中間体、およびその中間体を用いる（３−トリフルオロメチルスルホニル）−ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３イル−ピリミジン−２イルアミノ）−フェニル］ベンズアミドの調製方法

专利摘要:
この発明は、４−メチル−２−ニトロ−アニリン（式（ＩＩ））から開始して、（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［４−メチル−３−ニトロフェニル］−ベンズアミド（式（ＩＩＩ））、（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［３−アミノ−４−メチルフェニル］−ベンズアミド（式（ＩＶ））および（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［３−グアニジノ−４−メチルフェニル］−ベンズアミド（式（Ｖ））の中間体を介する、（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３イル−ピリミジン−２イルアミノ）−フェニル］−ベンズアミド（式（Ｉ））の調製方法に関する。この発明は、さらに、これらの中間体の調製方法にも関する。ＡＮ−０２４としても知られる式（Ｉ）の化合物は次のとおりである：
公开号:JP2011513379A
申请号:JP2010549211
申请日:2009-03-02
公开日:2011-04-28
发明作者:アディバトラ・カリ・サトゥヤ，ブジャンガ・ラオ；コムペラ，アマラ・キシャン；ベンカイア・チョウダーリ，ナンナパネニ；ラチャコンダ，スリーニバス
申请人:ナトコ ファーマ リミテッド；
IPC主号:C07D401-04

专利说明:

[0001] この出願は、２００９年３月２日に、米国を除くすべての国の指定に対する出願人は、インド国籍企業であるナトコファーマ リミテッド（Natco Pharma Limited）の名の下に、米国のみの指定に対する出願人は、インド国民である、アマラ・キシャン・コムペラ（Amala kishan Kompella）、ブジャンガ・ラオ・アディバトラ・カリ・サトゥヤ（Bhujanga rao Adibhatla Kali Satya）、スリーニバス・ラチャコンダ（Sreenivas Rachakonda）、およびナンナパネニ・ベンカイア・チョウダーリ（Nannapaneni Venkaiah Chowdary）の名の下に、ＰＣＴ国際特許出願として出願され、２００８年３月４日に出願された米国特許出願第１２／０４２，２４０号に対する優先権を主張する。]
[0002] この発明は、４−メチル−２−ニトロ−アニリン（式（ＩＩ））から開始して、（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［４−メチル−３−ニトロフェニル］−ベンズアミド（式（ＩＩＩ））、（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［３−アミノ−４−メチルフェニル］−ベンズアミド（式（ＩＶ））および（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［３−グアニジノ−４−メチルフェニル］−ベンズアミド（式（Ｖ））の中間体を介する、（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３イル−ピリミジン−２イルアミノ）−フェニル］−ベンズアミド（式（Ｉ））の調製方法に関する。この発明は、さらに、これらの中間体の調製方法にも関する。ＡＮ−０２４としても知られる式（Ｉ）の化合物は次のとおりである：]
[0003] ]
背景技術

[0004] 式（Ｉ）の（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３イル−ピリミジン−２イルアミノ）−フェニル］−ベンズアミドの調製、および、特に抗腫瘍薬としてのその使用が、２００７年１０月４日に公開されたＵＳ２００７／０２３２６３３の実施例１３および多数の他の国々における対応出願（ＰＣＴ／ＩＮ２００５／０００２４３）において記載されている。]
[0005] 社会および医療産業用の抗腫瘍薬としての（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３イル−ピリミジン−２イルアミノ）−フェニル］−ベンズアミド（式（Ｉ））の有用性に鑑み、式（Ｉ）の化合物の調製方法が開発された。]
課題を解決するための手段

[0006] この発明は、中間体の調製、およびそれらの中間体を用いる式（Ｉ）の３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３イル−ピリミジン−２イルアミノ）−フェニル］−ベンズアミドの調製方法に関する。式（Ｉ）の（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３イル−ピリミジン−２イルアミノ）−フェニル］−ベンズアミドは増殖阻害（たとえば抗腫瘍）薬である。]
[0007] 従って、この発明は、（下にスキームＩで示されるように）、
（ａ）（３−トリフルオロメチルスルホニル）ベンゾイルクロリド（式（ＶＩ））を提供するか、または従来の方法によってそれを調製するステップ；
（ｂ）４−メチル−２−ニトロ−アニリン（式（ＩＩ））と、式（ＸＩ）の化合物を、アルカリ水溶液を添加して塩化炭化水素溶媒中、約３０℃から約４０℃で縮合させることにより、（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［４−メチル−３−ニトロフェニル］−ベンズアミド（式（ＩＩＩ））を得るステップ；
（ｃ）式（ＩＩＩ）の化合物を、約０℃から約５℃で約３〜約４時間、塩化第一スズ／濃塩酸で還元して、（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［３−アミノ−４−メチルフェニル］−ベンズアミド（式（ＩＶ））を得るステップ；
（ｄ）式（ＩＶ）の化合物とシアナミド溶液を、ｎ−ブタノール溶媒中、約９０℃から約９５℃で縮合させて、（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［３−グアニジノ−４−メチルフェニル］−ベンズアミド（式（Ｖ））を得るステップ；および
（ｅ）式（Ｖ）の化合物と式（ＶＩＩ）の化合物を、塩基の存在下、還流温度で縮合させて、式（Ｉ）の化合物を得るステップ
を含む、式（Ｉ）の化合物の調製方法を提供する。]
[0008] ある実施形態では、この発明は、
（ａ）（３−トリフルオロメチルスルホニル）ベンゾイルクロリド（式（ＶＩ））を提供するか、または従来の方法によってそれを調製するステップ；および
（ｂ）４−メチル−２−ニトロ−アニリン（式（ＩＩ））と、式（ＶＩ）の化合物を、アルカリ水溶液を添加して塩化炭化水素溶媒中、約３０℃から約４０℃で縮合させることにより、（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［４−メチル−３−ニトロフェニル］−ベンズアミド（式（ＩＩＩ））を得るステップ
を含む、式（ＩＩＩ）の化合物の調製方法を提供する。]
[0009] ある実施形態では、この発明は、
（ａ）（３−トリフルオロメチルスルホニル）ベンゾイルクロリド（式（ＶＩ））を提供するか、または従来の方法によってそれを調製するステップ；
（ｂ）４−メチル−２−ニトロ−アニリン（式（ＩＩ））と、式（ＶＩ）の化合物を、アルカリ水溶液を添加して塩化炭化水素溶媒中、約３０℃から約４０℃で縮合させることにより、（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［４−メチル−３−ニトロフェニル］−ベンズアミド（式（ＩＩＩ））を得るステップ；および
（ｃ）式（ＩＩＩ）の化合物を、約０℃から約５℃で約３〜約４時間、塩化第一スズ／濃塩酸で還元して、（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［３−アミノ−４−メチルフェニル］−ベンズアミド（式（ＩＶ））を得るステップ
を含む、（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［３−アミノ−４−メチルフェニル］−ベンズアミド（式（ＩＶ））の化合物の調製方法を提供する。]
[0010] ある実施形態では，この発明は、
（ａ）（３−トリフルオロメチルスルホニル）ベンゾイルクロリド（式（ＶＩ））を提供するか、または従来の方法によってそれを調製するステップ；
（ｂ）４−メチル−２−ニトロ−アニリン（式（ＩＩ））と、式（ＶＩ）の化合物を、アルカリ水溶液を添加して塩化炭化水素溶媒中、約３０℃から約４０℃で縮合させることにより、（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［４−メチル−３−ニトロフェニル］−ベンズアミド（式（ＩＩＩ））を得るステップ；
（ｃ）式（ＩＩＩ）の化合物を、約０℃から約５℃で約３〜約４時間、塩化第一スズ／濃塩酸で還元して、（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［３−アミノ−４−メチルフェニル］−ベンズアミド（式（ＩＶ））を得るステップ；および
（ｄ）式（ＩＶ）の化合物とシアナミド水溶液を、ｎ−ブタノール溶媒中、約９０℃から約９５℃で縮合させて、（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［３−グアニジノ−４−メチルフェニル］−ベンズアミド（式（Ｖ））を得るステップ
を含む、Ｎ−｛２−（４−メチルピペラジノメチル）ベンゾイルアミド］−５−メチル｝グアニジン塩酸塩（式（Ｖ））の化合物の調製方法を提供する。]
図面の簡単な説明

[0011] Ｋ５６２細胞をさまざまな濃度のＡＮ０２４（１〜ｌ０μｇ／ｍｌ）で処置した。細胞溶解物を集めてウエスタンブロット解析を標準的試験計画書に従って行なった。ＢＣＲ−Ａｂｌ、ＣｒｋおよびＳｔａｔ５ＡＹ694/699の発現レベルを測定した（実施例１）。
Ｋ５６２移植ヌードマウスにおける、ＡＮ−０２４およびイマチニブの経口投与による脾臓肥大の減少（実施例２）。脾臓肥大を目視検査で判断し、対照群マウスは、Ｋ５６２細胞内局在化を示す脾臓肥大を示すと判断した。ＡＮ０２４で処置された細胞は脾臓肥大を示さなかったが、イマチニブで処置されたマウスは僅かな脾臓肥大を示した。
Ｋ５６２ｌｕｃヒト白血病細胞を移植され、ＡＮ０２４で処置されたヌードマウスにおけるルシフェラーゼ発現の減少（実施例４）。１ｍｇ／ｋｇの濃度のＡＮ０２４は、ルシフェラーゼ発現の減少を引き起こさなかったが、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇ濃度は、ルシフェラーゼ発現の減少を引き起こした。
Ｋ５６２ｌｕｃヒト白血病細胞を移植され、イマチニブで処置されたヌードマウスにおけるルシフェラーゼ発現の減少（実施例４）。１ｍｇ／ｋｇ濃度のイマチニブ投与は、ルシフェラーゼ発現の減少を引き起こさなかったが、１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇは、ルシフェラーゼ発現の遅延を示した。
対照薬ダサチニブを使用した、図３Ａおよび図３Ｂで示されたものと類似の研究結果である。Ｂａｆ３突然変異細胞（ｗｔ、Ｔ３１５Ｉ、Ｍ３５１ＴおよびＥ２５５Ｋ）を移植されたヌードマウスにおけるダサチニブの経口（ｏｒ）投与による芽細胞数の減少のグラフ表示である（実施例６）。
図３Ａおよび図３Ｂで示されたものと類似の研究結果である。Ｂａｆ３突然変異細胞（ｗｔ、Ｔ３１５Ｉ、Ｍ３５１ＴおよびＥ２５５Ｋ）を移植されたヌードマウスにおけるイマチニブの経口（ｏｒ）投与による芽細胞数の減少のグラフ表示である（実施例６）。
図３Ａおよび図３Ｂで示されたものと類似の研究結果である。Ｂａｆ３突然変異細胞（ｗｔ、Ｔ３１５Ｉ、Ｍ３５１ＴおよびＥ２５５Ｋ）を移植されたヌードマウスにおけるＡＮ−０２４の経口（ｏｒ）投与による芽細胞数の減少のグラフ表示である（実施例６）。
放射線照射有りおよび無しでの、所定濃度のＡＮ−０２４の存在下での、４９１０、５３１０およびＵ８７神経膠腫細胞ならびにＭＤＡＭＢ２３１およびＺＲ７１乳癌細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏマトリゲル浸潤アッセイ（実施例７）。
放射線照射有りおよび無しでの、所定濃度のＡＮ−０２４の存在下での、４９１０、５３１０およびＵ８７神経膠腫細胞ならびにＭＤＡＭＢ２３１およびＺＲ７１乳癌細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏマトリゲル浸潤アッセイ（実施例７）。
放射線照射有りおよび無しでの、所定濃度のＡＮ−０２４の存在下での、４９１０、５３１０およびＵ８７神経膠腫細胞ならびにＭＤＡＭＢ２３１およびＺＲ７１乳癌細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ血管新生アッセイ（実施例７）。
放射線照射有りおよび無しでの、所定濃度のＡＮ−０２４の存在下での、４９１０、５３１０およびＵ８７神経膠腫細胞ならびにＭＤＡＭＢ２３１およびＺＲ７１乳癌細胞のウエスタンブロット解析（実施例７）。
Ｋ５６２１ｕｃ移植マウスの、ＡＮ０２４、ＡＮ０１９またはイマチニブでの処置後のルシフェラーゼ発現。
ＡＮ０２４またはＡＮ０１９での処置後、５８日目で治癒した動物の数。薬物治療を４２日目で中止し、動物は、ＡＮ０２４およびＡＮ０１９での処置後、薬物治療の中止後において、治療効果を示し続けた（実施例８）。
示された日において動物から得られた血液塗抹標本からの芽細胞数。薬物治療は４２日目で中止した。ＡＮ０２４およびＡＮ０１９は、薬物治療の中止後において、有効性を示した。イマチニブは効果がないことが分かった（実施例８）。
放射線照射（５Ｇｙ）有りおよび無しで、ＴＭＺ、ＡＮ０２４またはＡＮ０１９での処置後のヌードマウスにおける頭蓋内腫瘍の半定量分析（実施例９）。
放射線処置無しでの、ＡＮ−０２４での薬物治療後において頭蓋内腫瘍が無いことを示すヌードマウスのグラフ表示（実施例９）。] 図３Ａ 図３Ｂ
[0012] この発明の詳細な説明
この発明による式（Ｉ）の化合物の調製のための反応スキームを、スキーム−１に示す。]
[0013] ]
[0014] スキーム１の反応の実施形態において、ステップ１では、アルカリは水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウム、たとえば水酸化カリウムであってよい。この反応は、塩化メチレンまたはクロロホルム等の塩化炭化水素、たとえばクロロホルム中で行なうことができる。温度は約３０〜約４０℃の範囲であってよい。]
[0015] 実施形態において、ステップ２での還元は、濃塩酸溶媒中、６モルの塩化第一スズを用いて達成することができる。実施形態において、ステップ３で使用される溶媒はｎ−ブタノールであってよい。実施形態において、この発明のステップ４は、ｎ−ブタノール存在下、水酸化ナトリウムを用いて行なうことができる。]
[0016] ２００７年３月５日出願の米国特許出願１１／７１４，５６５（米国公開番号ＵＳ２００７／０２３２６３３、２００７年１０月４日に公開）、および２００５年７月１９日出願のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＩＮ２００５／０００２４３（ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００６／０２７７９５、２００６年３月１６日に公開）の開示の全体をここに引用により援用する。]
[0017] この発明の実施形態は以下の実施例において述べられるが、それらはこの発明を例示するためにのみ提供され、したがって、それらはこの発明の範囲を限定するように解釈されるべきではない。]
[0018] 式Ｉ（開発コード（ＡＮ−０２４）によって示される）のこの発明の化合物は、有効な抗増殖（たとえば抗腫瘍）活性を示すと分かった。この抗増殖活性はこのクラスの既存の承認薬のいくつかよりも優れている。開発コードＡＮ−０１９は、本発明者らによって別記された同じクラスの別の化合物を指す。この発明の化合物のバイオ効能および活性を、この研究の陽性対照群とされるイマチニブメシラートおよびダサチニブ等の承認薬と比較した。「イマチニブメシラート」はこの研究では「イマチニブ」と短縮して呼ばれる。]
[0019] 実施例１−ｋ５６２細胞を移植されたヌードマウスにおけるＡＮ−０２４の抗ＣＭＬ活性の確立（図−１）
ＡＮ−０２４でのｉｎ ｖｉｔｒｏ研究
ＢＣＲ−Ａｂｌ、Ｃｒｋおよびｐｈｏｓｐｈｏ Ｓｔａｔ５ＡＹ694/699の発現レベルを、１２時間、さまざまな濃度のＡＮ０２４（１μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌまたはｌ０μｇ／ｍｌ）で処置されたＫ５６２細胞のウエスタンブロット解析によって測定した。ＢＣＲ−Ａｂｌ、Ｃｒｋおよびｐｈｏｓｐｈｏ Ｓｔａｔ５ＡＹ694/699タンパク質レベルは用量依存的態様で減少したことが観察された。]
[0020] ウエスタンブロット解析
Ｋ５６２細胞を、１μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌまたはｌ０μｇ／ｍｌのＡＮ０２４で処置した。１２時間後、細胞を集めて、全細胞溶解物を、トリス［０．１Ｍ、ｐＨ７．５］、トリトン−Ｘ１１４（１．０％）、ＥＤＴＡ（１０ｍＭ）、アプロチニンおよびフッ化フェニルメチルスルホニルを含有する抽出バッファ中で調製した。これらのサンプルからの１０μｇのタンパク質を非還元条件の下で１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロースメンブレン（Schleicher & Schuell, Keene, NH）に移した。メンブレンを、標準試験計画書に従って、ＢＣＲ−Ａｂｌ、Ｃｒｋおよびｐｈｏｓｐｈｏ Ｓｔａｔ５ＡＹ694/699に対する抗体で２時間プローブした。その後、メンブレンを、ＰＢＳで３回洗浄して過剰な一次抗体を除去し、必要とされる、適切な第２の、ＨＲＰ共役抗体でインキュベートし、次いで、強化化学ルミネセンス試験計画書（Amersham, Arlington Heights,IL）に従って現像した。]
[0021] ＭＴＴ細胞増殖アッセイ
Ｋ５６２細胞を、さまざまな濃度のＡＮ０２４（１μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌまたはｌ０μｇ／ｍｌ）で２４時間処置し、それに続いて、ＭＴＴアッセイを行なって、処置された細胞の増殖能の指標を測定した。アッセイは製造元の指示書（Chemicon Temecula, CA）による標準試験計画書に基づいて行なわれた。光学濃度は５７０ｎｍで測定され、グラフに表わされた。吸収度は、存在する細胞の数および測定された生細胞の数に正比例した。]
[0022] ＡＮ０２４は用量依存的態様でＢＣＲ−Ａｂｌキナーゼ活性を阻害した。
図１は、この試験の結果を示す。Ｋ５６２細胞は、さまざまな濃度（ｌ〜１０μｇ／ｍｌ）のＡＮ０２４で処置された。細胞溶解物を集め、ウエスタンブロット解析を標準試験計画書に従って行なった。ＢＣＲ−Ａｂｌ、ＣｒｋおよびＳｔａｔ５ＡＹ694/699の発現レベルを測定した。] 図１
[0023] 実施例２−Ｋ５６２細胞を移植されたヌードマウスのＡＮ０２４注入は脾臓肥大を示さず、Ｃｒｋ発現はまったくない（図−２）
Ｋ５６２細胞を移植されたヌードマウスを、腹腔内注射によりイマチニブまたはＡＮ０２４で処置した。百分率白血病成長指数（percent leukemia growth index（ＬＧＩ））の減少が観察された後、マウスを犠牲にして、脾臓を摘出した。脾臓肥大を目視検査によって判断し、対照群マウスはＫ５６２細胞内局在化を示す脾臓肥大を示したと判断した。ＡＮ０２４で処置された細胞は脾臓肥大を示さなかったが、イマチニブで処置されたマウスは僅かな脾臓肥大を示した。これらの結果を図２に示す。] 図２
[0024] Ｃｒｋタンパク質の存在に対して免疫プローブされた脾臓のパラフィン切片は、対照群マウスにおいてＫ５６２局在化を示す増加した細胞密度を伴うＣｒｋ発現の強い局在化を示した。ＡＮ−０２４処置されたマウスは、陰性対照群と類似する、基礎レベルのＣｒｋ発現を示しただけであった。イマチニブ処置されたマウスは、脾臓におけるＫ５６２細胞を示す、Ｃｒｋ発現の局所的な発現領域を示した。対照群マウスは、さらに、Ｋ５６２細胞の存在を示す、Ｃｒｋ発現を示すランダムな皮下腫瘍を生じさせた。]
[0025] これらの結果から、ＡＮ０２４処置がヌードマウスにおけるＬＧＩの後退を引き起こしたことは明白である。イマチニブ処置されたマウスも、ＬＧＩの有意な減少を示したが、ＡＮ−０２４処置マウスに遅れをとった。ＡＮ０２４処置されたマウス、およびイマチニブ処置されたマウスは、両方とも、異常な、生理学的な、表現型異常または行動異常を示さなかった。対照群マウスは、皮膚の下の赤みがかった斑点および腹部の僅かな肥大を伴って、指の損失を伴うランダムな皮下腫瘍の存在を示した。これらの結果から、白血病の治療用の治療薬としてＡＮ−０２４が有望であることは明白である。]
[0026] 実施例３−Ｂａｆ３イマチニブ耐性ネズミＣＭＬ細胞株を用いるｉｎ ｖｉｖｏ研究
ＡＮ０ｌ９およびＡＮ０２４のｉｎ ｖｉｖｏ抗白血病活性を判断するために、ヌードマウスに、Ｂａｆ３ネズミ白血病細胞（Ｗｔ、Ｔ３１５Ｉ、Ｍ３５１ＴおよびＥ２２５Ｋ）を腹腔内移植し、移植の１５日後に、マウスを、強制経口投与または腹腔内注射によって、イマチニブ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＡＮ０１９（２０ｍｇ／ｋｇ）およびＡＮ０２４（２０ｍｇ／ｋｇ）で処置した。血液塗抹標本を尾静脈または大腿静脈から６日おきに得、芽細胞を数えて、グラフに表わした。]
[0027] イマチニブ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＡＮ０１９（２０ｍｇ／ｋｇ）またはＡＮ０２４（２０ｍｇ／ｋｇ）で処置されたＢａｆ３Ｗｔ移植マウスの血液塗抹標本は、４２日後において、正常な対照群と同様であった。]
[0028] イマチニブ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＡＮ０１９（２０ｍｇ／ｋｇ）またはＡＮ０２４（２０ｍｇ／ｋｇ）で処置されたＢａｆ３Ｔ３１５Ｉ移植マウスの血液塗抹標本は、ＡＮ０２４およびＡＮ０１９で処置されたマウスにおいて芽細胞数の有意な減少を示した。イマチニブの経口投与で処置されたマウスは、芽細胞数の減少を示さず、処置していない対照群およびＢａｆ３Ｍ３５１Ｔ移植マウスと同様であった。]
[0029] Ｂａｆ３Ｅ２５５Ｋを移植されたマウスも、Ｂａｆ３Ｍ３５１ＴおよびＢａｆ３Ｔ３１５Ｉ移植マウスと同様に振舞った。]
[0030] Ｂａｆ３突然変異細胞Ｗｔ、Ｅ２５５Ｋ、Ｔ３１５ＩおよびＭ３５１Ｔを移植されたヌードマウスを、イマチニブ、ＡＮ０１９およびＡＮ０２４で（経口および腹腔内で）処置した。簡潔に言うと、マウスは、移植後１５日で、強制経口投与または腹腔内注射によって、イマチニブ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＡＮ０１９（２０ｍｇ／ｋｇ）およびＡＮ０２４（２０ｍｇ／ｋｇ）で処置された。腹部膨満および活動の減少を毎日監視し、血液塗抹標本を６日おきに尾静脈または大腿静脈から得て、標準試験計画書に従ってＨ＆Ｅ染色した。移植の４２日後に、マウスを犠牲にして、脾臓を摘出した。脾臓肥大が判断され、血液塗抹標本の芽細胞数と関連付けられた。]
[0031] 結果
芽細胞数の顕微鏡測定
尾静脈または大腿静脈からの血液を、Ｂａｆ３細胞移植マウスから６日おきに４２日目まで得た。移植後１５日目に、マウスを、先に述べたように（経口および腹腔内で）イマチニブ、ＡＮ０１９およびＡＮ０２４で処置した。Ｂａｆ３Ｗｔ移植マウスでは、芽細胞数の漸進的な減少がすべての処置条件において観察されたことが観察された。Ｂａｆ３Ｍ３５１Ｔ、Ｔ３１５ＩおよびＥ２２５Ｋは、イマチニブ処置に十分に応答しなかった。イマチニブの経口投与は、Ｂａｆ３Ｍ３５１Ｔ、Ｔ３１５ＩおよびＥ２２５Ｋ移植マウスにおいて有意な効果はなかった。全体的な腹腔内処置ＡＮ０２４およびＡＮ０１９は、すべてのＢａｆ３移植マウスにおいて芽細胞数を減少させることにおいて、有意に、より優れていた。]
[0032] Ｂａｆ３Ｗｔ移植マウスにおけるＡＮ０１９処置は、白血病芽細胞の完全な退行を引き起こし、処置していない対照群と類似した。腹腔内処置は経口処置より優れていた。Ｂａｆ３ Ｍ３５１Ｔ、Ｔ３１５ＩおよびＥ２２５Ｋ移植マウスにおけるＡＮ０１９処置は、芽細胞数の有意な減少を示し、４２日目において腹腔内処置されたマウスにおける移植後１２日目と類似した。また、腹腔内処置されたマウスは、経口処置されたマウスより芽細胞の大きな退行を示した。Ｂａｆ３ Ｍ３５１Ｔ、Ｔ３１５ＩおよびＥ２２５Ｋ移植マウスにおけるＡＮ０２４処置は、芽細胞数の有意な減少を示し、４２日目においてＡＮ０１９処置より優れていた。また、腹腔内処置されたマウスは、経口処置されたマウスより芽細胞の大きな退行を示した。]
[0033] 実施例４−Ｋ５６２正常／Ｌｕｃヒト白血病細胞を移植されたヌードマウスの、低用量のＡＮ０２４、ＡＮ０１９およびイマチニブでの、応答（図３Ａおよび図３Ｂ）
ＡＮ０１９、ＡＮ０２４およびイマチニブの経口投与] 図３Ａ 図３Ｂ
[0034] ]
[0035] ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）に、Ｋ５６２細胞（１ｘ１０６）正常／ｌｕｃを、尾静脈を介して移植した。１つの群につき５匹のマウスを使用し、２４の群と２つの対照群とに分けた。すべての群にＫ５６２正常／ｌｕｃ細胞を移植した。２４の群のうち、１２の群をルシフェラーゼ研究に用い、他の１２の群は血液塗抹標本数研究に用いられた。]
[0036] 薬剤は、先に提案されたように、強制経口投与によって投与された（水性懸濁液における２％アラビアゴムおよび２％ＳＬＳ）。]
[0037] 結果
Ｋ５６２ ｌｕｃヒト白血病細胞を移植されたヌードマウスにおけるＡＮ０２４（１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇ）の経口投与は、より高い濃度において、白血病退行をもたらす結果となった。１ｍｇ／ｋｇのＡＮ０２４濃度は、ルシフェラーゼ発現の減少を引き起こさなかったが、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇの濃度は、ルシフェラーゼ発現の減少を引き起こした。]
[0038] Ｋ５６２ ｌｕｃヒト白血病細胞を移植されたヌードマウスにおけるイマチニブ（１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇ）の経口投与は、より高い濃度において、白血病退行をもたらす結果となった。１ｍｇ／ｋｇの濃度のイマチニブ投与は、ルシフェラーゼ発現の減少を引き起こさなかったが、１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇは、ルシフェラーゼ発現の遅延を示した。白血病退行は、ＡＮ—０２４で処置された動物において非常に著しく、イマチニブよりもよかった。これらの結果を図３Ａおよび図３Ｂにおいて示す。] 図３Ａ 図３Ｂ
[0039] 実施例５−薬物有効性（Ｄe）および一時の薬物浸透度（drug temporal penetrance）の測定
薬物有効性（Ｄe）の測定
薬物有効性は、以下の等式Ｄe＝]
[0040] ]
[0041] を用いて測定した。ここで、Σａｌｉｖｅは、濃度毎の、実験の終わりでの生存するマウスの総数×光子数である。Σｌｕｃは、濃度毎の、実験の終わりでルシフェラーゼ発現を示した生存するマウスの総数（ｃは対照群未処置動物である）×光子数である。Σc-initialは、実験の開始時における対照群の動物の最初の数×光子数である。結果を、グラフで、百分率薬物有効性として表わした（表１）。]
[0042] 結果
表１は、ｉｎ ｖｉｖｏ研究から測定される、さまざまな濃度のイマチニブ、ＡＮ０１９およびＡＮ０２４での薬物有効性を示す。表１から、ＡＮ０１９は用量依存的態様でふるまい、イマチニブおよびＡＮ０２４はそうではなく、低い濃度で有効であった。]
[0043] ]
[0044] 一時の薬物浸透度（Ｔp）の測定
一時の浸透度は、以下の等式Ｔp＝]
[0045] ]
[0046] を適用して計算した。ここで、Ｐは、日「ａ」、日「ｔｅｒ」または日「ｂ」における光子数である（ここで、「ａ」は薬物処置を中止した日であり、「ｔｅｒ」は実験を終了した日であり、「ｂ」は日「ａ」の後かつ日「ｔｅｒ」前においてＰが最小であった日である）。ｎは、Ｐが測定されたときに生存していた動物の数である。]
[0047] 値が大きいほど、薬物処置を中止した後の薬物の有効性、つまり経時的な薬物の浸透度がより大きいことを示す。]
[0048] 結果
ＡＮ０１９、ＡＮ０２４およびイマチニブの一時の浸透度を測定するために、ヌードマウスにＫ５６２ｌｕｃ細胞を移植した。移植後、動物を６日間隔で撮影した。薬物処置（ＡＮ０１９を２０ｍｇ／ｋｇ、ＡＮ０２４を２０ｍｇ／ｋｇおよびイマチニブを１０ｍｇ／ｋｇ）を、移植後１５日で、毎日腹腔内注射によって開始した。薬物処置を３５日目に中止し、動物を４５日目まで撮影し、方法において記載されるように計算した。]
[0049] 一時の浸透度に対する等式を適用することにより、Ｔp値を以下のように判断した：
ＡＮ０１９＝２．０
ＡＮ０２４＝２．４
イマチニブ＝０．８
これらのＴpの値は、ＡＮ０２４が、未処置の対照群よりも活性を有し、薬物処置の中止後の経時的な活性に関して、ＡＮ０１９よりも良いことを示している。]
[0050] 実施例６−ＡＮ０２４、ＡＮ０１９およびイマチニブと比較した際の、Ｂａｆ３移植ヌードマウスにおけるダサチニブの効果（図４Ａ、図４Ｂおよび図４Ｃ）
実施例３は、Ｂａｆ３（ｗｔ、Ｔ３１５Ｉ、Ｍ３５１ＴおよびＥ２５５Ｋ）突然変異細胞株を用いて、イマチニブと比較して、ＡＮ０２４およびＡＮ０１９が白血病治療に有効であることを示した。ここで、我々は、ダサチニブを対照薬として用いて、ＡＮ０２４およびイマチニブと比較して、Ｂａｆ３突然変異細胞の処置に対する応答を測定した。] 図４Ａ 図４Ｂ 図４Ｃ
[0051] 方法
実験の概要を以下に表の形式で示す：]
[0052] ]
[0053] ヌードマウスにＢａｆ３突然変異細胞（ｗｔ、Ｔ３１５Ｉ、Ｍ３５１ＴまたはＥ２５５Ｋ）を腹腔内移植した。移植後１５日で、マウスを、１０ｍｇ／ｋｇダサチニブで、２７日間、経口または腹腔内処置した。血液を大腿静脈または尾静脈から６日毎に採取し、芽細胞数を測定し、グラフで表わした。]
[0054] 結果
６日目において、Ｂａｆ３突然変異細胞（ｗｔ、Ｔ３１５Ｉ、Ｍ３５１ＴまたはＥ２５５Ｋ）を移植されたヌードマウスの血液塗抹標本は正常な芽細胞数を示し、芽細胞数は１２日目に観察した通り、漸進的に増大した。ダサチニブ処置を移植後１５日目に開始した。ダサチニブ処置はイマチニブより良いことはなかった。４２日目に、実験を終了し、ｗｔ細胞を移植されたマウスはダサチニブに対して有意な応答を示し、腹腔内処置は経口処置よりも優れていることを示した。Ｔ３１５Ｉ細胞およびＭ３５１Ｔ細胞を移植されたマウスは対照群と同様にふるまい、芽細胞数における有意な減少はなかった。Ｅ２５５Ｋを移植されたマウスは、ダサチニブ処置に対する応答において、Ｔ３１５Ｉ移植細胞よりもほんの僅かしかよくなかった。全体的なダサチニブ処置は、白血病の進行における遅延を引き起こしたのみであり、どのような有意な治療効果もなかった。芽細胞数は、ＡＮ０２４で処置された群においてはずっと低く、この化合物がイマチニブおよびダサチニブよりも白血病治療における優位性と可能性を有することが示された。これらの結果を図４Ａ、図４Ｂおよび図４Ｃに示す。] 図４Ａ 図４Ｂ 図４Ｃ
[0055] 実施例７−神経膠腫細胞株および乳癌細胞株におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ研究（図５Ａ〜図５Ｄ）
材料および方法
放射線照射有り、または放射線照射無しでの、神経膠腫細胞および乳癌細胞に対するＡＮ０１９、ＡＮ０２４およびテモゾロマイド（ＴＭＺ）の効果を測定するために、細胞を指定された用量で処理し、浸潤、血管新生および特定のシグナル伝達分子の変化を測定した。] 図５Ａ 図５Ｂ 図５Ｃ 図５Ｄ
[0056] マトリゲル浸潤アッセイ
所定濃度の化合物の存在下での、４９１０、５３１０およびＵ８７神経膠腫細胞ならびにＭＤＡＭＢ２３１およびＺＲ７１乳癌細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ浸潤性を、修正されたボイデンチャンバー法を用いて評価した。細胞はこれらの化合物で４８時間処置された。１ｘ１０6個の細胞を、０．２％ＢＳＡを補われた６００μｌの無血清培地において懸濁し、マトリゲル（０．７ｍｇ／ｍｌ）で被覆されたトランスウェルチャンバー（Corning Costar Fischer Scientific Cat #07-200-158, Pittsburgh PA）の上部区画に配置した。このチャンバーの下部区画は２００μｌの血清培地で満たされ、細胞を２４時間、遊走させた。インキュベーションの後、細胞を固定し、Ｈｅｍａ−３で染色し、先に記載の通り、定量した（モハナムら（Mohanam et al.）１９９３年）。遊走した細胞を顕微鏡下で撮影し、この発明の化合物によって引き起こされる浸潤性の低減を測定した。]
[0057] 血管新生アッセイ
所定濃度の化合物の存在下での、４９１０、５３１０およびＵ８７神経膠腫細胞ならびにＭＤＡＭＢ２３１およびＺＲ７１乳癌細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ血管新生を以下のように測定した。細胞（２ｘ１０４／ウェル）を８ウェルチャンバースライドに接種し、さまざまな濃度の試験化合物で処理した。２４時間のインキュベーション期間の後、馴化培地を除去し、４ｘ１０４のヒトの皮膚内皮細胞（８ウェルチャンバースライドにおいて単層）に加え、ヒトの皮膚内皮細胞を７２時間成長させた。次いで、細胞を、３．７％ホルムアルデヒドで固定し、Ｈ＆Ｅで染色し、撮影した。]
[0058] ウェスタンブロット解析
所定濃度の化合物の存在下での、４９１０、５３１０およびＵ８７神経膠腫細胞ならびにＭＤＡＭＢ２３１およびＺＲ７１乳癌細胞のウェスタンブロット解析を、標準試験計画書に基づいて評価した。細胞は、所定濃度のＡＮ０１９、ＡＮ０２４またはテモゾロマイドで処理された。処理の２４時間後、細胞を集め、細胞溶解物を抽出した。等しい量のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画した。分画されたタンパク質を、ナイロンメンブレン上にブロットし、ＡＫＴ、ＥＲＫおよびＰｉ３ｋに関して免疫プローブした。乳癌細胞単離タンパク質を、さらに、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ３に対して免疫プローブした。]
[0059] 結果
マトリゲル浸潤アッセイ
所定濃度の化合物の存在下での、４９１０、５３１０およびＵ８７神経膠腫細胞ならびにＭＤＡＭＢ２３１およびＺＲ７１乳癌細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ浸潤を、修正されたボイデンチャンバー法を用いて評価した。細胞はこれらの化合物で４８時間処理された。表２は、放射線照射有り、および放射線照射無しでの、所定濃度の化合物の存在下での、４９１０、５３１０およびＵ８７神経膠腫細胞ならびにＭＤＡＭＢ２３１およびＺＲ７１乳癌細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏマトリゲル浸潤アッセイの研究からの結果を示す。]
[0060] さまざまな細胞株の浸潤性における変化を表２に示す。この浸潤アッセイから、ＡＮ０１９およびＡＮ０２４は、放射線照射有り、および放射線照射無しの両方において、細胞の大半において浸潤を阻害することに最も効果的であったことは明らかである。]
[0061] ]
[0062] 図５Ａは、所定の濃度のＡＮ０２４の存在下における、放射線照射有り、および放射線照射無しでの、４９１０、５３１０およびＵ８７神経膠腫細胞ならびにＭＤＡＭＢ２３１およびＺＲ７１乳癌細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏマトリゲル浸潤アッセイの結果を示す。] 図５Ａ
[0063] 図５Ｂは、所定の濃度のＡＮ０２４の存在下における、放射線照射有り、および放射線照射無しでの、４９１０、５３１０およびＵ８７神経膠腫細胞ならびにＭＤＡＭＢ２３１およびＺＲ７１乳癌細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏマトリゲル浸潤アッセイの結果を示す。] 図５Ｂ
[0064] 血管新生アッセイ
血管新生アッセイ実験から、ＡＮ０１９およびＡＮ０２４は、血管新生を阻害することにおいて最も効果的であったことが観察される。]
[0065] テモゾロマイド処置はＺＲ−７１細胞において完全な血管新生阻害を引き起こし、一方、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞では、対照条件において、放射線照射後における阻害の増加を伴う形で、ほんの僅かな阻害が観察されたのみであった。神経膠腫異種移植片細胞４９１０は、放射線照射有り、および放射線照射無しの両方において、血管新生の有意な阻害を示した。５３１０細胞の場合、血管新生阻害は対照条件において見られ、一方、血管新生は、放射線照射処置の後、促進された。Ｕ８７神経膠腫細胞は、放射線照射有り、および放射線照射無しの両方において、同様の阻害パターンを示した。]
[0066] ＡＮ０２４処置はＺＲ−７１細胞において完全な血管新生阻害を引き起こしたが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞では、対照および放射線照射処置においてほんの僅かな阻害が観察されたのみであった。神経膠腫異種移植片細胞４９１０は、放射線照射有り、および放射線照射無しの両方において、有意な血管新生阻害を示した。５３１０細胞の場合では、血管新生阻害は対照条件において見られ、一方、血管新生は、放射線照射処置の後、さらに阻害された。Ｕ８７神経膠腫細胞は、阻害の増加が放射線照射後にあり、血管新生において有意な遅延を示した。]
[0067] ＡＮ０１９処置はＺＲ−７１細胞において完全な血管新生阻害を引き起こしたが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞では、対照および放射線照射処置の両方において、僅かな阻害が観察された。神経膠腫異種移植片細胞４９１０は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞と同様の血管新生阻害を示し、血管新生阻害の増加が放射線照射後にあった。５３１０細胞の場合、血管新生阻害は、対照条件においては、放射線照射処置後よりも大きかった。Ｕ８７神経膠腫細胞は、放射線照射有り、および放射線照射無しの両方において、血管新生における同様の有意な遅延を示した。]
[0068] 図５Ｃは、放射線照射有りおよび無しでの、所定濃度のＡＮ−０２４の存在下での、４９１０、５３１０およびＵ８７神経膠腫細胞ならびにＭＤＡＭＢ２３１およびＺＲ７１乳癌細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ血管新生アッセイから得られた結果を示す。] 図５Ｃ
[0069] ウェスタンブロット解析
所定濃度のこの発明の化合物の存在下での、４９１０、５３１０およびＵ８７神経膠腫細胞ならびにＭＤＡＭＢ２３１およびＺＲ７１乳癌細胞のウェスタンブロット解析により、以下のことが示された。Ｕ８７細胞は、放射線照射有り、および放射線照射無しの両方において、ＡＫＴレベルまたはＰＩ３ｋレベルにおいて有意な変化を示さなかったが、ＡＮ０２４で処置された細胞においてはＥＲＫレベルにおける僅かな減少が観察され、減少は放射線照射後増加した。４９１０細胞は、Ｕ８７細胞と同様にふるまい、ＡＫＴレベルの減少がＡＮ０２４処置の後に見られ、そのＡＫＴレベルの減少は放射線照射後増加した。５３１０細胞の場合、ＥＲＫ発現には有意な観察可能な差異は見られなかったが、ＡＮ０１９処置はＡＫＴ発現レベルの減少を生じさせた。ＰＩ３ｋのレベルは、ＡＮ０１９で処置された細胞においては、放射線照射無しの状態では殆ど検出不可であったが、放射線照射処置の後、再び現れた。乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の場合は、ＡＫＴ、ＥＲＫまたはＰＩ３ｋにおける有意な変動は見られなかったが、ＺＲ７１の場合には、ＡＮ０１９処置によって、ＡＫＴレベルの減少が生じ、それは放射線照射後増加された。ＡＮ０２４処置は放射線非照射条件下においてどのような有意な変動も示さなかったが、放射線照射後、ＡＮ０２４で処置された細胞はＡＫＴ発現の減少を示した。ＰＩ３ｋレベルは、ＡＮ０１９処置においては、放射線照射有り、および放射線照射無しの両方において、なかった。ＡＮ０２４処置は、放射線照射後、ＰＩ３ｋレベルの減少を引き起こした。ｐＡＫＴのレベルは、放射線照射があってもなくても、どの処置においても有意な変動はなかったが、ｐＥＲＫのレベルは、特に、ＡＮ０１９で処置された細胞において、放射線照射有りおよび放射線照射無しの両方において有意に減少し、ＡＮ０２４も、ｐＥＲＫレベルにおいて減少を示したが、それはＡＮ０１９よりも少ない程度であった。テモゾロマイド処置は、放射線照射有りおよび放射線照射無しの両方において、活発なレベルのｐＡＫＴにおいて有意な変化を全く示さなかった。]
[0070] 図５Ｄは、放射線照射有りおよび無しでの、所定濃度のＡＮ−０２４の存在下での、４９１０、５３１０およびＵ８７神経膠腫細胞ならびにＭＤＡＭＢ２３１およびＺＲ７１乳癌細胞のウエスタンブロット解析の結果を示す。] 図５Ｄ
[0071] 実施例８−白血病生存研究（図６Ａ〜図６Ｃ）
Ｋ５６２ルシフェラーゼ発現細胞をヌードマウスに腹腔内移植した。ルシフェリンの腹腔内注射投与の後、ｘｅｎｏｇｅｎｙＩＶＩＳ撮影ステーションを用いてマウスを走査することにより、移植を判断した。薬物処置を、先の研究の通り、移植後１５日目に開始した。動物に対し、４２日目まで処置を与え、その後、薬物処置を中止し、動物の生存を動物福祉関連規制に従って判断した。対照群動物は白血病を発症し、死亡が３４日目および３５日目に生じたことが観察され、規制に従い、我々は、残りの８匹の動物を３５日目で犠牲にするよう勧告された。薬物処置を移植後４２日目で中止し、動物の生存を判断した。] 図６Ａ 図６Ｂ 図６Ｃ
[0072] ＡＮ０２４で処置された動物は３８日目で死亡を示し、死亡した動物に対するさらなる調査では、脾臓肥大は示されず、死因は白血病以外のものであると判断され、血液塗抹標本は死亡した動物からは取ることができなかった。用いられた１０匹の動物のうち、８匹は、５５日目において、白血病の兆候を全く示さなかった。]
[0073] ＡＮ０１９で処置された動物は全く死亡せず、１０匹のうちの７匹は、白血病の症状が完全に無いことを示した。]
[0074] イマチニブで処置された動物は、薬物処置中止後において再び白血病の症状が生じたことを示し、５５日目、５６日目、５７日目、５８日目に死亡を示した。生存している動物は白血病の症状があることを示した。]
[0075] 図６Ａは、ＡＮ０２４、ＡＮ０１９またはイマチニブでの処置後、移植されたマウスから得られるＫ５６２ｌｕｃのルシフェラーゼ発現の量を示す。] 図６Ａ
[0076] 図６Ｂは、ＡＮ０２４またはＡＮ０１９での処置後、５８日目において治癒した動物の数を示す。薬物処置を４２日目で中止した。動物は、ＡＮ０２４およびＡＮ０１９の処置後、薬物処置の中止後において、治癒効果を示し続けた。] 図６Ｂ
[0077] 図６Ｃは、示された日において動物から得られた血液塗抹標本からの芽細胞数を示す。薬物処置を４２日目で中止した。ＡＮ０２４およびＡＮ０１９は薬物処置の中止後において効果を示した。] 図６Ｃ
[0078] 実施例８Ａ−ＥＤ50、ＬＤ50、ＭＴＤおよび治療指数に関する研究
以下の表は、イマチニブと比較した、この発明の化合物のＥＤ50、ＬＤ50、先に引用したＭＴＤ（最大許容用量）および治療指数をまとめたものである。方法は、J, Pharmacol. Exp. Ther., （1949）, 96: 96-113に従って用いられた。]
[0079] ]
[0080] 実施例９−神経膠腫放射線照射研究（図７Ａおよび図７Ｂ）
ヌードマウスに、４９１０ヒト神経膠腫異種移植片細胞（１ｘ１０6個の細胞）を頭蓋内移植した。移植後１０日で、マウスを、ＡＮ０１９、ＡＮ０２４またはテモゾロマイドを用いて、放射線照射（５Ｇｙ／週）有りまたは無しで処置した。実験は移植後４０日目で終了した。] 図７Ａ 図７Ｂ
[0081] その結果から、対照群の動物の１００％が頭蓋内腫瘍を生じ、放射線照射のみでは腫瘍のサイズの低減には殆ど効果はなかったことが観察された。ＴＭＺ単独で処置された動物は頭蓋内腫瘍における低減を示し、１０匹のうち３匹には腫瘍が完全に見られなかった。放射線照射処置をＴＭＺ投与と組合せたものは、腫瘍のサイズにおいてさらなる退行を生じさせ、動物は、頭蓋内圧の症状（arched back）がより少なくなり、この場合においては、１０匹のうち２匹が観察可能な頭蓋内腫瘍を示さなかった。]
[0082] 放射線照射無しで、ＡＮ０２４で処置された動物は、頭蓋内腫瘍の存在を示したが、それらの腫瘍は十分に輪郭がはっきりとし、対照群またはＴＭＺ処置に見られるような拡散エッジ（diffuse edge）を示さず、１０匹のうち３匹が治癒した。放射線照射処置の後、１０匹のうち７匹が治癒し、腫瘍の存在を示した動物は、十分に輪郭がはっきりとして、外科的に見て礼儀正しい腫瘍を示した。]
[0083] ＡＮ０１９単独で処置された動物はＡＮ０２４で処置された動物と同様の腫瘍を示し、この場合においては、放射線照射有りおよび無しの両方において、１０匹のうち６匹が治癒した。放射線照射後、腫瘍のサイズは有意に低減したことが観察された。]
[0084] 図７Ａは、放射線照射（５Ｇｌｙ）有りまたは無しでの、ＴＭＺ、ＡＮ０２４またはＡＮ０１９での処置後のヌードマウスにおける頭蓋内腫瘍の半定量分析から得られた結果を示す。] 図７Ａ
[0085] 図７Ｂは、放射線処置無しでの、ＡＮ−０２４での薬物治療後において、頭蓋内腫瘍が無いことを示すヌードマウスのグラフ表示を示す。] 図７Ｂ
[0086] この発明の化合物の調製合成および他の局面を以下の実施例において示した。
実施例−１０
（ａ）（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［４−メチル−３−ニトロフェニル］−ベンズアミド）（式（ＩＩＩ））の調製：
３３６ｇ（６モル）の水酸化カリウムの１０４０ｍｌの水における溶液を、式（ＩＩ）の４−メチル−２−ニトロ−アニリン２２．８ｇ（０．１５モル）および式（ＶＩ）の（３−トリフルオロメチルスルホニル）ベンゾイルクロリド１６３．５ｇ（０．６モル）の３８０ｍｌのクロロホルムにおける懸濁液に、３〜４時間の間、３０〜４０℃でゆっくりと加えた。その後、クロロホルム層を分離し、水で洗浄した。有機質層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を真空下で除去して式（ＩＩＩ）の化合物を得た。１８０ｍｌのイソプロピルエーテルを残渣に加えてろ過した。
収量：４２ｇ（９０．６％）
純度：９８．５％（ＨＰＬＣによる）
ＩＲおよびＮＭＲは提案された構造と整合していた。]
[0087] （ｂ）（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［３−アミノ−４−メチルフェニル］−ベンズアミド（式（ＩＶ））の調製：
ステップ（ａ）で得られた式（ＩＩＩ）の（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［４−メチル−３−ニトロフェニル］−ベンズアミド４２．６ｇ（０．１１モル）の１００ｍｌ濃塩酸における懸濁液を、塩化第一スズ１４５．９ｇ（０．６５モル）の３９０ｍｌの濃塩酸における溶液に０〜５℃で３０分間かけてゆっくりと加えた。反応塊を室温にし、２時間維持した。５０％水酸化ナトリウム水溶液を、反応塊に、３０〜４０℃までゆっくり加え、生成物をクロロホルム（２ｘ５００ｍｌ）に抽出し、水（２ｘ５００ｍｌ）で洗浄した。クロロホルム層を活性炭（４ｇ）で処理し、ろ過し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を蒸留によって除去し、残渣を２５０ｍｌのアセトンに溶解し、イソプロピルアルコール性の塩酸塩で処置し、室温で３〜４時間撹拌した。式（ＩＶ）の塩酸塩をろ過し、アセトンで洗浄し、真空下で５０〜６０℃で乾燥させた。
収量：２５ｇ（６１％）
ＩＲおよびＮＭＲは提案された構造と整合していた。]
[0088] （ｃ）（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［３−グアニジノ−４−メチルフェニル］−ベンズアミドＨＣｌ（式（Ｖ））の調製：
２．２ｇ（０．５２モル）のシアナミドの２ｍｌの水における溶液を、ステップｂで得られた式（ＩＶ）の（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［３−アミノ−４−メチルフェニル］−ベンズアミド１０．２５ｇ（０．０２６モル）の６５ｍｌのｎ−ブタノール中における懸濁液に、９０℃で１０分間で加えた。その反応を９０〜９２℃で１時間維持し、ろ過した。それを真空下で６０〜７０℃で乾燥させた。
収量：６．１ｇ（６１％）
ＩＲおよびＮＭＲは提案された構造と整合していた。]
[0089] （ｄ）（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３イル−ピリミジン−（２イルアミノ）−フェニル］−ベンズアミド（式（Ｉ））の調製：
ステップ（ｃ）からの式（Ｖ）の（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［３−グアニジノ−４−メチルフェニル］−ベンズアミド塩酸塩７．８ｇ（０．０１８モル）、３−ジメチルアミノ−１−ピリジン−３−イル−プロペノン（式ＶＩＩ）３．１ｇ（０．０１８モル）、および水酸化ナトリウムフレーク０．７ｇ（０．０１８モル）の６０ｍｌのｎ−ブタノール中における混合物を、１１０℃で７時間加熱した。溶媒を蒸留によって除去し、残渣を７５ｍｌの水で処置し、ろ過した。ろ過した化合物を７５ｍｌのクロロホルムに溶解し、炭素処理を行なった。クロロホルム層を、５％の次亜硫酸ナトリウム溶液（５０ｍｌ）で洗浄し、次いで水で洗浄した。溶媒を蒸留によって除去し、式（Ｉ）の化合物を、残渣に１０ｍｌのクロロホルムおよび５０ｍｌの酢酸エチルの混合物を加えることにより、沈殿させた。固体をろ過し、酢酸エチルで洗浄して、真空下で５０〜６０℃で乾燥させた。
収量：５ｇ（５６％）
ＭＲ：２１４〜２１８℃
ＩＲとＮＭＲは提案された構造と整合していた。]
[0090] この発明の実施形態の利点は次のものを含み得る：
１．式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）および（Ｖ）の中間体。
２．式Ｉの化合物は、すべての生物学的試験によって証拠づけられるように有用な抗腫瘍薬であると分かった。]
[0091] ここで用いられる通り、「約」という語は、有機化学分野において通常の量または範囲における変動、たとえば、有機化学実験室、スケールアップ、もしくは製造設備における現実世界の状況、または抗増殖薬剤を評価する際において測定される温度または時間において生ずるような典型的な変動を指す。この発明の記載において用いられる、「約」という語によって修飾される範囲または量は、「約」という語によって修飾されなくても、この発明の一部である。たとえば、「約１０〜約２０」という記載は、「１０〜２０」という記載も含む。]
[0092] この明細書および特許請求の範囲において用いられる通り、単数形「a」、「an」および「the」は、内容が明らかに他の態様を示す場合を除き、複数形を含むことに注意されたい。したがって、たとえば、「ある１つの化合物（a compound）」を含む組成物に対する言及は、２つ以上の化合物の混合物を含む。さらに、「または」という語は、内容が明らかに他の態様を示すのでなければ、一般に、その、「および／または」を含む意味において用いられることに注意されたい。]
[0093] この明細書に記載のすべての刊行物および特許出願は、この発明が関係する当該技術分野の通常の技術レベルを示す。]
実施例

[0094] この発明を、さまざまな具体的な、および好ましい実施例および技術を参照して記載した。しかしながら、この発明の精神および範囲に存在する限り、数多くの変更および修正を行なってもよいことが理解されるべきである。]

权利要求:

請求項1
式Ｉ：の化合物。
請求項2
増殖性疾患を治療する方法であって、増殖性疾患に対する治療が必要な対象に対して、以下の式：の抗増殖性化合物を投与することを含む、方法。
請求項3
化合物（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［４−メチル−３−ニトロフェニル］−ベンズアミド。
請求項4
（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［４−メチル−３−ニトロフェニル］−ベンズアミドの調製方法であって、式ＶＩの化合物である（３−トリフルオロメチルスルホニル）ベンゾイルクロリドを提供するステップ；および４−メチル−２−ニトロ−アニリンと、式（ＶＩ）の化合物を、アルカリ水溶液を添加して塩化炭化水素溶媒中、約３０℃から約４０℃で縮合させることにより、（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［４−メチル−３−ニトロフェニル］−ベンズアミドを得るステップを含む、方法。
請求項5
化合物（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［３−アミノ−４−メチルフェニル］—ベンズアミド。
請求項6
（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［３−アミノ−４−メチルフェニル］—ベンズアミドの調製方法であって、式ＶＩの化合物である（３−トリフルオロメチルスルホニル）ベンゾイルクロリドを提供するステップ；４−メチル−２−ニトロ−アニリンと、式（ＩＶ）の化合物を、アルカリ水溶液を添加して塩化炭化水素溶媒中、約３０℃から約４０℃で縮合させることにより、式ＩＩＩの化合物である（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［４−メチル−３−ニトロフェニル］−ベンズアミドを得るステップ；および式（ＩＩＩ）の化合物を、約０℃から約５℃で約３〜約４時間、塩化第一スズ／濃塩酸で還元して、（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［３−アミノ−４−メチルフェニル］−ベンズアミドを得るステップを含む、方法。
請求項7
化合物（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［３−グアニジノ−４−メチルフェニル］—ベンズアミド。
請求項8
（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［３−グアニジノ−４−メチルフェニル］−ベンズアミドの調製方法であって：式ＶＩの化合物である（３−トリフルオロメチルスルホニル）ベンゾイルクロリドを提供するステップ；４−メチル−２−ニトロ−アニリンと、式（ＩＶ）の化合物を、アルカリ水溶液を添加して塩化炭化水素溶媒中、約３０℃から約４０℃で縮合させることにより、式ＩＩＩの化合物である（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［４−メチル−３−ニトロフェニル］−ベンズアミドを得るステップ；式（ＩＩＩ）の化合物を、約０℃から約５℃で約３〜約４時間、塩化第一スズ／濃塩酸で還元して、式ＩＶの化合物である（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［３−アミノ−４−メチルフェニル］−ベンズアミドを得るステップ；および式（ＩＶ）の化合物とシアナミド水溶液を、ｎ−ブタノール溶媒中、約９０℃から約９５℃で縮合させて、（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［３−グアニジノ−４−メチルフェニル］−ベンズアミドを得るステップを含む、方法。
請求項9
式Ｉの化合物の調製方法であって、式ＶＩの化合物である（３−トリフルオロメチルスルホニル）ベンゾイルクロリドを提供するステップ；４−メチル−２−ニトロ−アニリンと、式（ＩＶ）の化合物を、アルカリ水溶液を添加して塩化炭化水素溶媒中、約３０℃から約４０℃で縮合させることにより、式ＩＩＩの化合物である（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［４−メチル−３−ニトロフェニル］−ベンズアミドを得るステップ；式（ＩＩＩ）の化合物を、約０℃から約５℃で約３〜約４時間、塩化第一スズ／濃塩酸で還元して、式ＩＶの化合物である（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［３−アミノ−４−メチルフェニル］−ベンズアミドを得るステップ；式（ＩＶ）の化合物と、シアナミド水溶液を、ｎ−ブタノール溶媒中、約９０℃から約９５℃で縮合させて、式Ｖの化合物である（３−トリフルオロメチルスルホニル）−Ｎ−［３−グアニジノ−４−メチルフェニル］−ベンズアミドを得るステップ；および式（Ｖ）の化合物と、３−ジメチルアミノ−１−ピリジン−３−イル−プロペノンを、塩基の存在下、還流温度で縮合させて、式（Ｉ）の化合物を得るステップを含む、方法。