増強されたａｄｃｃ機能を有する抗体

专利摘要:
本発明は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害活性(ＡＤＣＣ)が増強された抗体、及びその調製方法に関する。
公开号:JP2011512875A
申请号:JP2010550843
申请日:2009-03-11
公开日:2011-04-28
发明作者:エイミー シェン，；ロバート バイエル，；エフレン パシス，；リード，；ジェイ． ハリス，；マーセラ ユー，；フェン リー，；ドミンゴス ング，
申请人:ジェネンテック， インコーポレイテッド；
IPC主号:C12N5-10

专利说明:

[0001] 本発明は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害活性(ＡＤＣＣ)が増強された抗体とその調製方法に関する。]
背景技術

[0002] 抗体依存性細胞媒介性細胞傷害活性(ＡＤＣＣ)は、Ｆｃレセプター(ＦｃＲ)を発現する非特異的細胞傷害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、好中球、及びマクロファージ)が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性反応である。ヒトＩｇＧクラスの抗体の中でも、ＩｇＧ１サブクラスは、最も高いＡＤＣＣ活性とＣＤＣ活性を有していることが知られており、現在、その効果の発現に対して高いエフェクター機能を必要とする商業的に入手可能なハーセプチン(登録商標)(トラスツズマブ)及びリツキサン(登録商標)(リツキシマブ)を含む臨床腫瘍学的診療におけるヒト化抗体の殆どがヒトＩｇＧ１サブクラスの抗体である。]
[0003] 治療用抗体の作用強度を増強するために、例えば抗体の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害活性(ＡＤＣＣ)及び／又は補体依存性細胞傷害活性(ＣＤＣ)を亢進させるようにエフェクター機能について抗体を修飾することがしばしば望ましい。これは、腫瘍学の分野で特に有益である場合があり、治療用モノクローナル抗体は、腫瘍細胞上の特異的抗原に結合し、腫瘍細胞の破壊に至る免疫応答を誘導する。Ｆｃレセプターを有するキラー細胞とのＩｇＧの相互作用を増強させることにより、これら治療用抗体をより強力にすることができる。]
[0004] ＡＤＣＣ等のエフェクター機能の増強は、抗体のＦｃ領域に一又は複数のアミノ酸置換を導入することを含む様々な手段により達成され得る。別法として又は付加的に、システイン残基(群)をＦｃ領域に導入し、それによって、この領域に鎖間ジスルフィド結合の形成を許容してもよい。このようにして生成されたホモ二量体抗体は、改善された内部移行能力、及び／又は増加された補体媒介性細胞死滅及び抗体依存性細胞傷害活性(ＡＤＣＣ)を有している場合がある。Caronら, J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992)、及びShopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)を参照。また、増強された抗腫瘍活性を有するホモ二量体抗体も、Wolffら, Cancer Research 53:2560-2565 (1993)に記載されているように、ヘテロ二官能性クロスリンカーを使用して調製することができる。別法では、二重Ｆｃ領域を有し、増強された補体溶解性及びＡＤＣＣ能力を有し得る抗体を設計可能である。Stevensonら, Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照。]
[0005] ＩｇＧクラスの抗体を含む抗体のエフェクター機能を増強する別のアプローチ法は、抗体Ｆｃ領域のグリコシル化パターンを操作することである。ＩｇＧ分子は、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのそれぞれの保存されたＡｓｎ２９７に共有的に結合したＮ結合オリゴ糖を含んでいる。血清ＩｇＧのＦｃ領域に見出されるオリゴ糖は、大部分は、複合型の２分岐グリカン類である。多くの抗体グリコフォームは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害活性(ＡＤＣＣ)を含む抗体エフェクター機能に対してポジティブな影響を有していると報告されている。よって、Ｆｃ部位の炭水化物成分の糖鎖工学、特にコアフコシル化の低減は、Shinkawa Tら, J Biol Chem. 2003;278:3466-73; Niwa Rら, Cancer Res 2004;64:2127-33; Okazaki Aら, J Mol Biol 2004;336:1239-49; 及びShieldsRLら, J Biol Chem 2002;277:26733-40により報告されている。]
[0006] 選択されたグリコフォームを有する抗体は、グリコシル化経路インヒビター、グリコシル化経路の特定の酵素の活性がなくなったか又は低減した変異株化細胞、増強されたか又はノックアウトされたグリコシル化経路における遺伝子発現を有する遺伝子操作細胞、及びグリコシダーゼ及びグリコシルトランスフェラーゼを用いたインビトロリモデリングの使用を含む多くの手段により作製されている。Rothmanら, 1989; Molecular Immunology 26: 1113-1123は、グルコシダーゼインヒビターであるカスタノスペルミン及びＮ-メチルデオキシノジリマイシン(methyldeoxynojirimycin)、及びマンノシダーゼＩインヒビターのデオキシマンノジリマイシンの存在下でモノクローナルＩｇＧを発現させた。Umanaら, Nature Biotechnology 1999; 17: 176-180には、ＧＮＴ-ＩＩＩを発現するＣＨＯ株化細胞において発現されたキメラＩｇＧ１の増強されたエフェクター機能が記載されている。Shieldsら, 2002;JBC 277:26733-26740, 2002には、フコースを付加するその能力が欠損しているＬｅｃ１３株化細胞で発現されたヒトＩｇＧ１における増強されたＡＤＣＣが記載されている。Shinkawaら, 2003; JBC 278: 3466-3473, 2003には、ＹＢ２／０細胞で発現された抗ＣＤ２０ＩｇＧ１が、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞により産生されたものより、エフェクターとして精製されたヒト末梢血単核球を使用して、５０倍以上高いＡＤＣＣを示すことが示されている。単糖組成とオリゴ糖プロファイリング分析により、ＣＨＯ産生ＩｇＧ１の高Ｆｕｃ量と比較して、複合型タイプのオリゴ糖のフコース(Ｆｕｃ)が低含有量であることはＹＢ２／０産生ＩｇＧ１における特徴である。Kandaら, 2006; Glycobiology 17, 104-118には、非フコシル複合体、非フコシルハイブリッド、Ｍａｎ５、及びＭａｎ８，９グリカンを有するリツキシマブにおけるＡＤＣＣの増強が記載されている。Yamane-Ohnukiら, Biotechnol Bioeng 2004;87:614-22では、コア-フコシルトランスフェラーゼ活性を欠くＣＨＯ細胞における組換え抗体発現により、コアフコシル化の低減が達成されている一方、Moriら, Biotechnol Bioeng 2004;88:901-8では、フコシルトランスフェラーゼに特異的な低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)を使用し、発現した抗体のエフェクター機能が最大化されている。]
[0007] 主としてＭａｎ５グリコフォームを有する抗体は、Wright及びMorrison; 1994, J. Exp. Med. 180:1087-1096; 1998; J. Immunology 160: 3393-3402 により記述されている。該抗体は、活性なＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩを有さないｌｅｃ１株化細胞中で発現された。J. Exp. Med. paperの図８の２相性クリアランス曲線から判断すると、異なるクリアランス特性を有する少なくとも２種の区別される抗体集団が存在していると思われる。より速やかに排除されるＩｇＧ集団は、おそらくはＭａｎ７，８，９グリコフォームを有する抗体である。]
[0008] 一態様では、本発明は、抗体又はその断片、又はイムノアドへシン又はその断片を発現するように改変された(engineered)、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性を欠く哺乳動物細胞に関する。特定の実施態様では、哺乳動物細胞は、増強されたα-１,２-マンノシダーゼ(ここでは、α-マンノシダーゼＩとも称される)活性をさらに有する。
他の態様では、本発明は、抗体又はその断片、又はイムノアドへシン又はその断片を発現するように改変された、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性がＲＮＡｉノックダウンにより低減された哺乳動物細胞に関する。特定の実施態様では、哺乳動物細胞は、増強されたα-１,２-マンノシダーゼ活性をさらに有する。]
[0009] 他の態様では、本発明は、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性が、ＲＮＡｉノックダウンにより、５％又はそれ以上、又は１０％又はそれ以上、又は２０％又はそれ以上、又は２５％又はそれ以上、又は３０％又はそれ以上、又は３５％又はそれ以上のＭａｎ５，Ｍａｎ６グリカンを含む糖鎖構造となるのに十分な程に低減され、増強されたα-１,２-マンノシダーゼ活性をさらに有していてよい、抗体又はその断片、又はイムノアドへシン又はその断片を発現するように改変され、該断片が少なくとも一のグリコシル化部位を有する哺乳動物細胞に関する。]
[0010] 他の態様では、本発明は、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性がゴルジＵＤＰ-ＧｌｃＮＡｃトランスポーターのＲＮＡｉノックダウンにより低減し、さらに増強されたα-１,２-マンノシダーゼ活性を有していてもよい、抗体又はその断片、又はイムノアドへシン又はその断片を発現するように改変され、該断片が少なくとも一のグリコシル化部位を有する哺乳動物細胞に関する。]
[0011] さらなる態様では、本発明は、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性がゴルジＵＤＰ-ＧｌｃＮＡｃトランスポーターのＲＮＡｉノックダウンにより低減し、またＲＮＡｉによりノックダウンしたＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩを有している、抗体又はその断片、又はイムノアドへシン又はその断片を発現するように改変され、該断片が少なくとも一のグリコシル化部位を有する哺乳動物細胞に関する。]
[0012] さらなる他の態様では、本発明は、抗体又はその断片、又はイムノアドへシン又はその断片が産生される条件下で、請求項２又は請求項２２に記載の哺乳動物株化細胞を培養することを含む、主としてＭａｎ５グリカンを有する、該抗体又はその断片、又はイムノアドへシン又はその断片を作製する方法に関する。]
[0013] さらなる態様では、本発明は、ＲＮＡｉノックダウンの結果として低減したＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性を有する哺乳動物株化細胞において、抗体又は抗体断片をコードする核酸を発現させることを含む、糖鎖構造中に制御された量のＭａｎ５グリカンを有する、抗体、イムノアドへシン、又はその断片を組換え産生させる方法に関する。]
[0014] またさらなる態様では、本発明は、α-１,２-マンノシダーゼの存在下で、抗体、イムノアドへシン、又はその断片を発現するように改変されたＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性を欠く哺乳動物株化細胞を培養するか、又はこのようなα-１,２-マンノシダーゼと発現産物を接触させることを含み、Ｍａｎ７，８，９グリカンがＭａｎ５，６グリカンに転換される、糖鎖構造中に主としてＭａｎ５グリカンを有する、抗体、イムノアドへシン、又はその断片の組換え産生方法に関する。]
[0015] またさらなる態様では、本発明は、このような抗体又はその断片、イムノアドへシン又はその断片が産生される条件下で、請求項２又は請求項１４に記載の哺乳動物株化細胞を培養することを含む、５％又はそれ以上、又は１０％又はそれ以上、又は２０％又はそれ以上、又は２５％又はそれ以上、又は３０％又はそれ以上、又は３５％又はそれ以上のＭａｎ５グリカンを有する、抗体又はその断片、又はイムノアドへシン又はその断片を作製する方法に関し、ここで、該抗体断片は少なくとも一のグリコシル化部位を有する。]
[0016] さらに本発明は、α-１,２-マンノシダーゼの存在下で、抗体、イムノアドへシン、又はその断片を発現するように改変され、ＲＮＡｉノックダウンのためにＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性が低減した哺乳動物株化細胞を培養するか、又はこのようなα-１,２-マンノシダーゼと発現産物を接触させることを含み、Ｍａｎ７，８，９グリカンがＭａｎ５，６グリカンに転換される、糖鎖構造中に主としてＭａｎ５グリカンを有する、抗体、イムノアドへシン、又はその断片の組換え産生方法に関する。]
[0017] 他の態様では、本発明は、有毒レクチンの存在下で哺乳動物株化細胞を培養して、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性が低減したクローンを選択し、α-１,２-マンノシダーゼの存在下で、抗体、イムノアドへシン、又はその断片を発現するように、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性が低減した一又は複数の前記クローンを改変するか、又はこのようなα-１,２-マンノシダーゼと発現産物を接触させることを含み、Ｍａｎ７，８，９グリカンがＭａｎ５グリカンに転換され、該断片が少なくとも一のグリコシル化部位を有している、糖鎖構造中に主としてＭａｎ５グリカンを有する抗体、イムノアドへシン、又はその断片を組換え産生させる方法に関する。特定の実施態様では、マンノシダーゼは、組換え産生に使用される細胞に内在性である。]
[0018] さらなる他の態様では、本発明は、α-１,２-マンノシダーゼの存在下で、抗体、イムノアドへシン、又はその断片を発現するように改変された、ＵＤＰ-ＧｌｃＮＡｃトランスポータ活性を欠く哺乳動物株化細胞を培養するか、又はこのようなα-１,２-マンノシダーゼと発現産物を接触させることを含み、Ｍａｎ７，８，９グリカンがＭａｎ５グリカンに転換され、該断片が少なくとも一のグリコシル化部位を有している、糖鎖構造中に主としてＭａｎ５グリカンを有する抗体、イムノアドへシン、又はその断片を組換え産生させる方法に関する。特定の実施態様では、マンノシダーゼは、組換え産生に使用される細胞に内在性である。]
[0019] 全ての態様において、哺乳動物株化細胞は、例えばチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞でありうる。
全ての態様において、本発明の株化細胞及び方法は、限定されるものではないが、診断又は治療的関心のある抗体、例えば次の抗原：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＥＧＦレセプター(ＥＧＦＲ、ＨＥＲ１、ＥｒｂＢ１)、ＨＥＲ２(ＥｒｂＢ２)、ＨＥＲ３(ＥｒｂＢ３)、ＨＥＲ４(ＥｒｂＢ４)、ＬＦＡ-１、Ｍａｃ１、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ-４、ＩＣＡＭ-１、ＶＣＡＭ、αｖ／β３インテグリン、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ１１ｂ、ＶＥＧＦ；ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３レセプター；肥満(ＯＢ)レセプター；ｍｐｌレセプター；ＣＴＬＡ-４；プロテインＣ、ＤＲ５、ＥＧＦＬ７、ニューロピリン及びレセプター、ネトリン及びレセプター、ｓｌｉｔ及びレセプター、ｓｅｍａ及びレセプター、セマフォリン及びレセプター、ｒｏｂｏ及びレセプター、及びＭ１の一又は複数に結合する抗体を含む、任意の抗体の生産に使用可能である。]
[0020] 抗体及び抗体断片は、キメラ又はヒト化であってよく、特にキメラ及びヒト化抗ＣＤ２０抗体を含み、特定の実施態様では、抗体はリツキシマブ又はオクレリズマブである。]
[0021] 他の実施態様では、ヒト化抗体は抗ＨＥＲ２、抗ＨＥＲ１、抗ＶＥＧＦ又は抗ＩｇＥ抗体であり、限定されるものではないが、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ベバシズマブ、ラニビズマブ、及びオマリズマブ、並びにこのような抗体の断片、変異体及び誘導体が含まれる。
抗体断片には、例えば相補性決定領域(ＣＤＲ)断片、線状抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ(minibodies)、ダイアボディ、抗体断片から形成される多重特異性抗体、及びポリペプチドに特異的抗原結合性を付与するのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部を含んでいるポリペプチドが含まれ、但し、それらはグリコシル化されている。]
図面の簡単な説明

[0022] Ｎ-グリカン生合成経路の一部を表す。
ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ(ＧｎＴ-Ｉ)タンパク質(Stratagene)にＮ末端ＦＬＡＧ(登録商標)タグを付加するのに使用されるプラスミドベクターを表す。
低分子干渉ＲＮＡ(Ambion, Austin. TX)を発現させるために使用されるプラスミドベクターを表す。
ＳｉＲＮＡプローブ配列(配列番号：２−６)及び完全長ＧｎＴ-Ｉ遺伝子におけるそれらの相対的位置(括弧内)を表す。各ｓｉＲＮＡプローブ配列には下線(ａ)を付している。ＢａｍＨＩ部位近傍の下線が付された配列は、ＧｎＴ-ＩｍＲＮＡ配列と相補的である。２つの下線が付された配列は互いに相補的であり、ヘアピンループｓｉＲＮＡの形成に至る。
個々のｓｉＲＮＡプローブとＦＬＡＧ(登録商標)-タグ化Ｇｎ-Ｉコンストラクトの同時形質移入からの溶菌液のウエスタンブロット分析を表す。エンプティベクターに加えて、５種の個々のｓｉＲＮＡ発現コンストラクトを、ＦＬＡＧ(登録商標)タグ化Ｇｎ-Ｉコンストラクトと、一過性に同時形質移入させた。同量の細胞タンパク質を含有する細胞溶菌液を、抗ＦＬＡＧ(登録商標)抗体(Sigma MO)を用いたウエスタンブロットにより分析した。
オクレリズマブ生成株化細胞を、ｓｉＲＮＡ発現プラスミドと一過性に同時形質移入させた。各サンプル条件からの細胞ペレットを、形質移入の１、２及び５日後に収集し、ついで、ｍＲＮＡをＴａｑＭａｎ分析用に単離した。コントロールのＧｎＴ-ＩｍＲＮＡ発現レベルを１００％に設定した。
示したＲＮＡｉベクターを用いて形質移入した各試料からの、形質移入５日後のＭａｎ５レベルを表す。
１４日間の実験中での、オクレリズマブ産生株化細胞中へのスクランブル及びＲＮＡｉ１３ベクターの一過性形質移入を表す。標示された培養期間で収集されたＨＣＣＦのＭａｎ５のレベルはＣＥ-グリカンを用いて決定した。エラーバーは２回の実施からの標準偏差を表す。
ＣＨＯ α-マンノシダーゼＩのｃＤＮＡ配列を表す。
ＣＨＯとマウスα-マンノシダーゼとの間のアミノ酸配列アラインメントを表す。
ＳＶ４０ＧＳ.ＣＭＶ.Ｍａｎ１.ＲＮＡｉ１３発現プラスミドの立体配置を表す。
ＴＡＱＭＡＮ(登録商標)アッセイにより決定された安定クローンにおける相対的なＧｎＴ-Ｉ ｍＲＮＡレベルを表す。コントロールは未形質移入ベースラインにおけるＧｎＴ-Ｉレベルを表す。
１４日間の生産実験の終わりでの安定クローンのＭａｎ５レベルを表す。Ｍａｎ５％はＣＥ-グリカン分析により決定される。
図１０Ａは、様々な培養期間の日数でのＭａｎ５レベルを表す。Ｍａｎ５レベルはＣＥ-グリカンアッセイにより決定し、エラーバーは標準偏差を表す。図１０Ｂは、２２日の培養後のＭａｎ５レベルの比較を表す。基本培地における４通りの異なる浸透圧を試験した(３００、３３０、３６０、４００ｍＯｓｍ)。Ｍａｎ５レベルをＣＥ-グリカンアッセイにより測定した。
図１０Ｃは、全１４日間の培養の様々な日にち目にＭｎＣｌ２を付加したＭａｎ５レベルを表す。図１０Ｄは、異なる細胞培養条件でのＧｎＴ-Ｉノックダウンクローン６ＤのＭａｎ５レベル(ＣＥ-グリカンアッセイ)を表す。コントロールは、標準的な生産培養培地を表す。高浸透圧とは、基本培地において浸透圧が４００ｍＯｓｍまで増加したことを表す。Ｍｎなしはマンガンを欠く標準的な生産培地を表す。
ＦｃガンマレセプターＩＩＩａ-Ｖ１５８に結合する抗体を表す。白丸はハーセプチン(登録商標)(トラスツズマブ)を表し、白四角はリツキサン(登録商標)(リツキシマブ)を表し、白三角は５％のＭａｎ５(７−９％の非フコシルグリカン)を有する抗レセプター抗体を表し、白菱形は１６％のＭａｎ５(１４．６％の非フコシルグリカン)を有する抗レセプター抗体を表し、黒丸は６２％のＭａｎ５(１１％の非フコシルグリカン)を有する抗レセプター抗体を表す。
ＦｃガンマレセプターＩＩＩａ-Ｆ１５８に結合する抗体を表す。白丸はハーセプチン(登録商標)(トラスツズマブ)を表し、白四角はリツキサン(登録商標)(リツキシマブ)を表し、白三角は５％のＭａｎ５(７-９％の非フコシルグリカン)を有する抗レセプター抗体を表し、白菱形は１６％のＭａｎ５(１４．６％の非フコシルグリカン)を有する抗レセプター抗体を表し、黒丸は６２％のＭａｎ５(１１％の非フコシルグリカン)を有する抗レセプター抗体を表す。]
[0023] Ｉ．定義
「抗体依存性細胞媒介性傷害活性」及び「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃレセプター(ＦｃＲ)を発現する非特異的細胞傷害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、好中球、及びマクロファージ)が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞を溶解する細胞媒介性反応を意味する。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血性細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch及びKinet, Annu.Rev.Immunol., 9:457-92(1991)の４６４頁の表３に要約されている。対象分子のＡＤＣＣ活性を評価するためには、米国特許第５５００３６２号又は同第５８２１３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイが実施されうる。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー細胞(ＮＫ)細胞を含む。別法として又は付加的に、対象分子のＡＤＣＣ活性を、例えばClynes等 .PNAS(USA), 95:652-656(1998)に開示されたもののような動物モデルでインビボにて評価することができる。]
[0024] 「ヒトエフェクター細胞」とは、一又は複数のＦｃＲｓを発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。好ましくは、その細胞は少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例として、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞及び好中球が含まれるが、ＰＢＭＣとＮＫ細胞が好適である。エフェクター細胞はその天然源、例えばここに記載するようなＰＢＭＣ又は血液から単離されうる。]
[0025] 「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」なる用語は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記述するために使用される。好適なＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。さらに好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体(γレセプター)に結合し、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含むものであり、これらのレセプターの対立遺伝子変異体及び選択的スプライシング型を含む。ＦｃγＲＩＩレセプターは、ＦｃγＲＩＩＡ(「活性化レセプター」)及びＦｃγＲＩＩＢ(「阻害レセプター」)を含み、それらは、主としてその細胞質ドメインにおいて異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化レセプターＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシンベース活性化モチーフ(ＩＴＡＭ)を有する。阻害レセプターＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシンベース阻害モチーフ(ＩＴＩＭ)を有する(Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234(1997)参照)。ＦｃＲはRavetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)；Capelら, Immunomethods4:25-34 (1994)；及びde Haasら, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41(1995)において概説されている。将来同定されるものも含む他のＦｃＲが、ここにおける「ＦｃＲ」なる用語によって包含される。本用語は、胎児への母性ＩｇＧの移動の原因であり、よりゆっくりとした異化作用を媒介し、よって半減期が長くなった新生児レセプターのＦｃＲｎもまた含む(Guyerら, J. Immumol. 117:587(1976)及びKimら, J. Immunol. 24:249 (1994))。]
[0026] 「補体依存性細胞傷害活性」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解する分子の能力を意味する。補体活性化経路は補体系(Ｃｌｑ)の第１成分が、同族抗原と結合した分子(例えば、抗体)に結合することにより開始される。補体活性化を評価するためには、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods202:163(1996)に記載されているようにして実施することができる。]
[0027] 「天然抗体」は、通常は、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド架橋を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(ＶＬ)を、他端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。]
[0028] 「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。それは、軽鎖及び重鎖可変ドメインの両方の高頻度可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を連結し、ある場合にはその一部を形成するループを形成する３つの高頻度可変領域により連結されたβシート配置を主に採る４つのＦＲをそれぞれ含んでいる。各鎖の高頻度可変領域は、ＦＲによって近接して保持され、他の鎖の高頻度可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabatら, Sequence of Proteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接には関連していないが、様々なエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞傷害活性(ＡＤＣＣ)における抗体の関与を示す。]
[0029] ここで使用されるところの「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合に寄与する抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基(例えば、軽鎖可変ドメインの残基２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７(Ｌ３)、及び重鎖可変ドメインの３１−３５(Ｈ１)、５０−６５(Ｈ２)及び９５−１０２(Ｈ３)；Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991))及び／又は「高頻度可変ループ」からの残基(例えば、軽鎖可変ドメインの残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)及び９１−９６(Ｌ３)及び重鎖可変ドメインの残基２６−３２(Ｈ１)、５３−５５(Ｈ２)及び９６−１０１(Ｈ３)；Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 196:901-917(1987))を含む。「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」残基はここで定義するように高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。]
[0030] 「フレームワーク領域」なる用語は、より多岐にわたるＣＤＲ領域間に存在する抗体可変領域の従来から認識されている部分を意味する。このようなフレームワーク領域は、典型的にはフレームワーク１から４まで(ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＲ４)を意味し、３次元空間において、重鎖又は軽鎖抗体可変領域に見出される３つのＣＤＲを、該ＣＤＲが抗原結合表面を形成可能なように、保持するための足場を提供する。]
[0031] その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体を異なるクラスに割り当てることができる。抗体には５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス(アイソタイプ)、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２にさらに分けられうる。
免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。]
[0032] 任意の脊椎動物種からの抗体の「軽鎖」には、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つを割り当てることができる。]
[0033] 「モノクローナル抗体」なる用語は、単一のクローンにより合成される抗体分子を指すために使用される。「モノクローナル」との修飾語句は、実質的に均一な抗体の集団から得たものとしての抗体の性質を表すものであり、抗体が何か特定の方法により生産されることを必要とすると解釈されるものではない。しかして、モノクローナル抗体は、最初はKohler及びMilstein, Nature, 256:495(1975)；Eur. J. Immunol. 6：511(1976)に記載されたハイブリドーマ法、あるいは組換えＤＮＡ法によって作製することができ、あるいは、ファージ又は他の抗体ライブラリーから単離されうる。
「ポリクローナル抗体」なる用語は、Ｂ細胞の集団により合成される抗体分子の集団を意味するために使用される。]
[0034] 「抗体断片」は、完全長抗体の一部、一般には、その抗原結合ドメイン又は可変ドメインを含む。抗体断片の例には、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ')２、ｓｃＦｖ、(ｓｃＦｖ)２、ｄＡｂ、及び相補性決定領域(ＣＤＲ)断片、線状抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ、抗体断片から形成された多重特異性抗体、一般的にはポリペプチドに特異的抗原結合性を付与するのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部を含んでいるポリペプチドが含まれる。特に本発明の範疇に入るのは、二重特異性抗体断片である。]
[0035] 抗体は、Ｆｃ領域がグリコシル化された糖タンパク質である。しかして、例えば、ＩｇＧ免疫グロブリンのＦｃ領域は、鎖間ジスルフィド結合ヒンジ領域、アスパラギン２９７(Ａｓｎ-２９７)でＮ結合オリゴ糖を有するグリコシル化ＣＨ２ドメイン、及び非共有的に対合したＣＨ３ドメインを含むホモ二量体である。グリコシル化はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、及びＣ１ｑを媒介するエフェクターメカニズムにおいて重要な役割を担っている。しかして、本発明の抗体断片は、グリコシル化Ｆｃ領域及び抗原結合領域を含んでいなければならない。]
[0036] 「二重特異性抗体」及び「二重特異性抗体断片」なる用語は、少なくとも２つの標的に対して特異的に結合する抗体又は抗体断片を意味するためにここで使用される。所望されるならば、多重特異性は、それらの標的の各々に対して１を越える結合部位を有する多価二重特異性抗体を生産するために、多価性により組み合わせることができる。例えば、ヘリックス-ターン-ヘリックスモチーフを介して２つのｓｃＦｖ融合体を二量体化することにより、(ｓｃＦｖ)１-ヒンジ-ヘリックス-ターン-ヘリックス-(ｓｃＦｖ)２、三価二重特異性ミニ抗体が生産された(Mullerら, FEBSLett. 432(1-2):45-9 (1998))。いわゆる「ジ-ビ-ミニ抗体」は、その標的抗原のそれぞれに対して２つの結合部位を有する。]
[0037] 抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ(ａｂ')２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。]
[0038] 「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。各可変ドメインの３つの高頻度可変領域が相互に作用してＶＨ-ＶＬ二量体表面に抗原結合部位を定めるのはこの配置においてである。集合的に、６つの高頻度可変領域が抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な３つの高頻度可変領域のみを含むＦｖの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。]
[0039] Ｆａｂ断片はまた軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(ＣＨ１)を有する。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加されている点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも一つの遊離チオール基を有しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生産された。抗体断片の他の化学結合もまた知られている。]
[0040] 任意の脊椎動物種からの抗体の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つを割り当てることができる。]
[0041] 「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖中に存在する。好ましくは、ＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それによりｓｃＦｖが抗原結合に対して望ましい構造を形成するのが可能になる。ｓｃＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。ＨＥＲ２抗体ｓｃＦｖ断片は、国際公開第９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号に記載されている。]
[0042] 「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を意味し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ-ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合してなる。非常に短いために同一鎖上で二つのドメインの対形成が不可能なリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディは、例えば、欧州特許出願公開第４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；及びHollingerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448(1993)にさらに詳細に記載されている。]
[0043] 非ヒト(例えば齧歯動物)抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)からの高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは実質的に全てのＦＲが、ヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも一又は典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。また、ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含むであろう。さらなる詳細については、Jones等, Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等, Nature 332:323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)を参照のこと。]
[0044] 「ネイキッド抗体」とは、細胞傷害性部分又は放射標識等の異種分子にコンジュゲートしていない(ここで定義した)抗体である。]
[0045] 「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分は、抗体の診断又は治療への使用を妨害しうる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様では、抗体は、非還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、ＣＥ-ＳＤＳ、又はバイオアナライザーにより測定して、抗体が９５重量％より多くなるまで精製される。抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一の精製工程により調製されるであろう。]
[0046] ここで使用される場合、「イムノアドヘシン」なる用語は、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能と異種タンパク質(「アドヘシン」、例えばレセプター、リガンドあるいは酵素)の「結合ドメイン」を組合わせた抗体様分子を意味する。構造的には、イムノアドヘシンは、抗体の抗原認識及び結合部位(抗原結合部位)以外の所望の結合特異性を備えた(つまり、「異種性」である)アドヘシンアミノ酸配列と免疫グロブリン定常ドメイン配列の融合体を含んでなる。イムノアドヘシン中の免疫グロブリン定常ドメイン配列は、任意の免疫グロブリン、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭから得ることができる。イムノアドヘシン、リガンド結合ドメイン、及びレセプター結合ドメインのさらなる詳細については、その開示を出典明示により明示的にここに援用する米国特許第５１１６９６４号；同第５７１４１４７号；及び同第６４０６６０４号を参照。]
[0047] ＩＩ．詳細な記載
本発明は、抗体又は抗体様分子を産生する組換え哺乳動物宿主細胞のグリコシル化機構をマニピュレートすることにより、哺乳動物宿主細胞において、主としてＭａｎ５グリカンを有するが、Ｍａｎ７、Ｍａｎ８、及びＭａｎ９の量が低減している抗体及び抗体様分子、例えばＦｃ融合タンパク質(イムノアドヘシン)を調製する方法を提供する。]
[0048] 抗体の組換え産生のための一般的方法
ここでの抗体及び他の組換えタンパク質は、組換えＤＮＡ技術のよく知られている技術により生産することができる。よって、ここで特に同定した抗体の他に、当業者は、例えば以下に記載の技術を使用し、関心のある抗原に対して抗体を生産することができる。]
[0049] 本発明で生産される抗体は、関心ある抗原に対するものである。好ましくは、抗原は、生物学的に重要なポリペプチドであり、疾病や疾患を患っている哺乳動物への抗体の投与によりその哺乳動物に治療的恩恵がもたらされうる。しかしながら、非ポリペプチド抗原(例えば腫瘍関連糖脂質抗原；米国特許第５０９１１７８号参照)に対する抗体もまた考慮される。抗原がポリペプチドである場合、それは膜貫通型分子(例えばレセプター)又はリガンド、例えば増殖因子でありうる。本発明に包含される抗体に対する例示的な分子標的は、ＣＤタンパク質、例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４０；ＥｒｂＢレセプターファミリーのメンバー、例えばＥＧＦレセプター(ＥＧＦＲ、ＨＥＲ１、ＥｒｂＢ１)、ＨＥＲ２(ＥｒｂＢ２)、ＨＥＲ３(ＥｒｂＢ３)又はＨＥＲ４(ＥｒｂＢ４)レセプター；細胞接着分子、例えばＬＦＡ-１、Ｍａｃ１、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ-４、ＩＣＡＭ-１、ＶＣＡＭ及びαｖ／β３インテグリンで、そのα又はβ何れかのサブユニットを含むもの(例えば、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８あるいは抗ＣＤ１１ｂ抗体)；ＶＥＧＦのような成長因子；ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３レセプター；肥満(ＯＢ)レセプター；ｍｐｌレセプター；ＣＴＬＡ-４；プロテインＣ、ニューロピリン類及びレセプター、ＥＧＦ-Ｃ、エフリン及びレセプター、ネトリン及びレセプター、ｓｌｉｔ及びレセプター、抗Ｍ１、又はここに記載の任意の他の抗原を含む。上に列挙した抗体が結合する抗原が特にここでの範囲に含まれる。]
[0050] 抗体の組換え産生では、それをコードする核酸を単離し、さらなるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能ベクター中に挿入しうる。他の実施態様では、抗体は、例えば出典明示により特にここに援用される米国特許第５２０４２４４号に記載されているように、相同組換えにより生産することができる。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは容易に単離され、常套的な手順を使用して(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより)配列決定される。多くのベクターが利用可能である。該ベクター成分は、一般に、限定されるものではないが、次のもの：シグナル配列、複製起点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列、例えば、特に出典明示によりここに援用される１９９６年７月９日発行の米国特許第５５３４６１５号に記載されているものの一又は複数を含む。]
[0051] 本発明の抗体は、グリコシル化されていなければならず、よって抗体鎖又は他の抗体様分子をコードするＤＮＡをクローニング又は発現するのに適した宿主細胞には、哺乳動物宿主細胞が含まれる。哺乳動物宿主細胞には大きな興味があり、培養(組織培養)での脊椎動物細胞の増殖は、常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例には、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (COS-7,ATCCCRL 1651);ヒト胚腎臓株(２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977))；ベビーハムスター腎臓細胞(BHK, ATCC CCL 10)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaubら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980))；マウスのセルトリ細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980))；サル腎臓細胞(CV1 ATCC CCL70)；アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO-76, ATCC CRL-1587)；ヒト子宮頸癌細胞(HELA, ATCC CCL 2)；イヌ腎臓細胞(MDCK, ATCC CCL 34)；バッファロラット肝臓細胞(BRL3A, ATCC CRL 1442)；ヒト肺細胞(W138, ATCC CCL 75);ヒト肝細胞(Hep G2, HB 8065); マウス乳房腫瘍(MMT060562, ATTCCCL51)；ＴＲＩ細胞(Matherら, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68(1982))；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝細胞腫(Hep G2)が含まれる。]
[0052] 宿主細胞は、抗体生産のための発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適するように改変された一般的な栄養培地で培養される。]
[0053] 哺乳動物宿主細胞は、様々な培地で培養されてよい。商業的に入手可能な培地、例えばハム(Ｈａｍ)のＦ１０(Sigma)、最小必須培地((ＭＥＭ)、(Sigma)、ＲＰＭＩ-１６４０(Sigma)及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ)、Sigma)が、宿主細胞の培養に適している。さらに、 Hamら, Meth. Enz. 58:44(1979)、Barnesら, Anal. Biochem.102:255(1980)、米国特許第４７６７７０４号；同第４６５７８６６号；同第４９２７７６２号；同第４５６０６５５号；又は同第５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国特許第再発行第３０９８５号に記載されている任意の培地も、宿主細胞用の培養培地として使用することができる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の増殖因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮増殖因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えばゲンタマイシンＴＭ)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充してもよい。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。]
[0054] 細胞から調製された抗体組成物は、例えばヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製することができ、アフィニティクロマトグラフィーは一次精製工程である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、ヒトγ２、又はヒトγ４の重鎖(Lindmarkら, J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983))をベースにした抗体を精製するのに使用可能である。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３について推奨される(Gussら,EMBO J. 5:15671575 (1986))。親和性リガンドが結合する基質は最も多くはアガロースであるが、他の基質も利用可能である。機械的に安定した基質、例えば調整された多孔質ガラス又はポリ(スチレンジビニル)ベンゼンにより、アガロースで達成されるよりも、流速がより速くなり、処理時間が短縮される。抗体がＣＨ３ドメインを含有している場合、ＢＡＫＥＲＢＯＮＤ ＡＢＸＴＭ樹脂(J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)が精製に有用である。タンパク質を精製するための他の技術、例えばイオン交換カラムにおける分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンセファロース(SEPHAROSE)ＴＭでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及び硫酸アンモニウム沈殿もまた、回収される抗体に応じて利用可能である。]
[0055] 任意の予備的精製工程に続き、関心ある抗体と汚染物質とを含む混合物に、所望レベルの純度を得るために、さらなる精製工程を施してもよい。]
[0056] ヒト化抗体は非ヒトである供給源からその中に導入される一又は複数のアミノ酸残基を有している。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は本質的に齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の対応配列を置換することによりWinter及び共同研究者（Jonesら, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmannら, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyenら, Science, 239:1534-1536 (1988)）の方法に従って本質的に実施できる。従って、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４８１６５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。]
[0057] ヒト化抗体を作るのに使用されるヒト可変ドメインの選択は、軽鎖でも重鎖でも、抗原性を低減させるために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット（best-fit）」法によれば、齧歯類抗体の可変ドメインの配列は、既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーからスクリーニングされる。齧歯類の配列に最も近いヒト配列は、ヒト化抗体のためのヒトＦＲとして受容される(Simsら，J. Immunol., 151:2296 (1993))。別の方法は、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来した特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを、幾つかの異なるヒト化抗体のために使用してもよい（Carterら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Prestaら, J. Immunol, 151:2623 (1993)）。]
[0058] 抗体は抗原への高親和性及び他の好ましい生物学的性質を保持したままヒト化されることがさらに重要である。この目標を達成するために、好ましい方法では、ヒト化抗体は、親及びヒト化配列の三次元モデルを用いて、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析プロセスによって調製される。三次元の免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能で、当業者にはなじみが深い。選択された候補免疫グロブリン配列の有望な三次元立体構造を例証し表示するコンピュータプログラムを利用することができる。これらの表示の検査により、候補免疫グロブリン配列の機能中で残基の可能な役割の分析、つまり、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、標的抗原に対する親和性の増大のような、所望の抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選び、組み合わせることができる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に影響を及ぼすことに直接的かつ最も実質的に関与している。]
[0059] 別法として、内在性の免疫グロブリン産生がなくともヒト抗体の全レパートリーを免疫化することで産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが今は可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子の同型接合除去が内在性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。Jakobovitsら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)；Jakobovitsら, Nature 362:255-258 (1993); Bruggermanら, Year in Immuno., 7:33 (1993)；Duchosalら, Nature 355:258(1992)を参照のこと。ヒト抗体は、ファージディスプレーライブラリーから得ることもできる(Hoogenboomら, J. Mol. Biol., 227:381(1991)；Marksら, J. Mol. Biol. 222:581-597(1991)；Vaughanら, Nature Biotech 14:309(1996))。]
[0060] 多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる抗原に対して結合特異性を有する。そのような分子は通常二つの抗原に結合するだけであるが（つまり二重特異性抗体、ＢｓＡｂｓ）、ここで使用される場合、三重特異性抗体のようなさらなる特異性を備えた抗体もこの表現に包含される。
二重特異性抗体を作製する方法は当該分野において既知である。完全長二重特異性抗体の伝統的な産生は、二つの鎖が異なる特異性を持っている二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づく(Millsteinら, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開第９３／０８８２９号及びTrauneckerら、EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。]
[0061] 国際公開第９６／２７０１１号に記載された他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を改変して、組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第一抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの代償的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第二抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような他の望まれない最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。]
[0062] 二重特異性抗体は、架橋した又は「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の一方はアビジンに結合し、他方はビオチンに結合できる。そのような抗体は、例えば、望まれない細胞に対して免疫系細胞をターゲティングするため(米国特許第４６７６９８０号)、及びＨＩＶ感染の治療のため(国際公開第９１／００３６０号、同９２／２００３７３号、及び欧州特許第０３０８９号)に提案された。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋法を用いて作製することができる。好適な架橋剤は、多くの架橋技術と共に当該分野において良く知られており、米国特許第４６７６９８０号に開示されている。
２価以上の抗体も考慮される。例えば、三重特異性抗体も調製可能である。Tuttら, J. Immunol. 147：60(1991)。]
[0063] イムノアドヘシン
最も簡単で最も直接的なイムノアドヘシンの設計は、アドヘシンの結合ドメイン(例えば、レセプターの細胞外ドメイン(ＥＣＤ))を免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域及びヒンジと組み合わせるものである。通常は、本発明のイムノアドヘシンを調製する場合、アドヘシンの結合ドメインをコードする核酸を、免疫グロブリン定常ドメイン配列のＮ末端をコードする核酸にＣ末端的に融合されるが、Ｎ末端融合もまた可能である。]
[0064] 典型的には、そのような融合において、コード化されるキメラポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖の定常ドメインの少なくとも機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを保持するであろう。融合はまた定常ドメインのＦｃ部分のＣ末端、又は重鎖のＣＨ１又は軽鎖の対応する領域にＮ末端に直ぐになされる。融合がなされる正確な部位は重要なものではない；特定の部位がよく知られており、イムノアドヘシンの生物活性、分泌、又は結合特性を最適化するために選択されうる。]
[0065] 好適な実施態様では、アドヘシン配列が免疫グロブリンＧ１(ＩｇＧ１)のＦｃドメインのＮ末端に融合される。アドヘシン配列に重鎖定常領域全体を融合させることができる。しかし、より好ましくは、ＩｇＧのＦｃを化学的に定めるパパイン切断部位の直ぐ上流のヒンジ領域に始まる配列(すなわち、重鎖定常領域の最初の残基を１１４として残基２１６)、又は他の免疫グロブリンの類似部位が融合において使用される。特に好適な実施態様では、アドヘシンアミノ酸配列はＩｇＧ重鎖の(ａ)ヒンジ領域及びＣＨ２及びＣＨ３又は(ｂ)ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインに融合される。]
[0066] 二重特異的イムノアドヘシンについては、イムノアドヘシンは多量体として、特にヘテロ二量体又はヘテロ四量体として組み立てられる。一般には、これらの組み立てられた免疫グロブリンは既知の単位構造を有している。基本的な四鎖構造単位はＩｇＧ、ＩｇＤ及びＩｇＥが存在する型である。四鎖単位はより高分子量の免疫グロブリンにおいて繰り返される；ＩｇＭは一般にジスルフィド結合によって一緒に保持される四つの基本単位の五量体として存在する。ＩｇＡグロブリン、そして時折ＩｇＧグロブリンが血清中に多量体型で存在しうる。多量体の場合、四つの単位の各々は同じでも異なっていてもよい。]
[0067] 抗体及び抗体断片として、本発明のイムノアドへシン構造は、Ｆｃ領域を有していなければならない。ここでの範囲内の様々な例示的組み立てられたイムノアドヘシンを以下に概略的に模式化する：
ＡＣＨ-(ＡＣＨ、ＡＣＬ-ＡＣＨ、ＡＣＬ-ＶＨＣＨ、又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)；
ＡＣＬ-ＡＣＨ-(ＡＣＬ-ＡＣＨ、ＡＣＬ-ＶＨＣＨ、ＶＬＣＬ-ＡＣＨ、又はＶＬＣＬ-ＶＨＣＨ)；
ＡＣＬ-ＶＨＣＨ-(ＡＣＨ、又はＡＣＬ-ＶＨＣＨ、又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)；
ＶＬＣＬ-ＡＣＨ-(ＡＣＬ-ＶＨＣＨ、又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)；及び
(Ａ-Ｙ)ｎ-(ＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ)２、
ここで、各Ａは、同一又は異なるアドヘシンアミノ酸配列を表し；
ＶＬは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨは免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨは免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
ｎは１より大きい整数であり；
Ｙは共有結合架橋剤の残基を示す。
簡潔にするため、上記構造はキーとなる特徴を示しているのみである；これらは、免疫グロブリンの結合する(Ｊ)又は他のドメインを示していないし、ジスルフィド結合も示していない。しかし、そのようなドメインが結合活性に対して必要である場合は、それらを構築して、免疫グロブリン分子にそれらが占める通常の位置に存在させることができる。]
[0068] あるいは、アドヘシン配列は、キメラ重鎖を含む免疫グロブリンが得られるように、免疫グロブリン重鎖と軽鎖配列の間に挿入することができる。この実施態様では、アドヘシン配列は免疫グロブリンの各アームの免疫グロブリンの重鎖の３'末端に、ヒンジとＣＨ２ドメインの間、又はＣＨ２とＣＨ３ドメインの間で融合される。同様なコンストラクトがHoogenboom等, Mol. Immunol. 28:1027-1037(1991)によって報告されている。]
[0069] 免疫グロブリン軽鎖の存在は本発明のイムノアドヘシンにおいて必要ではないけれども、免疫グロブリン軽鎖はアドヘシン-免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有的に結合されて存在するか、アドヘシンに直接的に融合されるかもしれない。前者の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは典型的にはアドヘシン-免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするＤＮＡと同時発現される。分泌時にハイブリッド重鎖及び軽鎖が共有的に結合されて、二つのジスルフィド結合された免疫グロブリン重鎖-軽鎖対を含んでなる免疫グロブリン様構造をもたらす。そのような構造の調製に好適な方法は、例えば１９８９年３月２８日に発行された米国特許第４８１６５６７号に開示されている。]
[0070] イムノアドヘシンは最も簡便には免疫グロブリンｃＤＮＡ配列にインフレームでアドヘシン部分をコードするｃＤＮＡ配列を融合させることにより構築される。しかし、ゲノム免疫グロブリン断片への融合もまた使用することができる(例えば、Aruffo等, Cell 61:1303-1313(1990)；及びStamenkovic等, Cell 66:1133-1144(1991)を参照のこと)。融合の後者のタイプは、発現に対してＩｇ調節配列の存在を必要とする。ＩｇＧ重鎖定常領域をコードするｃＤＮＡは、脾臓又は抹消血リンパ球から得られたｃＤＮＡライブラリーからの公開配列に基づいて、ハイブリダイゼーションにより、又はポリメラーゼ鎖反応(ＰＣＲ)法により単離することができる。「アドヘシン」をコードするｃＤＮＡとイムノアドヘシンの免疫グロブリン部が、選ばれた宿主細胞において効率的な発現を指示するプラスミドベクター内にタンデム挿入される。]
[0071] 増強ＡＤＣＣ機能を有する抗体
真核生物、例えば哺乳動物宿主細胞中でのタンパク質の発現後、タンパク質は、多くの場合、一般に「グリコシル化」と称される糖残基の酵素的付加を含む、翻訳後修飾を受ける。
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への糖鎖部分の結合を意味する。アスパラギン(Ａｓｎ)-Ｘ-セリン(Ｓｅｒ)及びアスパラギン(Ａｓｎ)-Ｘ-スレオニン(Ｔｈｒ)(ここでＸはプロリンを除く任意のアミノ酸)とのトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的結合のための認識配列である。Ｏ結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに、糖類Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、フコース、Ｎ-アセチルグルコサミン、又はキシロースの一つが結合することを意味するが、５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまたＯ結合グリコシル化に関与している。]
[0072] 哺乳動物により生成されるタンパク質のグリコシル化パターンは、The Plasma Proteins: Structure, Function and Genetic Control, Putnam, F. W編, 第2版, Vol. 4, Academic Press, New York, 1984, 特にpp. 271-315に記載されている。この章においては、複合体、高マンノース、及びハイブリッド構造と称される少なくとも３つの群への細分化を含み、アスパラギン結合オリゴ糖、並びにグリコシド結合オリゴ糖が検討されている。]
[0073] Ｎ結合グリカン類の場合、オリゴ糖の還元末端Ｎ-アセチルグルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)残基のアノマー炭素(Ｃ-１)と、ポリペプチドのアスパラギン(Ａｓｎ)の窒素とを結合させるアミド結合が存在する。動物細胞では、Ｏ結合グリカン類は、Ｎ-アセチルガラクトサミン(ＧａｌＮＡｃ)、ガラクトース(Ｇａｌ)、フコース、Ｎ-アセチルグルコサミン、又はキシロースと、いくつかのヒドロキシアミノ酸の一つ、最も一般的にはセリン(Ｓｅｒ)又はスレオニン(Ｔｈｒ)、いくつかの場合には、ヒドロキシプロリン又はヒドロキシリジンとの間のグリコシド結合を介して結合している。]
[0074] Ｏ結合オリゴ糖の生合成経路は、一連の特定のグリコシルトランスフェラーゼによる、ヌクレオチド糖からの単一の糖残基の段階的移動からなる。単糖類ドナーとして機能するヌクレオチド糖は、ウリジン-ジホスホ-ＧａｌＮＡｃ(ＵＤＰ-ＧａｌＮＡｃ)、ＵＤＰ-ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ-Ｇａｌ、グアニジン-ジホスホ-フコース(ＧＤＰ-Ｆｕｃ)、及びシチジン-モノホスホ-シアル酸(ＣＭＰ-ＳＡ)である。]
[0075] Ｎ結合オリゴ糖合成において、Ｎ結合オリゴ糖のアセンブリの開始は、タンパク質のＡｓｎ残基について直接生じないが、ｍＲＮＡからの翻訳中又は極めて直後に、ついでタンパク質に移動する、脂質結合前駆体オリゴ糖のプレアセンブリに関与している。この前駆体オリゴ糖(Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２)は、多くの膜結合グリコシルトランスフェラーゼを用いて、ポリイソプレノイド担体脂質、ドリコールへのピロリン酸架橋を介して結合しつつ、合成される。脂質結合前駆体のアセンブリが完了した後、別の膜結合酵素が、配列-Ａｓｎ-Ｘ-Ｓｅｒ／Ｔｈｒ-の一部として生じる、立体的に接近可能なＡｓｎ残基に、それを移動させる。]
[0076] 新たに合成された糖タンパク質のグリコシル化されたＡｓｎ残基は、唯一の種類のオリゴ糖Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２のみを一過性に有する。このオリゴ糖構造のプロセシングは、成熟した糖タンパク質に見出される非常に多様な構造を生じせしめる。
Ｎ結合オリゴ糖のプロセシングは、多くの膜結合酵素の連続的作用により達成され、３つのグルコース残基の除去、可変数のマンノース残基の除去、及び得られたトリミングされたコアへの様々な糖残基の付加を含む。]
[0077] Ｎ-グリカン生合成経路の一部を図１に示す。
Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２部分のマンノース残基の４つは、α-マンノシダーゼＩにより除去することができ、Ｎ結合Ｍａｎ５−９ＧｌｃＮＡｃ２が生じるが、その全てが脊椎動物糖タンパク質によく見出される。図１に示されるように、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は、ＵＤＰ-ＧｌｃＮＡｃからのβ１→２-結合ＧｌｃＮＡｃ残基を、α１→３-結合マンノーズ残基に移動させて、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を形成させ、α-マンノシダーゼＩＩによりさらにトリミングし、２つのマンノーズ残基を除去して、組成ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を有するタンパク質結合オリゴ糖を生じせしめる、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ(ＧｌｃＮＡｃＴ-Ｉ)用の基質となりうる。この構造はＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ用の基質である(図示せず)。] 図１
[0078] この段階には、様々な細胞型の間で異なる一連の膜結合グリコシルトランスフェラーゼによる、オリゴ糖鎖への単糖類の逐次付加を含む、複雑な一連のプロセシング工程が続く。その結果、様々な分岐状、例えば二分岐(２つの分岐状)、三分岐(３つの分岐状)又は四分岐(４つの分岐状)構造を含む多様なファミリーの「複合」オリゴ糖が生成される。]
[0079] 多くの抗体グリコフォームは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害活性(ＡＤＣＣ)を含む抗体エフェクター機能に対してポジティブな影響を有していることが報告されている。これは、腫瘍学分野で特に有益であり、そこでは、治療用のモノクローナル抗体が腫瘍細胞上の特異的抗原に結合し、腫瘍細胞の破壊をもたらす免疫反応を誘導する。Ｆｃレセプターを有するキラー細胞とのＩｇＧの相互作用の増強により、これらの治療用抗体は、より強力にされうる。]
[0080] 本発明は、以前に記載されていたものに対してＭａｎ７，８，９の量を減少させながら増加した量のＭａｎ５グリコフォームを有する抗体を生産する方法を開示する。本発明はまた生産したＭａｎ５グリコフォームの量を調節する方法も記載する。]
[0081] 上で検討したように、その一部を図１に示したＮ-グリカン生合成経路において、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩが、ＧｌｃＮａｃ部分を、ついでα-マンノシダーゼＩＩによって作用可能であるＭａｎ５の末端α-１,３アームに付加する。ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩの活性を無効にするか又は調節することにより、Ｍａｎ５グリカン類を有する抗体の割合を増加させることができる。] 図１
[0082] Ｍａｎ７，８，９グリコフォームの量は、α-１,２マンノシダーゼ活性を増強することにより減少させることができる。インビボ又はインビトロのいずれかでα-１,２-マンノシダーゼを使用することにより、より素早く浄化されるＭａｎ７，８，９グリカン類を、Ｍａｎ５に転換させることができる。]
[0083] また本発明は、ＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)ノックダウンを使用する、可変量のＭａｎ５を有する抗体を生産する方法を提供する。
ＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)は、遺伝子発現を調節するための方法である。ＲＮＡ分子は、相補的配列を有する単鎖ｍＲＮＡ分子に結合し、特定の遺伝子の翻訳を阻止することができる。ＲＮＡは、ＲＮＡ産生遺伝子(マイクロＲＮＡ、すなわちｍｉＲＮＡ)により、外因的(低分子干渉ＲＮＡ、すなわちｓｉＲＮＡ)、又は内因的に導入され得る。例えば、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩに相補的な二本鎖ＲＮＡは、抗体発現株化細胞において発現されるこのグリコシルトランスフェラーゼの量を低減させることができ、産生された抗体中のＭａｎ５グリコフォームのレベルを増加させる。標的遺伝子の発現レベルがゼロまで低下する遺伝子ノックアウトとは異なり、特定の遺伝子の異なった断片を使用することにより、阻害量が変わり得、所望のグリコフォームが最適量生産されるように特定の断片が使用され得る。最適なレベルは、Ｆｃレセプター結合性、ＡＤＣＣ、効能及び毒性を含むエフェクター機能についてのインビボ又はインビトロアッセイを含む、当該分野でよく知られている方法により測定することができる。完全なノックアウトよりもむしろ、ＲＮＡｉノックダウンアプローチを使用すると、Ｍａｎ５グリカンの量を最適レベルに微調整することが可能になり、１００％未満のＭａｎ５グリカン類を有する抗体の生産が所望される場合、大きな恩恵がある。]
[0084] α-１,２-マンノシダーゼ活性は、様々な方法により増強することができる。例えば、α-１,２-マンノシダーゼ活性は、抗体生産に使用される組換え宿主細胞中に存在するα-マンノシダーゼＩの付加的なコピーを提供することにより、増強することができる。]
[0085] 他の実施態様では、微生物株化細胞からのα-１,２-マンノシダーゼを、発現株化細胞に形質移入してもよい。異なった種由来のα-１,２-マンノシダーゼは、様々な高マンノースグリカン類に対して異なった特異性を有する。商業的に入手可能なα-マンノシダーゼＩのAspergillus saitoi由来のα-１,２-マンノシダーゼは、高度にリッチなＭａｎ９グリコフォームのＭａｎ５への強いインビトロトリミングを示した。Contrerasらは、Trichoderma reesei由来のα-１,２-マンノシダーゼ単独で、Ｍａｎ９から４つ全てのマンノースをトリミングし、同種のＭａｎ５グリカンが生じることを示している(Marasら, J. Biotechnol., 77: 255-263 (2000); Petegemら, J. Mol. Biol., 312: 157-165 (2001))。A. Saitoi又はT. reeseiのα-１,２-マンノシダーゼは、基質として、高レベルのＭａｎ９を有するプロテインＡ-精製オクレリズマブに使用することができる。]
[0086] 他の実施態様では、他の哺乳動物種由来のα-１,２-マンノシダーゼも、発現株化細胞に形質移入されうる。
異なった内在性マンノシダーゼがＭａｎ９をＭａｎ５に転換させる各マンノシダーゼのトリミングに関与していることも、高等生物においてまた明らかとなっている。実際、ほとんどの種が、一方は小胞体(ＥＲ)、他方はゴルジ体における、２つのマンノシダーゼを利用しており、２段階反応でＭａｎ９をＭａｎ５にトリミングする(Gonzalezら, J. Biol. Chem., 274(30): 21375-21386 (1999); Mast及びMoremen, MethodsEnzymol., 415: 31-46 (2006))。２段階プロセシングは、Ichishimaらの論文において検討されている(Ichishimaら, Biochem. J., 339: 589-597 (1999))。Ｍａｎ８Ｂは、ゴルジマンノシダーゼを使用し、Ｍａｎ５に転換される最も高い可能性を有している最適な中間体であると思われる。Ｍａｎ９をＭａｎ８Ｂに成功裏に転換させる多くのＥＲマンノシダーゼが同定されており(Gonzalezら, J. Biol. Chem., 274(30): 21375-21386 (1999); Jelinek-Kelly及びHerscovics, J. Biol. Chem., 263(29): 14757-14763 (1988))、これは、別の実施態様では、続いて、Aspergillus saitoi又はTrichoderma reesei由来のいずれかのα-１,２-マンノシダーゼを使用し、Ｍａｎ５にトリミングされうる。]
[0087] 同種のＭａｎ５グリコフォームを生じせしめるための他のアプローチは、上で検討したＲＮＡ干渉技術とインビトロトリミング反応とを組み合わせることを含む。ＣＨＯ細胞は、Ｍａｎ９をＭａｎ５に転換させるのに２つのマンノシダーゼを使用するため、ＣＨＯゴルジマンノシダーゼは、Ｍａｎ８Ｂの蓄積に至りうるＲＮＡｉを使用し、ノックダウンさせることができる。続いて、Ｍａｎ８Ｂに富む抗体を精製し、Aspergillus saitoi又はTrichoderma reesei由来のα-１,２-マンノシダーゼを使用し、同じインビトロトリミング反応により、Ｍａｎ５に転換させることができる。また、インビトロトリミング反応は、ＣＨＯゴルジマンノシダーゼが特異的にノックダウンされる同じ細胞において、α-１,２-マンノシダーゼを発現させることにより、インビボで導入されうる。これにより、Ｍａｎ８ＢからＭａｎ５への転換前の精製工程が除去される。]
[0088] さらなる他の実施態様では、これまでに記載されたマンノシダーゼのいずれも、Ｍａｎ６、７、８、９をＭａｎ５にトリミングするために、インビトロで発現後に使用されうる。
以下の実施例は例証目的のだめにのみ提供され、決して本発明の範囲を限定することを意図したものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献は、その全体が出典明示によりここに援用される。]
[0089] 実施例１
低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)によるＮ-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ(ＧｎＴ-Ｉ)のノックダウン
ＧｎＴ-ＩｃＤＮＡのクローニングと単離ｃＤＮＡのＦＬＡＧ(登録商標)タグ化：
ＣＨＯ細胞でオリゴマンノース型グリカン類を有する抗体を得るために、ＲＮＡｉアプローチを使用して内在性ＧｎＴ-Ｉ遺伝子の発現をノックダウンした。ＧｎＴ-Ｉコード化配列(NCBI受入番号：U65791)の１．３ｋｂ断片を、ＣＨＯＤＰ１２細胞から精製された全ＲＮＡを使用し、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(ＲＴ-ＰＣＲ)によりクローニングした。ついで、ＰＣＲ断片をStrategeneからのｐＣＭＶ-３Ｔａｇ-６ベクター(Cat # 240195)中にクローニングした(図２)。完全長ＧｎＴ-Ｉタンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングした。ＦＬＡＧ(登録商標)タグの３つのコピー(ＭｅｔＡｓｐＴｙｒＬｙｓＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐＬｙｓ)(配列番号：１)を、抗ＦＬＡＧ(登録商標)抗体を用いたウエスタンブロット分析のために、単離されたＧｎＴ-ＩｃＤＮＡ配列の５'末端に融合させた。] 図２
[0090] 低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)プローブの設計と発現ベクター中へのクローニング：
ＣＨＯ ＧｎＩ-Ｔ遺伝子を標的とするために５つのｓｉＲＮＡブローブ(配列番号：２-６)を設計するのに使用される方法は、Elbashirら, Methods26(2):199-213 (2002)により記載されている。ｓｉＲＮＡプローブは、Ambion, Inc. (Austin, TX)からのｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ３．１-Ｈ１ヒドロプラスミド(図３)中に独立してクローニングされ、アニール化された合成オリゴヌクレオチド類を使用して構築し、低分子ヘアピンｓｉＲＮＡを生成させた。ｓｉＲＮＡプローブをコードするＤＮＡ配列を、ＰｏｌＩＩＩ型Ｈ１プロモーターの制御下、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位中にクローニングした。Ｈ１プロモーターからの転写物は、９のヌクレオチドヘアピン様配列によりその逆相補鎖アンチセンス配列に連結した、ＧｎＴ-Ｉ遺伝子に対して特異的な１９のヌクレオチドセンス配列からなるヘアピン-ループｓｉＲＮＡを形成する。] 図３
[0091] 各ｓｉＲＮＡプローブは、ＧｎＴ-Ｉ遺伝子に特異的な１９のヌクレオチドセンス配列からなり、９のヌクレオチドヘアピン-ループ配列により、その逆相補アンチセンス配列に結合し、３'末端に５ ６Ｕ'sが続く(図３)。図４は、ＧｎＴ-Ｉ遺伝子を標的とする５つのｓｉＲＮＡ配列を示す。ＧｎＴ-Ｉ転写物を切断するこれらｓｉＲＮＡプローブの能力を、ＣＨＯ細胞中へＦＬＡＧ(登録商標)タグ化ＧｎＴ-Ｉプラスミドを用いた各ｓｉＲＮＡ発現プローブプラスミドを一過性に同時形質移入することにより試験した。また、ネガティブコントロールとなるエンプティｐＳｉｌｅｎｃｅｒ(Ambion, Inc.)ベクタープラスミドも、ＦＬＡＧ(登録商標)タグ化ＧｎＴ-Ｉプラスミドと共に同時形質移入された。細胞を溶解させ、形質移入の２４時間後に抽出し、細胞溶解物を、抗ＦＬＡＧ(登録商標)Ｍ２抗体(Sigma, MO)を用いたウエスタンブロットにより分析した。予想通り、コントロールプラスミドはＦＬＡＧタグ化ＧｎＴ-Ｉの発現を阻害しなかったが、ｓｉＲＮＡプローブはＦＬＡＧ(登録商標)タグ化ＧｎＴ-Ｉ融合タンパク質発現について様々な度合いの阻害性を有していた(図５)。残りのＲＮＡｉよりも顕著に強い阻害効果を示したＲＮＡｉ１及びＲＮＡｉ３を、さらなる評価のために選択した。] 図３ 図４ 図５
[0092] オクレリズマブ産生株化細胞中へのｓｉＲＮＡ発現プラスミドの一過性発現
ＲＮＡｉ１及びＲＮＡｉ３(ＲＮＡｉ１３)の配列を含む組合せｓｉＲＮＡプラスミドと共に、５つのｓｉＲＮＡ発現プラスミド(ＲＮＡｉ１、ＲＮＡｉ２、ＲＮＡｉ３、ＲＮＡｉ４、及びＲＮＡｉ５)を、オクレリズマブ産生のための株化細胞に一過性に形質移入させた。コントロールとして、ＧｎＴ-Ｉ又は任意の既知の遺伝子に対して相同性を有さないランダムなマウス配列を含むスクランブルプラスミドを、平行して形質移入させた。形質移入方法にリポフェクタミン(LIPOFECTAMINE)ＴＭ ２０００を用いた標準血清含有一過性形質移入プロトコルを続けた。簡潔に述べると、形質移入の日に、ウシ胎児血清(ＦＢＳ)の存在下で非選択的増殖培地に細胞を１．５×１０６細胞／ｍＬで播種した。ＤＮＡ及びリポフェクタミンＴＭを別々のチューブの形質移入用培地に添加し、続いて混合し、室温で３０分インキュベートした。ついで、ＤＮＡ複合体を細胞培養に添加した。２４時間後、形質移入した培養体を生産培地に培地交換した。収集細胞培養液(ＨＣＣＦ)及び細胞ペレットを、形質移入の１、２及び５日後に収集した。ＣＥ-グリカンアッセイを使用してＨＣＣＦを分析し、異なったグリコフォームのレベルを測定し、定量的ｑＰＣＲ分析用に細胞ペレットを使用し、ＧｎＴ-Ｉの内在性ｍＲＮＡレベルを測定した。ｑＰＣＲを実施するために、ＲＮｅａｓｙ(登録商標)９６ウェルキット(Qiagen)又はＭａｇＭＡＸＴＭ-９６全ＲＮＡ単離キット(Ambion)により、ｍＲＮＡを単離した。ＴＡＱＭＡＮ(登録商標)分析を実施し、実験過程中のＧｎＴ-ＩｍＲＮＡ発現レベルを測定した(図６Ａ)。ｃＤＮＡ(ｂｐ１２６０−１３２４)の３'末端をカバーするプライマー及びプローブの配列は以下の通りである：
順プライマー
ＣＧＴＴＧＴＣＡＣＴＴＴＣＣＡＧＴＴＣＡＧ(配列番号：７)
逆プライマー
ＡＧＣＣＴＴＣＣＣＡＧＧＴＴＴＧＴＧ(配列番号：８)
プローブ
ＦＡＭ-ＡＣＧＴＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＣ-ＴＡＭＲＡ(配列番号：９)] 図６Ａ
[0093] 図６Ａに示すｍＲＮＡ分析は、ＧｎＴ-Ｉを標的とする全てのＲＮＡｉプラスミドが、ＧｎＴ-Ｉ ｍＲＮＡを有意にノックダウンでき、形質移入の５日後、コントロール(スクランブルプラスミドで形質移入)と比較して、最大で８０％のノックダウンを有することを示している。コントロールのＧｎＴ-Ｉ発現レベルを１００％に設定した。ＴＡＱＭＡＮ(登録商標)アッセイにおけるノックダウン活性は、ＦＬＡＧ(登録商標)タグ化ＧｎＴ-Ｉのウエスタンブロット分析とよく相関しており、双方のアッセイにおいて、ＲＮＡｉ１とＲＮＡｉ３が、最も強いインヒビターであると思われた。ＲＮＡｉ１３は、ＲＮＡｉ１及びＲＮＡｉ３と個々に比較して、さらなる阻害をもたらし、全ての次の研究に対する主要なＲＮＡｉベクターとして選択した。] 図６Ａ
[0094] 実施例２
抗体のＭａｎ５レベルの測定
ＨＣＣＦに収集された抗体の実際のＭａｎ５レベルを決定するために、「ＣＥ-グリカン」と称されるキャピラリー電気泳動を選択し、抗体から放出されたグリカン類を測定するための標準的方法とした。簡潔に述べると、分取プロテインＡ精製方法を使用し、ＨＣＣＦからの抗体を精製した。ついで、Ｆｃ領域に結合したＮ結合グリカンを、３７℃で一晩インキュベートして、ペプチド-Ｎ-グリコシダーゼＦ(ＰＮＧアーゼＦ)により切断する。反応後、タンパク質を沈殿させ、切断されたグリカン類から分離し、還元的アミノ化により、８-アミノピレン-１,３,６-トリスルホナート(ＡＰＴＳ)で標識した。ついで、標識されたグリカン類を、特定の溶出プロファイルを有するＡＰＴＳ標識グリカン標準体に対して、キャピラリー電気泳動法を使用して分析した。アッセイの詳細はベックマン・コールターのウエブサイトに見出すことができる。５日目にアッセイされた抗体のＭａｎ５含有量は、ＴＡＱＭＡＮ(登録商標)データとよく相関しており(図６Ａ)、ＲＮＡｉ１３は、約９％で最も高いＭａｎ５含有量を有していた(図６Ｂ)。] 図６Ａ 図６Ｂ
[0095] 一過性形質移入実験の１４日間の実施中において安定なＭａｎ５レベル
ＲＮＡｉ１３プラスミドの一過性発現でＭａｎ５レベルを増加させるために、同じ株化細胞において、より長い細胞培養期間を試験した(１４日まで)。他の抗体を用いた経験では、生産培養期間を長くすると、Ｍａｎ５レベルが増加することが示された(図１０Ａ)。１４日間の実験では、同様の一過性形質移入プロトコルを使用した。株化細胞を、リポフェクタミンＴＭを使用し、スクランブル又はＲＮＡｉ１３ベクターを用いて形質移入した。形質移入から様々な日数後、ＨＣＣＦを収集し、ＣＥ-グリカンアッセイを使用して試料を分析し、Ｍａｎ５レベルを測定した。図７は、示されている培養期間でのＭａｎ５レベルを示すが、ＲＮＡｉ１３プラスミドはコントロール条件よりもほぼ１０倍高いＭａｎ５レベルとなり、そのレベルは、実験全体を通して安定していたようである。さらに、この特定の実験に対するＧｎＴ-ＩｍＲＮＡレベルは、５日間の培養と同様であった(データは示さず)。] 図７
[0096] 実施例３
ＣＨＯ α-マンノシダーゼＩｃＤＮＡのクローニング
上述のＧｎＴ-Ｉをクローニングするのに使用したものと同じ全ＲＮＡを、ＣＨＯ α-マンノシダーゼＩをクローニングするために使用した。α-マンノシダーゼＩはグリコシル化経路における別の重要な酵素である。それにより、高マンノース構造のＭａｎ７，８，９はＭａｎ５、６に転換される。このタンパク質を過剰発現させることにより、潜在的に、Ｍａｎ５へのより均質な転換が可能となる。先ず、ヒト、マウス、ラットからの相同体のコード化配列を、ＣＨＯ遺伝子をクローンアウトするのに使用できるであろう保存領域を明らかにするために整列させた。コード化配列の５'末端の上流の保存領域と終止コドンの後の小領域を、ＣＨＯ α-マンノシダーゼＩからクローンアウトした。ｃＤＮＡのサイズは１．９ｋＢである(図８Ａ)。アラインメントがタンパク質レベルでなされた場合、アミノ酸配列に基づきＣＨＯ細胞とマウスのマンノシダーゼの間には有意に高い相同性(９５％)が存在した。ＣＨＯ α-マンノシダーゼＩのｃＤＮＡとＧｎＴ-Ｉ ＲＮＡｉ１３カセットを、別の発現ベクターＳＶ４０.ＧＳ.ＣＭＶ.ｎｂｅ中にクローニングした(図８Ｃ)。] 図８Ａ 図８Ｃ
[0097] 実施例４
ＧｎＴ-Ｉの一定のノックダウンのためにｓｈＲＮＡを発現させる安定株化細胞の開発
オクレリズマブにＲＮＡｉ１３ベクターを一過性形質移入させることで、Ｍａｎ５レベルは、０．５−１％から９％まで、ざっと１０倍に増加した。Ｍａｎ５レベルをさらに増加させるため、安定した株化細胞の開発に着手し、ゲノムに導入されたｓｈＲＮＡを用いて安定したクローンを作製し、よって、さらに一貫した様式で、ＧｎＴ-Ｉをノックダウンさせる安定した発現レベルをもたらされることが予想される。安定した細胞クローンを開発するための標準的なプロトコルは、ＲＮＡｉ１３プラスミド(Shenら. (2007), Metabolic engineering to control glycosylation In M. Butler (Ed.), Cell culture and Upstream Processing (pp.131-148). New York, NY: Taylor & Francis Group)を用いて実施され、ベクターに存在する耐性遺伝子のためにハイグロマイシン選択を使用した(図３)。要するに、形質移入は、リポフェクタミンＴＭを使用する一過性形質移入実験と同じようにして実施した。形質移入から２４時間後に生産培地に交換する代わりに、細胞を、０．５ｍｇ／ｍＬのハイグロマイシン選択圧を含む選択培地に交換し、ついで、様々な播種密度でペトリ皿に配した。皿(全体で２０−５０皿)を、クローンが観察されるまで、３７℃で２−３週間、ＣＯ２加湿インキュベータでインキュベートした。個々のクローンを９６−ウェルプレート(１クローン／ウェル)に移し、約２００−３００のクローンを第１段階で採取した。潜在的に高いＭａｎ５レベルを有するクローンを選択するために、全てのクローンのＧｎＴ-ＩｍＲＮＡレベルを、ＴＡＱＭＡＮ(登録商標)アッセイを使用して測定し、最も低いＧｎＴ-Ｉ ｍＲＮＡレベルを有するクローンを選択した。続いて、選択されたクローンを４８ウェルプレート、２４ウェルプレート、６ウェルプレート、Ｔ７５培養フラスコ、ついで最終的には振盪フラスコにスケールアップした。大ざっぱに１２クローンを選択し、３日目に１０％の栄養素補給がなされた生産培地において１４日間、最初の生産培養を実施した。最も多くの量のＭａｎ５を有する上位クローンを、さらなる使用のために保存し、保管した。] 図３
[0098] 複数の形質移入実験を実施し、スクリーニングのための多くの安定したクローンをつくり出した。ＴＡＱＭＡＮ(登録商標)アッセイを使用し、全体で〜３５０のクローンをスクリーニングし、ＧｎＴ-Ｉの内在性ｍＲＮＡレベルを測定したが、ここで、ｍＲＮＡレベルのパーセントは、未形質移入株化細胞におけるＧｎＴ-Ｉ ｍＲＮＡレベルに対するものである。数回のスケールアップ後、ある形質移入実験からの上位５クローンと、他の形質移入実験からの上位１３クローンを選択し、それらの相対的ＧｎＴ-Ｉ ｍＲＮＡレベルを図９Ａに示す。安定したクローンにおけるＧｎＴ-Ｉノックダウンレベルは、一過性形質移入で観察されたノックダウンレベルと非常に類似し、８０％で最大のノックダウンを有している。１８クローンを、１４日間の生産実験でさらに評価し、ついで、ＣＥ-グリカン分析を使用し、実施の終わりにＨＣＣＦを分析した。Ｍａｎ５レベルを図９Ｂに示す。再び、結果には、安定なクローンのＭａｎ５グリコフォームのパーセント(Ｍａｎ５％)が、一過性形質移入実験で観察されたものに類似していることが示された。Ｍａｎ５レベルの約５倍の増加が観察され、クローンＰ２-１０ＣついてはＭａｎ５レベルは６％で最も高いレベルであった。] 図９Ａ 図９Ｂ
[0099] 実施例５
Ｍａｎ５レベルを増加させるための細胞培養条件の操作
ＧｎＴ-ＩのＲＮＡｉノックダウンと併せて、最適化された細胞培養パラメータを使用することで、得られるＭａｎ５の量を増加させることができる。培養期間を長くし、培地浸透圧を増加させることは、評価される別の抗体では有益であることが見出されており、他での結果(米国特許出願第２００７／０１９００５７-Ａ１号の図２及び図４)には、浸透圧を増加させることで、高マンノースグリコフォームを有する抗体の割合を増加させることができることが示されている。] 図２ 図４
[0100] 図１０Ａは、評価される抗体の生産実験の一例であり、多量のＭａｎ５抗体が１４日間の培養の終わりに生産されたことが、明確に示されている。さらに、基本培地中の増加したＮａＣｌ(又は浸透圧)濃度を、Ｍａｎ５レベルに関してまた試験した。図１０Ｂに示すように、３００から４００ｍＯｓｍに基本浸透圧が増加することで、Ｍａｎ５含有量をさらに増加させることができる。しかしながら、高浸透圧の栄養素補給溶液を添加しても、高浸透圧の基本培地における有益性以上には、Ｍａｎ５レベルは上昇しない(データは示さず)。より高い浸透圧とより長い培養期間の効果を、他の分子について、Ｍａｎ５レベルを増加させるために、組合せて使用することができる。これらの知見のため、オクレリズマブを生成する株化細胞と、上のセクションに記載されたオクレリスマブのトップ５のＧｎＴ-Ｉノックダウン安定クローンを用いて、これらの条件を試験するように実験をデザインした。]
[0101] 浸透圧及び培養期間に起因する効果に加えて、少量の塩化マンガンが培養に供給された場合、マンガンの添加により、Ｍａｎ５レベルが低減することが示されている。図１０Ｃには、同じ抗体を用いた１４日間の生産実験の結果が要約されており、そこでは、１μＭの塩化マンガンが３日、３及び６日、又は３、６及び９日で供給されている。全ての場合において、Ｍａｎ５レベルは、コントロールと比較して５０％低減した。Ｍａｎ５レベルを増加させるためには、マンガン濃度をより低くするという条件が有益であると予期される。]
[0102] ＧｎＴ-Ｉ活性のＲＮＡｉノックダウンにより生成されるトップ５の安定クローンを、この実験に含めた。クローン６Ｄからの結果の例を図１０Ｄに示す。一般に、Ｍａｎ５レベルは、全ての条件に対して、培養期間の増加につれて増加している。基本培地が高浸透圧であることは、Ｍａｎ５レベルの増強に最も強い効果を有しており、マンガンが存在しないことは、コントロールと比較してわずかに有益であると思われる。生産培養を１４日から２１日に延長し、高浸透圧の基本培地を使用することにより、Ｍａｎ５レベルを、約２倍まで増加させることができる。したがって、細胞培養条件を操作することにより、Ｍａｎ５レベルを、ＲＮＡｉノックダウンアプローチに関して、さらに増強することができる。]
[0103] 実施例６
ＧｎＴ-Ｉの下流で生産されたグリカン類を有する細胞に結合しこれを殺すためのレクチンの使用
細胞におけるＧｎＴ-Ｉ活性を低減させる他の方法を、ＧｎＴ-Ｉノックダウンと別に、又はそれと組合せて使用してもよい。高レベルのＭａｎ５を有する株化細胞は、ＧｎＴ-Ｉの活性喪失とＭａｎ５グリコフォームの蓄積を生じる、ＧｎＴ-Ｉ変異を有する細胞クローンをスクリーニングすることによりまた選択することができる。レクチン耐性法は、Stanleyら(Stanleyら, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 72(9): 3323-3327 (1975); Patnaik及びStanley, MethodsEnzymol., 416:159-182 (2006))により研究されている。例えば、ＧｎＴ-Ｉの下流で作製されるグリカンに結合するレクチンは、高レベルのＲＮＡｉノックダウンを有する細胞を選択することができる。フィトヘマグルチニン(ＰＨＡ)、つまり有毒の植物性レクチンは、少量の複合グリカンを有する細胞を選択するために、細胞培養に添加することができる。ＧｎＴ-Ｉ活性を欠く細胞は、細胞表面に存在する欠陥性のあるレクチン-結合糖タンパク質をもたらし、ついで、細胞が、ＰＨＡを含む環境において生存できるようにする。このアプローチは、レクチンストレス条件下で生存する細胞の可能性を増加させるために、ＧｎＴ-ＩのＲＮＡｉノックダウンと関連させて使用することができる。また、これにより、高レベルのノックダウンを有する変異体を見出す効率を増加させることができる。]
[0104] 実施例７
ＵＤＰ-ＧｌｃＮＡｃゴルジ膜トランスポーターのノックダウン
別法として、一又は複数の付加的な遺伝子をノックダウン又はノックアウトすることで、Ｍａｎ５のパーセントを増加させることが予期される。ＧｎＴ-Ｉは基質としてＵＤＰ-ＧｌｃＮＡｃを必要とする。ＵＤＰ-ＧｌｃＮＡｃはサイトゾル中で合成され、ゴルジのルーメンに運搬される。Guillenら(PNAS 95: 7888-7892, 1998)は、哺乳動物のゴルジ膜トランスポーターをクローニングした。このトランスポーターをノックダウン又はノックアウトすることで、ゴルジ体におけるＵＤＰ-ＧｌｃＮＡｃのプールが除去されるか、又は大きく低減させることが予期される。従って、ＧｎＴ-Ｉ用の基質のレベルを低減させると、Ｍａｎ５レベルがより高くなることが予期される。]
[0105] 実施例８
変動量のＭａｎ５グリカンを有する抗体の精製及び特徴付け
Ｍａｎ５グリコフォームに富む抗体を、可溶性レセプターに結合するヒト化ＩｇＧ１のＣＨＯ細胞発酵からの収集され清澄にされた細胞培養液(ＨＣＣＦ)のＣｏｎ Ａセファロースクロマトグラフィーにより精製した。この抗体を発現する株化細胞は、通常よりも多い量のＭａｎ５を有するグリカンを産生した(５−２０％)。]
[0106] ２ＬのＨＣＣＦ(１．２９ｇ／Ｌ ｍＡｂ)を、２５ｍＭのトリス、２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．１で平衡にしたプロセップ(PROSEP)ＴＭＡカラム(２．５×１４ｃｍ、Millipore)で精製した。平衡用バッファー及び０．４Ｍのリン酸カリウムバッファーを使用する一連の充填後洗浄工程の後に、０．１Ｍの酢酸，ｐＨ２．９を使用し、結合した抗体を溶出させ、１．５Ｍのトリス塩基でｐＨ７．４に調節した。ついで、溶出したプロテインＡのプールを、１ｍＭのＭｎＣｌ２、１ｍＭのＣａＣｌ２、０．５ＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのトリス、ｐＨ７．４で平衡にされたＣｏｎ ＡセファロースＴＭカラム(２．５×５ｃｍ、GE HealthCare)において処理した。０．５Ｍのα-Ｄ-マンノピラノシド、０．５ＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのトリス、ｐＨ７．４を使用し、結合した抗体を溶出させた。]
[0107] Ｃｏｎ ＡセファロースＴＭプール中の抗体をプロテインＡカラムで回収し、ついで、二度目に、Ｃｏｎ ＡセファロースＴＭでのクロマトグラフィーを施した。プロテインＡでの回収後、三度目に、プールにＣｏｎ ＡセファロースＴＭで再びクロマトグラフィーを施したが、今度は、平衡用バッファーと溶出用バッファーの１５カラム容量の勾配を用い、溶出を実施した。プロテインＡクロマトグラフィーにより、生成物を再び単離した。]
[0108] グリカン分析により、出発物質が１５％のＭａｎ５グリコフォームを含んでいたことが明らかとなった。Ｃｏｎ Ａに１回通過させた後、Ｍａｎ５含有量は４３％まで増加しており、２度目に通過させた後、Ｍａｎ５は５７％まで、三度目の通過後には、Ｍａｎ５は６２％まで増加していた。
リッチ化されていない(５％のＭａｎ５及び１６％のＭａｎ５)抗体の２つの試料と、Ｃｏｎ Ａでリッチ化された抗体(６２％)の１つの試料を、ＥＬＩＳＡによりＦｃガンマレセプターＩＩＩａ結合について評価し、リツキサン(登録商標)(リツキシマブ)及びハーセプチン(登録商標)(トラスツズマブ)と比較した。]
[0109] 図１１は、ＦｃガンマレセプターＩＩＩａ-Ｖ１５８への抗体結合性を示す。白丸はハーセプチン(登録商標)(トラスツズマブ)を表し、白四角はリツキサン(登録商標)(リツキシマブ)を表し、白三角は５％のＭａｎ５(７-９％の非フコシルグリカン)を有する抗レセプター抗体を表し、白菱形は１６％のＭａｎ５(１４．６％の非フコシルグリカン)を有する抗レセプター抗体を表し、黒丸は６２％のＭａｎ５(１１％の非フコシルグリカン)を有する抗レセプター抗体を表す。] 図１１
[0110] 図１２は、ＦｃガンマレセプターＩＩＩａ-Ｆ１５８に結合する抗体を示す。白丸はハーセプチン(登録商標)(トラスツズマブ)を表し、白四角はリツキサン(登録商標)(リツキシマブ)を表し、白三角は５％のＭａｎ５(７-９％の非フコシルグリカン)を有する抗レセプター抗体を表し、白菱形は１６％のＭａｎ５(１４．６％の非フコシルグリカン)を有する抗レセプター抗体を表し、黒丸は６２％のＭａｎ５(１１％の非フコシルグリカン)を有する抗レセプター抗体を表す。] 図１２
[0111] Ｆｃガンマレセプター結合アッセイデータ(相対的親和性)を次表にまとめる。]
実施例

[0112] 上の明細書を通して、本発明を、所定の実施態様を参照して検討したが、それに限定されるものではない。実際、ここに示され、記載されたものに加えて、本発明の様々な修正が、上の明細書から当業者には明らかであろうし、添付される特許請求の範囲に入る。]

权利要求:

請求項1
抗体又はその断片、又はイムノアドへシン又はその断片を発現するように改変された、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性を欠き、該断片が少なくとも一のグリコシル化部位を有する哺乳動物細胞。
請求項2
増強されたα-１,２-マンノシダーゼ活性をさらに有する請求項１に記載の哺乳動物細胞。
請求項3
株化細胞である請求項２に記載の哺乳動物細胞。
請求項4
チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞である請求項３に記載の哺乳動物細胞。
請求項5
抗体又は抗体断片が、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＥＧＦレセプター(ＥＧＦＲ、ＨＥＲ１、ＥｒｂＢ１)、ＨＥＲ２(ＥｒｂＢ２)、ＨＥＲ３(ＥｒｂＢ３)、ＨＥＲ４(ＥｒｂＢ４)、ＬＦＡ-１、Ｍａｃ１、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ-４、ＩＣＡＭ-１、ＶＣＡＭ、αｖ／β３インテグリン、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ１１ｂ、ＶＥＧＦ；ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３レセプター；肥満(ＯＢ)レセプター；ｍｐｌレセプター；ＣＴＬＡ-４；プロテインＣ、ＤＲ５、ＥＧＦＬ７、ニューロポリン及びそのレセプター、ＶＥＧＦ-Ｃ、エフリン及びそのレセプター、ネトリン及びそのレセプター、ｓｌｉｔ及びそのレセプター、ｓｅｍａ及びそのレセプター、セマフォリン及びそのレセプター、ｒｏｂｏ及びそのレセプター、及びＭ１からなる群から選択される抗原に結合する請求項３に記載の哺乳動物細胞。
請求項6
前記抗体がキメラ又はヒト化されている請求項５に記載の哺乳動物細胞。
請求項7
キメラ抗体が抗ＣＤ２０抗体である請求項６に記載の哺乳動物細胞。
請求項8
抗ＣＤ２０抗体がリツキシマブ又はオクレリズマブである請求項７に記載の哺乳動物細胞。
請求項9
ヒト化抗体が抗ＨＥＲ２、抗ＨＥＲ１、抗ＶＥＧＦ又は抗ＩｇＥ抗体である請求項６に記載の哺乳動物細胞。
請求項10
抗ＨＥＲ２抗体がトラスツズマブ又はペルツズマブである請求項９に記載の哺乳動物細胞。
請求項11
抗ＶＥＧＦ抗体がベバシズマブ又はラニビズマブである請求項９に記載の哺乳動物細胞。
請求項12
抗ＩｇＥ抗体がオマリズマブである請求項９に記載の哺乳動物細胞。
請求項13
抗体断片が、相補性決定領域(ＣＤＲ)断片、線状抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ、抗体断片から形成された多重特異性抗体、及びポリペプチドに特異的抗原結合性を付与するのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部を含んでいるポリペプチドからなる群から選択される請求項５に記載の哺乳動物細胞。
請求項14
抗体又はその断片、又はイムノアドへシン又はその断片を発現するように改変された、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性がＲＮＡｉノックダウンにより低減され、該断片が少なくとも一のグリコシル化部位を有する哺乳動物細胞。
請求項15
ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性が、ＲＮＡｉノックダウンにより、２０％又はそれ以上のＭａｎ５，Ｍａｎ６グリカンを含む糖鎖構造となるのに十分な程に低減している、請求項１４に記載の哺乳動物細胞。
請求項16
ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性が、ＲＮＡｉノックダウンにより、２５％又はそれ以上のＭａｎ５，Ｍａｎ６グリカンを含む糖鎖構造となるのに十分な程に低減している、請求項１４に記載の哺乳動物細胞。
請求項17
増強されたα-１,２-マンノシダーゼ活性をさらに有する、請求項１４に記載の哺乳動物細胞。
請求項18
抗体又はその断片、又はイムノアドへシン又はその断片を発現するように改変され、該抗体又はその断片が、２０％又はそれ以上のＭａｎ５，Ｍａｎ６グリカンの糖鎖構造を含む、請求項１７に記載の哺乳動物細胞。
請求項19
抗体又はその断片、又はイムノアドへシン又はその断片を発現するように改変され、該抗体又はその断片が、２５％又はそれ以上のＭａｎ５，Ｍａｎ６グリカンの糖鎖構造を含む、請求項１７に記載の哺乳動物細胞。
請求項20
株化細胞である、請求項１７に記載の哺乳動物細胞。
請求項21
チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞である、請求項２０に記載の哺乳動物細胞。
請求項22
抗体又は抗体断片が、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＥＧＦレセプター(ＥＧＦＲ、ＨＥＲ１、ＥｒｂＢ１)、ＨＥＲ２(ＥｒｂＢ２)、ＨＥＲ３(ＥｒｂＢ３)、ＨＥＲ４(ＥｒｂＢ４)、ＬＦＡ-１、Ｍａｃ１、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ-４、ＩＣＡＭ-１、ＶＣＡＭ、αｖ／β３インテグリン、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ１１ｂ、ＶＥＧＦ；ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３レセプター；肥満(ＯＢ)レセプター；ｍｐｌレセプター；ＣＴＬＡ-４；プロテインＣ、ＤＲ５、ＥＧＦＬ７、ニューロポリン及びそのレセプター、ＶＥＧＦ-Ｃ、エフリン及びそのレセプター、ネトリン及びそのレセプター、ｓｌｉｔ及びそのレセプター、ｓｅｍａ及びそのレセプター、セマフォリン及びそのレセプター、ｒｏｂｏ及びそのレセプター、及びＭ１からなる群から選択される抗原に結合する、請求項１７に記載の哺乳動物細胞。
請求項23
前記抗体がキメラ又はヒト化されている、請求項１４に記載の哺乳動物細胞。
請求項24
キメラ抗体が抗ＣＤ２０抗体である、請求項２３に記載の哺乳動物細胞。
請求項25
抗ＣＤ２０抗体がリツキシマブ又はオクレリズマブである、請求項２４に記載の哺乳動物細胞。
請求項26
ヒト化抗体が抗ＨＥＲ２、抗ＨＥＲ１、抗ＶＥＧＦ又は抗ＩｇＥ抗体である、請求項２３に記載の哺乳動物細胞。
請求項27
抗ＨＥＲ２抗体がトラスツズマブ又はペルツズマブである、請求項２６に記載の哺乳動物細胞。
請求項28
抗ＶＥＧＦ抗体がベバシズマブ又はラニビズマブである、請求項２６に記載の哺乳動物細胞。
請求項29
抗ＩｇＥ抗体がオマリズマブである、請求項２６に記載の哺乳動物細胞。
請求項30
抗体断片が、相補性決定領域(ＣＤＲ)断片、線状抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ、抗体断片から形成される多重特異性抗体、及びポリペプチドに特異的抗原結合性を付与するのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部を含んでいるポリペプチドからなる群から選択される、請求項２６に記載の哺乳動物細胞。
請求項31
抗体又はその断片、又はイムノアドへシン又はその断片を発現するように改変された、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性がゴルジＵＤＰ-ＧｌｃＮＡｃトランスポーターのＲＮＡｉノックダウンにより低減され、該断片が少なくとも一のグリコシル化部位を有する哺乳動物細胞。
請求項32
哺乳動物細胞が増強されたα-１,２-マンノシダーゼ活性をさらに有する、請求項３１に記載の哺乳動物細胞。
請求項33
抗体又はその断片、又はイムノアドへシン又はその断片を発現するように改変され、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性がゴルジＵＤＰ-ＧｌｃＮＡｃトランスポーターのＲＮＡｉノックダウンにより低減され、ＲＮＡｉによりノックダウンされたＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩをさらに有する、該断片が少なくとも一のグリコシル化部位を有する哺乳動物細胞。
請求項34
哺乳動物細胞が増強されたα-１,２-マンノシダーゼ活性をさらに有する、請求項３３に記載の哺乳動物細胞。
請求項35
抗体又はその断片、又はイムノアドへシン又はその断片が生成される条件下で、請求項３又は請求項２０従い、哺乳動物株化細胞を培養することを含み、該抗断片が少なくとも一のグリコシル化部位を有する、主としてＭａｎ５グリカンを有する、抗体又はその断片、又はイムノアドへシン又はその断片を作製する方法。
請求項36
哺乳動物株化細胞がチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞であり、抗体又はその断片、又はイムノアドヘシン又はその断片が、２０％又はそれ以上のＭａｎ５グリカンを担持している、請求項３５に記載の方法。
請求項37
哺乳動物株化細胞がチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞であり、抗体又はその断片、又はイムノアドヘシン又はその断片が、２５％又はそれ以上のＭａｎ５グリカンを担持している、請求項３５に記載の方法。
請求項38
哺乳動物株化細胞がチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞であり、抗体又はその断片、又はイムノアドヘシン又はその断片が、３０％又はそれ以上のＭａｎ５グリカンを担持している、請求項３５に記載の方法。
請求項39
哺乳動物株化細胞がチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞であり、抗体又はその断片、又はイムノアドヘシン又はその断片が、３５％又はそれ以上のＭａｎ５グリカンを担持している、請求項３５に記載の方法。
請求項40
抗体又は抗体断片が、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＥＧＦレセプター(ＥＧＦＲ、ＨＥＲ１、ＥｒｂＢ１)、ＨＥＲ２(ＥｒｂＢ２)、ＨＥＲ３(ＥｒｂＢ３)、ＨＥＲ４(ＥｒｂＢ４)、ＬＦＡ-１、Ｍａｃ１、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ-４、ＩＣＡＭ-１、ＶＣＡＭ、αｖ／β３インテグリン、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ１１ｂ、ＶＥＧＦ；ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３レセプター；肥満(ＯＢ)レセプター；ｍｐｌレセプター；ＣＴＬＡ-４；プロテインＣ、ＤＲ５、ＥＧＦＬ７、ニューロポリン及びそのレセプター、ＶＥＧＦ-Ｃ、エフリン及びそのレセプター、ネトリン及びそのレセプター、ｓｌｉｔ及びそのレセプター、ｓｅｍａ及びそのレセプター、セマフォリン及びそのレセプター、ｒｏｂｏ及びそのレセプター、及び抗Ｍ１からなる群から選択される抗原に結合する、請求項３５に記載の方法。
請求項41
前記抗体がキメラ又はヒト化されている、請求項４０に記載の方法。
請求項42
キメラ抗体が抗ＣＤ２０抗体である、請求項４１に記載の方法。
請求項43
抗ＣＤ２０抗体がリツキシマブ又はオクレリズマブである、請求項４２に記載の方法。
請求項44
ヒト化抗体が抗ＨＥＲ２、抗ＨＥＲ１、抗ＶＥＧＦ又は抗ＩｇＥ抗体である、請求項４１に記載の方法。
請求項45
抗ＨＥＲ２抗体がトラスツズマブ又はペルツズマブである、請求項４４に記載の方法。
請求項46
抗ＶＥＧＦ抗体がベバシズマブ又はラニビズマブである、請求項４４に記載の方法。
請求項47
抗ＩｇＥ抗体がオマリズマブである、請求項４４に記載の方法。
請求項48
抗体断片が、相補性決定領域(ＣＤＲ)断片、線状抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ、抗体断片から形成される多重特異性抗体、及びポリペプチドに特異的抗原結合性を付与するのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部を含んでいるポリペプチドからなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
請求項50
α-１,２-マンノシダーゼの存在下、抗体、イムノアドへシン、又はその断片を発現するように改変され、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性を欠く哺乳動物株化細胞を培養するか、又はこのようなα-１,２-マンノシダーゼと発現した生成物とを接触させることを含み、Ｍａｎ７，８，９グリカンがＭａｎ５グリカンに転換され、該断片が少なくとも一のグリコシル化部位を有する、請求項３５に記載の方法。
請求項51
ＲＮＡｉノックダウンの結果として、低減したＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性を有する、哺乳動物株化細胞において、抗体又は抗体断片をコードする核酸を発現させることを含み、該断片が少なくとも一のグリコシル化部位を有する、糖鎖構造中に約２０％〜１００％のＭａｎ５グリカンを有する、抗体、イムノアドへシン、又はその断片を組換え産生させる方法。
請求項52
抗体、イムノアドへシン、又はその断片を発現するように改変され、ＲＮＡｉノックダウンの故にＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性が低減した哺乳動物株化細胞を培養することを含み、Ｍａｎ７，８，９グリカンがＭａｎ５グリカンに転換され、該断片が少なくとも一のグリコシル化部位を有する、糖鎖構造中に主としてＭａｎ５グリカンを有する、抗体、イムノアドへシン、又はその断片を組換え産生させる方法。
請求項53
α-１,２-マンノシダーゼの存在下、抗体、イムノアドへシン、又はその断片を発現するように改変され、ＲＮＡｉノックダウンの故にＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性が低減した哺乳動物株化細胞を培養するか、又はこのようなα-１,２-マンノシダーゼと発現した生成物とを接触させることをさらに含み、Ｍａｎ７，８，９グリカンがＭａｎ５，６グリカンに転換され、該断片が少なくとも一のグリコシル化部位を有する、請求項５２に記載の方法。
請求項54
ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性が低減したクローンについて選択されるように、有毒レクチンの存在下、哺乳動物株化細胞を培養し、抗体、イムノアドへシン、又はその断片を発現するように、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性が低減した一又は複数の該クローンを操作することを含み、Ｍａｎ７，８，９グリカンがＭａｎ５グリカンに転換され、該断片が少なくとも一のグリコシル化部位を有する、糖鎖構造中に主としてＭａｎ５グリカンを有する、抗体、イムノアドへシン、又はその断片を組換え産生させる方法。
請求項55
有毒レクチンがフィトヘマグルチニンである、請求項５４に記載の方法。
請求項56
ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性が低減したクローンの選択が、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性がＲＮＡｉノックダウンにより低減した細胞を同定するのに使用される、請求項５４に記載の方法。
請求項57
α-１,２-マンノシダーゼの存在下で哺乳動物細胞を培養するか、又はこのようなα-１,２-マンノシダーゼと発現した生成物とを接触させることをさらに含み、Ｍａｎ７，８，９グリカンがＭａｎ５グリカンに転換され、該断片が少なくとも一のグリコシル化部位を有する、請求項５４に記載の方法。
請求項58
抗体、イムノアドへシン、又はその断片を発現するように改変され、ＵＤＰ-ＧｌｃＮＡｃトランスポーター活性を欠く哺乳動物株化細胞を培養するか、又はこのようなα-１,２-マンノシダーゼと発現した生成物とを接触させることを含み、Ｍａｎ７，８，９グリカンがＭａｎ５グリカンに転換され、該断片が少なくとも一のグリコシル化部位を有する、糖鎖構造中に主としてＭａｎ５グリカンを有する、抗体、イムノアドへシン、又はその断片を組換え産生させる方法。
請求項59
α-１,２-マンノシダーゼの存在下で哺乳動物細胞を培養するか、又はこのようなα-１,２-マンノシダーゼと発現した生成物とを接触させることをさらに含み、Ｍａｎ７，８，９グリカンがＭａｎ５グリカンに転換され、該断片が少なくとも一のグリコシル化部位を有する、請求項５８に記載の方法。
請求項60
細胞に内在するマンノシダーゼ活性が、抗体又はその断片の組換え産生に使用される、請求項５８に記載の方法。