リン脂質結晶、その製造方法、及び損傷組織の治療におけるその使用

专利摘要:
本発明は、結晶状態のリン脂質、その製造方法、それを含む組成物、及び損傷組織の治療におけるその使用を提供する。
公开号:JP2011513375A
申请号:JP2010549191
申请日:2009-03-04
公开日:2011-04-28
发明作者:デレク・ウッドコック
申请人:ブリタニア ファーマシューティカルズ リミテッド；
IPC主号:C07F9-10

专利说明:

[0001] 本発明は、改善されたリン脂質、その治療的使用、及びその製造方法を提供する。]
背景技術

[0002] リン脂質を製剤化する際の問題は、リン脂質を投与することを困難にし、かつ、リン脂質の治療活性を無効にする大きな凝集又は塊が形成することなしに、リン脂質の水性分散物を形成することが困難である可能性があることである。したがって、大きな凝集を形成することなしに、水性分散物として投与し得るリン脂質を提供する必要が依然として存在する。その活性を低減せず、かつ／又は、有機溶媒を使用せずに、リン脂質を滅菌する方法を見出す必要も存在する。]
先行技術

[0003] Akasak T et al. Hyaluronic acid diminishes the resistance to excursion after tendon flexor tendon repair: an invivo biomechanical study. J Biomech 2005; 38: 503
Akali A et al. Decrease in adhesion formation by a single application of 5-fluorouracil after flexor tendon injury. Plast Reconstr Surg 1999; 103: 151-8
BeredjiklianPK. Biologic aspects of flexor tendon laceration and epair. J Bone Joint Surg Am. 2003; 85A (3): 539-50
Berglund M, et al. Patterns ofmRNAexpression for matrix molecules and growth factors in flexor tendon injury: Differences in the regulation between tendon and tendon sheath. J Hand Surg 2006; 31A: 1279-1287
Branford O, et al. A novel biometric material to engineer post-surgical adhesion using the injured digital flexor tendon - synovial complex as an in vivo model. Plast Reconstr Surg 2008; 121: 781-793
Chang J, et al. Studies in flexor tendon wound healing: neutralizing antibody toe TGF-βl increases postoperative range of motion. Plast Reconstr Surg 2000; 105: 148-155
Fu S-C, et al. TGF-βl reverses the effects of matrix anchorage on the gene expression of decorin and procollagen type I in tendon fibroblasts . Clin Orthopaed ReI Res 2005; 431: 226-232
Gelberman RH, Manske PR. Factors influencing flexor tendon adhesions. Hand Clin 1985a; 1: 35-42
Gelberman RH et al, The Early stages of flexor tendon healing: a morphologic study of the first fourteen days. J Hand Surg (Am) 1985b; 10: 776-784 Gelberman RH et al. , Flexor tendon repair. J Orthop Res 1986, 4: 119-28
Gelberman et al. Fibroblast chemotaxis after tendon repair. J Hand Surg 1991; 16: 686-93
Golash A et al. Efficacy ofADCON-T/N after primary flexor tendon repair in zone II: A controlled clinical trial. J Hand Surg 2003; 28B (2): 113-115
Hatano et al, Adhesions from flexor tendon surgery: An animal study comparing surgical techniques. J Hand Surg (Am) 2000; 25: 252-259
He Q, et al. , repair of flexor tendon defects of rabbit with tissue engineering method. Chin J Traumatol 2002; 5: 200-8
Jones ME, al. The role of human-derived fibrin sealant in the reduction of postoperative flexor tendon adhesion formation in rabbits. J Hand Surg (Br) 2002; 27: 278-82.
Kakar S, et al. Differential cellular response within the rabbit tendon unit following tendon injury. / Hand Surg [Br] 1998; 23: 627-632
Khan U et al. Patterns of cellular activation after tendon injury. J Hand Surg 1996; 21B 813-820
Khan U, et al. , Differences in proliferative rate and collagen lattice contraction between endotenon and synovial fibroblasts. J Hand Surg 1998; 23A: 266-273
Khan U, et al. Modulation of the formation of adhesions during the healing of injured tendons. J Bone Joint Surg Br. 2000; 82: 1054-8
Manske PR. Flexor Tendon Healing. J Hand Surgery 1988; 13: 237-45.
Manske PR et al, Flexor tendon healing. Hand Clin 1985; 1 : 25-34
Matthews P, RichardsH. Factors in the adherence of flexor tendon after repair: an experimental study in the rabbit. J Bone Joint Surg 1976; 58B: 230-236
Mills PC, et al., Surface- active phospholipids (surfactant) in equine tendon and tendon sheath fluid. NZ Vet J 2005; 53:154-6
Moro-oka T et al. Mixture of hyaluronic acid and phospholipd prevents adhesion formation on the injured flexor tendon in rabbits. J Orthop Res 2000; 18: 835-40
MorganLW, et al. Glucose degradation products (GDP) retard re-mesothelialisation independently of D-glucose concentration. Kidney Int 2003; 64: 1854-1866
Momose T, Amadio PC, Zhao C, et al. Suture techniques with high breaking strength and low gliding resistance. Acta Orthop Scand 2001; 72: 635-641.
Ngo M., et al. Differential expression of transforming-growth factor beta receptors in a rabbit zone II tendon wound healing model. Plast Reconstr Surg 2001; 108: 1260-7
Nyska M, et al. Decreased adhesion formation in flexor tendons by topical application of enriched collagen solution- a histological study. Arch Orthop Trauma Surg 1987: 106: 192-4
Pennisi E. , Tending tender tendons. Science 2002, 295: 1011
Pfaffl MW, Horgan GW, Dempfle L. Relative expression software tool (REST) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-timePCR. Nucleic Acids Res 2002: 30: e36.
Porat S et al. Improvement of gliding function of flexor tendons by topically applied enriched collagen solution. J Bone Joint Surg Br 1980 62B (2): 208-13
Potenza AD. Critical evaluation of flexor tendon healing and adhesion formation within artificial digital sheaths. J Bone and Joint Surg 1963; 45 A: 1217-1233
Ragoowansi R, et al. differences in morphology, cytoskeletal architecture and proteas production between zone II tendon and synovial fibroblasts in vitro. J Hand Surg (Br) 2003; 28: 465-470
Rolfe KJ et al. A role for TGF-βl induced cellular responses during the wound healing of the non-scarring human fetus? J Invest Dermatol 2007; 127:2656-2667
SpeerDP, Feldman S, Chvapil M. The control of periteninous adhesions using topical beta-aminopropionitrile base. J Surg Res 1985; 38: 252-257
Strickland JW. Development of flexor tendon surgery :twenty-five years of progress. J Hand Surg [Am] 2000; 25: 214-35
Thomas SC et al, Hyaluronic acid and its effect on postoperative adhesions in the rabbit flexor tendon. A preliminary look. Clin Orthop 1986; 206: 281-289
Williams IF et al, The distribution of types I and III collagen and fibronectin in the healing equine tendon. Connect Tissue Res 1984; 12: 211-227
Zhang AY, et al. Inhibition of TGF-β- induced collagen production in rabbit flexor tendons. J Hand Surg 2004; 29A: 2300]
発明が解決しようとする課題

[0004] これらの問題を解決する方法が探索されている。]
課題を解決するための手段

[0005] 本発明によれば、初めての結晶状態のリン脂質が提供される。]
[0006] 本発明の利点は、本発明に係るリン脂質は、塊又は凝集を形成せずに水性溶媒に分散され得ることを含む。本発明に係るリン脂質のさらなる利点は、改善された治療活性を有すること、及び有機溶媒を実質的に含有しないことを含む。前記改善された治療活性は、本願の実施例２から６のデータから明らかである。当該データは、創傷治癒の促進における本発明に係るリン脂質の有効性を示す。]
[0007] ある態様では、本発明に係るリン脂質は凍結乾燥されてよい。ある態様では、本発明に係るリン脂質は滅菌されてよい。ある態様では、前記リン脂質は粒子状であってよい。ある実施態様では、前記リン脂質は、呼吸域粒子の状態であってよい。呼吸域粒子は、肺投与に適切な空気動力学的中央粒子径を有してよく、例えば、呼吸域粒子の空気動力学的中央粒子径は１０μｍ未満であってよい。ある実施態様では、呼吸域粒子は微粒子である。本発明に係るリン脂質は、一般的には、糖の微結晶の外観のような結晶の外観を有する。本発明に係るリン脂質は、室温で極性溶媒（例えば、水）、特に等張極性溶媒（例えば、Ｍ１９９）に分散される際に、形成される分散物が、離散した結晶又は粒子を含むような状態であってよい。前記離散した結晶又は粒子は、少なくとも５倍、特に５０倍の倍率で観察した際に可視的な離散した結晶又は粒子であってよい。本発明に係るリン脂質は、３７℃で極性溶媒（例えば、水）、特に等張極性溶媒（例えば、Ｍ１９９）に分散される際に、形成される分散物が、可視のミセルの凝集を実質的に有しない、本発明に係るリン脂質の微細なミセル分散物を含むような状態であってよい。前記微細なミセル分散物は、実質的に一様な粒子径分布を有してよい。前記微細なミセル分散物は、少なくとも５倍、特に５０倍の倍率で観察した際に可視であってよい。]
[0008] ある態様では、本発明に係るリン脂質は、以下の一般式を有してよい。



式中、Ｒ１及びＲ２は、各々独立に、水素原子又は脂肪酸アシル基を表わし（ある態様では、Ｒ１及びＲ２は、各々独立に、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和の１４から、好ましくは１６から２２まで、好ましくは２０までの炭素原子を有するアシル基を表わす）、Ｒ３は、水素原子若しくはコリン、グリセロール、エタノールアミン、セリン、又はイノシトール基を表わし、Ｒ１及びＲ２の双方が水素原子とはなり得ない。]
[0009] ある態様では、Ｒ１又はＲ２によって独立に表わされる脂肪酸アシル基は、パルミトイルＣ１６：０及びステアロイルＣ１８：０などの飽和基、並びに／又はオレオイルＣ１８：１及びＣ１８：２などの不飽和基であってよい。ある実施態様では、Ｒ１及びＲ２は、前記リン脂質がジアシルを示すような水素原子を表わさなくてよい。ある実施態様では、Ｒ１及びＲ２は、同一の飽和又は不飽和アシル基、特にジパルミトイル及びジステアロイルを表わしてよい。ある実施態様では、前記リン脂質は、その様なリン脂質の混合物、特にジパルミトイルが主要なジアシル成分である混合物であってよい。]
[0010] 前記リン脂質は、場合によって、動物由来若しくは植物由来であってよく、又は合成によって製造されてよい。人工のリン脂質は、天然には生じないリン脂質であると一般的に解されており、好ましくは、動物由来のタンパク質を含むリスクの無い合成リン脂質である。前記リン脂質は、動物由来のリン脂質であってよく、又は上述のような合成リン脂質であってよい。]
[0011] 前記リン脂質は、好ましくは、単独の有効成分として治療方法において使用される。したがって、本発明に係る医薬組成物は、好ましくは、治療剤としてリン脂質のみを含む。前記リン脂質は、好ましくは、コレステロール又はトリグリセリドを実質的に含まない。前記リン脂質は、好ましくは、抗凍結剤も実質的に含まない。]
[0012] 前記リン脂質は、好ましくは、ジアシルホスファチジルコリン及びホスファチジルグリセロールの混合物である。前記ホスファチジルグリセロールは、有利には、ジアシルホスファチジルグリセロールである。前記ホスファチジルグリセロールのアシル基は、同一又は異なるものであってよく、有利には、各々、１４から２２の炭素原子を有してよい脂肪酸アシル基である。実施には、前記ホスファチジルグリセロール成分は、異なるアシル基を含有するホスファチジルグリセロールの混合物であってよい。前記ホスファチジルグリセロールの脂肪酸アシル基の少なくとも一部が不飽和脂肪酸アシル基、例えば、モノ又はジ不飽和Ｃ１８又はＣ２０脂肪酸アシル基であることが好ましい。]
[0013] 前記ホスファチジルグリセロール成分の好ましいアシル置換基は、パルミトイル、オレオイル、リノレオイル、リノレノイル、ミリストイル、及びアラキドノイルである。前記リン脂質は、好ましくは、ジパルミトイル、ホスファチジルコリン、及びホスファチジルグリセロールを含む。]
[0014] 前記リン脂質は、好ましくは、１：９から９：１、好ましくは６：４から８：２、より好ましくは約７：３の重量比のＤＰＰＣ及びＰＧの混合物である。ＤＰＰＣは、Ｂａｅｒ ＆ Ｂａｃｈｒｅａ，Ｃａｎ．Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ １９５９，３７，ｐａｇｅ ９５３の方法を使用する、グリセリルホスファチジルコリンのアシル化によって合成により製造でき、Ｓｉｇｍａ（Ｌｏｎｄｏｎ）Ｌｔｄ．から購入することが可能である。ＰＧは、Ｃｏｍｆｒｉｏｎｓ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １９７７，４８８，ｐａｇｅｓ ３６ ｔｏ ４２及びＤａｗｓｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．１９６７，１０２，ｐａｇｅｓ ２０５ ｔｏ ２１０の方法によって、タマゴのホスファチジルコリンから製造するか、又はダイズレシチンなどの他のホスファチジルコリンから製造し得る。]
[0015] 本発明は、驚くべきことに、界面活性を示す温度が体温よりも高いために生じる、ＤＰＰＣを完全に治療活性を有するようにする際の課題を解決する。ＤＰＰＣについての、液体（好ましくは、水）境界における、固体相から液体相への相転移の温度は４１℃であり、これは３７℃である体温よりも高い。治療活性形態のＤＰＰＣを得る２つの主要な方法が存在している。これらは、他のリン脂質、場合によってはタンパク質、脂肪酸、及び／又はコレステロールとの混合物としてＤＰＰＣを含有する動物由来のリン脂質を使用するか、又はリン脂質及び他の化合物との非天然混合物である合成リン脂質を使用する。]
[0016] 動物由来のリン脂質は、ブタ又はウシの肺などの哺乳動物の肺をミンチにするか又は前記肺からの洗浄によって、一般的な方法で得られてよい。動物由来のリン脂質の例は、ミンチにしたブタの肺から製造され、９９％のリン脂質及び１％のサーファクタントタンパク質からなる、Ｃｕｒｏｓｕｒｆ（商標）（Ｃｈｉｅｓｉ Ｆａｒｍａｃｅｕｔｉｃｉ）；ウシの肺の洗浄で得られ、９０％のリン脂質、約１％のタンパク質、３％のコレステロール、０．５％の遊離脂肪酸、及びトリグリセリドを含む他の成分を含有する、Ａｌｖｅｏｆａｃｔ（商標）（Ｄｒ．Ｋａｒｌ Ｔｈｏｍａｅ，Ｌｔｄ．，Ｇｅｒｍａｎｙ）；ミンチにしたウシの肺の脂質抽出によって調製され、約８４％のリン脂質、１％のタンパク質、及び６％の遊離脂肪酸を含有する、Ｓｕｒｖａｎｔａ（商標）（Ａｂｂｏｔｔ，Ｌｔｄ．，Ｇｅｒｍａｎｙ）；ウシの肺の洗浄によって製造される、ＢＬＥＳ（ＢＬＥＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｃａｎａｄａ）；又は子牛の肺の洗浄によって製造され、２６ｍｇ／ｍｌのホスファチジルコリン（ＰＣ）、２６ｍｇ／ｍｌのジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、０．６５ｍｇ／ｍｌのタンパク質、及び０．２６ｍｇ／ｍｌの疎水性ペプチドである３５ｍｇ／ｍｌのリン脂質を含有する、カルファクタントとしても知られるＩｎｆａｓｕｒｆ（商標）（Ｆｏｒｅｓｔ Ｌａｂｓ）を含む。]
[0017] 合成リン脂質は、好ましくは、ＤＰＰＣ、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、若しくはジステアリルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）などのジアシルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ＰＣ、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジン酸、及び／又はリゾリン脂質である。]
[0018] 市販の合成リン脂質製品の例は、２６モル部のＤＰＰＣ、８モル部のＰＯＰＧ、５モル部のＰＡ、及び１部のＫＬ−４を含有する、ルシナクタントとしても知られるＳｕｒｆａｘｉｎ（商標）（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌａｂｓ）；組換えＳＰ−Ｃ、ＤＰＰＣ、ＰＧ、及びＰＡを含有する、ルスプルチドとしても知られるＬｕｎｇ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ＦａｃｔｏｒＬＳＦ（Ａｌｔａｎａ）；ＤＰＰＣ（〜８４％）、セチルアルコール、及びチロキサポールからなる、Ｅｘｏｓｕｒｆ（商標）（ＧＳＫ，Ｇｅｒｍａｎｙ）；又は７：３の重量比のＤＰＰＣ及びＰＧの混合物からなる、プマクタント（ｐｕｍａｃｔａｎｔ）（Ｂｒｉｔａｎｎｉａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を含む。]
[0019] 治療活性を有するＤＰＰＣを作製する既知の方法の課題は、それらは費用が高いこと、ＤＰＰＣの濃度が小さいこと、他の効果を有する添加物を含める可能性があることである。本発明は、水に容易に可溶な形態で提供することにより治療活性を有するＤＰＰＣを作製することによって、この課題に対する解決方法を提供する。]
[0020] 前記リン脂質は、好ましくは、体温（治療されるヒト又は動物の身体の温度）とほぼ同じ又はそれより低い融点又は転移温度を有するリン脂質又はリン脂質の混合物である。関連する転移温度は、リン脂質が脂質表面に広がり及び／又は界面活性を有する温度である。その様なリン脂質の混合物は、好ましくは、ＰＧ、ＰＥ、ＰＳ、又はＰＩなどの体温とほぼ同じ又はそれより低い融点を有するスプレッディングリン脂質（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）を含有する。]
[0021] 本発明によれば、
極性溶媒にリン脂質を分散させる工程；
リン脂質分散物を均質化する工程；
均質化したリン脂質を濾過して滅菌する工程；及び
濾過したリン脂質分散物を凍結乾燥する工程
を含む、本発明に係るリン脂質の製造方法がさらに提供される。]
[0022] 本発明の方法において、均質化したリン脂質を濾過することが可能であったことは驚くべきことであった。極性溶媒にリン脂質を分散させたものは、フィルターの孔を詰まらせる凝集を形成するであろうと予測されていた。本発明に係る方法は、ＤＰＰＣを治療的により活性を有する形態にする手法を提供する。かくして、前記方法は、ＤＰＰＣをさらに希釈することなく、かつ、副作用のリスクを伴う可能性がある添加剤を導入することなく、ＤＰＰＣの治療活性形態を提供する代替的な手段を提供する。]
[0023] 前記濾過工程は、好ましくは０．５μｍ、より好ましくは０．２μｍのフィルターを使用する。ある態様では、滅菌工程は加圧濾過を使用する。]
[0024] 本発明に係る方法の分散工程で使用する極性溶媒は、一般的には、リン脂質がリポソーム分散物を形成する極性溶媒である。ある実施態様では、前記極性溶媒は水であってよい。プマクタントなどの幾つかのリン脂質は、温度及び／又は水感受性である。したがって、本発明の方法が、治療活性を有するリン脂質の製造に効果的であることは驚くべきことである。]
[0025] 均質化工程では、リポソーム分散物中のリポソームのサイズが低減される。ある実施態様では、前記均質化工程はホモジナイザーを使用する。前記ホモジナイザーは、超音波、圧力、又は機械的なホモジナイザーであってよい。]
[0026] 凍結乾燥工程は、好ましくは、抗凍結剤を使用せずに実施される。抗凍結剤は、例えば、氷の結晶の形成による、凍結損傷から物質を保護するために使用される物質である。一般的に使用される抗凍結剤の例は、グルコース、スクロース、マンニトール、又はトレハロースなどの糖分子を含む。]
[0027] 分散工程、均質化工程、及び／又は滅菌工程は、リン脂質の転移温度よりも高い温度で実施される。リン脂質の関連する転移温度は、脂質の存在下において固体相から液層にリン脂質が相転移する温度、すなわち、リン脂質が脂質表面に広がり及び／又は界面活性になる温度である。]
[0028] 本発明によれば、
極性溶媒にリン脂質を分散させる工程；
前記リン脂質分散物を均質化する工程；
前記リン脂質分散物を凍結乾燥する工程；
前記凍結乾燥したリン脂質を微粉化する工程
を含む、本発明に係るリン脂質を調製する方法も提供される。前記方法は、場合によって、濾過工程を含む。]
[0029] 本発明によれば、本発明の方法によって得られ得る第二のリン脂質も提供される。]
[0030] 本発明によれば、製薬学的に許容される希釈剤とともに、本発明に係る第一又は第二のリン脂質を含む医薬組成物も提供される。]
[0031] 本発明に係る医薬組成物は、製薬学的に許容される希釈剤又はビヒクルを含む。任意の適合する希釈剤又はビヒクルが使用されてよい。ある態様では、前記希釈剤は、等張極性溶媒、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、リンガー乳酸塩、注射用水、Ｍ１９９、及び／又はハートマン液である。ある態様では、希釈剤を添加してもよい。ある態様では、前記希釈剤は、グリセロールを実質的に含まない。ある態様では、前記希釈剤は、水酸化ナトリウムを実質的に含まなくてよい。ある態様では、前記希釈剤は、緩衝液、例えば、Ｔｒｉｓ及び／又は乳酸塩を含んでよい。]
[0032] ある実施態様では、本発明で使用する製薬学的に許容される希釈剤は、界面活性剤を含む。界面活性剤は、体温より高い融点を有するリン脂質を前記組成物で使用することを可能にするため有用である。より好ましくは、前記界面活性剤は、製薬学的に許容される界面活性剤又は疎水性タンパク質である。その様な化学物質の例は、２１アミノ酸の合成ペプチドであるＫＬ−４；非イオン性界面活性剤であるチロキサポール；セチルアルコール（又はヘキサデカノール）；又はパルミチン酸コレステリルを含む。さらに適切な希釈剤は、タンパク質、特に吸収を促進するタンパク質、例えば、アポプロテインＢである。]
[0033] 本発明によれば、第一の部分は本発明に係る第一又は第二のリン脂質を含み、第二の部分は製薬学的に許容される希釈剤を含む、少なくとも２つの部分を有する、本発明に係る医薬組成物を調製するためのキットも提供される。]
[0034] ある実施態様では、本発明に係るキットの各部分は、容器、例えば、袋又はバイアルにて提供される。]
[0035] 本発明によれば、損傷組織の治療において使用するための、本発明に係る第一若しくは第二のリン脂質又は本発明に係る医薬組成物が提供される。]
[0036] 本発明によれば、損傷組織の治療において使用するための医薬の製造における、本発明に係る第一若しくは第二のリン脂質又は本発明に係る医薬組成物の使用も提供される。]
[0037] 本発明によれば、治療上有効量の本発明に係る第一又は第二のリン脂質を、治療が必要なヒト又は動物の患者に適用する工程を含む、損傷組織の治療方法も提供される。前記第一又は第二のリン脂質は、好ましくは、本発明に係る医薬組成物の形態にある。]
[0038] 前記リン脂質は、好ましくは、１、好ましくは１０μｇ、より好ましくは５０μｇから１０００ｍｇまで、好ましくは８００ｍｇまで、より好ましくは３００ｍｇまでの量で適用される。適用されるリン脂質の量は、損傷組織の領域若しくは容量又は患者の体重に依存してよい。]
[0039] ある態様では、本発明における損傷組織の治療は、例えば、ケラチン生成細胞、腱鞘の滑液分泌内皮細胞（lining cell）、又は他の上皮細胞の再上皮化を容易にする。本発明によって容易にされる可能性があるさらなる修復プロセスは、内在性又は移動細胞（例えば、繊維芽細胞）の表現型又は機能の変化である。換言すると、リン脂質は、好ましくは、再上皮化及び／又は内在性細胞型の表現型又は機能の変化を容易にすることによって損傷組織を治療するために使用される。再上皮化は、上皮又は他の表面細胞の再成長を意味する。]
[0040] 本発明によって治療しようとする損傷組織は、外来性又は内在性の組織であってよい。前記損傷組織は、皮膚、器官組織、結合組織（特に、負荷がかかっている（load bearing）結合組織（例えば、腱組織及び／又は腱鞘））、又は膜（上皮又は結合組織の膜）であってよい。ある態様では、本発明によって治療しようとする損傷組織は、ヒト又は動物の表面上の開放又は擦傷である。治療しようとするヒト又は動物の身体の表面は、場合によって、内部又は外部表面のいずれかである。前記組織は、物理的外傷の結果で損傷しているか、又は慢性的な炎症プロセスによるものであってよい。物理的外傷の例は、例えば、火傷による怪我若しくは損傷、事故若しくは手術による切開、暴力的若しくは破壊的な行為を含む。本発明によって治療される内部の物理的外傷は、事故的な作用又は手術のような意図した作用による損傷によって生じる内部の事故的な物理的外傷である。本発明によって治療しようとする外部の物理的外傷は、外部の事故的な物理的外傷、並びに例えば皮膚移植のために皮膚を除去することによって生じる外傷などの手術による外部の手術による物理的損傷を含む。前記損傷組織は、場合によっては、火傷、開放、又は擦傷などの、表面の状態が事故的に侵食されたヒト又は動物の表面上の部位である。組織に対する損傷は、炎症によって悪化されている可能性がある。本発明によって治療しようとする動物は、哺乳動物であってよい。]
[0041] 本発明に係るリン脂質又は医薬組成物は、好ましくは、傷に局所的に適用される。]
[0042] ある態様では、本発明における損傷組織の治療は、手術による癒着を防止するための、手術過程における損傷組織の治療を含む。実施例１２のデータは、プマクタントを用いた治療によって、癒着の組織／存在の統計的に有意な低減がもたらされたことを示す。]
[0043] 本発明を、特許請求の範囲を制限することを意図していない、図面を参照することによって説明する。]
図面の簡単な説明

[0044] 図１は、引掻き傷を付けた後の再中皮化速度（ピクセル／時間）のスケールをｙ軸に備えた棒グラフを示し、左から一番目のバーは線を引いていないものであり、対照の傷が閉じる速度を示し、左から二番目のバーは斜線を引いたものであり、ＡＬＥＣ（登録商標）についての傷が閉じる速度を表し、左から三番目のバーは平行線を引いたものであり、２％ｖ／ｖのウシ胎仔血清についての傷が閉じる速度を表す。
図２は、引掻き傷を付けた後の再中皮化の速度（ピクセル／時間）のスケールをｙ軸に備えた棒グラフを示し、左から一番目のバーは線を引いていないものであり、対照の傷が閉じる速度を表し、左から二番目のバーは平行線を引いたものであり、２％ｖ／ｖのウシ胎仔血清についての傷が閉じる速度を表し、左から三番目のバーは縦線を引いたものであり、１ｍｇ／ｍｌの用量の実施例１によって調製したリン脂質についての傷が閉じる速度を表し、左から四番目のバーは交差線を引いたものであり、２ｍｇ／ｍｌの用量の実施例１によって調製したリン脂質についての傷が閉じる速度を示し、左から五番目のバーは水平に波線を引いたものであり、４ｍｇ／ｍｌの用量の実施例１によって調製したリン脂質についての傷が閉じる速度を示す。
図３は、引掻き傷を付けた後のＮＨＥＫ−Ａ修復速度（ピクセル／時間）をｙ軸上のスケールに備えた棒グラフを示し、左から一番目のバーは線を引いていないものであり、対照の傷が閉じる速度を表し、左から二番目のバーは横線を引いたものであり、２％ｖ／ｖのウシ胎仔血清についての傷が閉じる速度を示し、左から三番目のバーは縦線を引いたものであり、１ｍｇ／ｍｌの用量の実施例１によって調製したリン脂質についての傷が閉じる速度を示し、左から四番目のバーは交差線を引いたものであり、２ｍｇ／ｍｌの用量の実施例１によって調製したリン脂質についての傷が閉じる速度を示し、左から五番目のバーは水平に波線を引いたものであり、４ｍｇ／ｍｌの用量の実施例１によって調製したリン脂質についての傷が閉じる速度を示す。
図４は、ＨＰＭＣ細胞の傷領域（ピクセルで測定）のスケールをｙ軸に、時間（時、ｈ）をｘ軸に備えたグラフを示し、４ｍｇ／ｍｌの用量の実施例１によって調製したリン脂質を用いて治療した傷に関するデータポイントは「Ｘ」で示し、２ｍｇ／ｍｌの用量の実施例１によって調製したリン脂質を用いて治療した傷についてのデータポイントは「▲」で示し、Ｍ１９９及び２％ｖ／ｖウシ胎仔血清を用いて治療した傷についてのデータポイントは■で示す。
図５は、ＨＰＭＣ細胞の増殖（増加した倍数fold increase）のスケールをｙ軸に、時間（時、ｈ）をｘ軸に備えたグラフを示し、０．１２５ｍｇ／ｍｌの用量の実施例１によって調製したリン脂質を用いて処理した細胞についてのデータポイントは「Ｘ」で示し、０．２５ｍｇ／ｍｌの用量の実施例１によって調製したリン脂質を用いて処理した細胞についてのデータポイントは「■」で示し、０．５ｍｇ／ｍｌの用量の実施例１によって調製したリン脂質で処理した細胞についてのデータポイントは「０」で示し、１ｍｇ／ｍｌの用量の実施例１によって調製したリン脂質で処理した細胞のデータポイントは「●」で示し、Ｍ１９９及び２％ｖ／ｖウシ胎仔血清を用いて処理した細胞についてのデータポイントは「□」で示す。
図６ＡからＦは、ＨＰＭＣ増殖アッセイの結果の棒グラフを示す。図６Ａは、記載されているｖ／ｖ％量のＦＣＳを用いて処理した細胞についての４８時間後の結果を示す。図６Ｂは、記載したｍｇ／ｍｌ量の実施例１に記載のように調製した振動（vibrated）リン脂質を用いて処理した細胞についての４８時間後の結果を示す。図６Ｃは、記載したｍｇ／ｍｌ量の実施例１に記載のように調製した非振動リン脂質を用いて処理した細胞についての４８時間後の結果を示す。図６Ｄは、記載したｖ／ｖ％量のＦＣＳを用いて処理した細胞についての７２時間後の結果を示す。図６Ｅは、記載したｍｇ／ｍｌ量の実施例１に記載のように調製した振動リン脂質を用いて処理した細胞についての７２時間後の結果を示す。図６Ｆは、記載したｍｇ／ｍｌ量の実施例１に記載したように調製した非振動リン脂質を用いて処理した細胞についての７２時間後の結果を示す。ｙ軸は、増殖のスケール（対照に対する絶対単位で測定される）を有し、エラーバーは標準偏差を示し、ｎは試験したウェルの数を示し、血清無しで組織培養培地（Ｍ１９９）を用いて刺激した細胞である陰性対照（Ｃ）と比較した*ｐ＜０．０５を示す。
図７ＡからＦは、ＨＰＭＣ増殖アッセイの結果の棒グラフを示す。図７Ａは、記載したμｇ／ｍｌ量のリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）を用いて処理した細胞についての４８時間後の結果を示す。図７Ｂは、記載したｍｇ／ｍｌ量のＤＰＰＣを用いて処理した細胞についての４８時間後の結果を示す。図７Ｃは、記載した（ｍｇ／ｍｌ）（μｇ／ｍｌ）量のＤＰＰC／ＬＰＡを用いて処理した細胞についての４８時間後の結果を示す。図７Ｄは、記載したμｇ／ｍｌ量のリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）を用いて処理した細胞の７２時間後の結果を示す。図７Ｅは、記載したｍｇ／ｍｌ量のＤＰＰＣを用いて処理した細胞についての７２時間後の結果を示す。図７Ｆは、記載した（ｍｇ／ｍｌ）（μｇ／ｍｌ）量のＤＰＰC／ＬＰＡを用いて処理した細胞についての７２時間後の結果を示す。ｙ軸は、増殖スケール（対照に対する絶対単位で測定される）を有し、エラーバーは標準偏差を示し、ｎは試験したウェルの数を示し、陰性対照（Ｃ）は、血清無しで組織培養培地を用いて刺激した細胞についてのものである陰性対照（Ｃ）と比較した。
図８ＡからＦは、ＨＰＭＣ増殖アッセイの結果の棒グラフを示す。図８Ａは、記載したｍｇ／ｍｌ量のＰＯＰＣを用いて処理した細胞についての４８時間後の結果を示す。図８Ｂは、記載したμｇ／ｍｌ量のＣｕｒｏｓｕｒｆ（商標）を用いて処理した細胞についての４８時間後の結果を示す。図８Ｃは、記載したｍｇ／ｍｌ量のタマゴ-ＰＧ（ＥＰＧ）を用いて処理した細胞についての４８時間後の結果を示す。図８Ｄは、記載したｍｇ／ｍｌ量のＰＯＰＣを用いて処理した細胞についての７２時間後の結果を示す。図８Ｅは、記載した量のμｇ／ｍｌ量のＣｕｒｏｓｕｒｆ（商標）を用いて処理した細胞についての７２時間後の結果を示す。図８Ｆは、記載したｍｇ／ｍｌ量のタマゴ−ＰＧを用いて処理した細胞についての７２時間後の結果を示す。ｙ軸は、増殖スケール（対照に対する絶対単位で測定される）を有し、エラーバーは標準偏差を示し、ｎは試験したウェルの数を示し、血清無しで組織培養培地（Ｍ１９９）を用いて刺激した細胞である陰性対照（Ｃ）と比較した*ｐ＜０．０５を示す。
図９ＡからＦは、ＨＰＭＣ増殖アッセイの結果の棒グラフを示す。図９Ａは、血清を含まない組織培養培地（Ｍ１９９）中における、記載したｖ／ｖパーセント、すなわち、１０％ｖ／ｖのＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）の脂肪エマルジョンを用いて処理した細胞についての４８時間後の結果を示す。図９Ｂは、血清を含まない組織培養培地（Ｍ１９９）中における、記載したｖ／ｖパーセント、すなわち、２０％ｖ／ｖのＩｎｔｒａｌｉｐｉｄの脂肪エマルジョンを用いて処理した細胞についての４８時間後の結果を示す。図９Ｃは、血清を含まない組織培養培地（Ｍ１９９）中における、記載したｖ／ｖパーセント、すなわち、３０％ｖ／ｖのＩｎｔｒａｌｉｐｉｄの脂肪エマルジョンを用いて処理した細胞についての４８時間後の結果を示す。図９Ｄは、血清を含まない組織培養培地（Ｍ１９９）中における、記載したｖ／ｖパーセント、すなわち、１０％ｖ／ｖのＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）の脂肪エマルジョンを用いて処理した細胞についての７２時間後の結果を示す。図９Ｅは、血清を含まない組織培養培地（Ｍ１９９）中における、記載したｖ／ｖパーセント、すなわち、２０％ｖ／ｖのＩｎｔｒａｌｉｐｉｄの脂肪エマルジョンを用いて処理した細胞についての７２時間後の結果を示す。図９Ｆは、血清を含まない組織培養培地（Ｍ１９９）中における、記載したｖ／ｖパーセント、すなわち、３０％ｖ／ｖのＩｎｔｒａｌｉｐｉｄの脂肪エマルジョンを用いて処理した細胞についての７２時間後の結果を示す。ｙ軸は、増殖スケール（対照に対する絶対単位で測定される）を有し、エラーバーは標準偏差を示し、ｎは試験したウェルの数を示し、血清無しで組織培養培地（Ｍ１９９）を用いて刺激した細胞である陰性対照（Ｃ）と比較した*ｐ＜０．０５を示す。
図１０ＡからＦは、ＨＰＭＣ増殖アッセイの結果の棒グラフを示す。図１０Ａは、血清を含まない組織培養培地（Ｍ１９９）中における、記載したｍｇ／ｍｌ量のリポイドリン脂質製品Ｓ７５を用いて処理した細胞についての４８時間後の結果を示す。図１０Ｂは、血清を含まない組織培養培地（Ｍ１９９）中における、記載したｍｇ／ｍｌ量のリポイドリン脂質製品Ｅ８０を用いて処理した細胞についての４８時間後の結果を示す。図１０Ｃは、血清を含まない組織培養培地（Ｍ１９９）中における、記載したｍｇ／ｍｌ量のリポイドリン脂質製品Ｓ７５−３を用いて処理した細胞についての４８時間後の結果を示す。図１０Ｄは、血清を含まない組織培養培地（Ｍ１９９）中における、記載したｍｇ／ｍｌ量のリポイドリン脂質製品Ｓ７５を用いて処理した細胞についての７２時間後の結果を示す。図１０Ｅは、血清を含まない組織培養培地（Ｍ１９９）中における、記載したｍｇ／ｍｌ量のリポイドリン脂質製品Ｅ８０を用いて処理した細胞についての７２時間後の結果を示す。図１０Ｆは、血清を含まない組織培養培地（Ｍ１９９）中における、記載したｍｇ／ｍｌ量のリポイドリン脂質製品Ｓ７５−３を用いて処理した細胞についての７２時間後の結果を示す。ｙ軸は、増殖スケール（対照に対する絶対単位でされる）を有し、エラーバーは標準偏差を示し、ｎは試験したウェルの数を示し、陰性対照（Ｃ）は、血清無しで組織培養培地（Ｍ１９９）を用いて刺激した細胞のものである。
図１１ＡからＬは、記載したｖ／ｖ％量のＦＣＳ（図１１Ａ）、記載したｍｇ／ｍｌ量の実施例１に記載のように調製した振動リン脂質（図１１Ｂ）、記載したｍｇ／ｍｌ量の実施例１に記載のように調製した非振動リン脂質（図１１Ｃ）、記載したμｇ／ｍｌ量のＬＰＡ（図１１Ｄ）、記載したｍｇ／ｍｌ量のＤＰＰＣ（図１１Ｅ）、記載した（ｍｇ／ｍｌ）／（μｇ／ｍｌ）量のＤＰＰＣ／ＬＰＡ（図１１Ｆ）、記載したｍｇ／ｍｌ量のＰＯＰＣ（図１１Ｇ）、記載したμｇ／ｍｌ量のＣｕｒｏｓｕｒｆ（商標）（図１１Ｈ）、記載したｍｇ／ｍｌ量のタマゴ−ＰＧ（図１１Ｉ）、血清を含まない組織培養培地（Ｍ１９９）中における、記載したｖ／ｖパーセント、すなわち、１０％ｖ／ｖのＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）の脂肪エマルジョン（図１１Ｊ）、血清を含まない組織培養培地（Ｍ１９９）中における、記載したｖ／ｖパーセント、すなわち、２０％ｖ／ｖのＩｎｔｒａｌｉｐｉｄの脂肪エマルジョン（図１１Ｋ）、血清を含まない組織培養培地（Ｍ１９９）中における、記載したｖ／ｖパーセント、すなわち、３０％ｖ／ｖのＩｎｔｒａｌｉｐｉｄの脂肪エマルジョン（図１１Ｌ）を用いて処理した１つのウェルの細胞についての７２時間後のＨＰＭCＡＴＰアッセイの結果の棒グラフである。ｙ軸は、対照値のパーセントとしてのＡＴＰ値を示す。
図１２ＡからＦは、ＮＥＫａ増殖アッセイの結果の棒グラフを示す。図１２Ａは、記載したｖ／ｖ％量のＦＣＳを用いて処理した細胞についての４８時間後の結果を示す。図１２Ｂは、記載したｍｇ／ｍｌ量の図１に記載のように調製した振動リン脂質を用いて処理した細胞についての４８時間後の結果を示す。図１２Ｃは、記載したｍｇ／ｍｌ量の実施例１に記載のように調製した非振動リン脂質を用いて処理した細胞についての４８時間後の結果を示す。図１２Ｄは、記載したｖ／ｖ％量のＦＣＳを用いて処理した細胞についての７２時間後の結果を示す。図１２Ｅは、記載したｍｇ／ｍｌ量の図１に記載のように調製した振動リン脂質を用いて処理した細胞の７２時間後の結果を示す。図１２Ｆは、記載したｍｇ／ｍｌ量の実施例１に記載のように調製した非振動リン脂質を用いて処理した細胞についての７２時間後の結果を示す。ｙ軸は、増殖スケール（対照に対する絶対単位で測定される）を有し、エラーバーは標準偏差を示す。
図１３ＡからＪは、２％ｖ／ｖ ＦＣＳと、記載したｍｇ／ｍｌ量の、ハートマン（Ｈａｒｔｍａｎｎ’ｓ）溶液及びＭ１９９の５０：５０ｖ／ｖ混合物を培地として使用して実施例１に記載のように調製した振動リン脂質と（図１３Ａ及び１３Ｂ）、２％ｖ／ｖＦＣＳと、記載したｍｇ／ｍｌ量の、リンガー（Ｒｉｎｇｅｒ）溶液及びＭ１９９の５０：５０ｖ／ｖ混合物を培地として使用して実施例１に記載のように調製した振動リン脂質と（図１３Ｃ及び１３Ｄ）、２％ｖ／ｖＦＣＳと、記載したｍｇ／ｍｌ量の、生理食塩水溶液（０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウム／水を含有する）及びＭ１９９の５０：５０ｖ／ｖ混合物を培地として使用して実施例１に記載のように調製した振動リン脂質（図１３Ｅ及び１３Ｆ）、２％ｖ／ｖ ＦＣＳと、記載したｍｇ／ｍｌ量の、ハートマン溶液及びＭ１９９の５０：５０ｖ／ｖ混合物を培地として使用したＤＰＰＣ（図１３Ｇ及び１３Ｈ）、２％ｖ／ｖ ＦＣＳと、記載したｍｇ／ｍｌ量の、ハートマン溶液及びＭ１９９の９０：１０ｖ／ｖ混合物を培地として使用して実施例１に記載したように調製した振動リン脂質（図１３Ｉ及び１３Ｊ）で処理した１つのウェルの細胞についての４８時間後のＨＰＭC増殖アッセイの結果を示す。ｙ軸は、増殖スケール（対照に対する絶対単位で測定される）を有し、エラーバーは標準偏差を示す。
図１４は、７２時間インキュベーション後の、ＦＣＳ（％）に対する蛍光活性（Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ａｂｓ ５４０ｎｍ）を示す。
図１５は、ＦＣＳの量を変化させて、７２時間インキュベートした後の、ＨＰＭＣのインキュベートを測定するＭＴＴアッセイとＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（商標）を使用して得られたデータとの間の直接的な相関を示すグラフを示す。
図１６は、実施例４に記載のＡＴＰ標準曲線の手法を使用して作成したＡＴＰ標準曲線を示し、ＡＴＰ濃度（ｎＭ）に対する相対的な光の単位（×１０６）を示す。
図１７Ａ及び１７Ｂは、室温でＭ１９９中の実施例１に記載のように調製した０．５ｍｇ／ｍｌのリン脂質の分散の顕微鏡写真を示す。図１７Ａに示す顕微鏡写真は、３０分間にわたって室温で分散させた後に撮影し、図１７Ｂに示す顕微鏡写真は、３０分間にわたって３７℃で分散させた後に撮影した。画像は、画像の最終的な倍率が５０×であるように、５×対象レンズ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を備えたＡｘｉｏｖｅｒｔ １００Ｍ反転顕微鏡を使用して撮影した。
図１８は、実施例１に記載のように調製した１ｍｇ／ｍｌの非振動リン脂質の分散物を含有する３つのバイアルの写真を示す。分散物を形成するために使用した媒体は、左のバイアルではリンガー乳酸塩であり、中央のバイアルでは注射用水であり、右のバイアルでは生理食塩水である。
図１９は、プマクタントを用いた２４時間の時点の鞘細胞についての平均（ｎ＝３）及びＳＤを示すグラフを示す。統計的な減少は、０．２５ｍｇ／ｍｌのプマクタントで示された（*Ｐ＝０．０４）。各種の濃度のウシ胎仔血清又は各種の濃度のＴＧＦ−β１で２４時間にわたって培養した鞘細胞は、細胞数における統計的な変化を示さなかった（データ示さず）。
図２０Ａ及びＢは、プマクタント（図２０Ａ）、ウシ胎仔血清（ｎ＝３、図２０Ｂ）を使用した４８時間の時点における鞘細胞についての平均（ｎ＝７）及びＳＥＭを表すグラフを示す。０．６％のウシ胎仔血清で鞘細胞は、統計的に有意な増殖増大（*Ｐ＝０．０２５）を示し、これは１．２５％（**Ｐ＝０．０３）、２．５％（†ｐ＝０．０３）、及び５％（‡ｐ＝０．０１）でも認められた。ＴＧＦ−β１で培養した細胞は、いずれの濃度についても統計的な有意性を示さなかった（データ示さず）。
図２１Ａ及びＢは、プマクタント（図２１Ａ）を使用した７２時間の時点における鞘細胞についての平均（ｎ＝７）及びＳＥＭを表すグラフを示す。プマクタントは、４ｍｇ／ｍｌ（**ｐ＝０．０２２）及び２ｍｇ／ｍｌ（*ｐ＝０．０１８）で統計的に顕著な増大を示した。ウシ胎仔血清で増殖させた細胞は、血清を含まない培地で増殖させたものと比較して統計的に有意な増加を示した（*ｐ＝０．０３、†ｐ＝０．００２、**ｐ＝０．０４、‡ｐ＝０．００４、◇ｐ＝０．００５、図２１Ｂ）。０．５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１における腱鞘細胞は、統計的に有意な増大を示した（*ｐ＝０．０２２）。
図２２Ａ及び２２Ｂは、プマクタント（図２２Ａ）、ウシ胎仔血清（図２２Ｂ）を使用した２４時間の時点における表面細胞についての平均（ｎ＝３）及びＳＥＭを表すグラフを示す。血清を含まない培地で培養したものと比較して、０．６％（*ｐ＝０．０２７）及び２．５％（**ｐ＝０．００１）のウシ胎仔血清で培養した表面由来の腱細胞についてのみ、統計的に異なる増大があった。
図２３Ａ及び２３Ｂは、プマクタント（図２３Ａ）、及びウシ胎仔血清（図２８Ｂ）を使用した４８時間の時点における表面細胞についての平均（ｎ＝６）及びＳＥＭを表すグラフを示す。最小培地で増殖させたものと比較して、２ｍｇ／ｍｌ（*ｐ＝０．０４７）におけるプマクタントでの増大、及び血清を含まない培地のものと比較して、０．３％（*ｐ＝０．００９）、１．２５％（**ｐ＝０．００５）、２．５％（†ｐ＝０．０１７）、５％（‡ｐ＝０．０１）のウシ胎仔血清で増殖させた細胞における増大のみが統計的な差異であった。各種の濃度のＴＧＦ−β１で培養したものは、統計的な有意性を示さなかった（データ示さず）。
図２４ＡからＣは、プマクタント（ｎ＝６；図２４Ａ）、ウシ胎仔血清（ｎ＝３；図２４Ｂ）、及びＴＧＦ−β１（ｎ＝３；図２４Ｃ）を使用して７２時間の時点における表面細胞についての平均及びＳＥＭを表すグラフを示す。プマクタントで培養した細胞は、いずれの濃度についても統計的な有意性を示さなかった。血清を含まない培地のものと比較して、２．５％（*ｐ＝０．０３）及び５％（**ｐ＝０．０４４）のウシ胎仔血清で増殖させた表面細胞についての増大のみが統計的な差異であり、並びに最小培地のみのものと比較して、２ｎｇ／ｍｌ（*ｐ＝０．００３）で増大が認められた。
図２５は、プマクタントを使用して２４時間の時点におけるコア細胞についての平均及びＳＥＭを表すグラフを示す（ｎ＝３）。いずれの処理についても統計的な差異は存在しなかった。
図２６は、プマクタント（ｎ＝５）を使用して４８時間の時点におけるコア細胞の平均及びＳＥＭを表すグラフを示す（ｎ＝５）。プマクタントは、最小培地で増殖させたコア細胞と比較して、０．５ｍｇ／ｍｌにおいて統計的な増大を示した（*Ｐ＝０．０４９）。各種の濃度のＦＣＳ又はＴＧＦ−β１で培養したコア細胞は、統計的な有意性を示さなかった（データ示さず）。
図２７は、プマクタントを使用して７２時間の時点におけるコア細胞についての平均及びＳＥＭを表すグラフを示す（ｎ＝６）。いずれの濃度でも統計的な有意性は存在しなかった。各種の濃度のウシ胎仔血清又はＴＧＦ−β１は、統計的な有意性を示さなかった（データ示さず）。
図２８ＡからＥは、表面由来細胞の遺伝子転写に対するＴＧＦ−β１の効果を示す（ｎ＝３）。グラフは、絶対的な遺伝子制御を表す。図２８Ａは、２４時間（*ｐ＝０．０２５）及び４８時間（*ｐ＝０．０４）の時点で統計的に有意な上方調節を示すコラーゲンタイプＩ（灰色のバー）についてのＴＧＦ−β１に対する表面由来の細胞の応答を表す。図２８Ｂは、１時間（*ｐ＝０．０３６）、２時間（*ｐ＝０．００１）、６時間（*ｐ＝０．０３８）、１６時間及び４８時間（*ｐ＝０．００１）で統計的に顕著な下方調節を示したコラーゲンタイプＩＩＩ（ストライプのバー）についてのグラフを示す。図２８Ｃは、２４時間の時点で統計的に有意な上方調節（*ｐ＝０．０３）を示したフィブロネクチン遺伝子発現についてのグラフを表す（黒色のバー）。図２８Ｄは、４時間の時点で統計的に有意な上方調節（*ｐ＝０．０２６）を示したＰＡＩ−１（スポット）についてのグラフを表す。図２８ＥはｔＰＡについてのグラフを表す（白色のバー）。
図２９ＡからＥは、表面由来細胞の遺伝子転写に対するプマクタントの効果を示す（ｎ＝３）。図２９ＡからＥは、絶対的な遺伝子調節を表す。図２９Ａは、コラーゲンタイプＩについてのプマクタントに対する表面由来細胞の応答を示す（灰色のバー）；統計的な有意性は存在しなかった。図２９Ｂは、コラーゲンタイプＩＩＩについてのグラフを表す（ストライプのバー）。図２９Ｃは、フィブロネクチン遺伝子発現についてのグラフを表す（黒色のバー）。図２９ＤはＰＡＩ−１についてのグラフを表し（スポット）、図２９ＥはｔＰＡについてのグラフを表し（白色のバー）、遺伝子転写は下方調節を示したが、経時的な統計的な変化は認められなかった。
図３０ＡからＥは、鞘由来細胞の遺伝子転写に対するＴＧＦ−β１の効果を示す（ｎ＝３）。図３０Ａは、コラーゲンタイプＩについてのＴＧＦ−β１に対する鞘由来細胞の応答を示す（灰色のバー）。図３０Ｂは、コラーゲンタイプＩＩＩについてのグラフを表し（ストライプのバー）、６時間（*ｐ＝０．０３）、８時間（*ｐ＝０．０３７）、１６時間（*ｐ＝０．０１２）、及び２４時間（*ｐ＝０．０３）の時点で統計的に顕著な上方調節を示した。図３０Ｃは、フィブロネクチン遺伝子発現についてのグラフを表す（黒色のバー）。図３０ＤはＰＡＩ−１についてのグラフを表し（スポット）、図３０ＥはｔＰＡについてのグラフを表し（白色のバー）、２時間（*ｐ＝０．０１３）、４時間（*ｐ＝０．００１）、及び２４時間（*ｐ＝０．００１）の時点において統計的に有意な下方調節を示した。
図３１ＡからＥは、鞘由来細胞の遺伝子転写に対するプマクタントの効果を示す（ｎ＝３）。図３１ＡからＥは、絶対的な遺伝子調節を表す。図３１Ａは、コラーゲンタイプＩについてのプマクタントに対する鞘由来細胞の応答を示す（灰色のバー）；統計的な有意性は存在しなかった。図３１Ｂは、コラーゲンタイプＩＩＩについてのグラフを表す（ストライプのバー）。図３１Ｃは、フィブロネクチン遺伝子発現についてのグラフを表し（黒色のバー）、上方調節を示したが、経時的に有意な変化は存在しなかった。図３１Ｄは、ＰＡＩ−１についてのグラフを表し（スポット）、１時間（*ｐ＝０．００１）で統計的に有意な下方調節を示した。ｔＰＡ遺伝子転写についての図３１Ｅ（白色のバー）は、下方調節を示したが、経時的には統計的な変化を示さなかった。
図３２ＡからＥは、コア由来細胞の遺伝子転写に対するＴＧＦ−β１の効果を示す（ｎ＝３）。図３２ＡからＥは、絶対的な遺伝子制御を表す。図３２Ａは、コラーゲンタイプＩについてのＴＧＦ−β１に対するコア由来細胞の応答を示す（灰色のバー）。図３２Ｂは、コラーゲンタイプＩＩＩについてのグラフを表し（ストライプのバー）、２、６、及び８時間で統計的に有意な下方調節を示した（*ｐ＜０．０２）。図３２Ｃはフィブロネクチン遺伝子発現についてのグラフを表し（黒色のバー）、６時間の時点でフィブロネクチン遺伝子転写の有意な下方調節を示し（*ｐ＝０．０２４）、２４時間（*ｐ＝０．０３）及び４８時間（*ｐ＝０．０４）で統計的に有意な上方調節を示した。図３２Ｄは、ＰＡＩ−１についてのグラフを示し（スポット）、２時間の時点で統計的に有意な増大を示した（*ｐ＝０．００１）。図３２Ｅは、ｔＰＡについてのグラフを示し（白色のバー）、２時間、６時間、８時間、１６時間、及び２４時間の時点における統計的に有意な下方調節を示した。
図３３ＡからＥは、コア由来細胞の遺伝子転写に対するプマクタント（１ｍｇ／ｍｌ）の効果を示す（ｎ＝３）。図３３Ａから３３Ｅは、絶対的な遺伝子制御を表す。図３３Ａは、コラーゲンタイプＩについてのプマクタントに対するコア由来細胞の応答を示し（灰色のバー）、下方調節を示したが、統計的に有意な差異ではなかった。図３３Ｂは、コラーゲンタイプＩＩＩについてのグラフを表し（ストライプのバー）を表し、２４時間及び４８時間の時点で統計的に有意な上方調節を示した（*ｐ＝０．０２５）。図３３Ｃは、フィブロネクチン遺伝子発現についてのグラフを表すが（黒色のバー）、経時的には有意な変化を示さなかった。図３３Ｄは、ＰＡＩ−１についてのグラフを示し（スポット）、１及び２時間の時点で統計的に有意な上方調節（*ｐ＝０．００１）を示した。図３３Ｅは、ｔＰＡについてのグラフを示すが（白色のバー）、経時的に有意な変化は示さなかった。
図３４ＡからＣは、各細胞タイプにプマクタント（１ｍｇ／ｍｌ）を用いて処理した後の接着アッセイついての平均を表す（ｎ＝３、エラーバー＝ＳＤ）。図３４Ａは、鞘由来細胞を用いたアッセイの結果のグラフを示す。図３４Ｂは、表面細胞を用いたアッセイの結果のグラフを示す。図３４Ｃは、コア細胞を用いたアッセイの結果のグラフを示す。いずれの細胞タイプについても、プマクタントをとともに培養した細胞とそうでない細胞との間に統計的に有意な差異は示さなかった。
図３５ＡからＣは、各細胞タイプにプマクタント（１ｍｇ／ｍｌ）を用いて処理した後のＳｉｒｃｏｌアッセイついての平均を表す（ｎ＝３、エラーバー＝ＳＤ）。図３５Ａは、コア由来細胞を用いたアッセイの結果を示す。図３５Ｂは、鞘由来細胞を用いたアッセイの結果のグラフを示す。図３４Ｃは、表面由来細胞を用いたアッセイの結果のグラフを示す。いずれの細胞タイプについても、可溶性コラーゲンの生産における統計的に有意な変化を示さなかった。
図３６は、Ｅｍｐｅｒｏｒ（商標）ソフトウェアを使用した力学的引張り試験装置（Ｍｅｃｍｅｓｉｎ）からの生データの典型例のグラフを示す。当該グラフは、腱鞘からウサギの腱を移動するために必要な負荷（力（ニュートン））を示す。測定した最大の力（Ｎ）は、接着が破壊した時点である。当該グラフは、２つの対照群：手術したが未処理及び未手術未処理を比較する。
図３７は、Ｅｍｐｅｒｏｒ（商標）を使用した力学的引張り試験装置（Ｍｅｃｍｅｓｉｎ）からの生データの典型例のグラフを示す。当該グラフは、当該グラフは、腱鞘からウサギの腱を移動するために必要な負荷（力（ニュートン））を示す。測定した最大の力（Ｎ）は、接着が破壊した時点である。当該グラフは、手術してプマクタントで処理した群と未手術未処理の群とを比較する。
図３８は、実験群：未手術（ＵＯＵＴ；ｎ＝１６）、手術後未処理（ＯＵＴ；ｎ＝８）、手術後プマクタント処理（ｎ＝３）についての平均引張り力を表すグラフを示す。エラーバーはＳＥＭである。ＵＯＵＴ群とＯＵＴ群との間（*ｐ＜０．０００１）及びプマクタント群とＯＵＴ群との間（**ｐ＝０．００１２）には統計的に有意な差異が存在した。
図３９Ａ及びＢは、４０倍の倍率における光学顕微鏡写真を示す。図３９Ａは、未手術で未処理（ＵＯＵＴ）の腱の写真を示し、青色に染色された（Ｍａｓｓｏｎ‘ｓ Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ Ｓｔａｉｎ）コラーゲン線維の束を示す。図３９Ｂは、損傷した腱の写真を示し、青色（Ｍａｓｓｏｎ‘ｓ Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ Ｓｔａｉｎ）のコラーゲン繊維を示すが、腱に存在する新しいマトリックス（赤色に染色）も示す。
図４０Ａ及びＢは、４０倍の倍率における光学顕微鏡写真を示す。図４０Ａは、腱と鞘との間に明らかな「癒着」架橋（Ａ）を有する未処理の損傷した腱を示す写真を示す。凡例は、Ｔ＝腱、Ａ＝癒着、Ｓ＝鞘である。図４０Ｂは、癒着形成の形跡を有しない、プマクタントで処理した損傷した腱を示す写真を示す。凡例は、ＴＩ＝腱損傷部位、Ｔ＝腱、Ｓ＝鞘である。
図４１は、Ｔａｎg ｅｔ ａｌ（１９９６）に基づく組織学的なスコアの平均を表すグラフを示す。エラーバーはＳＥＭである。２つの群の間に統計的に有意な差異が存在した（*ｐ＝０．００１２）。] 図１ 図１０Ａ 図１０Ｂ 図１０Ｃ 図１０Ｄ 図１０Ｅ 図１０Ｆ 図１１Ａ 図１１Ｂ 図１１Ｃ
[0045] 本発明を、特許請求の範囲を制限することを意図しない以下の実施例によって説明する。]
[0046] （実施例１）
以下の実施例では、本発明に係るリン脂質の製造を説明する。各々３００ｍｇのリン脂質を含有する１００のバイアルを調製した。]
[0047] 実施例１に記載のように調製したリン脂質の３０ｇを、０．４リットルの水を含有するバイアルに約５０から６０℃で３０分間にわたって攪拌して溶解することによって、０．７５％ｗ／ｖのリン脂質を含有する水性分散物を調製した。]
[0048] その水性分散物を、９６０バールで高圧ホモジナイザーを用いて３回反復して均質化した。]
[0049] 半透明の均質化した水性分散物を、０．２μｍの酢酸セルロース膜を使用して圧力をかけて濾過することによって滅菌した。２リットルの容量の加圧濾過ユニットを、窒素ガス条件で使用した。濾過ユニットは、６０℃において均質化した水性分散物で満たして、濾過した均質化水性分散物の最終温度が４０から５０℃になるようにした。濾過を容易にする、実施例１に記載のように調製したリン脂質の相転移温度より高いため、この温度を選択した。濾過ユニットを密閉した後に、２から３バールの圧力で窒素ガスを適用した。濾過したものを、滅菌したボトルに回収した。]
[0050] 滅菌した均質化水性分散物を、各々４ｍｌの容量で１０ｍｌバイアルに分注して、各バイアルに３００ｍｇのリン脂質を含有させた。]
[0051] そのバイアルを次いで凍結乾燥サイクル：
・８℃の装置温度を有する凍結乾燥器にバイアルを入れた；
・バイアルを凍結させた；
・装置温度を−４０℃に設定して、バイアルを４８分にわたって−１℃／分で当該温度まで傾斜冷却した；
・バイアルを−４０℃に３時間にわたって保持した；
・真空にした；
・真空を少なくとも０．１ミリバールで適用しながら、バイアルを−４０℃に４５分間にわたって保持した；
・装置を４５分にわたって１℃／分の加温速度で５℃まで温めた；
・主要乾燥期間として、バイアルを５℃に２０時間にわたって保持した；
・装置を１１分にわたって１℃／分で１６℃まで温めた；
・最終乾燥期間として、バイアルを１６℃に２０時間にわたって保持した；
・装置を１１分にわたって１℃／分で５℃まで冷却した；及び
・凍結乾燥器から取りだす前に、完全な真空条件下で栓をするまで、サンプルを５℃に保持した
に供した。]
[0052] （実施例２）
肺への投与に適するリン脂質を調製するために、滅菌濾過工程なしで実施例１を繰り返す。かくして、９６０バールで高圧ホモジナイザーを使用して３回反復して水性分散物を均質化した後に、その均質化した水性分散物を、各々４ｍｌの容量で１０ｍｌバイアルに分注して、各バイアルに３００ｍｇのリン脂質を含有させる。次いで、バイアルを実施例１に記載した凍結乾燥サイクルに供する。次いで、高圧エアジェットミルで微粉化して、１０μｍ未満の空気動力学的中央粒子径を有する、肺への投与に適するリン脂質が得られる微粉化工程に、サンプルを供する。]
[0053] 本実施例に記載の調製方法の代替例として、実施例１の方法を使用して、上述の微粉化工程を含むが実施例１の方法を繰り返すことによって、肺への投与に適するリン脂質を調製してよい。]
[0054] （実施例３）
本実施例では、ＦＣＳ、実施例１で調製したリン脂質（振動及び非振動）、有機非極性溶媒を使用して濾過前にリン脂質を分散させる方法によって調製した従来技術のリン脂質（ＡＬＥＣ（登録商標）乾燥粉末（Ｂｒｉｔａｎｎｉａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｌｔｄ））、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、ＤＰＰＣ、ＤＰＰＣ／ＬＰＡ、ＰＯＰC，Ｃｕｒｏｓｕｒｆ、及びＩｎｔｒａｌｉｐｉｄの、擦傷後の再上皮化（細胞増殖、移動）速度に対する効果を、ヒト腹腔中皮細胞（ＨＰＭＣ）、ヒトケラチン生成細胞、及びヒト肺上皮細胞において調べた。]
[0055] 再上皮化（ヒト腹腔中皮細胞、ケラチン生成細胞、及び肺上皮細胞）に対するリン脂質の影響は、（Ｙｕｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９４、１９９８、及び２０００、並びにＭｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．２００３において以前に報告されているように）低速度撮影の光学顕微鏡によって評価した。]
[0056] 連続的なトリプシン消化（Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．２００３）によって健康なヒトドナーの網から得られた中皮細胞（ＨＰＭＣ）及びヒト表皮ケラチン生成細胞（ＮＨＥＫ−Ａ、ＴＣＳＣｅｌｌ Ｗｏｒｋｓ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ、ＵＫ）を２４ウェル培養プレートに播種した。増殖停止（４８時間）後に、無血清培地において、滅菌したピペットチップを使用して機械的に直線状に擦ることによって、単層を損傷させて、細胞が存在しない再生可能な領域とした。ウェルを無血清培地で洗浄して、剥がれた細胞を除去した。]
[0057] Ｍ１９９（３７℃）で再構成した本発明に係るリン脂質を、無血清培地（１ｍＬ）中のＨＰＭＣ及びＮＨＥK−Ａ単層に直接適用した。使用した対照は、無血清培地のみ、又は２％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを添加したＭ１９９培地（陽性対象）であった。各ウェルの剥がした領域は、顕微鏡で認識して、その後のデータ収集のために座標を記録した。コンピューターで制御されたＸＹ自動スキャンステージ及びインキュベーターに取り付けられたＡｘｉｏｖｅｒｔ １００Ｍ倒立顕微鏡を使用して、再中皮化が連続的に観察された。加湿インキュベーターを、加熱した挿入及び方向性気流を使用して、３７℃、５％ＣＯ２に維持した（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。Ｏｒｃａ Ｃ５９８５デジタルビデオカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ、ＨａｍａｍａｔｓｕＣｉｔｙ、Ｊａｐａｎ）２．５×対物レンズを使用して、６０分の間隔で、２４ウェルプレートの各ウェルで同じ位置から画像を得た。画像は、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ Ｇ４コンピューターでＯｐｅｎｌａｂ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．０．８（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ，Ｌｔｄ．，Ｃｏｖｅｎｔｒｙ，ＵＫ）を使用して分析した。再中皮化の速度は、傷が閉じるのを確認するまで、６０分の間隔で剥がした領域（ピクセル）の低減を測定することによって算出した。]
[0058] 従来技術のリン脂質（ＡＬＥＣ（登録商標）乾燥粉末）を用いて、Ｖ−ＰＡＧ装置を使用して適用して得られた過去のデータは、内在性のもの（対照のプロセス）と比較して顕著に増大したＨＰＭＣの傷が閉じる速度であるが、２％ｖ／ｖのＦＣＳによる誘導よりは遅い速度であることを示した（図１）。このデータは、国際特許出願公開番号ＷＯ ２００６／０５６８００に開示されている。] 図１
[0059] 実施例１に記載したように調製してＭ１９９（Ｇｉｂｃｏ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｏ．３１１５０−０２２）に再懸濁したリン脂質を最大溶解用量（１００％用量、すなわち４ｍｇ／ｍｌ）、最大溶解用量の半分（５０％用量、すなわち２ｍｇ／ｍｌ）、最大溶解用量の四分の一（２５％用量、すなわち１ｍｇ／ｍｌ）でＨＰＭＣの処理を実施した。１００％及び５０％用量については、双方の細胞タイプにおいて傷の閉鎖が顕著に増大した（図２）。これらの場合において、傷が閉じる速度が、２％ｖ／ｖＦＣＳによる誘導よりも大きかった。] 図２
[0060] １００％、５０％、及び２５％用量を使用したＮＨＥＫ−Ａの処理は、同様の結果をもたらし、内在性対照よりも大きく、かつ、１００％及び５０％用量については２％ｖ／ｖＦＣＳ陽性対照よりも大きかった（図３）。] 図３
[0061] 図４は、対照及び２％ｖ／ｖＦＣＳと比較して、１００％及び５０％用量で処理したＨＰＭＣにおける傷の閉鎖の時間が促進されたことを示す。傷の領域が約５００００ピクセルである際は、目に見える傷の閉鎖が存在した。図４は、５０％用量については７．５時間後、１００％用量については９時間後に傷の閉鎖が完了したことを示す。１０時間後には、２％ｖ／ｖ ＦＣＳについて傷の閉鎖が存在したが、対照では存在しなかった。] 図４
[0062] 実施例１に記載のように調製してＭ１９９（Ｇｉｂｃｏ Ｐｒｏｄｕｃｔ ｒｅｆ．３１１５０−０２２）に懸濁したリン脂質を、最大溶解用量の２５％（１ｍｇ／ｍｌ用量）、最大溶解用量の１２．５％（０．５％ｍｇ／ｍｌ用量）、最大溶解用量の６．２５％（０．２５ｍｇ／ｍｌ用量）、最大溶解用量の３．１２５％（０．１２５ｍｇ／ｍｌ用量）で使用したＨＰＭＣ細胞の処理を実施した。図５は、Ｍ１９９培地中の２．５％ｖ／ｖＦＣＳと比較した、３．１２５％、６．２５％、１２．５％、及び２５％用量の実施例１にしたがって調製したリン脂質を使用して処理したＨＰＭＣ細胞の増殖における変化の速度を示す。] 図５
[0063] 実施例１に従って調製して液状に再構成したリン脂質は、驚くべきことに、既知の製剤と比較して改善された結果を示す。本発明に係るリン脂質は、中皮細胞とケラチン生成細胞の双方における再上皮化プロセスを促進する。異なるドナー細胞を用いて実施した独立した実験の数に基づいて（各々ｎ＝３）、傷の治癒プロセスの促進において、本発明に係るリン脂質の適用は、既知のＡＬＥＣ（登録商標）乾燥粉末製剤を超える利点を有する。]
[0064] （実施例４）
ヒト腹膜中皮細胞増殖を誘導する、実施例１に記載のように調製したリン脂質（及び／又はその構成化合物）の効果は、Ａｌａｍｅｒ Ｂｌｕｅ（商標）アッセイ及びＭＴＴアッセイを使用して評価した。]
[0065] Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（商標）アッセイは、細胞の代謝及び酸化還元指標（Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（商標））を低減する能力を測定することによって各種の細胞タイプの増殖を測定するために設計されている。酸化還元指標の低減は、蛍光活性を変化させる。したがって、測定される蛍光活性は細胞増殖に比例する。]
[0066] ＭＴＴアッセイは、各種の細胞の増殖を測定し、テトラゾリウム塩である３−［４，５−ジメチル−チアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラジウムブロミド（ＭＴＴ）の不溶性ホルマザン塩へのミトコンドリアによる変換に基づく。得られる色の変化は、生存細胞数に直接関係する。]
[0067] ＭｏｒｇａｎＬＷｅｔ ａｌ（“Ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ （ＧＤＰ） ｒｅ−ｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｌｉｓａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ” Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ６４：１８５４−１８６６，２００３）に記載されているように、初代ＨＰＭＣを、同意を得て任意腹部手術をうけた患者によって提供された大網組織生検から単離する。細胞を９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）で約６０％コンフルエントまで増殖させて、２回の継代で使用した。すべての細胞について、使用前２４時間にわたって、無血清Ｍ１９９で増殖を停止させた。]
[0068] ＭＴＴアッセイについては、以下の材料を使用した：
３−［４，５−ジメチル−チアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラジウムブロミド（Ｓｉｇｍａ）
ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（Ｓｉｇｍａ）
ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
滅菌水
酢酸（氷酢酸）
ＨＣＬ]
[0069] 添加Ｍ１９９培地は以下のように調製した：
Ｅａｒｌｅ塩培地Ｍ１９９に、１００μ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、５μｇ／ｍｌインスリン、５μｇ／ｍｌトランスフェリン、及び０．４μｇ／ｍｌヒドロコルチゾン、並びに２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ‘−２エタンスルホン酸を添加した。]
[0070] 実施例１に記載したように調製したリン脂質を以下のように調製した。２２ｋＰａの圧力及び２．５秒の送達時間に設定したプマクタント送達装置（Ｂｒｉｔａｎｎｉａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｌｔｄ，Ｒｅｄｈｉｌｌ ＵＫ）を使用して、約５ｍｇ（単回用量）の実施例１に記載したように調製したリン脂質を、２５ｍｌのユニバーサル（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）中の１ｍｌ（サンプル毎）の添加Ｍ１９９培地（３７℃）に添加した。少し攪拌（ボルテックスによって）した後に、次いで、１時間にわたって３７℃でサンプルをインキュベートした。サンプル用量の１／４倍及び１／２倍希釈物を、上述の溶液の適当な希釈物を使用して調製した。]
[0071] ＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を以下のように調製した。１００ｍｇのＭＴＴを２０ｍｌの滅菌ＰＢＳに溶解した。次いで、その溶液をボルテックスして、軽い耐久性のある容器に保存した。]
[0072] ＭＴＴアッセイのための溶解緩衝液は、２０ｇのＳＤＳを５０ｍｌ Ｎ．Ｎ−ジメチルホルムアミド及び５０ｍｌ滅菌水と混合して調製した。溶液のｐＨは、８０ｍｌの酢酸、２．５ｍｌの１Ｎ ＨＣＬ、及び１７．５ｍｌの滅菌水から形成される酸混合物の適当量の添加によって、４．７に調整した（ｐＨメーターを使用して測定した）。]
[0073] 方法
ウェル毎に２００μｌの容量を刺激に使用した。各々刺激の性質は、以下に説明するように図６Ａから６Ｆ、７Ａから７Ｆ、８Ａから８Ｆ、９Ａから９Ｆ、及び１０Ａから１０Ｆに示す。所定濃度のＦＣＳを含む添加Ｍ１９９の陽性対照を使用し、添加Ｍ１９９の陰性対照を使用した。各刺激は、各時点において三回重複して実施した。] 図６Ａ
[0074] 増殖培地を各ウェルから吸い取って、２００μｌ添加培地を使用して一回洗浄した。割り当てられたウェルに対して、２００μｌの各刺激を添加して、ウェルを３つに分割した。]
[0075] プレートを組織培養インキュベーターでインキュベートした。各時点において、ＨＰＭＣのアッセイをＡｌａｍｅｒ Ｂｌｕｅ（商標）及びＭＴＴを使用して増殖に関して実施した。ＭＴＴアッセイは、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（商標）試薬の非毒性の性質によるＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（商標）処理に従って実施することが可能である。]
[0076] Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（商標）アッセイ
適当量のＡｌａｍｅｒ Ｂｌｕｅ（商標）試薬を添加Ｍ１９９に添加して、１０％（ｖ／ｖ）Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（商標）溶液を製造した。]
[0077] 増殖培地を各ウェルから吸い取り、次いで、ウェル毎に２００μｌの添加Ｍ１９９を使用してウェルを一度洗浄した。ウェル毎に２００μｌの前に調製した１０％Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（商標）溶液を各ウェルに添加した。プレートを３７℃で５％ ＣＯ２条件下で１時間にわたってインキュベートした。１００μｌのサンプルを各ウェルからＭｉｃｒｏｆｌｕｏｒ １黒色平底マイクロタイタープレートの対応するウェルに移した。５４０ｎｍ（波長）におけるＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（商標）蛍光活性を、Ｄｙｎｅｘ Ｒｅｖａｌａｔｉｏｎ ９６マルチウェルプレートリーダーを使用して測定した。ＦＣＳ標準曲線を使用して、各時点について、図１４に示し、かつ、「任意単位」と表記しているように、結果を未処理の陰性対照値（Ｃ）に標準化した。] 図１４
[0078] ＭＴＴアッセイ
増殖培地を各ウェルから吸い取り、次いで、ウェル毎に２００μｌの添加Ｍ１９９を使用して各ウェルを一度洗浄した（Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（商標）アッセイの使用に従って本アッセイを使用した。この工程は、２００μｌの温かいＰＢＳを使用して各ウェルを洗浄する工程に置き換えた）。マルチチャンネルピペットを使用して、１００μｌの前に作製したＭＴＴ溶液を各ウェルに添加した。３７℃、５％ＣＯ２条件下で４時間にわたって（暗所で）プレートをインキュベートした。インキュベート後に、１００μｌの溶解緩衝液を各ウェルに添加した。次いで、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩にわたってプレートをインキュベートした。６００ｎｍ（波長）における吸光を、Ｄｙｎｅｘ Ｒｅｖａｌａｔｉｏｎ９６マルチウェルプレートリーダーを使用して測定した。各時点について未刺激の対照値（Ｃ）に吸光／蛍光知を標準化することによって結果を解釈し、「相対蛍光／吸光」又は「任意単位」と表記している。Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（商標）データとＭＴＴデータとの間の相関は図１５に示す。] 図１５
[0079] 結果
ＨＰＭＣのアッセイの結果は、４８時間及び７２時間後に得られた。]
[0080] 陽性対照として、添加Ｍ１９９中のＦＣＳを使用して、ＨＰＭＣ刺激して、４８時間及び７２時間の時点で得られたデータを図６Ａ及び６Ｄの各々の棒グラフに示す。図６Ａのデータは１２ウェルからのものであったが、図６Ｄのデータは１１ウェルからのものであった。これらの棒グラフでは、左から一つ目のバーは陰性対照（Ｃ）である。ＦＣＳは０．１５６、０．３１３、０．６２５、１．２５、及び２．５の濃度（ｖ／ｖ％）で使用して、各濃度について得られた結果を棒グラフの各々隣り合うバーに示す。図６Ａ及び６Ｄの結果は、陰性対照との比較において、ＦＣＳに対する顕著に用量依存的な増殖応答を示す。] 図６Ａ 図６Ｄ
[0081] 実施例１に記載のように調製して、添加Ｍ１９９に分散させた振動リン脂質を使用してＨＰＭＣを刺激し、４８時間及び７２時間の時点で得られたデータを図６Ｂ及び６Ｅの各々の棒グラフに示す。図６Ｂ及び６Ｅのデータは各々６ウェルからのものであった。これらの棒グラフでは、左から一つ目のバーは陰性対照（Ｃ）である。実施例１に記載のように調製した振動リン脂質を、０．１２５、０．２５、０．５、１、２、及び４の濃度（ｍｇ／ｍｌ）で使用して、各濃度で得られた結果を棒グラフの各々隣接するバーに示す。図６Ｂ及び６Ｅの結果は、陰性対照との比較において、実施例１に記載のように調製した振動リン脂質が、特に、４８時間の時点で０．１２５から２ｍｇ／ｍｌ及び７２時間の時点で０．１２５から１ｍｇ／ｍｌの濃度で、ＨＰＭＣの増殖を顕著に刺激したことを示す。結果は、増殖速度が経時的に加速することを示す。] 図６Ｂ
[0082] 実施例１に記載のように調製して添加Ｍ１９９に分散させた非振動リン脂質を使用して、ＨＰＭＣを刺激して、４８時間及び７２時間の時点で得られたデータを図６Ｃ及び６Ｆの各々の棒グラフに示す。図６Ｃ及び６Ｆのデータは各々４ウェルからのものである。これらの棒グラフでは、左から一つ目のバーは陰性対照（Ｃ）である。実施例１に記載のように調製した非振動リン脂質は、０．１２５、０．２５、０．５、１、２、及び４の濃度（ｍｇ／ｍｌ）で使用して、各濃度について得られた結果は棒グラフの各々隣接するバーに示す。図６Ｃ及び６Ｆの結果は、陰性対照との比較において、実施例１に記載のように調製した非振動リン脂質が、顕著にＨＰＭＣの増殖を、特に４８時間の時点では０．１２５から１ｍｇ／ｍｌの濃度で及び７２時間の時点では０．１２５から０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で刺激したことを示す。] 図６Ｃ
[0083] 添加Ｍ１９９中のリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）を使用してＨＰＭＣを刺激し、４８時間及び７２時間の時点で得られたデータを図７Ａ及び７Ｄの各々の棒グラフに示す。図７Ａのデータは３ウェルからのものであり、図７Ｄのデータは４ウェルからのものである。これらの棒グラフでは、左から一つ目のバーは陰性対照（Ｃ）である。２．５、５、１０、２０、４０、及び８０の濃度（μｇ／ｍｌ）でＬＰＡを使用し、各濃度で得られた結果を棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、ＨＰＭＣ増殖の顕著な刺激を示さない。] 図７Ａ 図７Ｄ
[0084] 添加Ｍ１９９中のジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）を使用してＨＰＰＣを刺激し、４８時間及び７２時間の時点で得られたデータを図７Ｂ及び７Ｅの各々の棒グラフに示す。図７Ｂのデータは３ウェルからのものであり、図７Ｅのデータは４ウェルからのものである。これらの棒グラフにおいて、左から一つ目のバーは陰性対照（Ｃ）である。０．０８７５、０．１７５、０．３５、０．７、１．４、及び２．８の濃度（ｍｇ／ｍｌ）でＤＰＰＣを使用し、各濃度で得られた結果を棒グラフの各々隣接したバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、ＨＰＭＣ増殖の顕著な刺激を示さない。] 図７Ｂ 図７Ｅ
[0085] 添加Ｍ１９９中のＤＰＰＣ及びＬＰＡの混合物を使用してＨＰＭＣを刺激して、４８時間及び７２時間の時点で得られた結果を図７Ｃ及び７Ｆの各々の棒グラフに示す。図７Ｃ及び７Ｆのデータは各々３ウェルからのものであった。これらの棒グラフにおいて、左から一つ目のバーは陰性対照（Ｃ）である。０．０８７５／２．５、０．１７５／５、０．３５／１０、０．７／２０、１．４／４０、及び２．８／８０の各々の濃度（（ｍｇ／ｍｌ）（μｇ／ｍｌ））でＤＰＰＣ／ＬＰＡ混合物を使用し、各濃度で得られた結果を棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、ＨＰＭＣ増殖の顕著な刺激を示さない。] 図７Ｃ
[0086] 添加Ｍ１９９中のパルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）を使用してＨＰＭＣを刺激して、４８時間及び７２時間の時点で得られた結果を図８Ａ及び８Ｄの各々の棒グラフに示す。図８Ａ及び８Ｄのデータは各々３ウェルからのものであった。これらの棒グラフにおいて、左から一つ目のバーは陰性対照（Ｃ）である。０．０８７５、０．１７５、０．３５、０．７、１．４、及び２．８の濃度（ｍｇ／ｍｌ）でＰＯＰＣを使用し、各濃度で得られた結果を棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、ＨＰＭＣ増殖の顕著な刺激を示さない。] 図８Ａ
[0087] 添加Ｍ１９９中のＣｕｒｏｓｕｒｆ（商標）（Ｃｈｉｅｓｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｉ）を使用してＨＰＭＣを刺激して、４８時間及び７２時間の時点で得られた結果を図８Ｂ及び８Ｅの各々の棒グラフに示す。図８Ｂ及び８Ｅのデータは各々３ウェルからのものであった。これらの棒グラフにおいて、左から一つ目のバーは陰性対照（Ｃ）である。３１．２５、６２．５、１２５、２５０、５００、及び１０００の濃度（μｇ／ｍｌ）でＣｕｒｏｓｕｒｆ（商標）を使用し、各濃度で得られた結果を棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、ＨＰＭＣの増殖を、４８時間の時点では６２．５から１０００μｇ／ｍｌの濃度で及び７２時間の時点ではすべての試験した濃度で顕著に低減したことを示す。] 図８Ｂ
[0088] 添加Ｍ１９９中のタマゴ−ＰＧ（ＥＰＧ）を使用してＨＰＭＣを刺激して、４８時間及び７２時間の時点で得られた結果を図８Ｃ及び８Ｆの各々の棒グラフに示す。図８Ｃ及び８Ｆのデータは各々３ウェルからのものであった。これらの棒グラフにおいて、左から一つ目のバーは陰性対照（Ｃ）である。０．０８７５、０．１７５、０．３５、０．７、１．４、及び２．８の濃度（ｍｇ／ｍｌ）でＥＰＧを使用し、各濃度で得られた結果を棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、ＨＰＭＣの増殖を、４８時間の時点では０．３５から２．８ｍｇ／ｍｌの濃度で及び７２時間の時点ではすべての試験した濃度で顕著に低減したことを示す。] 図８Ｃ
[0089] 添加Ｍ１９９中のＩｎｔｒａｐｉｄ（商標）−１０％（Ｆｒｅｓｅｍｏｉｓ Ｋａｂｉ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＨＰＭＣを刺激して、４８時間及び７２時間の時点で得られたデータを図９Ａ及び９Ｄの各々の棒グラフに示す。Ｉｎｔｒａｐｉｄ（商標）−１０％は水中の脂質の１０％ｖ／ｖ懸濁物である。特に、Ｉｎｔｒａｐｉｄ（商標）−１０％は、５０ｇ大豆油、６ｇレシチン、１１．２５ｇグリセリン、及び４３０．５ｇ水を含有する。図９Ａのデータは３ウェルからのものであり、図９Ｄのデータは４ウェルからのものであった。これらの棒グラフにおいて、左から一つ目のバーは陰性対照（Ｃ）である。３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０、及び１００％の無血清組織培養培地（Ｍ１９９）中の濃度（ｖ／ｖ％）でＩｎｔｒａｐｉｄ（商標）−１０％を使用し、各濃度で得られた結果を棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、ＨＰＭＣの増殖を、４８時間及び７２時間の時点ですべての試験した濃度で顕著に低減したことを示す。] 図９Ａ 図９Ｄ
[0090] 添加Ｍ１９９中のＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）−２０％（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＨＰＭＣを刺激して、４８時間及び７２時間の時点で得られたデータを図９Ｂ及び９Ｅの各々の棒グラフに示す。Ｉｎｔｒａｐｉｄ（商標）−２０％は、Ｉｎｔｒａｐｉｄ（商標）−１０％と似た成分を有する、水中の脂質の２０％ｖ／ｖ懸濁物である。図９Ｂのデータは３ウェルからのものであり、図９Ｅのデータは４ウェルからのものであった。これらの棒グラフにおいて、左から一つ目のバーは陰性対照（Ｃ）である。３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０、及び１００％の無血清組織培養培地（Ｍ１９９）中の濃度（ｖ／ｖ％）でＩｎｔｒａｐｉｄ（商標）−２０％を使用し、各濃度で得られた結果を棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、ＨＰＭＣの増殖を、４８時間及び７２時間の時点ですべての試験した濃度で顕著に低減したことを示す。] 図９Ｂ 図９Ｅ
[0091] 添加Ｍ１９９中のＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）−３０％（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＨＰＭＣを刺激して、４８時間及び７２時間の時点で得られたデータを図９Ｃ及び９Ｆの各々の棒グラフに示す。Ｉｎｔｒａｐｉｄ（商標）−３０％は、Ｉｎｔｒａｐｉｄ（商標）−１０％と似た成分を有する、水中の脂質の３０％ｖ／ｖ懸濁物である。図９Ｃのデータは３ウェルからのものであり、図９Ｆのデータは４ウェルからのものであった。これらの棒グラフにおいて、左から一つ目のバーは陰性対照（Ｃ）である。３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０、及び１００％の無血清組織培養培地（Ｍ１９９）中の濃度（ｖ／ｖ％）でＩｎｔｒａｐｉｄ（商標）−３０％を使用し、各濃度で得られた結果を棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、４８時間の時点で３．１２から５０％及び１００％で、陰性対照との比較において、顕著にＨＰＭＣの増殖を低減し、７２時間の時点で３．１２から１２．５％及び１００％の濃度で、陰性対照との比較において、顕著に低減したことを示す。] 図９Ｃ 図９Ｆ
[0092] （実施例５）
ＦＣＳ、実施例１にしたがって調製したリン脂質（振動及び非振動）、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、ＤＰＰＣ、ＤＰＰＣ／ＬＰＡ、ＰＯＰＣ、Ｃｕｒｕｓｕｒｆ、タマゴ−ＰＧ（ＥＰＧ）、及び三種のＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）製品で刺激した後のＨＰＭＣの生存率を、ＡＴＰアッセイを使用して測定した。このアッセイは、ＡＴＰ濃度を正確に定量するために、ルシフェリンのＡＴＰ依存性酸化の間の発光を測定する。]
[0093] 実施例３に記載のように、初代ＨＰＭＣを、同意を得た任意の腹部手術を受けた患者から提供された大網組織生検から単離した。約６０％コンフルエントまで９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）で細胞を増殖させて、２回の継代で使用した。使用前の２４時間にわたって無血清Ｍ１９９中で、全ての細胞の増殖を停止させた。]
[0094] ＡＴＰ生物発光アッセイキットＣＬＳ ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｃａｔ Ｎｏ １ ６９９ ６９５，１１８５７３００）を使用した。当該キットは、ＡＴＰ標準物質、ルシフェラーゼ、及び蒸留水を含む。１．８６１２ｇのＥＤＴＡ（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃｏｄｅ Ｄ／０６５０／６０、Ｂａｔｃｈ０４４７４３０、Ｍｒ − ３７２．２４）を５００ｍｌのＨ２Ｏ（又は３．７２２４ｇ／１リットル）に溶解して、１０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を調製した。１ｇ塩化ベンザルコニウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔ：−２３，４４２−７、Ｌｏｔ Ｓ２２１０４−３３４）を１リットルの１０ｍＭ ＥＤＴＡに溶解して、ＢＡＣ抽出溶液を調製した。２．９７８８ｇ Ｈｅｐｅｓ（Ｓｉｇｍａ，Ｈ３３７５−２５Ｇ，Ｂａｔｃｈ ０９４Ｋ５４３２，Ｍｒ − ２３８．３１）を５００ｍｌの１０ｍＭ ＥＤＴＡ（又は５．９５７７ｇ Ｈｅｐｅｓ／１リットル）溶解して、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ溶液を調製した。]
[0095] 以下の手順の前に、実施例３（Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（商標）Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ）で使用したＨＰＭＣをＰＢＳで洗浄して、１ｍｇ／ｍｌ ＢＡＣ抽出溶液及び２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓで溶解した。次いで、必要となるまで−２０℃でサンプルを凍結保存した。]
[0096] ＡＴＰアッセイを実施する前に、以下の工程を使用して、標準曲線を作成することが必要である。
１）１０ｍｌの蒸留水を生物発光キットのルシフェラーゼ試薬に添加し、５分放置する（振らない）。混合するために、容器を注意深く振盪する。
２）１．６５μＭ ＡＴＰの基本濃度を有するＡＴＰ標準溶液を作製する。１６５０から０．０１２６ｎＭのＡＴＰの濃度範囲が得られるまで蒸留水を使用して、１．６５μＭ ＡＴＰ（＝１６５０ｎＭ）の段階的な希釈物を作製する。
３）標準曲線の濃度範囲を決定する、例えば、２０６．２５から０．０１２６ｎＭであり、２０μｌの分量の標準物質を白色９６ウェルプレートのウェルに以下のテンプレートのように３つに重複して入れる。蒸留水を対照として使用する。
４）Ｆｌｕｏｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａプレートをセットして発光を測定する。Ｆｌｕｏｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａプレートリーダーポンプをセットして、２０μｌのルシフェラーゼを必要なウェルの各々に注入する。
５）プレートをプレートリーダーにおいて、相対光単位（ＲＬＵ）を測定する。
６）ＡＬＰ濃度に対するＲＬＵのグラフをプロットすることによって、図１６に示すような標準曲線を作成する。] 図１６
[0097] ＨＰＭＣ増殖試験からの９６ウェルプレートを解凍した。各ウェル由来のサンプルの４０μｌを、白色９６ウェルプレートの対応するウェルに移した。ＡＴＰ標準曲線の手順のステップ４から６にしたがって、サンプルのＲＬＵを測定した。標準曲線を使用して、ＡＴＰ濃度をサンプルのＲＬＵから算出した。ＡＴＰ標準曲線の使用の代替的な方法として、データを未刺激の対照に対して標準化して、「ＡＴＰ（対照の％）」と表わす。]
[0098] 結果
７２時間後のアッセイからの結果を図１１Ａから１１Ｌに示す。各アッセイのデータは単独のウェルからのものであった。] 図１１Ａ
[0099] 陽性対照として、添加Ｍ１９９中のＦＣＳを使用してＨＰＭＣを刺激した。得られたデータを図１１Ａの棒グラフに示す。当該棒グラフにおいて、左から１つ目のバーは陰性対照（Ｃ）である。ＦＣＳは、０．１５６、０．３１２、０．６２５、１．２５、及び２．５の濃度（ｖ／ｖ％）で使用した。各濃度で得られた結果は棒グラフの各々隣接するバーに示す。図１１Ａの結果は、陰性対照との比較における、ＦＣＳに対する用量依存的な増殖応答を示す。] 図１１Ａ
[0100] 実施例１に記載のように調製して添加Ｍ１９９に分散させた振動リン脂質を使用してＨＰＭＣを刺激した。得られたデータを図１１Ｂの棒グラフに示す。当該棒グラフにおいて、左から１つ目のバーは陰性対照（Ｃ）である。実施例１に記載のように調製した振動リン脂質は、０．１２５、０．２５、０．５、１、２、及び４の濃度（ｍｇ／ｍｌ）で使用した。各濃度で得られた結果は棒グラフの各々隣接するバーに示す。図１１Ｂの結果は、実施例１に記載のように調製した振動リン脂質が、陰性対照との比較において、０．１２５から０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度でＨＰＭＣ増殖を増大させたことを示す。] 図１１Ｂ
[0101] 実施例１に記載のように調製して添加Ｍ１９９に分散させた非振動リン脂質を使用してＨＰＭＣを刺激した。得られたデータを図１１Ｃの棒グラフに示す。当該棒グラフにおいて、左から１つ目のバーは陰性対照（Ｃ）である。実施例１に記載のように調製した非振動リン脂質は、０．１２５、０．２５、０．５、１、２、及び４の濃度（ｍｇ／ｍｌ）で使用した。各濃度で得られた結果は棒グラフの各々隣接するバーに示す。図１１Ｃの結果は、実施例１に記載のように調製した非振動リン脂質が、陰性対照との比較において、０．１２５から０．５ｍｇ／ｍｌの濃度でＨＰＭＣ増殖を増大させたことを示す。実施例１に記載のように調製した非振動リン脂質は、実施例１に記載に記載のように調製した振動リン脂質よりもＨＰＭＣ増殖増大に対する大きな効果を有していた。] 図１１Ｃ
[0102] 添加Ｍ１９９中のリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）を使用してＨＰＭＣを刺激した。得られたデータを図１１Ｄの棒グラフに示す。当該棒グラフにおいて、左から１つ目のバーは陰性対照（Ｃ）である。ＬＰＡは、２．５、５、１０、２０、４０、及び８０の濃度（μｇ／ｍｌ）で使用した。各濃度で得られた結果は棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、ＬＰＡによるＨＰＭＣ増殖における増大は示さない。] 図１１Ｄ
[0103] 添加Ｍ１９９中のジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）を使用してＨＰＭＣを刺激した。得られたデータを図１１Ｅの棒グラフに示す。当該棒グラフにおいて、左から１つ目のバーは陰性対照（Ｃ）である。ＤＰＰＣは、０．０８７５、０．１７５、０．３５、０．７、１．４、及び２．８の濃度（ｍｇ／ｍｌ）で使用した。各濃度で得られた結果は棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、ＤＰＰＣによるＨＰＭＣ増殖における増大は示さない。] 図１１Ｅ
[0104] 添加Ｍ１９９中のＤＰＰＣ及びＬＰＡの混合物を使用してＨＰＭＣを刺激した。得られたデータを図１１Ｆの棒グラフに示す。当該棒グラフにおいて、左から１つ目のバーは陰性対照（Ｃ）である。ＤＰＰＣ／ＬＰＡ混合物は、０．０８７５／２．５、０．１７５／５、０．３５／１０、０．７／２０、１．４／４０、及び２．８／８０の濃度（（ｍｇ／ｍｌ）（μｇ／ｍｌ））で使用した。各濃度で得られた結果は棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、ＤＰＰＣ／ＬＰＡ混合物によるＨＰＭＣ増殖における増大は示さない。] 図１１Ｆ
[0105] 添加Ｍ１９９中のパルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）を使用してＨＰＭＣを刺激した。得られたデータを図１１Ｇの棒グラフに示す。当該棒グラフにおいて、左から１つ目のバーは陰性対照（Ｃ）である。ＰＯＰＣは、０．０８７５、０．１７５、０．３５、０．７、１．４、及び２．８の濃度（ｍｇ／ｍｌ）で使用した。各濃度で得られた結果は棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、ＰＯＰＣは、０．０８７５ｍｇ／ｍｌの濃度でＨＰＭＣ増殖を増大させたことを示す。] 図１１Ｇ
[0106] 添加Ｍ１９９中のＣｕｒｏｓｕｒｆ（商標）（Ｃｈｉｅｓｉ Ｆａｒｍａｃｅｕｔｉｃｉ）を使用してＨＰＭＣを刺激した。得られたデータを図１１Ｈの棒グラフに示す。当該棒グラフにおいて、左から１つ目のバーは陰性対照（Ｃ）である。Ｃｕｒｏｓｕｒｆ（商標）は、３１．２５、６２．５、１２５、２５０、５００、及び１０００の濃度（μｇ／ｍｌ）で使用した。各濃度で得られた結果は棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、ＣｕｒｏｓｕｒｆはＨＰＭＣ増殖を低減させたことを示す。] 図１１Ｈ
[0107] 添加Ｍ１９９中のタマゴ−ＰＧ（ＥＰＧ）を使用してＨＰＭＣを刺激した。得られたデータを図１１Ｉの棒グラフに示す。当該棒グラフにおいて、左から１つ目のバーは陰性対照（Ｃ）である。ＥＰＧは、０．０８７５、０．１７５、０．３５、０．７、１．４、及び２．８の濃度（ｍｇ／ｍｌ）で使用した。各濃度で得られた結果は棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、ＥＰＧはＨＰＭＣ増殖を低減させたことを示す。] 図１１Ｉ
[0108] 添加Ｍ１９９中のＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）−１０％（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＨＰＭＣを刺激した。得られたデータを図１１Ｊの棒グラフに示す。当該棒グラフにおいて、左から１つ目のバーは陰性対照（Ｃ）である。Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）−１０％は、無血清培地（Ｍ１９９）中のＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）−１０％の１０％ｖ／ｖ脂質エマルションの３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０、及び１００％のｖ／ｖ％で使用した。各濃度で得られた結果は棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）−１０％はＨＰＭＣ増殖を低減させたことを示す。] 図１１Ｊ
[0109] 添加Ｍ１９９中のＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）−２０％（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＨＰＭＣを刺激した。得られたデータを図１１Ｋの棒グラフに示す。当該棒グラフにおいて、左から１つ目のバーは陰性対照（Ｃ）である。Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）−２０％は、無血清培地（Ｍ１９９）中のＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）−２０％の２０％ｖ／ｖ脂質エマルションの３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０、及び１００％のｖ／ｖ％で使用した。各濃度で得られた結果は棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）−２０％はＨＰＭＣ増殖を低減させたことを示す。] 図１１Ｋ
[0110] 添加Ｍ１９９中のＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）−３０％（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＨＰＭＣを刺激した。得られたデータを図１１Ｌの棒グラフに示す。当該棒グラフにおいて、左から１つ目のバーは陰性対照（Ｃ）である。Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）−３０％は、無血清培地（Ｍ１９９）中のＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）−３０％の３０％ｖ／ｖ脂質エマルションの３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０、及び１００％のｖ／ｖ％で使用した。各濃度で得られた結果は棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）−３０％はＨＰＭＣ増殖を低減させたことを示す。] 図１１Ｌ
[0111] （実施例６）
実施例１に記載のように調製したリン脂質又は市販のＤＰＰＣのヒトケラチン生成細胞増殖を誘導する効果を、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（商標）アッセイ及びＭＴＴアッセイを使用して評価した。]
[0112] 実験は、ヒト上皮ケラチン生成細胞株（ＴＣＳＣｅｌｌＷｏｒｋｓ）を使用して実施した。９６ウェルプレート（ファルコン）で約６０％コンフルエントまで細胞を増殖させて、二回の継代で使用した。使用前の２４時間にわたって無血清ケラチン生成細胞基本培地（ＴＣＳ ＣｅｌｌＷｏｒｋｓ）で、全ての細胞の増殖を停止させた。]
[0113] ＭＴＴアッセイについては、実施例３に記載の以下の物質を使用した。]
[0114] 添加無血清ケラチン生成細胞基本培地は、１％ＦＣＳ及び上皮ケラチン生成細胞増殖添加物パック（ＴＣＳＣｅｌｌＷｏｒｋｓ）を上皮ケラチン生成細胞基本培地（ＴＣＳ ＣｅｌｌＷｏｒｋｓ）に添加することによって調製した。上皮ケラチン生成細胞増殖添加物パックは、ウシインスリン、ヒドロコルチゾン、ウシトランスフェリン、ヒト上皮増殖因子、ウシ下垂体、２５μｇ／ｍｌゲンタマイシン、及び２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢを含む。]
[0115] リン脂質は以下のように調製した。プマクタント送達装置（圧力：２２Ｋｐａ、送達時間：２．５秒）を使用して、約５ｍｇ（単回用量）の実施例１に記載のように調製したリン脂質を、２５ｍｌのユニバーサル中の１ｍｌ（サンプルあたり）の添加ケラチン生成細胞基本培地（３７℃）に添加した。簡単に攪拌（ボルテックスによる）の後に、次いで、サンプルを１時間にわたって３７℃でインキュベートした。サンプル用量の１／４倍及び１／２倍希釈物は、上述の溶液の適当な希釈物を使用して調製した。]
[0116] ＭＴＴ溶液及び溶解緩衝溶液は、実施例３に記載のように調製した。]
[0117] 方法
ウェルあたり２００μｌの用量を刺激に使用した。各刺激の性質は、以下に記載するように図１２Ａから１２Ｆに示している。所定の濃度のＦＣＳを含む添加ケラチン生成細胞基本培地の陽性対照を使用し、添加ケラチン生成細胞基本培地の陰性対照を使用した。各刺激は、各時点で３回重複して実施した。] 図１２Ａ
[0118] 増殖培地を各ウェルから吸い取って、２００μｌの添加培地を使用して一度洗浄した。割り当てられたウェルに、２００μｌの各刺激を加えて、ウェルを３つに分割した。]
[0119] プレートを組織培養インキュベーターでインキュベートする。各時点において、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（商標）及び／又はＭＴＴを使用して、ＮＨＥＫ−Ａのアッセイを増殖について実施した。Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（商標）試薬の非毒性によるＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（商標）処理にしたがってＭＴＴアッセイを実施できる。]
[0120] Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（商標）アッセイ
適当量のＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（商標）試薬を、添加ケラチン生成細胞基本培地に添加して、１０％（ｖ／ｖ）Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（商標）溶液を製造した。]
[0121] 増殖培地を各ウェルから吸い取り、次いで、ウェルを２００μｌ／ウェルの添加ケラチン生成細胞基本培地を使用して一度洗浄した。各ウェルに、２００μｌ／ウェルの前に調製した１０％ Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（商標）溶液を添加した。プレートを３７℃で５％ＣＯ２条件下で１時間にわたってインキュベートした。１００μｌのサンプルを、各ウェルからＭｉｃｒｏｆｌｕｏｒ １黒色平底マイクロタイタープレートの対応するウェルに移した。５４０ｎｍ（波長）のＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（商標）の蛍光活性を、Ｄｙｎｅｘ Ｒｅｖａｌａｔｉｏｎ ９６マルチウェルプレートリーダーを使用して測定した。各時点について、結果を未刺激陰性対照値（Ｃ）に対して標準化し、「任意単位」で表わした。]
[0122] ＭＴＴアッセイ
増殖培地を各ウェルから吸い取り、次いで、各ウェルを、２００μｌ／ウェルの添加ケラチン生成細胞基本培地を使用して一度洗浄した（このアッセイは、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（商標）アッセイの使用にしたがって使用し、この工程は、２００μｌの暖かいＰＢＳを使用して各ウェルを洗浄する工程に置き換えた）。マルチチャンネルピペットを使用して、１００μｌの前に作製したＭＴＴ溶液を各ウェルに添加した。プレートを３７℃で５％ＣＯ２条件下で４時間にわたって（暗所で）インキュベートした。インキュベート後に、１００μｌの溶解緩衝液を各ウェルに添加した。次いで、プレートを３７℃で５％ＣＯ２条件下で一晩にわたってインキュベートした。Ｄｙｎｅｘ Ｒｅｖａｌａｔｉｏｎ ９６マルチウェルプレートリーダーを使用して、６００ｎｍ（波長）の吸光を測定した。結果は、各時点について、吸光／蛍光値を未刺激の対照値（Ｃ）に対して標準化することによって解釈し、「相対蛍光／吸光」又は「任意単位」と表わす。]
[0123] 結果
陽性対照として、添加ケラチン生成細胞基本培地中のＦＣＳを使用して、ＮＥＫａケラチン生成細胞を刺激した。４８時間及び７２時間後のＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（商標）アッセイから得られたデータを図１２Ａ及び１２Ｄの棒グラフの各々に示す。これらの棒グラフにおいて、左から１つ目のバーは陰性対照（Ｃ）である。ＦＣＳは、０．０６２、０．１２５、０．２５、０．５、及び１．００の濃度（ｖ／ｖ％）で使用した。各濃度で得られた結果は、棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、ＦＣＳに対する用量依存的な増殖応答を示す。] 図１２Ａ
[0124] 実施例１に記載のように調製し、添加ケラチン生成細胞基本培地に分散させた振動リン脂質を使用して、ＮＥＫａケラチン生成細胞を刺激した。４８時間及び７２時間後にＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（商標）アッセイから得られたデータを、図１２Ｂ及び１２Ｅの棒グラフの各々に示す。これらの棒グラフにおいて、左から１つ目のバーは陰性対照（Ｃ）である。実施例１に記載のように調製した振動リン脂質は、０．１２５、０．２５、０．５、１、２、及び４の濃度（ｍｇ／ｍｌ）で使用した。各濃度で得られた結果は、棒グラフの各々隣り合うバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、実施例１に記載のように調製した振動リン脂質が、４８時間後に４ｍｇ／ｍｌの濃度でＮＥＫａ増殖を顕著に増大させたことを示す。７２時間では、結果は、陰性対照との比較において、実施例１に記載のように調製した振動リン脂質が０．１２５ｍｇ／ｍｌの濃度でＮＥＫａ増殖を顕著に増大させたことを示す。] 図１２Ｂ
[0125] 実施例１に記載のように調製し、添加ケラチン生成細胞基本培地に分散させた非振動リン脂質を使用して、ＮＥＫａケラチン生成細胞を刺激した。４８時間及び７２時間後にＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（商標）アッセイから得られたデータを、図１２Ｃ及び１２Ｆの棒グラフの各々に示す。これらの棒グラフにおいて、左から１つ目のバーは陰性対照（Ｃ）である。実施例１に記載のように調製した非振動リン脂質は、０．１２５、０．２５、０．５、１、２、及び４の濃度（ｍｇ／ｍｌ）で使用した。各濃度で得られた結果は、棒グラフの各々隣り合うバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、実施例１に記載のように調製した非振動リン脂質が、０．１２５ｍｇ／ｍｌ及び０．５ｍｇ／ｍｌの濃度でＮＥＫａ増殖を顕著に増大させたことを示す。] 図１２Ｃ
[0126] （実施例７）
実施例１に記載のように調製したリン脂質の分散物又はＤＰＰＣの分散物の形成に使用するための各種の培地の適性を調べた。実施例３に記載のＨＰＭＣ増殖のＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（商標）アッセイを、試験培地に分散させたＦＣＳの陽性対照、試験培地の陰性対照、及び試験培地に分散させたリン脂質を用いる各刺激について単独のウェルの細胞を使用して繰り返した。４８時間後に得られた結果を図１３Ａから１３Ｊに示し、以下に説明する。] 図１３Ａ
[0127] 第一の試験培地は、ハートマン溶液（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ）及び添加Ｍ１９９の５０／５０ｖ／ｖ混合物であった。陽性対照として、第一の試験培地中のＦＣＳを使用してＨＰＭＣを刺激した。得られたデータを図１３Ａ及び１３Ｇの棒グラフに示す。これらの棒グラフにおいて、左から１つ目のバーは陰性対照（Ｃ）である。ＦＣＳは、第一の試験培地中において０．１５６、０．３１３、０．６２５，１．２５、及び２．５の濃度（ｖ／ｖ％）で使用した。得られた結果は、図１３Ａ及び１３Ｇの棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、第一の試験培地中のＦＣＳに対して用量依存的に増大したＨＰＭＣ増殖応答が存在したことを示す。しかしながら、増大した量は、図６Ａに示す、添加Ｍ１９９中のＦＣＳを用いた場合ほど大きくなかった。] 図１３Ａ 図６Ａ
[0128] 実施例１に記載のように調製し、第一の試験培地中に分散させた振動リン脂質を使用してＨＰＭＣを刺激した。得られたデータを図１３Ｂの棒グラフに示す。この棒グラフにおいて、左から１つ目のバーは陰性対照（Ｃ）である。実施例１に記載のように調製した振動リン脂質は、第一の試験培地中において０．１５６、０．３１２５、０．６２５、１．２５、２．５、５、１０、１５、２０、３０、及び４０の濃度（ｍｇ／ｍｌ）で使用した。得られた結果は図１３Ｂの棒グラフの各々隣り合うバーに示す。結果は、陰性対照との比較における、第一の試験溶媒中の実施例１に記載のように調製した振動リン脂質に対する増殖応答の増大は、図６Ｂに示す、添加Ｍ１９９中の実施例１に記載のように調製した振動リン脂質を用いた場合ほど大きくなかった。] 図１３Ｂ 図６Ｂ
[0129] 第一の試験培地中に分散させたＤＰＰＣを使用してＨＰＭＣを刺激した。得られたデータは図１３Ｈの棒グラフに示す。この棒グラフにおいて、左から１つ目のバーは陰性対照（Ｃ）である。ＤＰＰＣは、第一の試験培地中において０．１５６、０．３１２５、０．６２５、１．２５、２．５、５、１０、１５、２０、及び４０の濃度（ｍｇ／ｍｌ）で使用した。得られた結果は、図１３Ｈの棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較における、第一の試験溶媒中のＤＰＰＣに対する増殖応答の増大は、図７Ｂに示す、添加Ｍ１９９中のＤＰＰＣを用いた場合ほど大きくなかった。] 図１３Ｈ 図７Ｂ
[0130] 第二の試験培地は、リンガー溶液（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ）及び添加Ｍ１９９の５０／５０ｖ／ｖ混合物であった。陽性対照として、第二の試験培地中のＦＣＳを使用してＨＰＭＣを刺激した。得られたデータを図１３Ｃの棒グラフに示す。この棒グラフにおいて、左から１つ目のバーは陰性対照（Ｃ）である。ＦＣＳは、第二の試験培地中において０．１５６、０．３１３、０．６２５，１．２５、及び２．５の濃度（ｖ／ｖ％）で使用した。得られた結果は、図１３Ｃの棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、第二の試験培地中のＦＣＳに対して用量依存的に増大したＨＰＭＣ増殖応答が存在したことを示す。しかしながら、増大した量は、図１３Ａに示す、第一の試験培地中のＦＣＳを用いた場合ほど大きくなかった。] 図１３Ａ 図１３Ｃ
[0131] 実施例１に記載のように調製し、第二の試験培地中に分散させた振動リン脂質を使用してＨＰＭＣを刺激した。得られたデータを図１３Ｄの棒グラフに示す。この棒グラフにおいて、左から１つ目のバーは陰性対照（Ｃ）である。実施例１に記載のように調製した振動リン脂質は、第二の試験培地中において０．１５６、０．３１２５、０．６２５、１．２５、２．５、５、１０、１５、２０、３０、及び４０の濃度（ｍｇ／ｍｌ）で使用した。得られた結果は図１３Ｄの棒グラフの各々隣り合うバーに示す。結果は、陰性対照との比較における、第二の試験溶媒中の実施例１に記載のように調製した振動リン脂質に対する増殖応答の増大は、図１３Ｂに示す第一の試験培地中の振動リン脂質よりも良好であったが、図６Ｂに示す、添加Ｍ１９９中の振動リン脂質を用いた場合ほど大きくなかった。] 図１３Ｂ 図１３Ｄ 図６Ｂ
[0132] 第三の試験培地は、生理食塩水溶液（０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウム水）及び添加Ｍ１９９の５０／５０ｖ／ｖ混合物であった。陽性対照として、第三の試験培地中のＦＣＳを使用してＨＰＭＣを刺激した。得られたデータを図１３Ｅの棒グラフに示す。この棒グラフにおいて、左から１つ目のバーは陰性対照（Ｃ）を示す。ＦＣＳは、第三の試験培地中において０．１５６、０．３１３、０．６２５，１．２５、及び２．５の濃度（ｖ／ｖ％）で使用した。得られた結果は、図１３Ｅの棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、第三の試験培地中のＦＣＳに対して用量依存的に増大したＨＰＭＣ増殖応答が存在したことを示す。しかしながら、増大した量は、図１３Ａに示す、第一の試験培地中のＦＣＳを用いた場合ほど大きくなかった。] 図１３Ａ 図１３Ｅ
[0133] 実施例１に記載のように調製し、第三の試験培地中に分散させた振動リン脂質を使用してＨＰＭＣを刺激した。得られたデータを図１３Ｆの棒グラフに示す。この棒グラフにおいて、左から１つ目のバーは陰性対照（Ｃ）である。実施例１に記載のように調製した振動リン脂質は、第三の試験培地中において０．１５６、０．３１２５、０．６２５、１．２５、２．５、５、１０、１５、２０、３０、及び４０の濃度（ｍｇ／ｍｌ）で使用した。得られた結果は図１３Ｆの棒グラフの各々隣り合うバーに示す。結果は、陰性対照との比較における、第三の試験溶媒中の振動リン脂質に対する増殖応答の増大は、図１３Ｂに示す第一の試験培地中の振動リン脂質を用いた場合ほど大きくなかった。] 図１３Ｂ 図１３Ｆ
[0134] 第四の試験培地は、ハートマン溶液及び添加Ｍ１９９の９０／１０ｖ／ｖ混合物であった。陽性対照として、第四の試験培地中のＦＣＳを使用してＨＰＭＣを刺激した。得られたデータを図１３Ｉの棒グラフに示す。この棒グラフにおいて、左から１つ目のバーは陰性対照（Ｃ）を示す。ＦＣＳは、第四の試験培地中において０．１５６、０．３１３、０．６２５，１．２５、及び２．５の濃度（ｖ／ｖ％）で使用した。得られた結果は、図１３Ｉの棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、第四の試験培地中のＦＣＳがＨＰＭＣ増殖を増大させなかったことを示す。したがって、図１３Ｉに示す結果の図６Ａの結果との比較から、第四の試験培地は、添加Ｍ１９９自体よりも効果的でないことが明らかである。] 図１３Ｉ 図６Ａ
[0135] 実施例１に記載のように調製し、第四の試験培地中に分散させた振動リン脂質を使用してＨＰＭＣを刺激した。得られたデータを図１３Ｊの棒グラフに示す。この棒グラフにおいて、左から１つ目のバーは陰性対照（Ｃ）である。実施例１に記載のように調製した振動リン脂質は、第四の試験培地中において０．１５６、０．３１２５、０．６２５、１．２５、２．５、５、１０、１５、２０、３０、及び４０の濃度（ｍｇ／ｍｌ）で使用した。得られた結果は図１３Ｊの棒グラフの各々隣り合うバーに示す。結果は、陰性対照との比較における、第四の試験溶媒中の振動リン脂質に対する増殖応答の増大は、図６Ｂに示す添加Ｍ１９９中の振動リン脂質を用いた場合ほど大きくなかった。] 図１３Ｊ 図６Ｂ
[0136] 実施例８
この実施例では、実施例１に記載のように調製したリン脂質によって形成される分散物の特性を、異なる温度及び異なる培地中で調べた。]
[0137] 第一の実験では、０．５ｍｇ／ｍｌの実施例１に記載のように調製したリン脂質をＭ１９９培地に室温で分散させた。３０分後に、図１７Ａに示す顕微鏡写真を、像の最終倍率が５０倍となるように、５倍の対物レンズ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を備えたＡｘｉｏｖｅｒｔ １００Ｍ倒立顕微鏡を使用して撮影した。この顕微鏡写真は、本発明に係るリン脂質の分散物がリン脂質の離散した結晶を含むことを示す。] 図１７Ａ
[0138] 第二の実験では、０．５ｍｇ／ｍｌの実施例１に記載のように調製したリン脂質をＭ１９９に３７℃で分散させた。３０分後に、図１７Ｂに示す顕微鏡写真を、図１７Ｂと同じ方法で撮影した。この顕微鏡写真は、ミセル凝集を実質的に有しない本発明に係るリン脂質の微細なミセルの分散を示す。] 図１７Ｂ
[0139] 第三の実験では、１ｍｇ／ｍｌの実施例１に記載のように調製したリン脂質を室温でリンガー乳酸塩、注射用水、及び生理食塩水に分散させ、各分散物を各々ラベルを貼ったバイアルに入れた。３０分が経過した後に、図１８に示すバイアルの写真を撮影した。この写真は、本発明に係るリン脂質の注射用水中の分散は微細であり、裸眼では見ることができないことを示す。かくして、前記分散は、わずかに曇りを有するのみであり、半透明である。本発明に係るリン脂質のリンガー乳酸塩及び生理食塩水中の分散は、注射用水中の本発明に係るリン脂質の分散ほど微細でない。これら２つの分散物は曇っているが、分散物は可視の巨視的なミセルの凝集を欠いていることは明らかである。] 図１８
[0140] （実施例９）
実施例１に記載のように調製したリン脂質は、実施例２において、擦傷によって損傷された中皮細胞及びケラチン生成細胞の単層の再上皮化を促進したことが示されている。これは、部分的には、細胞増殖および細胞移動に対する効果によって達成する(Yung, S. et al; 1998; "Response of the human peritoneal mesothelial cell to injury: an in vitro model of peritoneal wound healing. " Kidney international 54:2160-2169; and Yung, S. et al 2000 "Induction of hyaluronan metabolism after mechanical injury of human peritoneal mesothelial cells in vitro" ; Kidney international 58: 1953-1962)。]
[0141] 実施例１に記載のように調製したリン脂質が、腱の損傷に関する修復プロセスに対しても同様の効果を有するか否かを確立するために、腱鞘の滑膜表層細胞又は腱若しくはエピテノン（ｅｐｉｔｅｎｏｎ）由来の細胞を使用して実験を実施した(Lundborg, G. et al; 1978; "Experimental intrinsic healing of flexor tendons based upon synovial fluid nutrition" The Journal of hand surgery 3:21-31 ; Manske, P. R. et al; 1984; "Histologic evidence of intrinsic flexor tendon repair in various experimental animals. An in vitro study. " Clinical orthopaedics and related research :297-304; Gelberman, R. H. et al; 1984; "Flexor tendon repair in vitro: a comparative histologic study of the rabbit, chicken, dog, and monkey" ; Journal of orthopaedic research 2:39- 48)。腱複合体は、エピテノン（腱の外表）由来の細胞、エンドテノン（腱内部）由来の細胞、及び腱鞘の滑膜表層細胞からなる。細胞増殖の速度が、増殖因子に対する応答において、これら３種の細胞タイプの間で顕著に変化する証拠が存在する（Khan, U. et al; 1998; "Differences in proliferative rate and collagen lattice contraction between endotenon and synovial fibroblasts . " The Journal of hand surgery 23:266-273）。]
[0142] 方法
損傷後の細胞増殖及び修復に対する、実施例１に記載のように調製したリン脂質の影響を評価するために、腱又は鞘由来細胞（鞘、エピテノン、及びエンドテノン）を、コンフルエント又はサブコンフルエントまでの単層培養物に確立する（Vater, CA. et al; 1979; "Inhibitor of human collagenase from cultures of human tendon. " The Journal of biological chemistry 254:3045-3053 ; Becker, H. et al; 1981 ; "Intrinsic tendon cell proliferation in tissue culture. " The Journal of hand surgery 6:616-619）。]
[0143] コンフルエントな培養物において、過去に開示されているように（Yung et al. 1998, 2000）、金属ロッドを使用して細胞を掻きとって損傷させる。実施例１に記載のように調製したリン脂質の量を増大させながら存在させるか（０．１から４ｍｇ／ｍｌ）又はその不在下において、７日までの期間にわたって低速度撮影のビデオ顕微鏡を使用して、損傷が閉じるのをモニターする（Morgan, L. W. et al; 2003; "Glucose degradation products (GDP) retard remesothelialization independently of D-glucose concentration" Kidney international 64: 1854- 1866）。]
[0144] サブコンフルエントの細胞において、実施例１に記載のように調製したリン脂質によって処置するか又は対照処置をした後に、腱由来の細胞増殖を７２時間の期間にわたってＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ細胞増殖アッセイを使用して評価する（Squatrito, R. C. et al; 1995; "Comparison of a novel redox dye cell growth assay to theATPbioluminescence assay"Gynecologic oncology 58:101-105）。]
[0145] （実施例１０）
ＡＬＥＣ（登録商標）（Ｂｒｉｔａｎｎｉａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｌｔｄ）は、マウスモデルの癒着形成を低減することが過去に示されており、そのため、実施例１に記載のように調製したリン脂質が、手術修復後の腱の癒着の低減において類似の保護メカニズムを備えている可能性がある。腱の損傷後において、癒着形成は、瘢痕の形成をもたらす、コラーゲン及び他の細胞外マトリックス成分（例えば、コラーゲン及びフィブロネクチン）の沈着の増大を伴うと解されている。過去の研究は、ＴＧＦ−βｍＲＮＡ発現（細胞外マトリックス代謝回転の強力な調節因子）の変化が、エンドテノン及びエピテノン並びにインビトロの腱鞘細胞のいずれにおいても発生し得ることを示している（Chang, J. et al; "Gene expression of transforming growth factor beta-1 in rabbit zone II flexor tendon wound healing: evidence for dual mechanisms of repair. " Plast Reconstr Surg 1997; 100: 937-994）。]
[0146] 方法
腱細胞の細胞外マトリックス生産に対する実施例１に記載のように調製したリン脂質の影響を評価するために、腱細胞（鞘、エピテノン、及びエンドテノン）のサブコンフルエントまでの単層培養物を確立した（Vater, CA. et al; 1979; "Inhibitor of human collagenase from cultures of human tendon. " The Journal of biological chemistry 254:3045-3053; Becker, H. et al; 1981 ; "Intrinsic tendon cell proliferation in tissue culture" The Journal of hand surgery 6:616-619）。]
[0147] サブコンフルエントな腱由来の細胞における、構成的及びサイトカイン（例えば、インターロイキン−１）駆動性の増殖因子（ＴＧＦ−β）及び細胞外マトリックス（コラーゲンＩ／ＩＩＩ及びフィブロネクチン）ｍＲＮＡ発現の双方を、市販の有効なプライマーセットを使用してＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）９７００マルチアナライザーを使用して定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって評価する。これらの実験は、増大する用量の実施例１に記載のように調製したリン脂質（０．１から４ｍｇ／ｍｌ）の存在下又は不在下において７２時間の期間にわたって実施する。]
[0148] （実施例１１）
腱の損傷修復後の癒着形成は、大きな医学的な問題である。これらは、近接して向かい合った腱の間又は腱と腱鞘との間において生じる。腱の損傷は再生プロセスではなく、瘢痕組織の形成によって治癒するため、腱の修復は、機能の損傷（腱の滑り及び制限された可動性）又は更なる損傷（破裂）をもたらし得る、欠陥がある生体力学特性を有することが多い。腱の癒着形成を低減するための試みは、多くの場合に成功しないままであり、市場で得られる治療方法は限られている。]
[0149] 実施例１に記載のように調製したリン脂質が腱の治癒を改善し、並びに損傷及び手術後の修復の後に機能する潜在能力を有するか否かを確立するために、確立され、かつ、有効性が確認されたインビボモデルを使用する。ウサギの前足屈筋腱修復モデルが腱の治癒及び損傷後の機能を定量するための最適なモデルであることがよく確立されている（Lundborg, G. et al; 1985; "Intrinsic tendon healing. A new experimental model" Scandinavian journal of plastic and reconstructive surgery 19: 113-117; Greenwald, D. et al; 1991 ; "Biomechanical analysis of intrinsic tendon healing in vitro and the effects of vitamins A and E" Plastic and reconstructive surgery 87:925-930; discussion 931-922）。]
[0150] 手術は、癒着対照としての損傷した未処理の腱とともに、各処理群において８匹のウサギの右前肢の２及び４の指で実施する。中手指節関節の近位で切開して、滑液鞘に対する直接的な損傷を避ける。床指屈筋腱の滑液嚢内箇所を、近位の収縮によって評価し、部分的な腱切除を実施する。腱の損傷は実施例１に記載のように調製したリン脂質、及び滑液嚢内箇所に戻した腱で被覆する。二週間後に指を回収し、腱−滑膜癒着複合体を注意深く切除する。]
[0151] 引張強度の評価
未処理の指を使用して、対照の癒着強度を測定する。処理後の損傷した指を試験して、癒着強度の修正における実施例１に記載のように調製したリン脂質の効果を調べる。]
[0152] 引張試験機装置の使用は、腱の修復及び癒着形成の生体力学を評価するためによく確立されている（He Q et al . , "Repair of flexor tendon defects of rabbit with tissue engineering method" Chin J Traumatol 2002; 5: 200-8; Jones ME et al, "The role of human-derived fibrin sealant in the reduction of postoperative flexor tendon adhesion formation in rabbits" J Hand Surg (Br) 2002; 27: 278-82）。クランプを使用して指の爪を保持し、ＦＤＰ腱をシルク２／０縫合糸で引張強度試験装置に結紮する（Ｚｗｉｃｋ Ｒｏｅｌｌ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｌｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。引張は、一定速度（２．５ｍｍ／分）で実施して、評価の直前にその付着点から切断した腱を使用して、鞘から腱を引き出すのに必要な力を測定する。]
[0153] （実施例１２）
本実施例の目的は、実施例１によって調製したリン脂質が、腱由来の線維芽細胞の増殖を変化させるか否か、腱由来の線維芽細胞の細胞外マトリックス合成に対する効果を有するか否か、遺伝子転写を変化させるか否か、及びインビボモデルにおける癒着の形成を予防するか否かを評価することであった。]
[0154] 屈筋腱損傷は、米国において一年に１００万の約３分の１の指の屈筋腱損傷が存在するほど、一般的な損傷である（Pennisi, 2002）。現在の最適な手術技術及び早期の修復後の運動プロトコールの遵守にもかかわらず、外傷を受けた手の修復後の裂けた滑膜内の指の屈筋腱の１５から２０％において乏しい結果のみが依然として得られる。損傷が指の滑膜鞘の領域である場合に、乏しい結果は機能障害を引き起こす癒着であることが多い（Potenza 1963; Matthews and Richards1976; Manske, 1988; Khan et al. 1996）。これらの半数は、屈筋腱剥離術の形態の追加の手術を必要とする（Strickland 2000）。二段階の腱再構成は、手術及びリハビリテーションを終えるまでに一年の休暇を必要とし、２８％は段階的な腱再構築において乏しい結果を有すると評価されている。]
[0155] 腱は再生プロセスでは治癒せず、治癒は繊維状の瘢痕の形成により生じる（Gelberman et al, 1985a, 1986, 1985b; Speer et al, 1985; Hatano et al, 2000）。この修復は、妥協的な機能を生じる粗悪な生体力学的特性を有する。さらに、腱と鞘との間の癒着は、腱が滑るメカニズムに害を及ぼし、限られた可動性を生じさせ得る（Manske et al, 1985）。新しい手術技術及びリハビリテーションにより結果が改善されているが、癒着は依然として大きな問題のままである（Gelberman et al, 1985a, Porat et al, 1980; Speer et al, 1985; Manske et al, 1985; Thomas et al, 1986; Nyska et al, 1987; Beredjiklian, 2003）。現在までの癒着形成を制御する試みは失敗しており、物理的又は薬理学的手段による創傷治癒プロセスの取扱いに集中しており、癒着の形成を低減し得るが、破裂率の増大をもたらす（例えば、ADCON; Golash et al, 2003）。]
[0156] 腱の治癒は、修復の３つの連続するフェーズ：炎症、線維芽細胞、及びリモデリングを有する。腱の修復の２つのメカニズム：腱細胞及び炎症細胞芽が末梢から修復部位に移動して治癒を促進する外因性のものと、腱（エンドテンシン）内の細胞が修復部位に移動することによる内因性のもの（Manske et al, 1985; Gelberman et al, 1986)）とを提唱する多くの研究が存在する。外因性の修復は癒着形成と関連する。最近の研究により、腱の修復は外因性及び内因性修復の双方の組み合わせによることが示唆されている。線維芽細胞の移動が癒着形成における役割を担っており、創傷の数日後かつ修復中に線維芽細胞走化性及び基底層への癒着がフィブロネクチン分泌と直接関係しているようであることがよく確立されている（Gelberman et a, 1991）。他の研究によって、フィブロネクチン及びＴＧＦβ１ＲＯが、重度の癒着形成を有する腱において上方調節されていることが示唆されている（Ngo et al, 203）。]
[0157] 未損傷の腱は、骨から筋肉への結合を可能にする、密に一定の間隔で組織化されたコラーゲン線維からなる。腱の構造は、縦方向に配置されたコラーゲン線維から構成される。未損傷の腱は、６０から８５％のコラーゲンタイプＩから構成され、０から１０％のみがコラーゲンタイプＩＩＩから構成される（乾燥重量）。コラーゲンタイプの比率又はその架橋が変化すると、腱は負荷に対する耐久性が乏しくなるか、又は多すぎる細胞マトリクスが生産されると、癒着の形成が生じる。]
[0158] 材料及び方法
エピテノン（表面）、エンドテノン（コア）、及び鞘由来の腱の細胞は、複数の増殖因子（Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ，１９９８）、阻害抗体（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，２００４）、細胞外マトリックス遺伝子転写（Ｂｅｒｇｕｌａｎｄ ｅｔ ａｌ，２００６）、コラーゲンゲル縮小（Ｒａｇｏｏｗａｎｓｉ ｅｔ ａｌ，２００３）、及びフィブロネクチン分泌（Ｇｅｌｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ，１９９１）に対して異なる増殖速度を有することが示されている。したがって、３種全ての細胞タイプを確立し、別々の細胞株として培養した。]
[0159] 腱由来の線維芽細胞を、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（ＮＧＭ）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）中で培養した。]
[0160] リン脂質の調製
実施例１にしたがって調製され、「プマクタント」と本実施例で称されるリン脂質の５ｍｇ／ｍｌ溶液を、滅菌した１００ｍｌの容器中で無血清培地に溶解し、３７℃でインキュベートし、次いで、１ｍｇ／ｍｌの濃度までさらに希釈した。]
[0161] ＴＧＦ−βの調製
２ｎｇ／μｌのストック濃度で、ＴＧＦ−βを製造業者の説明書にしたがって希釈した。濃度は２ｎｇ／μｌを採用した（過去に最適化した）。]
[0162] ウシ胎仔血清の調製
５％（ｖ／ｖ）、２．５％、１．２５％、０．６％、０．３％の濃度のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を無血清培地に希釈した。]
[0163] 増殖アッセイ
腱由来の線維芽細胞を５×１０３／ウェルで９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に播種して、最小培地（０．４％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ）中で一晩にわたって接着させ、健康であるが休止状態に細胞を維持した。２４時間後に、培地を吸い取って、試験培地（複数の濃度のプマクタント、又は異なる濃度のウシ胎仔血清、又は異なる濃度のＴＧＦ−β１を添加した最小培地）に置換して、２４、４８、及び７２時間にわたって培養した。ＷＳＴ−１アッセイ（Ｒｏｃｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｌｔｄ）を使用して細胞数を評価した。試験培地を除去して、ウェルを最小培地で二回洗浄し、最小培地を置換して、１０μｌのＷＳＴ−１溶液を各ウェルに添加した。細胞を１時間にわたって標準の組織培養条件下においてインキュベートした。試薬を着色したホルマザン結晶に変換する生細胞数に関連する吸光度を、４５０ｎｍでＢｉｏ−Ｒａｄプレートリーダーで読み取った。実験は、各細胞株について三回重複して実施した。]
[0164] 接着アッセイ
コラーゲンタイプＩ、コラーゲンタイプＩＩＩ、若しくはフィブロネクチンで被覆しているか又は未被覆のウェルを有する、Ｎｕｎｃ ｍａｘａｂｓｏｒｂ ９６ウェル培養プレートを使用した。ウェルは３つ重複して用意した。細胞をプラスチックフラスコからＡｃｃｕｔａｓｅを使用して取り出して、ＮＧＭに再懸濁した。２×１０５細胞／ｍｌが必要であった。細胞を処理（プマクタント１ｍｇ／ｍｌ）して、３７℃で３０分間にわたって懸濁物中でインキュベートした。１００μｌ細胞及び処理溶液を被覆ウェルに播種した。細胞／処理溶液を２時間にわたって、加湿５％ＣＯ２条件下において３７℃でインキュベートする。処理溶液を吸い取って、ウェルをＰＢＳでやさしく洗浄する。最後に、細胞を固定化し、ｃｒｙｓｔａｌ ｖｉｏｌｅｔ溶液（０．５％ ｃｒｙｓｔａｌ ｖｉｏｌｅｔ、５％ホルモル生理食塩水、５０％エタノール、０．８５％ＮａＣｌ）で染色する。ｃｒｙｓｔａｌ ｖｉｏｌｅｔを除去して、リン酸緩衝生理食塩水を用いてウェルを注意深く洗浄する。結合したｃｒｙｓｔａｌ ｖｉｏｌｅｔを３３％酢酸に可溶化し、プレートをＢｉｏ−Ｒａｄプレートリーダーにおいて５９５ｎｍで読取った。]
[0165] 細胞外マトリックス生産
Ｓｉｒｃｏｌアッセイ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ Ｌｔｄ）を過去に開示されているように実施した（Ｒｏｌｆｅ ｅｔ ａｌ，２００７）。腱由来の線維芽細胞を１０６細胞／２５ｃｍ２フラスコに播種して、接着させ、ＮＧＭ中で一晩拡散させた。ＰＢＳを用いて細胞を二回洗浄して、５％ウシ胎仔血清＋／−プマクタント（１ｍｇ／ｍｌ）又は＋／−ＴＧＦ−β１（２ｎｇ／ｍｌ）を添加したＤＭＥＭで培地を置換した。次いで、条件培地を回収した。細胞をトリプシンで処理して、計数し、後のコラーゲン定量を細胞数について修正した。Ｓｉｒｕｓ ｒｅｄ染料に対するプマクタントの結合により、プマクタントを含有する条件培地を１０，０００ｇで５分間にわたって遠心分離した（最適化後、データ示さず）。２００μｌの条件培地を、１ｍｌのＳｉｒｃｏｌ染料と３０分間にわたってインキュベートした。次いで、管を１０，０００ｇで１０分間にわたって遠心分離し、沈殿したコラーゲン−染料複合体をペレット状にした。]
[0166] 上清を除去して、１ｍｌのアルカリ試薬をコラーゲンペレットに添加した。溶解したコラーゲン及び染料溶液を、次いで、コラーゲン標準物質とともに、９６ウェルプレートに３ウェル重複させて分取した（２００μｌ／ウェル）。次いで、溶液を５４０ｎｍで読取った。全ての実験を３回繰り返して、各実験を三回重複して実施した。結果は、細胞数で標準化した。]
[0167] ＱＲＴ−ＰＣＲ
プマクタント又はＴＧＦ−β１を用いる刺激の前に、細胞を無血清培地中に２４時間にわたって置いて、トリパンブルーを使用して生存率を評価した（Ｓｉｇｍａ；データ示さず）。静止細胞を、プマクタント（１ｍｇ／ｍｌ）を用いて０から２４時間にわたって又はＴＧＦ−β１を用いて０から２４時間にわたって（陽性対照）処理した。全ＲＮＡを処理サンプル及び未処理サンプルからＴｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ）を使用して単離した。Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標） Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ（登録商標） ＲＮＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＲＮＡ濃度を測定した。第一鎖ｃＤＮＡは、ＳｔｒａｔａＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標））を、オリゴヌクレオチドｄＴ（０．５μｇ／μｌ）とともに使用して製造業者の説明書にしたがって合成した。]
[0168] 定量リアルタイムＰＣＲ
１２．５μｌのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（商標）、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）及び１０ｐＭの各プライマーを含有する２５μｌの反応溶液中で、製造業者の説明書にしたがって、２μｌの第一鎖ｃＤＮＡ産物を増幅に三回重複して使用した。プライマー配列は表１に記載している。プライマー配列は、本願明細書に添付し、その一部である配列表にも記載している。]
[0169] ＰＣＲ反応をＭＸ３０００Ｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で実施した。ＰＣＲプログラムは、反応物を１０分間にわたって９５℃でインキュベートする最初の変性、９５℃で３０秒、６０℃で１分のプライマーのアニーリング、７２℃で３０秒の伸長の４０サイクルでＤＮＡを増幅する第二のステップからなる。解離曲線により、プライマー二量体が各ＰＣＲの実施後に存在しないことを確実にした。]
[0170] インビボアッセイ
Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ（２０００）は、ウサギ屈筋修復モデルが、腱瘢痕形成を基節骨と末節骨との間の屈曲の程度に基づいて定量するために有用であることを示した。]
[0171] 全ての動物のケアは、「ＵＫ Ｈｏｍｅ ｏｆｆｉｃｅ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ’ １９９６」を遵守した。全身麻酔（クエン酸フェンタニル及びフルアニソン及びイソフルラン／Ｏ２）下で１６匹のＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅウサギ（ＮＺＷ）の右前肢の２及び４の指に対して、手術を過去（Ｂｒａｎｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ）に開示されているように実施した。手術部位は剃毛して、クロルヘキシジンを用いて下処理をした。滑液鞘に対する直接的損傷を避けながら、中手指節関節に近接した「Ｖ」型の切開を、深指屈筋（ＦＤＰ）腱にアクセスした。浅指屈筋腱を切除して、癒着をＦＤＰ腱と鞘との間の形成されるものに限定した。滑液嚢内腱を曝露することによって、ＦＤＰ腱を縮めた。外科用メスを使用して、半分の厚さ及び５ｍｍの長さの損傷を作成した（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ，２００２）（この技術は多数の文献に開示されている（Ｋａｋａｒ ｅｔ ａｌ，１９９８、Ａｋａｌｉ ｅｔ ａｌ，１９９９、Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ，２０００））。指を広げて、損傷を滑液嚢内の位置に戻して、腱を縫合し、固定した（近位相互作用によって）。]
[0172] プマクタント（滅菌水に溶解した１０ｍｇ／ｍｌ）で処理した群又は未処理の群に、ＮＺＷをランダムに分けた。針を除去した２４ゲージのカニューレを使用して処置（鞘当たりの１０ｍｇ／ｍｌプマクタントの０．５ｍｌ）を、腱鞘に浸潤させた。]
[0173] 残部のプマクタントを皮膚の組織片の下に置いた。清潔な４／０ナイロン縫合糸を使用して皮膚を閉じ、抗生物質（オーレオマイシン）粉末を局所的に適用した。動物を移動させ、次いで、１４日目に処分した。]
[0174] 未手術の対照として、左前肢の指２及び４を回収した。ｉ．力学的評価又はｉｉ．定量的組織学的評価に、指をランダムに分けた。]
[0175] 力学的評価
腱／癒着最大抗張力の間の関係は、組成並びにコラーゲン線維の長さ及び機械的挙動に依存する。引張強度試験装置の使用は、腱修復及び癒着形成の生体力学評価に関する文献でよく確立されている（Ｈｅ ｅｔ ａｌ，２００２、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ，２００２、Ｍｏｍｏｓｅ ｅｔ ａｌ，２００１、Ｂｒａｎｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ，２００７）。]
[0176] 前肢を新しく評価した。試験する前に、Ｖ型の傷を再び開き、処理した腱の各々の近位遊離端を同定した。遠位切断面をＦＤＰの遠位指節骨への付着上に作製した。これにより、腱を鞘の中に自由に入れることが可能となり、近位に適用した力が、鞘と腱との間に存在する任意の癒着の強度のみを測定するように両端が接続されていない状態である。クランプを使用して指の爪の各々を保持し、近位ＦＤＰ腱を引張強度試験装置（Ｍｅｃｍｅｓｉｎ）に固定した。次いで、癒着が壊れるまで、近位腱を鞘から引っ張った（５ｍｍ／分）。最大の力をニュートンで測定した。]
[0177] 組織学的分析
指をホルマリン中で固定して、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）中で脱灰し、パラフィンで包んだ。縦断面を標準の深さで切断し、腱全体の任意の癒着形成を評価した。次いで、前記断面をヘマトキシリン及びエオシン又はＭａｓｓｏｎ Ｔｒｉｃｈｏｍｅのいずれかで染色した（コラーゲンの構造を決定するため）。周囲の組織に対して腱を接続する特徴的な高密度の細胞帯としての、顕微鏡検査における癒着の存在が記録され、次いで、下記の表２に示すように、Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ（１９９６）によって開示されているように癒着の採点を実施した。]
[0178] データ分析
リアルタイムＰＣＲにおいて相対発現レベルを算出するために、相対的発現ソフトウェアツール（ＲＥＳＴ（登録商標））を使用した（Ｐｆａｆｆｌ ｅｔ ａｌ，２００２）。この数学モデルは、ＰＣＲ効率、及び処理細胞と未処理細胞との間の平均クロシングポイント（ｃｒｏｓｓｉｎｇ ｐｏｉｎｔ）偏差に基づく。２種のハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ及びＡＣＴＢを使用して、標的遺伝子発現を標準化した。Ｐａｉｒ Ｗｉｓｅ Ｆｉｘｅｄ Ｒｅａｌｌｏｃａｔｉｏｎ Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔによって群間の相違の統計分析を実施し、ＲＥＳＴ−ＸＬソフトウェア（Ｐｆａｆｆｌ ｅｔ ａｌ，２００２）で解釈し、変動係数を得た。Ｓｉｇｍａ Ｐｌｏｔを使用して、対数グラフを示す。]
[0179] 統計学的な優位性は、適当な場合にＳｔｕｄｅｎｔ ｔ−ｔｅｓｔを使用して分析した。＜０．０５のｐ値は、統計的に有意であると解した。]
[0180] 結果
増殖：
腱鞘：０．２５ｍｇ／ｍｌのプマクタント中で培養した腱鞘由来の細胞は、２４時間で細胞数における有意な低減を示した（ｐ＝０．０４；図１９）。残りの濃度は細胞数における増大を示したが、いずれの濃度も、最小培地のみで増殖させた細胞との比較における統計的優位性を示さなかった。各種の濃度のＴＧＦ−β１又はＦＣＳで培養した鞘細胞において統計的優位性は存在しなかった（データ示さず）。] 図１９
[0181] プマクタント中で培養した腱由来の鞘細胞は、４８時間ではいずれの濃度においても統計的優位性を示さなかった（図２０Ａ）。しかしながら、４８時間における腱鞘細胞（図２０Ｂ）は、無血清培地中で増殖させた細胞と比較して、各種の濃度のＦＣＳ：０．６％（ｐ＝０．０２５）、１．２５％（ｐ＝０．０３）、２．５％（ｐ＝０．００３）、及び５％（ｐ＝０．０１）において増殖における統計的に有意な増大を示した。腱鞘由来の細胞は、４８時間で任意の濃度のＴＧＦ−β１で培養した際には、統計的優位性を示さなかった。] 図２０Ａ 図２０Ｂ
[0182] プマクタント中で培養した７２時間の時点の腱鞘細胞（図２１Ａ）は、最小培地のみで増殖させた細胞と比較して、４ｍｇ／ｍｌ（ｐ＝０．０２２）及び２ｍｇ／ｍｌ（ｐ＝０．０１８）の双方において統計的に有意な増大を示した。全ての濃度のウシ胎仔血清が、無血清培地中で増殖させた細胞と比較して、統計的な増大を示した（図２１Ｂ）。] 図２１Ａ 図２１Ｂ
[0183] 腱表面細胞：２４時間の時点の腱の表面由来の細胞（図２２Ａ）は、プマクタント中で培養した際に、２及び４ｍｇ／ｍｌで増殖における増大を示したが、統計的な優位性にまでは至らなかった。腱の表面細胞は、０．６％（ｐ＝０．０２７）及び２．５％（ｐ＝０．００１；図２２Ｂ）のウシ胎仔血清で、無血清培地中で増殖させた細胞と比較して統計的に優位な増大を示したが、ＴＧＦ−β１中で培養した細胞は、いずれの濃度においても統計的に有意な差異は示さなかった。] 図２２Ａ 図２２Ｂ
[0184] ４８時間では、腱表面細胞は、最小培地で増殖させた細胞と比較して、２ｍｇ／ｍｌのプマクタントと培養した際に統計的に有意な増大を示した（図２３Ａ）。０．６％を除く全ての濃度のウシ胎仔血清は、無血清培地中で培養した細胞と比較して統計的に有意な増大を示した（図２３Ｂ）。いずれのＴＧＦ−β１の濃度も、４８時間の時点では有意な増大を示さなかった（データ示さず）。] 図２３Ａ 図２３Ｂ
[0185] ７２時間の時点の腱表面細胞（図２４Ａ）は、２及び４ｍｇ／ｍｌのプマクタント中で培養した際に増殖における増大を示したが、統計的な優位性にまでは至らなかった。腱表面細胞は、無血清培地のみで増殖させた細胞と比較して、２．５％（ｐ＝０．０３）及び５％（ｐ＝０．０４；図２４Ｂ）ウシ胎仔血清において、増殖における統計的に有意な増大を示した。さらに、２ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１中で培養した腱表面細胞は、増殖における統計的に有意な増大を示した（ｐ＝０．００３；図２４Ｃ）。] 図２４Ａ 図２４Ｂ 図２４Ｃ

权利要求:

請求項1
結晶状態のリン脂質。
請求項2
凍結乾燥されている、請求項１に記載のリン脂質。
請求項3
滅菌されている、請求項１又は２に記載のリン脂質。
請求項4
極性溶媒に室温で分散される際に、形成される分散物が、離散した結晶を含むような状態にあり；好ましくは、極性溶媒に３７℃で分散される際に、形成される分散物が、ミセルの可視的な凝集を実質的に有しない微細なミセル分散を含むような状態にあり；より好ましくは、前記極性溶媒が等張極性溶媒である、請求項１から３のいずれか一項に記載のリン脂質。
請求項5
呼吸域粒子の状態であり、好ましくは、前記呼吸域粒子が肺への投与に適切な空気動力学的中央粒子径を有し、より好ましくは、前記呼吸域粒子の空気動力学的中央粒子径が１０μｍ未満である、請求項１から４のいずれか一項に記載のリン脂質。
請求項6
微細粒子の状態にある、請求項１から５のいずれか一項に記載のリン脂質。
請求項7
一般式：［式中、Ｒ１及びＲ２は、各々独立に、水素原子又は脂肪酸アシル基を表わし（ある態様では、Ｒ１及びＲ２は、各々独立に、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和の１４から、好ましくは１６から２２まで、好ましくは２０までの炭素原子を有するアシル基を表わす）、Ｒ３は、水素原子、又はコリン、グリセロール、エタノールアミン、セリン、若しくはイノシトール基を表わすが、Ｒ１及びＲ２の双方が水素原子とはなり得ない］を有する、請求項１から６のいずれか一項に記載のリン脂質。
請求項8
Ｒ１又はＲ２によって独立に表わされる脂肪酸アシル基が、パルミトイルＣ１６：０、ステアロイルＣ１８：０、オレオイルＣ１８：１、及び／又はオレオイルＣ１８：２であり、好ましくは、Ｒ１及びＲ２の各々が水素原子を表わさず；好ましくは、Ｒ１及びＲ２が同一の飽和又は不飽和のアシル基を表わす、請求項７に記載のリン脂質。
請求項9
結晶状態のリン脂質であって、前記リン脂質が滅菌されており、一般式：［式中、Ｒ１及びＲ２は、各々独立に、水素原子又は脂肪酸アシル基を表わし（ある態様では、Ｒ１及びＲ２は、各々独立に、直鎖又は分枝鎖の、飽和又は不飽和の、１４以上、好ましくは１６から２２、好ましくは２０以下の炭素原子を有するアシル基を表わす）、Ｒ３は、水素原子、又はコリン、グリセロール、エタノールアミン、セリン、若しくはイノシトール基を表わすが、Ｒ１及びＲ２の双方が水素原子とはなり得ない］を有し、好ましくは請求項２、４、５、６、又は８に記載されたものである、リン脂質。
請求項10
リン脂質の製造方法であって、極性溶媒にリン脂質を分散する工程；前記リン脂質分散物を均質化する工程；及び（ａ）均質化した前記リン脂質を濾過して滅菌し、濾過したリン脂質分散物を凍結乾燥する工程；又は（ｂ）前記リン脂質分散物を凍結乾燥し、凍結乾燥したリン脂質を微粉化する工程のいずれかを含む、方法。
請求項11
前記濾過工程が、０．５μｍフィルター、好ましくは０．２μｍフィルターを使用する、請求項１０に記載の方法。
請求項12
請求項１０又は１１に記載の方法によって得ることができるリン脂質。
請求項13
製薬学的に許容される希釈剤とともに、請求項１から９及び１２のいずれか一項に記載のリン脂質を含む、医薬組成物。
請求項14
唯一の活性成分がリン脂質である、請求項１３に記載の医薬組成物。
請求項15
請求項１３又は１４に記載の医薬組成物を製造するためのキットであって、第一の部分が請求項１から９及び１２のいずれか一項に記載のリン脂質を含み、第二の部分が製薬学的に許容される希釈剤を含む、少なくとも２つの部分を有する、キット。
請求項16
損傷組織の治療に使用するための、請求項１から９及び１２のいずれか一項に記載のリン脂質、又は請求項１３若しくは１４に記載の医薬組成物、又は請求項１５に記載のキット。
請求項17
損傷組織の治療に使用するための医薬の製造における、請求項１から９及び１２のいずれか一項に記載のリン脂質、又は請求項１３若しくは１４に記載の医薬組成物、又は請求項１６に記載のキットの使用。
請求項18
請求項１から９及び１２のいずれか一項に記載のリン脂質、又は請求項１３若しくは１４に記載の医薬組成物、又は請求項１６に記載のキットの治療有効量を、治療の必要なヒト又は動物の患者に適用する工程を含む、損傷組織の治療方法。