記反応媒体が、前記反応媒体中に存在する溶媒または溶媒の混合物より極性の低い第二の有機溶媒で希釈される、請求項１２に記載の方法。