イミダゾリウム及びイミダゾリニウム化合物で線維症及び癌を治療する方法

专利摘要:
ここに、抗線維症剤又は抗癌剤を細胞に送達する方法が提供される。本方法は、イミダゾリウム及びイミダゾリニウム塩を含む、本明細書に記載のイミダゾリウム及びイミダゾリニウム化合物の有効量と細胞を接触させることを含む。ａ
公开号:JP2011510979A
申请号:JP2010544928
申请日:2009-01-30
公开日:2011-04-07
发明作者:ジャッキー；ワイ． イン，；ツィーヤン ケ，；ベガン ゴパラン，；チュンヤン ツァン，；ユゲン ツァン，；ラン ツォウ，；ツァオビン ディン，
申请人:エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ；
IPC主号:A61K31-4164

专利说明:

[0001] ［０００１］本出願は、その内容が参照により完全に本明細書に組み込まれる、２００８年１月３０日に出願の米国特許仮出願第６１／００６７６９号の利益及び優先権を主張する。]
技術分野

[0002] ［０００２］本発明は、線維症疾患又は癌を治療する方法を含む、細胞に抗線維症剤又は抗癌剤を送達する方法に関する。]
背景技術

[0003] ［０００３］肝星状細胞（ＨＳＣ）は肝線維形成で重要な役割を演じ、治療的介入の主要な細胞標的とみなされる。しかし、承認された抗線維症薬剤は現在市場に出ていない。]
[0004] ［０００４］肝臓の線維形成は、酸化的ストレス、化学毒性又はウイルス感染から生じる傷害の結果として起こることができる。したがって、細胞及び組織の線維症を含む線維症疾患は、酸化的ストレスを原因とする生理障害の１つである。例えば、ＲＯＳの代謝的生成から生じる酸化的ストレスは、ＨＳＣ活性化及び肝臓線維症に関連付けられた（Ｂｒｉｔｔｏｎら１９９４、Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら１９９５、Ｇａｌｌｉら２００５）。脂質過酸化生成物は、ＨＳＣによるコラーゲン合成の増加をもたらすことが示されている（Ｃａｓｉｎｉら１９９７及びＰａｒｏｌａら１９９６）。]
[0005] ［０００５］活性酸素種（ＲＯＳ）は、過酸化物及び酸素誘導体などのフリーラジカル及び非ラジカル反応性分子を含む酸素誘導体である。これらの分子の生成と除去又は中和との間のアンバランスによるＲＯＳの過剰量があるときに、酸化的ストレスが起こる。ＲＯＳの過剰量は細胞の脂質、タンパク質及びＤＮＡに傷害を与えることができ、正常な細胞機能の阻害又は異常な細胞行動の発達をもたらし、それらは次に、影響を受ける細胞に従い様々な疾患及び状態をもたらすことができる。ＲＯＳは、多くの生理障害、並びにいくつかの疾患の発症及び発達に関連付けられた。]
[0006] ［０００６］いくつかの抗酸化剤が、肝臓線維症の潜在的阻害剤として探究されてきた（Ｋａｗａｄａら１９９８）。茶カテキンの主活性成分（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）は、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）シグナル伝達を通してインビトロでＨＳＣ活性化を阻害することが示されている（Ｃｈｅｎら２００２、Ｎａｋａｎｕｔａら２００５、Ｆｕら２００６）。臨床試験では、ビタミンＥ及びＣの組合せが、非アルコール性脂肪性肝炎患者で線維症スコアを低下させることが示されたが、肝臓の炎症に影響しなかった（Ｈａｒｒｉｓｏｎら２００３）。抗酸化剤として臨床的に用いられているグルタチオン（ＧＳＨ）の合成前駆体Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）は、同様にＴＧＦ−βシグナル伝達の抑制を通して抗線維形成特性を示した（Ｍｅｕｒｅｒら２００５）。]
[0007] ［０００７］酸化的ストレスは、癌の発症及び進行にも関連付けられた。抗酸化酵素活性の低下によって示される酸化的ストレスが、臨床患者での一次発癌及び転移の発達に関連すると報告されている（Ｖａｌｉら２００８）。ＲＯＳはＤＮＡ損傷を引き起こし、ＤＮＡ突然変異の危険、したがって癌の発達を増加させることが見出された（Ｈｕｓｓａｉｎら２００５）。茶ポリフェノールは抗酸化剤であり、皮膚、肺、結腸、肝臓及び膵臓癌の動物モデルにおいて発癌物質誘導性のＤＮＡ損傷を阻害することが示された（Ｆｒｅｉら２００３）。さらに、抗酸化剤ＰＢＮ及びＮＸＹ−０５９は、肝細胞癌で抗癌活性を証明した。（Ｆｌｏｙｄ ２００６）。しかし、調査した抗酸化剤の有効性は、不明のままである（Ｖａｌｋｏら、２００４）。]
[0008] ［０００８］炎症性応答は感染又は損傷への免疫系応答であり、他の細胞をさらに活性化して感染を退けるか損傷を修復する免疫反応のカスケードをもたらす、サイトカインなどの媒介物質を生成する免疫系の細胞の活性化を含む。酸化的ストレスと同様に、炎症性ストレスは線維症疾患及び癌に関連付けられている（Ｒａｋｏｆｆ−Ｎａｈｏｕｍ ２００６、Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら１９９９、Ｂａｃｈｅｍら１９９２、Ｖａｓｉｌｉｏｕら２０００）。例えば、肝臓線維症の発達において、ＨＳＣは重大な役割を演ずる。肝臓損傷に応答して、ＨＳＣは「活性化」及び筋線維芽細胞様細胞へのトランス分化と呼ばれる過程を経る。この過程は、細胞増殖、平滑筋アクチン−α（ＳＭＡＡ）の過剰発現、並びにコラーゲンαＩ型（Ｉ）（ｃｏｌ１ａ１）及びフィブロネクチンを含む細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質の沈着を含む、表現型変化を特徴とする。]
[0009] ［０００９］炎症性サイトカインは、ＨＳＣ活性化の主要な媒介物質を表す。それらの間で、形質転換成長因子βＩ（ＴＧＦ−β１）及びインターロイキン６（ＩＬ−６）は、主にＥＣＭタンパク質を誘導する役割を担う線維形成促進サイトカインに分類されている（Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ １９９９）。ＨＳＣは、肝臓損傷の間クッパー細胞及び内皮細胞から分泌されるＴＧＦ−β１に、並びにオートクリン作用を通してそれら自身に応答し、ＨＳＣ活性化及び肝臓線維症をもたらす（Ｂａｃｈｅｍら１９９２）。さらに、ＨＳＣの活性化は炎症誘導性サイトカインＩＬ−６の分泌を通す慢性肝臓炎症に帰することもでき、それは、肝硬変（Ｖａｓｉｌｉｏｕら２０００）及び肝細胞癌（Ｎａｕｇｌｅｒら、２００７）をもたらす。転写因子核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）は炎症性サイトカインの分泌の重要な調節因子であり、そのサブユニットＮＦ−κＢ ｐ６５は肝臓線維症を媒介することが報告された（Ｖａｓｉｌｉｏｕら２０００）。]
[0010] ［００１０］炎症性応答が酸化的ストレスを誘導すること及びその逆も可能なので、線維症疾患及び癌との共通する関連性を共有することを越えて、酸化的ストレス及び炎症性ストレスの生成及び調節は相互関連するようである。]
[0011] ［００１１］例えば、肝臓の線維形成では、ＲＯＳ及び炎症誘導性サイトカインの両方が、肝線維形成の発達における中心的事象であるＨＳＣの活性化に関与することが示された。ＴＧＦ−βはＨＳＣ活性化の主要な媒介物質であり、ＴＧＦ−βシグナル伝達は酸化的ストレス及び炎症性応答の誘導の両方の影響を受ける（Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら１９９９、Ｂａｃｈｅｍら１９９２、Ｃｈｅｎら２００２、Ｎａｋａｎｕｔａら２００５、Ｆｕら２００６、Ｍｅｕｒｅｒら２００５）。線維症の発達における別の重要な分子は、炎症性サイトカインの分泌の重要な調節因子であるが、酸化的ストレスに感受性であることも知られているＮＦ−κＢである。ＮＦ−κＢを活性化するほとんどの剤は、ＲＯＳ又はオキシダント自身によって調節される。抗酸化剤レズベラトロル（Ｃｈａｖｅｚら２００７）又はビタミンＥ（Ｌｉｕら１９９５）による治療が、四塩化炭素による実験的線維症齧歯動物で誘導されたＮＦ−κＢ上昇を軽減させたことが報告されている。]
[0012] ［００１２］酸化的ストレス及び炎症性応答は、癌の病因において互いに関係することも見出されている。酸化的ストレスはＤＮＡ突然変異を引き起こすことができ、そのいくつかは癌細胞の形成をもたらす。しかし、他の突然変異は細胞死をもたらし、炎症性応答を刺激する。次に、炎症性応答は癌細胞に生存シグナル及び増殖シグナルを提供するだけでなく、ＲＯＳの生成を誘導することもできる（Ｒａｋｏｆｆ−Ｎａｈｏｕｍ ２００６）。]
[0013] ［００１３］動物モデル及びヒトにおいて過剰の酸化的ストレスを軽減する一般手法として、食事からの抗酸化剤が広く使われている。例えば、レズベラトロルは様々な種の生存期間を延長すること、並びに高カロリー食を摂取するマウスの健康及び生存の改善に有効であることが示された（Ｂａｕｒら２００６）。]
[0014] ［００１４］今まで、天然又は合成の抗酸化剤を用いる、酸化的ストレス及び酸化的ストレスに関連する特定の疾患の有効な治療法の開発には、問題があった。天然の抗酸化剤の効力のためのストリンジェントな科学的証拠は、確立されていない（Ｄｒｏｇｅら２００１）。治療薬として天然の抗酸化剤を用いることの注目すべき限界のいくつかには、低効力及び代謝の間の速いターンオーバーが含まれる。対照的に、合成抗酸化剤の開発は、安全性への懸念によって阻害されてきた。しかし、この方向での多少の進捗が見られる。効力を高めるために、天然の抗酸化剤の改変を行った（Ｋｅｕｍら２００７）。さらに、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）及びカタラーゼの合成模倣剤が、虚血性疾患及びパーキンソン病の齧歯動物モデルで有効であることが示された（Ｐｅｎｇら２００５）。さらに心強いことに、ニトロン系のフリーラジカルトラップ剤のクラス、α−フェニル−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−ニトロン（ＰＢＮ）及び二ナトリウム２，４−ジスルホフェニル−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン（ＮＸＹ−０５９）は強力な神経保護剤であることが示され（Ｍａｐｌｅｓら２００４）、その抗炎症特性を通して肝細胞癌で抗癌活性を証明した（Ｆｌｏｙｄ ２００６）。]
[0015] ［００１５］本明細書で記載されるように、抗線維症剤又は抗癌剤を細胞に送達する方法であって、イミダゾリウム及びイミダゾリニウム塩を含むイミダゾリウム及びイミダゾリニウム化合物の有効量と、細胞を接触させることを含む方法が現在提供される。]
[0016] ［００１６］一態様では、一般式Ｉの化合物又はそのオリゴマー若しくはポリマー、又は薬学的に許容されるその塩の有効量と、細胞を接触させることを含む、抗線維症剤又は抗癌剤を細胞に送達する方法が提供される。]
[0017] 式中、破線は不在であるか、Ｒ１及びＲ３が結合する炭素とＲ２及びＲ４が結合する炭素との間で第２の結合を形成する結合として存在し、
Ｒ１及びＲ２は、
（ｉ）各々独立にＨ、直鎖若しくは分枝状のＣ１〜Ｃ６アルキル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルケニル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ６〜Ｃ１０アリールであるか、
（ｉｉ）それらの環原子と一緒に６〜１０員環の縮合した飽和、不飽和若しくは芳香族の環系を形成するか、
（ｉｉｉ）Ｒ１及びＲ５がそれらの環原子と一緒に、又はＲ２及びＲ６がそれらの環原子と一緒に、５〜１０員環の縮合した飽和、不飽和若しくは芳香族の環系を形成し、Ｒ１及びＲ２の他のものが前記（ｉ）で定義される通りであるか、又は、
（ｉｖ）Ｒ１及びＲ５がそれらの環原子と一緒に、並びにＲ２及びＲ６がそれらの環原子と一緒に各々５〜１０員環の縮合した飽和、不飽和若しくは芳香族の環系を形成し、
Ｒ３及びＲ４の両方がＨであるか、又は、Ｒ１及びＲ２がそれらの環原子と一緒に６〜１０員環の縮合芳香環系を形成する場合、若しくは破線が結合として存在する場合、Ｒ３及びＲ４が不在であり、
Ｒ５又はＲ６は、
（ｉ）Ｒ１及びＲ２について上で定義される通りであるか、又は
（ｉｉ）各々独立に直鎖若しくは分枝状のＣ１〜Ｃ６アルキル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルケニル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルキニル、縮合シクロアルキル環系を含むＣ３〜Ｃ１８シクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ６〜Ｃ１０アリール−Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール−Ｃ２〜Ｃ６アルケニル若しくはＣ６〜Ｃ１０アリール−Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル−Ｃ６〜Ｃ１０アリール若しくはＣ２〜Ｃ６アルキニル−Ｃ６〜Ｃ１０アリールであり、
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル又はハロであり、
その際、該当する場合、Ｒ１〜Ｒ７のいずれかは、１つ又は複数の炭素原子が、Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＰから選択されるヘテロ原子で任意選択で置き換えられ、且つ直鎖若しくは分枝状のＣ１〜Ｃ６アルキル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルケニル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルキニル、縮合シクロアルキル環系を含むＣ３〜Ｃ１８シクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、フルオロ、トリフルオロメチル、シアナト、イソシアナート、カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ６アシロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アシル、カルボニル、アミノ、アセチル、アセトキシ、オキソ、ニトロ、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ６アルキルカルボキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ２〜Ｃ６アルケノキシ、Ｃ２〜Ｃ６アルキノキシの１つ又は複数によって任意選択で置換され、
Ｒ１及びＲ５が結合する環炭素原子並びにＲ２及びＲ６が結合する環炭素の１つが窒素原子によって任意選択で置換される。]
[0018] ［００１７］一実施形態では、化合物はイミダゾリウム又はイミダゾリウム塩である。別の実施形態では、化合物はイミダゾリニウム又はイミダゾリニウム塩である。]
[0019] ［００１８］一実施形態では、Ｒ５はＲ６と同じである。別の実施形態では、Ｒ５及びＲ６は炭化水素である。]
[0020] ［００１９］特定の実施形態では、一般式Ｉの薬学的に許容される塩は、塩化物、臭化物、テトラフルオロホウ酸塩又はヘキサフルオロリン酸塩であってもよい。]
[0021] ［００２０］様々な実施形態において、化合物は１−エチル−３−メチルイミダゾリウム、１，３−ビスベンジルイミダゾリウム（又は１，３−ジベンジルイミダゾリウム）、１，３−ジイソプロピルイミダゾリウム、１，３−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルイミダゾリニウム、１，３−ビス（１−アダマンチル）イミダゾリウム、１，３−ビス（２，４，６−トリメチルフェニル）−イミダゾリニウム、１，３−ビス（２，６−ジイソプロピル−フェニル）−イミダゾリニウム、１，３−ジアリルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−メチルイミダゾリウム、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム、１−（１−アダマンチル）−３−（２，４，６−トリメチルフェニル）−４，５−ジヒドロイミダゾリウム、２−ベンジルイミダゾ［１，５−ａ］キノリニウム、１，３−ビス（１−アダマンチル）−ベンゾイミダゾリウム、１，３−ジシクロヘキシルベンゾイミダゾリウム、１，３−ジイソプロピルイミダゾリニウムテトラフルオロボレート、１，３−ジイソプロピルイミダゾリウム、２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−メチルイミダゾ［１，５−ａ］ピリジニウム、１−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−３−（２，４，６−トリメチルフェニル）−イミダゾリニウム、２−メシチル−５−メチルイミダゾ［１，５−ａ］ピリジニウム、２−メシチル−２，５，６，７−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアゾール−４−イウム、１，３−ビス（１−アダマンチル）イミダゾリニウム、１−ブチル−３−（２−ピリジニルメチル）−１Ｈ−イミダゾリウム、６，７−ジヒドロ−２−ペンタフルオロフェニル−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］−１，２，４−トリゾリウム、１−メチル−３−（２−ヒドロキシルエチル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−イソシアナトベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−カルボキシルベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（２，２−ジメトキシエチル）−イミダゾリウム、１−（２，４，６−トリメチルフェニル）−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１，３−ジベンジル−５−フェニルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−カルボキシルベンジル）−２−メチルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（３，４，５−トリメトキシベンジル）−２−メチルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテート−ベンジル）−２−メチル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルカルボキシレートベンジル）−２−メチル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（２，２−ジメトキシエチル）−２−メチル−イミダゾリウム、２，６−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウム）−ピリジン、２，２’−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウム）−１，１’−ビナフタレン、１−ベンジル−３−（４−メチルベンジル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（２−トリフルオロメチルベンジル）−２−メチルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルカルボキシレートベンジル）−５−フェニル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテートベンジル）−５−フェニル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルベンジル）−５−フェニルイミダゾリウム、（１，２−４，５−ジイミダゾリウム）−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラベンジル−ベンゼン、１−ベンジル−３−（２−プロピン−１−イル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（３−ヒドロキシル−プロピル）−イミダゾリウム、１，３−ジ（２−フェニルエチル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテートベンジル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（ピリジン−２−イル）−イミダゾリウム、１，３，５−トリス−（４−メチル−イミダゾリウム）−ｌｉｎｋｅｄシクロファン、１，３−ジベンジル−２−（１，３−ジベンジル−１Ｈ−イミダゾール−２（３Ｈ）−イリデン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール、１−ベンジル−３−メチル−イミダゾリウム、１−（４−シアナトベンジル）−３−メチル−イミダゾリウム、１−（４−カルボキシベンジル）−３−メチル−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（２，２−ジメトキシエチル）−イミダゾリウム、又は１−（２，４，６−トリメチルフェニル）−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、又は薬学的に許容されるその塩であってもよい。]
[0022] ［００２１］一実施形態では、化合物は一般式Ｉの構造を有する化合物の二量体である。例えば、化合物は１，３−ジベンジル−２−（１，３−ジベンジル−１Ｈ−イミダゾール−２（３Ｈ）−イリデン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール、（１，２−４，５−ジイミダゾリウム）−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラベンジル−ベンゼン、２，６−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウム）−ピリジン又は２，２’−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウム）−１，１’−ビナフタレン、又は薬学的に許容されるその塩であってもよい。]
[0023] ［００２２］別の実施形態では、化合物は一般式Ｉの構造を有する化合物の三量体である。例えば、化合物は１，３，５−トリス（４−メチル−イミダゾリウム）に連結しているシクロファン又は薬学的に許容されるその塩である。]
[0024] ［００２３］本方法の一実施形態では、細胞はインビトロであってもよい。]
[0025] ［００２４］別の実施形態では、細胞はインビボであってもよい。例えば、本方法は、線維症疾患の治療又は癌の治療のために対象に剤を投与することを含むことができる。特定の一実施形態では、線維症疾患は肝線維症であってもよく、化合物は、例えば３−ジイソプロピルイミダゾリウム又は薬学的に許容されるその塩であってもよい。他の実施形態では、癌は肝細胞癌、肺癌、乳癌、胃癌又は神経膠腫であってもよく、又は、化合物は、例えば３−ビスベンジルイミダゾリウム、３−ジベンジル−２−メチルイミダゾリウム、１−（２，４，６−トリメチルフェニル）−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテート−ベンジル）−２−メチル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルベンジル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（２−トリフルオロメチルベンジル）−２−メチルイミダゾリウム又は１，３−ジ（２−フェニルエチル）−イミダゾリウム、又は薬学的に許容されるその塩であってもよい。]
[0026] ［００２５］別の態様では、インビボで細胞に抗線維症剤又は抗癌剤を送達するための、一般式Ｉの構造を有する化合物又はそのオリゴマー若しくはポリマーの使用が提供される。]
[0027] ［００２６］別の態様では、インビボで細胞に抗線維症剤又は抗癌剤を送達するための医薬の製造における、一般式Ｉの構造を有する化合物又はそのオリゴマー若しくはポリマーの使用が提供される。]
[0028] ［００２７］本明細書で記載される使用の一実施形態では、化合物はイミダゾリウム又はイミダゾリウム塩である。別の実施形態では、化合物はイミダゾリニウム又はイミダゾリニウム塩である。]
[0029] ［００２８］他の実施形態では、Ｒ５はＲ６と同じである。別の実施形態では、Ｒ５及びＲ６は炭化水素である。]
[0030] ［００２９］特定の実施形態では、一般式Ｉの薬学的に許容される塩は、塩化物、臭化物、テトラフルオロホウ酸又はヘキサフルオロリン酸塩であってもよい。]
[0031] ［００３０］本使用の様々な実施形態では、化合物は１−エチル−３−メチルイミダゾリウム、１，３−ビスベンジルイミダゾリウム、１，３−ジイソプロピルイミダゾリウム、１，３−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルイミダゾリニウム、１，３−ビス（１−アダマンチル）イミダゾリウム、１，３−ビス（２，４，６−トリメチルフェニル）−イミダゾリニウム、１，３−ビス（２，６−ジイソプロピル−フェニル）−イミダゾリニウム、１，３−ジアリルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−メチルイミダゾリウム、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム、１−（１−アダマンチル）−３−（２，４，６−トリメチルフェニル）−４，５−ジヒドロイミダゾリウム、２−ベンジルイミダゾ［１，５−ａ］キノリニウム、１，３−ビス（１−アダマンチル）−ベンゾイミダゾリウム、１，３−ジシクロヘキシルベンゾイミダゾリウム、１，３−ジイソプロピルイミダゾリニウムテトラフルオロボレート、１，３−ジイソプロピルイミダゾリウム、２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−メチルイミダゾ［１，５−ａ］ピリジニウム、１−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−３−（２，４，６−トリメチルフェニル）−イミダゾリニウム、２−メシチル−５−メチルイミダゾ［１，５−ａ］ピリジニウム、２−メシチル−２，５，６，７−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアゾール−４−イウム、１，３−ビス（１−アダマンチル）イミダゾリニウム、１−ブチル−３−（２−ピリジニルメチル）−１Ｈ−イミダゾリウム、６，７−ジヒドロ−２−ペンタフルオロフネイル−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］−１，２，４−トリゾリウム、１−メチル−３−（２−ヒドロキシルエチル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−イソシアナトベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−カルボキシルベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（２，２−ジメトキシエチル）−イミダゾリウム、１−（２，４，６−トリメチルフェニル）−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１，３−ジベンジル−５−フェニルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−カルボキシルベンジル）−２−メチルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（３，４，５−トリメトキシベンジル）−２−メチルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテート−ベンジル）−２−メチル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルカルボキシレートベンジル）−２−メチル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（２，２−ジメトキシエチル）−２−メチル−イミダゾリウム、２，６−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウム）−ピリジン、２，２’−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウム）−１，１’−ビナフタレン、１−ベンジル−３−（４−メチルベンジル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（２−トリフルオロメチルベンジル）−２−メチルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルカルボキシレートベンジル）−５−フェニル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテートベンジル）−５−フェニル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルベンジル）−５−フェニルイミダゾリウム、（１，２−４，５−ジイミダゾリウム）−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラベンジル−ベンゼン、１−ベンジル−３−（２−プロピン−１−イル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（３−ヒドロキシル−プロピル）−イミダゾリウム、１，３−ジ（２−フェニルエチル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテートベンジル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（ピリジン−２−イル）−イミダゾリウム、１，３，５−トリス−（４−メチル−イミダゾリウム）−ｌｉｎｋｅｄシクロファン、１，３−ジベンジル−２−（１，３−ジベンジル−１Ｈ−イミダゾール−２（３Ｈ）−イリデン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール、１−ベンジル−３−メチル−イミダゾリウム、１−（４−シアナトベンジル）−３−メチル−イミダゾリウム、１−（４−カルボキシベンジル）−３−メチル−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（２，２−ジメトキシエチル）−イミダゾリウム、又は１−（２，４，６−トリメチルフェニル）−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、又は薬学的に許容されるその塩であってもよい。]
[0032] ［００３１］一実施形態では、化合物は一般式Ｉの構造を有する化合物の二量体である。例えば、化合物は１，３−ジベンジル−２−（１，３−ジベンジル−１Ｈ−イミダゾール−２（３Ｈ）−イリデン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール、（１，２−４，５−ジイミダゾリウム）−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラベンジル−ベンゼン、２，６−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウム）−ピリジン又は２，２’−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウム）−１，１’−ビナフタレン、又は薬学的に許容されるその塩であってもよい。]
[0033] ［００３２］別の実施形態では、化合物は一般式Ｉの構造を有する化合物の三量体である。例えば、化合物は１，３，５−トリス（４−メチル−イミダゾリウム）に連結しているシクロファン又は薬学的に許容されるその塩である。]
[0034] ［００３３］本使用の一実施形態では、抗線維症剤は線維症疾患の治療のために送達される。特定の実施形態では、線維症疾患は肝線維症であってもよく、化合物は、例えば１，３−ジイソプロピルイミダゾリウム又は薬学的に許容されるその塩であってもよい。]
[0035] ［００３４］本使用の別の実施形態では、抗癌剤は癌の治療のために送達される。様々な実施形態で、癌は肝細胞癌、肺癌、乳癌、胃癌又は神経膠腫であってもよく、化合物は、例えば３−ビスベンジルイミダゾリウム、３−ジベンジル−２−メチルイミダゾリウム、１−（２，４，６−トリメチルフェニル）−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテート−ベンジル）−２−メチル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルベンジル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（２−トリフルオロメチルベンジル）−２−メチルイミダゾリウム又は１，３−ジ（２−フェニルエチル）−イミダゾリウム、又は薬学的に許容されるその塩であってもよい。]
[0036] ［００３５］別の態様では、１−エチル−３−メチルイミダゾリウム、１−メチル−３−（２−ヒドロキシルエチル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−イソシアナトベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−カルボキシルベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（２，２−ジメトキシエチル）−イミダゾリウム、１−（２，４，６−トリメチルフェニル）−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１，３−ジベンジル−５−フェニルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−カルボキシルベンジル）−２−メチルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（３，４，５−トリメトキシベンジル）−２−メチルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテート−ベンジル）−２−メチル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルカルボキシレートベンジル）−２−メチル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（２，２−ジメトキシエチル）−２−メチル−イミダゾリウム、２，６−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウム）−ピリジン、２，２’−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウム）−１，１’−ビナフタレン、１−ベンジル−３−（４−メチルベンジル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（２−トリフルオロメチルベンジル）−２−メチルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルカルボキシレートベンジル）−５−フェニル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテートベンジル）−５−フェニル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルベンジル）−５−フェニルイミダゾリウム、（１，２−４，５−ジイミダゾリウム）−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラベンジル−ベンゼン、１−ベンジル−３−（２−プロピン−１−イル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（３−ヒドロキシル−プロピル）−イミダゾリウム、１，３−ジ（２−フェニルエチル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテートベンジル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（ピリジン−２−イル）−イミダゾリウム、１，３，５−トリス−（４−メチル−イミダゾリウム）−ｌｉｎｋｅｄシクロファン、１，３−ジベンジル−２−（１，３−ジベンジル−１Ｈ−イミダゾール−２（３Ｈ）−イリデン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール、１−ベンジル−３−メチル−イミダゾリウム、１−（４−シアナトベンジル）−３−メチル−イミダゾリウム、１−（４−カルボキシベンジル）−３−メチル−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（２，２−ジメトキシエチル）−イミダゾリウム、又は１−（２，４，６−トリメチルフェニル）−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、又は薬学的に許容されるその塩であるイミダゾリウム又はイミダゾリニウムである化合物が提供される。]
[0037] ［００３６］本発明の他の態様及び特徴は、付随する図面と合わせて本発明の具体的な実施形態の以下の記載の精査により、当分野の技術者に明らかになる。]
図面の簡単な説明

[0038] 本発明の実施形態を例としてだけ例示する図面。
ＤＢＺＩＭの細胞毒性。ＨＳＣ Ｔ６細胞を９６ウェルプレートに１ウェルにつき５０００個の細胞の密度で播種し、１０％ＦＢＳＤＭＥＭで１８〜２４時間培養した後に、アッセイの前に４８時間の増殖のために１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ中の様々な化合物（０〜４００μＭ）を添加した。シグナルは、媒体対照処理（０μＭの化合物）に対して正規化した。データは４つの独立した実験から得、平均値及び標準誤差又は平均値（ＳＥＭ）で示した、＊ａ Ｐ＜０．０５、＊ｂ Ｐ＜０．０１及び＊ｃ Ｐ＜０．００５。
ＴＤＢＺＩＭの細胞毒性。
ＤＢＺＩＭは細胞ＲＯＳレベルを減弱させた。ＨＳＣ Ｔ６細胞をＤＢＺＩＭ（１０、５０、１００及び３００μＭ）、ＴＤＢＺＩＭ（１０、５０及び１００μＭ）、ＮＡＣ（１ｍＭ）及びＥＧＣＧ（２５μＭ）と４８時間インキュベートした後に、細胞ＲＯＳレベルについて試験した。データは、媒体対照に対する正規化の後に、相対値として示した。データは、媒体対照と比較した平均値及びＳＥＭで示した、Ｎ＝６、＊ｂ Ｐ＜０．０１、＊ｃ Ｐ＜０．００５及び＊ｄ Ｐ＜０．０００５。
ＴＤＢＺＩＭは細胞ＲＯＳレベルを減弱させた。
ＧＳＨの量に対するＤＢＺＩＭ及びＴＤＢＺＩＭの効果。ＤＢＺＩＭは総細胞ＧＳＨ量を減弱させた。ＨＳＣ−Ｔ６細胞を様々な濃度の化合物と４８時間インキュベートし、ＧＳＨ及びＧＳＳＧの総量について試験した。ＧＳＨ／ＧＳＳＧ比は、（ＧＳＨ−ＧＳＳＧ）／ＧＳＳＧとして計算した。ＧＳＨ及びＧＳＳＧの量を、総タンパクに対して正規化した。ＤＢＺＩＭはＤＭＳＯに溶解し、ＴＤＢＺＩＭはＨ２Ｏに溶解した点に注意する。データは、媒体対照と比較した平均値及びＳＥＭで示した、Ｎ＝６、＊ａ Ｐ＜０．０５、＊ｂ Ｐ＜０．０１、＊ｃ Ｐ＜０．００５及び＊ｄ Ｐ＜０．０００５。
ＴＤＢＺＩＭは総ＧＳＨを変化させなかった。
ＤＢＺＩＭは、細胞のＧＳＳＧ（ＧＳＨの酸化生成物）を抑制した。
ＴＤＢＺＩＭは、細胞のＧＳＳＧ（ＧＳＨの酸化生成物）を抑制した。
ＤＢＺＩＭは、ＧＳＨ／ＧＳＳＧ比を高めた。
ＴＤＢＺＩＭは、ＧＳＨ／ＧＳＳＧ比を高めた。
ＧＰｘ、ＣＡＴ、ＳＯＤ及びＧＳＴに対するＤＢＺＩＭ及びＴＤＢＺＩＭの効果。ＤＢＺＩＭは、ＧＰｘ活性に用量依存的に影響を及ぼした。ＨＳＣ Ｔ６細胞を様々な濃度の化合物で４８時間処理し、ＧＰｘ、ＧＳＴ及びＣＡＴアッセイについてはＰＢＳ（ｐＨ７．４、１ｍＭのＥＤＴＡ）中で、又はＳＯＤアッセイについては１ｍＭのＥＧＴＡ、２１０ｍＭのマンニトール及び７０ｍＭのショ糖を含有する２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中で、超音波処理（６０％の周波数で３０秒間）によってホモジナイズした。酵素活性は、総タンパクに対して正規化した。ＤＢＺＩＭはＤＭＳＯに溶解し、ＴＤＢＺＩＭはＨ２Ｏに溶解した。データは、媒体対照と比較した平均値及びＳＥＭで示した、Ｎ＝６、＊ａ Ｐ＜０．０５、＊ｂ Ｐ＜０．０１、＊ｃ Ｐ＜０．００５及び＊ｄ Ｐ＜０．０００５。
ＴＤＢＺＩＭは、ＧＰｘ活性を抑制した。
ＤＢＺＩＭは、ＣＡＴ活性に用量依存的に影響を及ぼした。
ＴＤＢＺＩＭは、ＣＡＴ活性を抑制した。
ＤＢＺＩＭは、ＳＯＤ活性にほとんど影響を及ぼさなかった。
ＴＤＢＺＩＭは、ＳＯＤ活性にほとんど影響を及ぼさなかった。
ＤＢＺＩＭは、ＧＳＴ活性を誘導した。
ＤＢＺＩＭ及びＴＤＢＺＩＭは、０．２％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯによって誘導された酸化的ストレスから一次ＨＳＣ細胞を保護した。ＩＭＳで２６及び９３時間処理した細胞の光学像。スケールバー＝６０μｍ。
０．２％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯは、総ＧＳＨレベルを減少させることによって、酸化的ストレスを誘導した。データは、未処理試料と比較した平均値及びＳＥＭで示した、Ｎ＝６、＊ｃ Ｐ＜０．００５及び＊ｄ Ｐ＜０．０００５。
０．２％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯは、ＧＳＳＧレベルを誘導することによって、酸化的ストレスを誘導した。
０．２％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯは、ＧＳＨ／ＧＳＳＧ比を低下させることによって、酸化的ストレスを誘導した。
０．２％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯは、ＧＰＸ活性レベルを誘導することによって、酸化的ストレスを誘導した。
０．２％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯは、ＣＡＴ活性レベルを誘導することによって、酸化的ストレスを誘導した。
０．２％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯは、ＳＯＤ活性レベルを誘導することによって、酸化的ストレスを誘導した。
ＤＢＺＩＭは、ＨＳＣ活性化マーカー（ＧＦＡＰ及びＳＭＡＡ）及び線維症エンドポイント（ｃｏｌ１ａ１及びフィブロネクチン）のｍＲＮＡ発現を用量依存的に抑制した。ＨＳＣ Ｔ６細胞をＤＢＺＩＭ（１、１０、１００及び３００μＭ）及びＴＤＢＺＩＭ（１、１０及び１００μＭ）で４８時間処理した。正規化遺伝子としてβ−アクチンを用いた。その発現レベルは、実験条件下で一定であった。媒体対照試料をキャリブレータとして、ΔΔＣｔ法を相対的な定量化のために用いた。データは、媒体対照と比較した平均値及びＳＥＭで示した、Ｎ＝６、＊ａ Ｐ＜０．０５、＊ｂ Ｐ＜０．０１、＊ｃ Ｐ＜０．００５及び＊ｄ Ｐ＜０．０００５。
ＴＤＢＺＩＭは、ＨＳＣ活性化マーカー（ＧＦＡＰ及びＳＭＡＡ）及び線維症エンドポイント（ｃｏｌ１ａ１及びフィブロネクチン）のｍＲＮＡ発現を用量依存的に抑制した。
ＤＢＺＩＭ（１００μＭ）及びＴＤＢＺＩＭ（１００μＭ）は、ＧＦＡＰのｍＲＮＡ発現を時間依存的に抑制した。ＨＳＣ Ｔ６細胞をＤＢＺＩＭ及びＴＤＢＺＩＭで処理し、８、２４及び４８時間の後に試験した。ＴＤＢＺＩＭについて、ＳＭＡＡ発現の一時的上昇が２４時間後に観察された。β−アクチンハウスキーピング遺伝子及び媒体対照試料に正規化することによってΔΔＣｔ法を用いてｍＲＮＡ発現を計算し、媒体対照と比較した平均値及びＳＥＭにより相対的な定量データで示した、Ｎ＝６、＊ａ Ｐ＜０．０５、＊ｂ Ｐ＜０．０１、＊ｃ Ｐ＜０．００５及び＊ｄ Ｐ＜０．０００５。
ＤＢＺＩＭ（１００μＭ）及びＴＤＢＺＩＭ（１００μＭ）は、ＳＭＡＡのｍＲＮＡ発現を時間依存的に抑制した。
ＤＢＺＩＭ（１００μＭ）及びＴＤＢＺＩＭ（１００μＭ）は、ｃｏｌ１ａ１のｍＲＮＡ発現を時間依存的に抑制した。
ＤＢＺＩＭ（１００μＭ）及びＴＤＢＺＩＭ（１００μＭ）は、フィブロネクチンのｍＲＮＡ発現を時間依存的に抑制した。
ＤＢＺＩＭ（１００μＭ）及びＴＤＢＺＩＭ（５０μＭ）で４８時間処理したＨＳＣ Ｔ６細胞におけるｃｏｌ１ａ１、フィブロネクチン、ＧＦＡＰ及びＳＭＡＡタンパク質発現のウェスタンブロット法。ｃｏｌ１ａ１及びフィブロネクチンについては３〜８％のトリス−アセテートゲルに、ＧＦＡＰ及びＳＭＡＡについては４〜１２％勾配のＰＡＧＥ−ＳＤＳゲルに１５μｇの総タンパクを溶解した。標的タンパク質をそれぞれの抗体によって認識して、ＥＣＬ法によって視覚化した。膜を剥離し、負荷対照としてα−チューブリンを再精査した。
ＤＢＺＩＭ及びＴＤＢＺＩＭは、ＴＧＦ−β１ｍＲＮＡを抑制した。ＨＳＣ Ｔ６細胞を、用量依存性試験についてはＤＢＺＩＭ（１、１０、１００及び３００μＭ）と４８時間インキュベートした。ＴＧＦ−β１ ｍＲＮＡの発現レベルを、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで定量した。データは、媒体対照と比較した平均値及びＳＥＭで示した、Ｎ＝６、＊ａ Ｐ＜０．０５、＊ｂ Ｐ＜０．０１、＊ｃ Ｐ＜０．００５。
ＨＳＣ Ｔ６細胞を、用量依存性試験についてはＴＤＢＺＩＭ（１、１０及び１００μＭ）と４８時間インキュベートした。
ＨＳＣ Ｔ６細胞を、時間依存性試験についてはＤＢＺＩＭ（１００μＭ）及びＴＤＢＺＩＭ（１００μＭ）と８、２４及び４８時間インキュベートした。
ＤＢＺＩＭ及びＴＤＢＺＩＭは、ＩＬ−６ ｍＲＮＡを抑制した。ＨＳＣ Ｔ６細胞を、用量依存性試験についてはＤＢＺＩＭ（１、１０、１００及び３００μＭ）と４８時間インキュベートした。ＩＬ−６ ｍＲＮＡの発現レベルを、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで定量した。データは、媒体対照と比較した平均値及びＳＥＭで示した、Ｎ＝６、＊ｂ Ｐ＜０．０１、＊ｃ Ｐ＜０．００５及び＊ｄ Ｐ＜０．０００５。
ＨＳＣ Ｔ６細胞を、用量依存性試験についてはＴＤＢＺＩＭ（１、１０及び１００μＭ）と４８時間インキュベートした。
ＨＳＣ Ｔ６細胞を、時間依存性試験についてはＤＢＺＩＭ（１００μＭ）及びＴＤＢＺＩＭ（１００μＭ）と８、２４及び４８時間インキュベートした。
ＤＢＺＩＭ（１００μＭ）及びＴＤＢＺＩＭ（５０μＭ）で４８時間処理したＨＳＣ Ｔ６細胞におけるＮＦ−κＢ及びＡＰ−１（ｃ−Ｆｏｓ、ＪｕｎＤ及びＦｒａ−１）タンパク質発現のウェスタンブロット法。１５μｇの核タンパク質を、４〜１２％勾配のＰＡＧＥ−ＳＤＳゲルに溶解した。標的タンパク質をそれぞれの抗体によって認識して、ＥＣＬ法によって視覚化した。膜を剥離し、負荷対照として用いたＴａｔａ結合性タンパク質ＴＢＰを精査した。
β−ガラクトシダーゼ活性によって報告されるように、ＤＢＺＩＭはＧＦＡＰ−ＬａｃＺ導入遺伝子を減弱させた。安定してトランスフェクトされたＴ６ ＧＦＡＰ−ＬａｃＺ細胞を１〜３００μＭ濃度の化合物で処理し、２４時間及び４８時間後に試験した。β−ガラクトシダーゼ活性を総タンパクに正規化し、媒体対照と比較した後に相対値として示した。データは、媒体対照と比較した平均値及びＳＥＭで示した、Ｎ＝６、＊ｃ Ｐ＜０．００５及び＊ｄ Ｐ＜０．０００５。
β−ガラクトシダーゼ活性によって報告されるように、ＴＤＢＺＩＭはＧＦＡＰ−ＬａｃＺ導入遺伝子を減弱させた。
様々なＩＭＳで４８時間処理したＨＳＣ Ｔ６細胞におけるＳＭＡＡ、ｃｏｌ１ａ１、フィブロネクチン、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦβＲＩタンパク質発現のウェスタンブロット法。ＤＢＩＭ（１ｍＭ）、ＡＭＩＭ（５０μＭ）、ＴＭＰＨＩＭ（５０μＭ）、ＤＰＰＨＩＭ（１０μＭ）及びＤＢＺＢＩＭ（１００μＭ）を、０．２％（ｖ／ｖ）の最終ＤＭＳＯ濃度でＤＭＳＯに溶解した。ＤＰＩＭ（２ｍＭ）、ＥＧＣＧ（２５μＭ）及びＤＢＺＩＭ（１００μＭ）は、Ｈ２Ｏに溶解した。αチューブリンを、負荷対照として用いた。タンパク質バンド強度の濃度測定は、それぞれの媒体対照に対して正規化した。
タンパク質バンド強度の相対的な濃度測定定量化。媒体処理試料を、１に正規化した。
様々なＩＭＳで４８時間処理したＨＳＣ Ｔ６細胞におけるＧＦＡＰのｍＲＮＡ発現のリアルタイムＰＣＲ定量。ＤＢＩＭ（１ｍＭ）、ＡＭＩＭ（５０μＭ）、ＴＭＰＨＩＭ（５０μＭ）、ＤＰＰＨＩＭ（１０μＭ）及びＤＢＺＢＩＭ（１００μＭ）を、０．２％（ｖ／ｖ）の最終ＤＭＳＯ濃度でＤＭＳＯに溶解した。ＤＰＩＭ（２ｍＭ）、ＥＧＣＧ（２５μＭ）及びＤＢＺＩＭ（１００μＭ）は、Ｈ２Ｏに溶解した。正規化遺伝子としてβ−アクチンを用いた。その発現は、実験条件下で一定であった。相対的定量を、それぞれの媒体対照に対して正規化した。データは、媒体対照と比較した平均値及びＳＥＭで示した、Ｎ＝６、＊ａ Ｐ＜０．０５、＊ｃ Ｐ＜０．００５及び＊ｄ Ｐ＜０．０００５。
様々なＩＭＳで４８時間処理したＨＳＣ Ｔ６細胞におけるＳＭＡＡのｍＲＮＡ発現のリアルタイムＰＣＲ定量。
様々なＩＭＳで４８時間処理したＨＳＣ Ｔ６細胞におけるフィブロネクチンのｍＲＮＡ発現のリアルタイムＰＣＲ定量。
様々なＩＭＳで４８時間処理したＨＳＣ Ｔ６細胞におけるｃｏｌ１ａ１のｍＲＮＡ発現のリアルタイムＰＣＲ定量。
マウスの肝臓線維症に対するＤＢＺＩＭ及びＤＰＩＭの効果。肝臓毒素チオアセタミド（ＴＡＡ）によって誘導したマウスで、ＤＢＺＩＭを試験した。ＤＢＺＩＭはＴＡＡモデル（５００ｍｇ／Ｌ、１２週間）及びＢＤＬモデル（１０ｍｇ／Ｌ、４週間）において線維症を減弱させたが、ＤＰＩＭはＢＤＬモデルにおいて１ｇ／Ｌ（４週間）でその効果を示した。
胆管結紮（ＢＤＬ）によって誘導したマウスで、ＤＢＺＩＭを試験した。
ＤＰＩＭは、ＴＡＡ（データ示さず）又は胆管結紮（ＢＤＬ）によって誘導したマウスでも試験した。
異なるＤＰＩＭ化合物で処理された群のマウスからの肝臓切片におけるシリウスレッド染色像の代表。群に１匹のマウスだけが含まれた５００ｍｇ／ｌ処理群を除いて、各処理群には６〜８匹のマウスが含まれた。赤色染色領域は、コラーゲン沈着を表す。（Ａ）疑似手術、（Ｂ）疑似手術＋ＤＰＩＭ １ｇ／ｌ ４週間、（Ｃ）ＢＤＬ ４週間、（Ｄ）ＢＤＬ ４週間＋５００ｍｇ／ｌ ＤＰＩＭ処理、（Ｅ）ＢＤＬ ４週間＋７５０ｍｇ／ｌ ＤＰＩＭ処理、（Ｆ）ＢＤＬ ４週間＋１ｇ／ｌ ＤＰＩＭ処理。
シリウスレッド染色領域の割合。異なる処理群マウスからのシリウスレッド染色領域は画像Ｊソフトウェアで定量化し、各マウスの肝臓の左葉及び中央葉からの少なくとも６つの異なる領域が含まれた。＊Ｐ＜０．０５、ＢＤＬ対ＤＰＩＭ処理群、＃Ｐ＜０．０５、７５０ｍｇ／ｌ対１ｇ／ｌの処理群。
異なる処理群の肝臓重量。各群は、手術処置の開始時に１０〜１２週齢であった６〜８匹のマウスからなった。＊Ｐ＜０．０５、疑似手術対照群対ＢＤＬ ４週間、＊＊Ｐ＜０．０５、ＤＰＩＭ化合物処理群対ＢＤＬ週群、＃Ｐ＜０．０５、７５０ｍｇ／ｌ ＤＰＩＭ処理群対１ｇ／ｌ ＤＰＩＭ処理群。
肝臓切片のＨ＆Ｅ染色の代表的な像。（Ａ）対照群、（Ｂ）ＢＤＬ ４週間群、及び（Ｃ）ＢＤＬ ４週間＋ＤＰＩＭ １ｇ／ｌ処理群。
コラーゲン１ａ１ ｍＲＮＡの定量リアルタイムＰＣＲ。ＤＰＩＭは、コラーゲン１ａ１ ｍＲＮＡを減少させた。
ＤＢＺＩＭはＨＬＥ細胞の細胞増殖を阻害し、細胞周期を破壊した。ＤＢＺＩＭはＨＬＥ細胞の細胞増殖を阻害し、細胞周期を破壊した。ＤＢＺＩＭは、ＨＣＣ細胞増殖を阻害した。ＨＬＥ細胞を９６ウェルプレートに１ウェルにつき５０００個の細胞の密度で播種し、１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭで１８〜２４時間培養した後に、アッセイの前に４８時間の増殖のために１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ中の様々な化合物（０〜１．２５ｍＭ）を添加した。細胞数はヘキスト色素染色に基づいて計算し、ＢｒｄＵ取込みは抗体染色の総蛍光強度に基づいた。
ＤＢＺＩＭは、Ｇ０／Ｇ１期のＨＣＣ細胞を停止した。ＨＬＥ細胞をＤＢＺＩＭ（０、１、３ｍＭ）と２４時間インキュベートした後に、ＤＮＡ含量（２Ｎ対４Ｎ）の判定のために固定及びＤＡＰＩ染色した。
ＤＢＺＩＭはＨＬＥ細胞でカスパーゼ３／７活性を誘導した。ＨＬＥ又はＨｅｐＧ２細胞を様々な濃度のＤＢＺＩＭと６時間インキュベートし、カスパーゼ３／７活性及びＬＤＨ放出（毒性割合で表した）を試験した。散布図及びヒストグラムは細胞集団分布に関する代表的な情報を与えたが、棒グラフはヒストグラムからアポトーシス細胞の割合を定量化した。ＨＬＥ及びＨｅｐＧ２細胞を様々な濃度のＤＢＺＩＭによって２４時間処理した後に、アネキシンＶ染色及びフローサイトメトリー分析のために収集した。
ＤＢＺＩＭはＨＬＥでＬＤＨ放出を引き起こさなかった。
ＤＢＺＩＭはＨｅｐＧ２でカスパーゼ３／７活性を誘導した。
ＤＢＺＩＭはＨｅｐＧ２でＬＤＨ放出を引き起こさなかった。
ＨＬＥでフローサイトメータを用いてアネキシンＶ染色によって特徴づけられたように、ＤＢＺＩＭはアポトーシスを誘導した。
ＨｅｐＧ２でフローサイトメータを用いてアネキシンＶ染色によって特徴づけられたように、ＤＢＺＩＭはアポトーシスを誘導した。
ＤＢＺＩＭはＨＬＥ細胞でカスパーゼ８活性を変化させず、カスパーゼ９及び３活性を誘導した。ＨＬＥ細胞をＴ７５フラスコ中で増殖させ、ＤＢＺＩＭで２４時間処理した。次に細胞を溶解し、Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎからのキットを用いてカスパーゼ８、９及び３を試験するために細胞質タンパク質を収集した。データを、媒体対照に対して正規化した。
ＤＢＺＩＭは、ミトコンドリアからサイトゾルへのチトクロームｃの放出を引き起こさなかった。ＨＬＥ細胞を１．５ｍＭのＤＢＺＩＭによって２４時間処理した。サイトゾル及びミトコンドリアのタンパク質分画を、Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎからのキットを用いて収集した。１５μｇの各タンパク質を、４〜１２％勾配のＰＡＧＥ−ＳＤＳゲルに溶解した。標的タンパク質をチトクロームＣの抗体によって認識して、ＥＣＬ法によって視覚化した。膜を剥離し、サイトゾル分画については負荷対照としてα−チューブリンを、ミトコンドリア分画についてはＣｏｘ４を精査した。
ＤＢＺＩＭは、Ｂｃｌ−２及びＩＡＰタンパク質発現に影響を及ぼした。ＨｅｐＧ２細胞をＤＢＺＩＭ（０、０．５、１．０、１．５及び２．０ｍＭ）で２４時間処理した。総タンパクは、ＲＩＰＡ緩衝剤を用いて収集した。１５μｇの総タンパク質を、４〜１２％勾配のＰＡＧＥ−ＳＤＳゲルに溶解した。標的タンパク質をそれぞれの抗体によって認識して、ＥＣＬ法によって視覚化した。膜を剥離し、負荷対照としてα−チューブリンを精査した。
ＤＢＺＩＭは、サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）タンパク質の核から細胞質への転位を誘導した。ＤＢＺＩＭ（０及び１．０ｍＭ）によって２４時間処理されたＨＬＥ細胞の代表的な免疫細胞染色像。矢印は、それぞれ対照及びＤＢＺＩＭ処理細胞の核におけるサバイビンの蓄積及び消滅を示す。像は、ＡｒｒａｙＳｃａｎＶＴＩ ＨＣＳリーダー（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰＡ、ＵＳＡ）及びＴａｒｇｅｔ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ＢｉｏＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎソフトウェアを用いて獲得し、分析した。
転位事象の定量化。細胞を９６ウェルプレートで増殖させ、様々な濃度のＤＢＺＩＭによって２４時間処理した後、サバイビンのための固定及び免疫細胞染色を行った。「細胞質−核差」のより低い値は、細胞質サバイビンのより低い量を示した。
ＤＢＺＩＭは、細胞質から核へのＡＩＦの転位を誘導した。ＤＢＺＩＭは、ＡＩＦを細胞質から核に転位させた。ＨｅｐＧ２細胞をＤＢＺＩＭによって２４時間処理した。Ｐｉｅｒｃｅからのキットを用いて、細胞質及び核のタンパク質を分画した。１５μｇのタンパク質を、４〜１２％勾配のＰＡＧＥ−ＳＤＳゲルに溶解した。標的タンパク質をＡＩＦの抗体によって認識し、ＥＣＬ法によって視覚化した。膜を剥離し、細胞質分画につては負荷対照としてα−チューブリンを、核タンパク質についてはＴａｔａ結合性タンパク質ＴＢＰを再精査した。
ＨＬＥ細胞を９６ウェルプレートで増殖させ、ＤＢＺＩＭで２４時間処理した。次に細胞を固定し、ＡＩＦの抗体によって染色した。像は、ＡｒｒａｙＳｃａｎ ＶＴＩ ＨＣＳリーダー（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰＡ、ＵＳＡ）及びＴａｒｇｅｔ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ＢｉｏＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎソフトウェアを用いて獲得し、分析した。矢印は、それぞれ対照及びＤＢＺＩＭにおけるＡＩＦ染色の細胞質及び核の位置を示す。
異なる細胞下区画におけるＡＩＦ染色の定量化。「細胞質−核差」のより高い値は、より高い核ＡＩＦを示した。
高用量ＤＢＺＩＭは、ＨＬＥ細胞でＲＯＳ生成を誘導した。ＨＬＥ細胞を９６−ウェルプレートで増殖させ、ＤＢＺＩＭで２４時間処理した。次に細胞を固定し、ＲＯＳ生成の定量化のためにＤＨＥによって染色した。像は、ＡｒｒａｙＳｃａｎ ＶＴＩ ＨＣＳリーダー（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰＡ、ＵＳＡ）及びＴａｒｇｅｔ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ＢｉｏＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎソフトウェアを用いて獲得し、分析した。
ＤＢＺＩＭは、ＨｅｐＧ２細胞でＡＰ−１発現の上方制御を誘導した。ＨｅｐＧ２細胞をＤＢＺＩＭで２４時間処理した。Ｐｉｅｒｃｅからのキットを用いて、細胞質及び核のタンパク質を分画した。１５μｇの核タンパク質を、４〜１２％勾配のＰＡＧＥ−ＳＤＳゲルに溶解した。標的タンパク質をそれらのそれぞれの抗体によって認識し、ＥＣＬ法によって視覚化した。膜を剥離し、負荷対照としてＴａｔａ結合性タンパク質ＴＢＰを再精査した。
ＤＭＺＩＭは、アポトーシスを誘導した。位相差顕微鏡法からの画像は、ＤＢＺＩＭに７２時間曝露させた後の、胃癌細胞ＡＧＳのアポトーシス形態を示す。曝露時間の延長は、細胞培養でのアポトーシス細胞による集密度の喪失の増加を引き起こした。
位相差顕微鏡法からの画像は、ＤＢＺＩＭに７２時間曝露させた後の、肺癌細胞Ｈ１２９９のアポトーシス形態を示す。
ＤＢＺＩＭは、グリオーマ細胞株Ｃ６で細胞増殖を阻害した。増殖アッセイのためにＣ６又はＵ８７細胞を様々な濃度のＤＢＺＩＭと４８時間、カスパーゼ３／７活性化アッセイのために６時間インキュベートした。ＰｒｏｍｅｇａからのＭＴＳキットを用いて増殖を測定し、対照群を１に正規化して相対的な細胞増殖で表した。Ｐｒｏｍｅｇａからのキットを用いてカスパーゼ３／７活性を定量化し、同様に対照群に対する処理群の相対的カスパーゼ３／７活性で表した。
ＤＢＺＩＭは、Ｃ６でカスパーゼ３／７活性を誘導した。
ＤＢＺＩＭは、Ｕ８７ ＭＧで細胞増殖を阻害した。
ＤＢＺＩＭは、Ｕ８７ ＭＧでカスパーゼ３／７活性を誘導した。
ＤＢＺＩＭは、アポトーシスの指標として、カスパーゼ−３、カスパーゼ−９及びＰＡＲＰの切断を誘導する。ｐ５３野生型胃癌細胞ＡＧＳにおける、カスパーゼ−３、カスパーゼ−９及びＰＡＲＰの切断に及ぼすＤＢＺＩＭの影響のウェスタンブロット分析。５０μＭのＤＢＺＩＭへの７２時間の曝露の後の細胞で実行されたウェスタンブロット分析。
ｐ５３野生型乳癌細胞株ＭＣＦ−７における、カスパーゼ−３、カスパーゼ−９及びＰＡＲＰの切断に及ぼすＤＢＺＩＭの影響のウェスタンブロット分析。５０μＭのＤＢＺＩＭへの７２時間の曝露の後の細胞で実行されたウェスタンブロット分析。
ＤＢＺＩＭは、Ａｋｔのリン酸化を阻害する。ＡＧＳ、ＭＫＮ２８、Ｈ１２９９及びＭＣＦ−７細胞をそれらの対応するＩＣ５０濃度のＤＢＺＩＭで処理したとき、Ａｋｔのセリン４７３におけるリン酸化は、ｐ５３野生型癌細胞株ＡＧＳ（Ａ）、ｐ５３突然変異体胃癌細胞ＭＫＮ ２８（Ｂ）、ｐ５３ヌル肺癌細胞Ｈ１２９９（Ｃ）及びｐ５３野生型乳癌細胞ＭＣＦ−７（Ｄ）で下方制御された。リン酸化ＡＫＴの経時的阻害を、ウェスタンブロットによって示した。内部負荷対照として、β−アクチンを用いた。
ＤＢＺＩＭは、インビボでＨＣＣ腫瘍を減少させた。植え付け後３週間における、対照群及び処理群のＨＣＣ異種移植マウスの腫瘍を示す。
腫瘍増殖曲線を示す。＊Ｐ＜０．０１。
体重チャートを示す。＊Ｐ＜０．０１。
ｐ５３の内因性発現。Ｈｅｐ３Ｂ（ｐ５３ヌル）、Ｈｅｐ Ｇ２（野生型）、Ｈｌｅ及びＰｌｃ（ｐ５３突然変異体）からの細胞溶解物を、ｐ５３（ＤＯ−１）及びアクチン抗体を用いてウェスタンブロット法にかけた。
ＩＭＳに曝露させた細胞の位相差顕微鏡検査。位相差顕微鏡検査からの画像は、ＩＭＳ（ＩＢＮ １５、ＩＢｎ １９、ＩＢＮ ２４、ＩＢＮ ２５及びＩＢＮ ３２）への７２時間の曝露の後の細胞培養をそれぞれ示す。曝露時間の延長は、細胞培養での集密度の喪失の増加を引き起こした。
ＩＭＳは、肝癌細胞でアポトーシスを誘導する。細胞を媒体並びにＩＢＮ １５、ＩＢＮ １９、ＩＢＮ ２４、ＩＢＮ ２５及びＩＢＮ ３２で７２時間処理し、アポトーシスは、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ／ＰＩ染色と後に続くフローサイトメトリー分析を用いて定量化した。試料ごとに１０，０００個の細胞が検出された。生細胞は、左下四分の一（ＦＩＴＣ−及びＰＩ−）にあり、初期アポトーシス細胞は右下四分の一（ＦＩＴＣ＋及びＰＩ−）に、後期アポトーシス細胞は右上四分の一（アポトーシス性ＦＩＴＣ＋及びＰＩ＋）にある。
異なるＩＭＳに関するアポトーシス細胞の割合。
ＩＭＳは、肝癌細胞を停止する。細胞を媒体並びにＩＢＮ １５、ＩＢＮ １９、ＩＢＮ ２４、ＩＢＮ ２５及びＩＢＮ ３２で７２時間処理し、細胞周期分布はフローサイトメトリーによって調査した。ヨウ化プロピジウム染色対照細胞及びＩＭＳでそれぞれ処理した細胞の例示的ＦＡＣＳプロフィール。
細胞周期相における細胞の割合（％）。各値は、３つの判定の平均±Ｓ．Ｄ．である。
Ｇ０下集団の細胞の割合（％）。各値は、３つの判定の平均±Ｓ．Ｄ．である。
ＩＭＳは、カスパーゼ−３、カスパーゼ−９及びＰＡＲＰの切断を誘導する。指示された用量のＩＭＳへの７２時間の曝露の後のＨＬＥ細胞における、カスパーゼ−３、カスパーゼ−９及びＰＡＲＰの切断に及ぼすＩＢＮ １５、ＩＢＮ １９、ＩＢＮ ２４、ＩＢＮ ２５、ＩＢＮ ３２の影響のウェスタンブロット分析。
ＩＭＳ誘導性アポトーシスには、核内のｐ５３の蓄積が付随した。ＨＬＥ細胞を、指示された用量のＩＢＮ １９及びＩＢＮ ２４で４８時間処理した。処理細胞を４％ホルムアルデヒドで固定し、抗ｐ５３（緑色蛍光）及びＤＡＰＩ（青色蛍光）で免疫染色し、共焦鏡検によって分析した。
ｐ５３のＩＭＳ誘導性蓄積並びにｐ５３突然変異体ＨＬＥ細胞のセリン１５、２０、４６及び３９２上でのｐ５３リン酸化。（Ａ）肝癌細胞ＨＬＥを指示された濃度のＩＢＮ １５、ＩＢＮ １９、ＩＢＮ ２４、ＩＢＮ ２５及びＩＢＮ ３２で７２時間処理した。ｐ５３タンパク質並びにＳｅｒ−１５、Ｓｅｒ−２０、Ｓｅｒ−４６及びＳｅｒ−３９２のリン酸化のレベルを、ウェスタンブロット法で測定した。負荷対照としてβ−アクチンを用いた。
ミトコンドリア経路の開始を通してのＩＭＳ誘導性アポトーシス。細胞を様々なＩＭＳで処理し、Ｂｃｌ−２及びＢＡＸのレベルをウェスタンブロットアッセイによって評価した。
ｐ５３シグナル伝達経路関連の遺伝子発現のリアルタイムＰＣＲアレイ分析。抗アポトーシス遺伝子。遺伝子発現の相対レベルを、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨで正規化した。値を、平均±標準偏差で表す。
増殖阻害遺伝子ＳＥＳＮ２。
細胞周期チェックポイント遺伝子。
細胞増殖遺伝子。
ＤＮＡ修復遺伝子ＡＴＭ。
肺癌及び胃癌細胞に対する化合物Ｃ（ＤＢＺＭＩＭ）及び化合物９（ＭＡＢＺＭＩＭ）の効果。処理の１２０時間後に、化合物Ｃ（ＤＢＺＭＩＭ）及び化合物９（ＭＡＢＺＭＩＭ）は、肺癌細胞ＭＤＡＭＢ ２３１（Ａ）及び胃癌細胞ＭＫＮ ２８（Ｂ）で形態学的変化及びアポトーシスを誘導した。
ＨＣＣ異種移植のマウスに対する化合物９の効果。植え付け後３週間における、対照群及び処理群のＨＣＣ異種移植マウスの腫瘍を示した。
腫瘍増殖曲線を示す。＊Ｐ＜０．０１。
体重チャートを示す。＊Ｐ＜０．０１。
ＩＭＳの名称及び構造を示す表１。
ＩＭＳの名称及び構造を示す表１続き。
ＩＭＳの名称及び構造を示す表１続き。
ＩＭＳの名称及び構造を示す表１続き。
ＩＭＳの名称及び構造を示す表１続き。
ＩＭＳの名称及び構造を示す表１続き。
ＩＭＳの名称及び構造を示す表１続き。
ＩＭＳの名称及び構造を示す表１続き。
ＩＭＳのＩＣ５０値を示す表２。
ＩＭＳのＩＣ５０値を示す表２続き。
ＩＭＳのＩＣ５０値を示す表２続き。
ＩＭＳのＩＣ５０値を示す表２続き。
ＩＭＳのＩＣ５０値を示す表２続き。
ＩＭＳのＩＣ５０値を示す表２続き。
様々な癌細胞株におけるＤＢＺＩＭのＩＣ５０値を示す表３。
ＨＬＥ細胞におけるＩＢＮ−１５、１９、２４、２５及び３２のＩＣ５０値を示す表４。
胃癌細胞におけるＤＢＺＭＩＭ及び化合物９のＩＣ５０値を示す表５。
乳癌細胞におけるＤＢＺＭＩＭ及び化合物９のＩＣ５０値を示す表６。
正常な乳房細胞におけるＤＢＺＭＩＭ及び化合物９のＩＣ５０値を示す表７。]
実施例

[0039] ［００８９］本明細書で記載の方法は、本明細書で記載される、イミダゾリウム及びイミダゾリニウム塩の形態を含むイミダゾリウム及びイミダゾリニウム化合物（総称で「ＩＭＳ」）を、抗線維症剤及び抗癌剤として、又は線維症疾患若しくは癌を治療するために用いることができるという発見に関する。発明者らは、本明細書で記載される方法で用いることができる新規ＩＭＳを合成した。]
[0040] ［００９０］イミダゾリウム及びイミダゾリニウムの両方はイミダゾール環に基づき、両方ともＮ，Ｎ’−置換されている。イミダゾリウムは、Ｎ，Ｎ’−置換イミダゾールであり、イミダゾリニウムはＮ，Ｎ’−置換イミダゾリンであって、イミダゾールに存在するＣ４及びＣ５位置の間の炭素間二重結合を有しない。イミダゾール自体は多くの生体分子に組み込まれており、合成されたＣ置換イミダゾールは多くの医薬の重要な部分になっている（Ｏｌｍｏｓら１９９９）（Ｃａｓａｎｏｖａｓら２０００）。]
[0041] ［００９１］合成化学でＩＭＳを用いることの１つの魅力的な特徴は、それらが提供する構造融通性である。ＩＭＳの電子構造及び安定性、したがって治療上の安全性及び有効性は、分子のＮ−置換基（中心環の窒素原子上の置換基）及び中心環を変更することによって微調整することができる。ＩＭＳの「中心環」は、様々な置換基が結合して異なるＩＭＳ分子を生成することができる２つの窒素原子を含む５員環（イミダゾール又はイミダゾリン環）を指すことが理解されよう。ＩＭＳは、新規治療法の開発のために、安価で化学的に調整可能なビルディングブロックを提供する。]
[0042] ［００９２］一部のＩＭＳは、Ｎ−複素環式カルベン（ＮＨＣ）の前駆体である。ＮＨＣは、中心環のＣ２位置に水素原子を有し、中心環の両窒素原子上に置換基、すなわち２つのＮ−置換基を有するＩＭＳから、容易に生成することができる。ＮＨＣは、適当な条件下でのＩＭＳの脱プロトン化によって、これらのＩＭＳから生成される。ＩＭＳの脱プロトン化は、塩基条件下で、又は中性条件下の希釈溶液中で実施することができる。]
[0043] ［００９３］中心環のＣ２位置の水素原子以外の置換基で、ＩＭＳからＮＨＣを生成するのは困難である。しかし、Ｎ−置換基を切断することによってこれらのＩＭＳからラジカル種を形成することができる。]
[0044] ［００９４］発明者らは、本明細書で記載のＩＭＳを抗線維症剤若しくは抗癌剤として用いることができること、又は線維症疾患若しくは癌を治療するために用いることができることを発見した。いかなる特定の理論にも限定されることなく、本明細書で記載のＩＭＳは、抗酸化性及び抗炎症性の特性を示すことができる。線維症疾患及び癌の両方は、酸化的ストレス応答に関連付けられた。次に、線維症疾患及び癌において、酸化的ストレスは炎症性応答と緊密に関連することが示されている。]
[0045] ［００９５］抗線維症剤又は抗癌剤として用いることができるＩＭＳは、一般式Ｉの構造を有する化合物である。]
[0046] ]
[0047] ［００９６］式Ｉにおいて、破線は不在であるか、Ｒ１及びＲ３が結合する炭素とＲ２及びＲ４が結合する炭素との間で第２の結合を形成する結合として存在する。したがって、Ｒ１及びＲ３が結合する炭素とＲ２及びＲ４が結合する炭素を、単結合又は二重結合で連結することができる。]
[0048] ［００９７］Ｒ１及びＲ２は、（ｉ）各々独立にＨ、直鎖若しくは分枝状のＣ１〜Ｃ６アルキル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルケニル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ６〜Ｃ１０アリールであるか、又は（ｉｉ）それらの環原子と一緒に６〜１０員環の縮合した飽和、不飽和若しくは芳香族の環系を形成するか、又は（ｉｉｉ）Ｒ１及びＲ５はそれらの環原子と一緒に、又はＲ２及びＲ６はそれらの環原子と一緒に、５〜１０員環の縮合した飽和、不飽和若しくは芳香族の環系を形成し、Ｒ１及びＲ２の他のものは上の（ｉ）で定義される通りであるか、又は（ｉｖ）Ｒ１及びＲ５はそれらの環原子と一緒に、並びにＲ２及びＲ６はそれらの環原子と一緒に５〜１０員環の縮合した飽和、不飽和若しくは芳香族の環系を形成する。]
[0049] ［００９８］Ｒ３及びＲ４の両方はＨであるか、又は、Ｒ１及びＲ２がそれらの環原子と一緒に６〜１０員環の縮合芳香環系を形成する場合、若しくは破線が結合として存在する場合、Ｒ３及びＲ４は不在である。]
[0050] ［００９９］上記のようにＲ５又はＲ６がそれぞれＲ１又はＲ２と縮合していない場合、Ｒ５及びＲ６は各々独立に直鎖若しくは分枝状のＣ１〜Ｃ６アルキル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルケニル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルキニル、縮合シクロアルキル環系を含むＣ３〜Ｃ１８シクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ６〜Ｃ１０アリール−Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール−Ｃ２〜Ｃ６アルケニル若しくはＣ６〜Ｃ１０アリール−Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル−Ｃ６〜Ｃ１０アリール若しくはＣ２〜Ｃ６アルキニル−Ｃ６〜Ｃ１０アリールである。]
[0051] ［００１００］Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル又はハロである。]
[0052] ［００１０１］該当する場合、上記の置換基Ｒ１〜Ｒ７のいずれかは、１つ又は複数の炭素原子が、Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＰから選択されるヘテロ原子で任意選択で置き換えることができる。同様に、該当する場合、上記の置換基Ｒ１〜Ｒ７のいずれかは、直鎖若しくは分枝状のＣ１〜Ｃ６アルキル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルケニル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルキニル、縮合シクロアルキル環系を含むＣ３〜Ｃ１８シクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、フルオロ、トリフルオロメチル、シアナト、イソシアナート、カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ６アシロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アシル、カルボニル、アミノ、アセチル、アセトキシ、オキソ、ニトロ、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ６アルキルカルボキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ２〜Ｃ６アルケノキシ、Ｃ２〜Ｃ６アルキノキシの１つ又は複数によって任意選択で置換されてもよい。]
[0053] ［００１０２］Ｒ１及びＲ５が結合する環炭素原子並びにＲ２及びＲ６が結合する環炭素の１つは、窒素原子によって任意選択で置換されてもよい。]
[0054] ［００１０３］上記の化合物は、塩の形態で存在してもよい。したがって、本方法で用いることができるＩＭＳには、式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩並びにそのような塩のオリゴマー及びポリマーが含まれる。そのような塩は、一般式ＩＩの構造を有する。]
[0055] ]
[0056] ［００１０４］一般式ＩＩは一般式Ｉについて上で定義される通りであり、対イオンＸのさらなる特徴を有する。Ｘは薬学的に許容されるアニオンであり、例えば、それらに限定されないが、塩化物、臭化物、テトラフルオロホウ酸、ヘキサフルオロリン酸塩が含まれる。]
[0057] ［００１０５］環構造に関して本明細書で用いる場合、用語「縮合した」は、環構造の間で少なくとも２つの原子を共有することを指す。２つの環原子（そのいずれかはＣ又はＮであってよい）が縮合環系に含まれる場合、環系は中心イミダゾリウム又はイミダゾリニウム環と縮合される。]
[0058] ［００１０６］特定の実施形態では、破線は不在でもよく、又はＲ１及びＲ３が結合する炭素とＲ２及びＲ４が結合する炭素との間で第２の結合を形成する結合として存在し、Ｒ１及びＲ２は両方ともＨであるか、又はそれらの環原子と一緒に６〜１０員環の縮合芳香環系を形成し、Ｒ３及びＲ４は両方ともＨであるか無であり、Ｒ５及びＲ６は各々独立に直鎖若しくは分枝状のＣ１〜Ｃ６アルキル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルケニル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルキニル、縮合シクロアルキル環系を含むＣ３〜Ｃ１８シクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ６〜Ｃ１０アリール−Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール−Ｃ２〜Ｃ６アルケニル又はＣ６〜Ｃ１０アリール−Ｃ２〜Ｃ６アルキニルであり、Ｒ７はＨであり、該当する場合、置換基Ｒ１〜Ｒ７のいずれかは、１つ又は複数の炭素原子が、Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＰから選択されるヘテロ原子で置き換えることができ、そのいずれかは、直鎖若しくは分枝状のＣ１〜Ｃ６アルキル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルケニル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルキニル、縮合シクロアルキル環系を含むＣ３〜Ｃ１８シクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、フルオロ、トリフルオロメチル、シアナト、カルボキシル、カルボニル、アミノ、アセチル、オキソ、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ２〜Ｃ６アルケノキシ、Ｃ２〜Ｃ６アルキノキシの１つ又は複数で任意選択で置換されてもよい。]
[0059] ［００１０７］例えば、様々な実施形態では、化合物は、Ｒ１及びＲ２が結合する２つの環原子の間の二重結合を有する、イミダゾリウム塩であってもよい。様々な他の実施形態では、化合物は、Ｒ３及びＲ４が水素であり、それらの環炭素の間に単結合だけがあるイミダゾリニウム塩であってもよい。さらに他の実施形態では、Ｒ３及びＲ４は無であり、Ｒ１及びＲ２はそれらの環原子と一緒に６〜１０員環の縮合芳香環系を形成する。]
[0060] ［００１０８］Ｒ５及びＲ６を含む置換基が異なってもよい。例えば、一部の実施形態では、本方法のＩＭＳは、Ｒ５及びＲ６が同じである化合物であってもよい。異なる実施形態では、Ｒ５又はＲ６は、縮合環系を含むアラルキル、分枝状アルキル又はシクロアルキルであってもよい。他の実施形態では、Ｒ５又はＲ６は、フェナルキル（ｐｈｅｎａｌｋｙｌ）基を含むことができる。他の実施形態では、Ｒ５及びＲ６の１つ又は両方は、アダマンタニル基を含むことができる。]
[0061] ［００１０９］本方法で用いることができるＩＭＳには、一般式Ｉの化合物から形成されるオリゴマー又はポリマーも含まれる。したがって、本明細書で用いる「オリゴマー」は、下記の方法で連結される、例えば２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、２５個以上、５０個以上、１００個以上、１５０個以上の一般式Ｉの化合物を指す。したがって、オリゴマーには二量体及び三量体が含まれる。本明細書で用いる「ポリマー」は、下記の方法で連結される、例えば１００個以上、１５０個以上、２００個以上、２５０個以上、５００個以上、１０００個以上の一般式Ｉの化合物を指す。]
[0062] ［００１１０］本明細書で用いるオリゴマー又はポリマーでは、一般式Ｉの化合物は互いに連結されて巨大分子構造を形成し、それは環化されてもよい。]
[0063] ［００１１１］例えば、本明細書で記載される三量体には、１，３，５−トリス（４−メチル−イミダゾリウム）に連結しているシクロファン又は薬学的に許容されるその塩（ＴＤＢＺＩＭ）が含まれる。]
[0064] ［００１１２］巨大分子構造では、存在するあらゆる一般式Ｉの化合物のオリゴマー又はポリマーに存在する関連置換基を有するよりも、一般式Ｉの２つの化合物は、１つ又は複数のＲ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６又はＲ７置換基が二価であり、したがって２つの化合物で共有されるように連結されてもよい。例えば、そのような二量体では、２つの化合物は共有二価Ｒ１置換基によって連結されてもよく、したがって完全な二量体では、一般式Ｉの２つの化合物のためにＲ１置換基が１つだけ出現する。]
[0065] ［００１１３］したがって、一般式Ｉの化合物は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６又はＲ７などの二価置換基を通して、互いに連結されてもよい。例えば、２つの化合物が共有Ｒ５置換基を通して連結されるように、一般式Ｉの１つの化合物の上のＲ５置換基は、一般式Ｉの第２の化合物の上のＲ５であることもできる。同様にオリゴマー又はポリマーは、共有されるＲ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６又はＲ７置換基を通して化合物を連結することによって形成することができる。例えば、本記載の二量体には、２，６−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウムブロミド）−ピリジン又は薬学的に許容されるその塩（ＩＢＮ−２２）が含まれる。]
[0066] ［００１１４］上に述べたような置換基の共有には、それらの環炭素と一緒に縮合環系を形成する２つの置換基の共有を含めることができる。したがって、例えば、Ｒ１及びＲ２がそれらの環炭素と一緒に式Ｉの第１の化合物の上で環系を形成する場合、環の中の追加の炭素は、一般式Ｉの第２の化合物からの環炭素になる。例えば、本記載の二量体には、ベンゾ（１，２−４，５−ジイミダゾリウム）−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラベンジル−ジ−ブロミド又は薬学的に許容されるその塩（ＩＢＮ−２９）が含まれる。]
[0067] ［００１１５］或いは、２つの化合物を連結してオリゴマー又はポリマーを形成するために、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６又はＲ７の１つ又は複数などの置換基を第２の化合物の上の別のそのような置換基に結合することができ、したがって、オリゴマー又はポリマー中の一般式Ｉの各化合物について、関連する連結置換基が１つ出現する。１つ又は複数の共有される二価Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６又はＲ７置換基によって、一般式Ｉに入る複数の化合物をこの方法で結合すること（オリゴマー形成）ができる。例えば、そのような二量体には、２，２’−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウムブロミド）−１，１’−ビナフタレン又は薬学的に許容されるその塩（ＩＢＮ−２３）が含まれる。]
[0068] ［００１１６］さらに、一般式Ｉの２つの化合物は、一般式ＩのＲ７が結合するそれぞれの炭素原子の間の単結合又は二重結合によって結合して、二量体を形成することができる。これらの分子には、例えば、１，３−ジベンジル−２−（１，３−ジベンジル−１Ｈ−イミダゾール−２（３Ｈ）−イリデン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール又は薬学的に許容されるその塩（化合物Ｈ）が含まれる。]
[0069] ［００１１７］オリゴマー化又はポリマー化化合物は、一般式Ｉのすべての置換基が各オリゴマー化又はポリマー化化合物において同じであるように同じ化合物であるか、又は、化合物の間で１つ又は複数の置換基が異なるように異なってもよいが、但し、共有される二価置換基（複数可）は、二価置換基が共有される化合物においては明らかに同じである。]
[0070] ［００１１８］表１は、本明細書で記載されるＩＭＳの特定の例の名称及び構造を含む。]
[0071] ［００１１９］特定の実施形態では、本発明の化合物は、１−エチル−３−メチルイミダゾリウム、１，３−ビスベンジルイミダゾリウム、１，３−ジイソプロピルイミダゾリウム、１，３−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルイミダゾリニウム、１，３−ビス（１−アダマンチル）イミダゾリウム、１，３−ビス（２，４，６−トリメチルフェニル）−イミダゾリニウム、１，３−ビス（２，６−ジイソプロピル−フェニル）−イミダゾリニウム、１，３−ジアリルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−メチルイミダゾリウム、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム、１−（１−アダマンチル）−３−（２，４，６−トリメチルフェニル）−４，５−ジヒドロイミダゾリウム、２−ベンジルイミダゾ［１，５−ａ］キノリニウム、１，３−ビス（１−アダマンチル）−ベンゾイミダゾリウム、１，３−ジシクロヘキシルベンゾイミダゾリウム、１，３−ジイソプロピルイミダゾリニウムテトラフルオロボレート、１，３−ジイソプロピルイミダゾリウム、２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−メチルイミダゾ［１，５−ａ］ピリジニウム、１−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−３−（２，４，６−トリメチルフェニル）−イミダゾリニウム、２−メシチル−５−メチルイミダゾ［１，５−ａ］ピリジニウム、２−メシチル−２，５，６，７−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアゾール−４−イウム、１，３−ビス（１−アダマンチル）イミダゾリニウム、１−ブチル−３−（２−ピリジニルメチル）−１Ｈ−イミダゾリウム、６，７−ジヒドロ−２−ペンタフルオロフネイル−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］−１，２，４−トリゾリウム、又は薬学的に許容されるその任意の塩であってもよい。]
[0072] ［００１２０］特定の実施形態では、本発明の化合物は、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムブロミド、１，３−ビスベンジルイミダゾリウムブロミド（ＤＢＺＩＭ）、１，３−ジイソプロピルイミダゾリウムテトラフルオロボレート（ＤＰＩＭ）、１，３−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルイミダゾリニウムテトラフルオロボレート（ＤＢＩＭ）、１，３−ビス（１−アダマンチル）イミダゾリウムテトラフルオロボレート（ＡＭＩＭ）、１，３−ビス（２，４，６−トリメチルフェニル）−イミダゾリニウムクロリド（ＴＭＰＨＩＭ）、１，３−ビス（２，６−ジイソプロピル−フェニル）−イミダゾリニウムクロリド（ＤＰＰＨＩＭ）、１，３−ジアリルイミダゾリウムブロミド（化合物Ｄ）、１−ベンジル−３−メチルイミダゾリウムブロミド（化合物Ｅ）、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムクロリド（化合物Ｇ）、１−（１−アダマンチル）−３−（２，４，６−トリメチルフェニル）−４，５−ジヒドロイミダゾリウムクロリド（化合物Ｓ１）、２−ベンジルイミダゾ［１，５−ａ］キノリニウムクロリド（化合物Ｓ２）、１，３−ビス（１−アダマンチル）−ベンゾイミダゾリウムクロリド（化合物Ｓ３）、１，３−ジシクロヘキシルベンゾイミダゾリウムクロリド（化合物Ｓ６）、１，３−ジイソプロピルイミダゾリニウムテトラフルオロボレート（化合物Ｓ７）、１，３−ジイソプロピルイミダゾリウムクロリド（化合物Ｓ８）、２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−メチルイミダゾ［１，５−ａ］ピリジニウムヘキサフルオロホスフェート（化合物Ｓ９）、１−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−３−（２，４，６−トリメチルフェニル）−イミダゾリニウムクロリド（化合物Ｓ１０）、２−メシチル−５−メチルイミダゾ［１，５−ａ］ピリジニウムクロリド（化合物Ｓ１１）、２−メシチル−２，５，６，７−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアゾール−４−イウムクロリド（化合物Ｓ１２）、１，３−ビス（１−アダマンチル）イミダゾリニウムテトラフルオロボレート（化合物Ｓ１３）、１−ブチル−３−（２−ピリジニルメチル）−１Ｈ−イミダゾリウムヘキサフルオロホスフェート（化合物Ｓ１４）、６，７−ジヒドロ−２−ペンタフルオロフネイル−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］−１，２，４−トリゾリウムテトラフルオロボレート（化合物Ｓ１５）であってもよい。]
[0073] ［００１２１］一般式Ｉの化合物には、１−エチル−３−メチルイミダゾリウム、１−メチル−３−（２−ヒドロキシルエチル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−イソシアナトベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−カルボキシルベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（２，２−ジメトキシエチル）−イミダゾリウム、１−（２，４，６−トリメチルフェニル）−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１，３−ジベンジル−５−フェニルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−カルボキシルベンジル）−２−メチルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（３，４，５−トリメトキシベンジル）−２−メチルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテート−ベンジル）−２−メチル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルカルボキシレートベンジル）−２−メチル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（２，２−ジメトキシエチル）−２−メチル−イミダゾリウム、２，６−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウム）−ピリジン、２，２’−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウム）−１，１’−ビナフタレン、１−ベンジル−３−（４−メチルベンジル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（２−トリフルオロメチルベンジル）−２−メチルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルカルボキシレートベンジル）−５−フェニル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテートベンジル）−５−フェニル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルベンジル）−５−フェニルイミダゾリウム、（１，２−４，５−ジイミダゾリウム）−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラベンジル−ベンゼン、１−ベンジル−３−（２−プロピン−１−イル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（３−ヒドロキシル−プロピル）−イミダゾリウム、１，３−ジ（２−フェニルエチル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテートベンジル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（ピリジン−２−イル）−イミダゾリウム、１，３，５−トリス−（４−メチル−イミダゾリウム）−ｌｉｎｋｅｄシクロファン、１，３−ジベンジル−２−（１，３−ジベンジル−１Ｈ−イミダゾール−２（３Ｈ）−イリデン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール、１−ベンジル−３−メチル−イミダゾリウム、１−（４−シアナトベンジル）−３−メチル−イミダゾリウム、１−（４−カルボキシベンジル）−３−メチル−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（２，２−ジメトキシエチル）−イミダゾリウム、及び１−（２，４，６−トリメチルフェニル）−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、又は薬学的に許容されるその任意の塩を含む新規化合物が含まれる。]
[0074] ［００１２２］一般式Ｉの化合物には、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムブロミド、１−メチル−３−（２−ヒドロキシルエチル）−イミダゾリウムブロミド（ＩＢＮ−２）、１−メチル−３−（４−イソシアナトベンジル）−イミダゾリウムクロリド（ＩＢＮ−３）、１−メチル−３−（４−カルボキシルベンジル）−イミダゾリウムブロミド（ＩＢＮ−４）、１−メチル−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウムクロリド（ＩＢＮ−６）、１−メチル−３−（２，２−ジメトキシエチル）−イミダゾリウムブロミド（ＩＢＮ−８）、１−（２，４，６−トリメチルフェニル）−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウムクロリド（ＩＢＮ−９）、１，３−ジベンジル−５−フェニルイミダゾリウムブロミド（ＩＢＮ−１５）、１−ベンジル−３−（４−カルボキシルベンジル）−２−メチルイミダゾリウムクロリド（ＩＢＮ−１７）、１−ベンジル−３−（３，４，５−トリメトキシベンジル）−２−メチルイミダゾリウムクロリド（ＩＢＮ−１８）、１−ベンジル−３−（４−アセテート−ベンジル）−２−メチル−イミダゾリウムクロリド（ＩＢＮ−１９）、１−ベンジル−３−（４−メチルカルボキシレートベンジル）−２−メチル−イミダゾリウムクロリド（ＩＢＮ−２０）、１−ベンジル−３−（２，２−ジメトキシエチル）−２−メチル−イミダゾリウムブロミド（ＩＢＮ−２１）、２，６−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウムブロミド）−ピリジン（ＩＢＮ−２２）、２，２’−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウムブロミド）−１，１’−ビナフタレン（ＩＢＮ−２３）、１−ベンジル−３−（４−メチルベンジル）−イミダゾリウムクロリド（ＩＢＮ−２４）、１−ベンジル−３−（２−トリフルオロメチルベンジル）−２−メチルイミダゾリウムクロリド（ＩＢＮ−２５）、１−ベンジル−３−（４−メチルカルボキシレートベンジル）−５−フェニル−イミダゾリウムブロミド（ＩＢＮ−２６）、１−ベンジル−３−（４−アセテートベンジル）−５−フェニル−イミダゾリウムブロミド（ＩＢＮ−２７）、１−ベンジル−３−（４−メチルベンジル）−５−フェニルイミダゾリウムクロリド（ＩＢＮ−２８）、ベンゾ（１，２−４，５−ジイミダゾリウム）−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラベンジル−，ジ−ブロミド（ＩＢＮ−２９）、１−ベンジル−３−（２−プロピン−１−イル）−イミダゾリウムブロミド（ＩＢＮ−３０）、１−ベンジル−３−（３−ヒドロキシル−プロピル）−イミダゾリウムブロミド（ＩＢＮ−３１）、１，３−ジ（２−フェニルエチル）−イミダゾリウムブロミド（ＩＢＮ−３２）、１−ベンジル−３−（４−アセテートベンジル）−イミダゾリウムクロリド（ＩＢＮ−３３）、１−ベンジル−３−（ピリジン−２−イル）−イミダゾリウムブロミド（ＩＢＮ−３４）、１，３，５−トリス−（４−メチル−イミダゾリウム）−ｌｉｎｋｅｄシクロファン・３Ｂｒ（ＴＤＢＺＩＭ）、１，３−ジベンジル−２−（１，３−ジベンジル−１Ｈ−イミダゾール−２（３Ｈ）−イリデン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール（化合物Ｈ）、１−ベンジル−３−メチル−イミダゾリウムブロミド（化合物１２）、１−（４−シアナトベンジル）−３−メチル−イミダゾリウムクロリド、１−（４−カルボキシベンジル）−３−メチル−イミダゾリウムブロミド、１−メチル−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウムクロリド、１−メチル−３−（２，２−ジメトキシエチル）−イミダゾリウムブロミド、及び１−（２，４，６−トリメチルフェニル）−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウムクロリドを含む新規化合物が含まれる。]
[0075] ［００１２３］一般式Ｉの化合物並びにそのオリゴマー及びポリマーは、市販されているか、下に示す実施例に記載のように通常の化学変化を用いて合成することができる。合成方法は、Ｈａｒｌｏｗら１９９６、Ｚｈａｎｇら２００７、Ｃｈｉａｎｅｓｅ及びＣｒａｔｒｅｅ２００５並びにＢｏｙｄｓｔｏｎら２００５にも記載されている。]
[0076] ［００１２４］したがって、抗線維症剤又は抗癌剤を細胞に送達する方法であって、一般式Ｉの化合物、薬学的に許容されるその塩又はそのオリゴマー若しくはポリマーの有効量と、細胞を接触させることを含む方法が現在提供される。]
[0077] ［００１２５］本明細書で用いる場合、抗線維症剤又は抗癌剤を細胞に「送達する」ことは、その剤が細胞に対してその抗線維症効果又は抗癌効果を発揮することができるように、細胞に十分近接して剤を提供することを指す。例えばインビトロでは、剤を細胞培地に加えることによって剤を細胞に送達することができる。例えばインビボでは、剤を医薬組成物として対象に投与することによって剤を送達することができる。]
[0078] ［００１２６］本明細書で用いる場合、細胞を「接触させる」ことは、細胞との直接的及び間接的な接触を指す。直接的接触とは、剤と細胞との間の直接相互作用を指す。対照的に、間接的接触は、他の分子又は化合物との相互作用を通して「細胞を接触させる」ことを含む。例えば、剤は分子と相互作用して、それに細胞と相互作用させるか、又は別の分子と相互作用させ、それが次に細胞と相互作用して効果を発揮させる、その分子内の変化に影響を及ぼすことができる。間接的接触は、細胞に対する影響をもたらす一連の分子相互作用を含むことができる。]
[0079] ［００１２７］本明細書で用いる抗線維症剤は、線維症疾患に関連する分子、機構又は影響を変化させるか、減少させるか、阻害する化合物を指す。例えば、剤は抗炎症剤又は抗酸化剤であってもよく、アポトーシスを誘導すること、ＴＧＦ−β、ＮＦ−κＢ若しくはＩＬ−６などの線維形成性媒介物質の活性を変化させるか、減少させるか、阻害すること、又は細胞の増殖性、線維形成性、収縮性若しくは炎症誘発性の応答を中和することができる。いかなる特定の理論にも限定されることなく、抗線維症剤は、以下のことによって線維症疾患を減少させるか阻害することができる。（ａ）星状細胞などの線維症疾患に関与する細胞の活性化の刺激を回避するために炎症を減らすこと、（ｂ）線維症疾患に関与する細胞の活性化を直接に下方制御すること、（ｃ）線維症疾患に関与する細胞の増殖性、線維形成性、収縮性又は炎症誘発性の応答を中和すること、（ｄ）例えばＢｃｌ−ｘＬ又はＦａｓなどの、アポトーシスを誘導すること、又は（ｅ）ＥＣＭ分解を誘導すること。]
[0080] ［００１２８］本明細書で用いる抗癌剤は、癌に関連する分子、機構又は影響を変化させるか、減少させるか、阻害する化合物を指す。例えば、剤は抗炎症剤又は抗酸化剤あってもよく、アポトーシスを誘導すること、異常な細胞増殖を阻害すること、細胞増殖を阻害すること、ＤＮＡ突然変異を阻害すること又は、サバイビン、カスパーゼ９、カスパーゼ３、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂａｋ、ＢＡＸ、ＡＴＭ、ｐ５３、Ｃｄｃ２５Ａ、Ｃｄｃ２、ＳＥＳＮ２及びＡＰ−１などの癌に関連する分子の活性又は活性のレベルを改変することができる。]
[0081] ［００１２９］抗線維症剤又は抗癌剤が提供されるべき細胞は、インビトロの細胞、培養細胞又は対象内のインビボ細胞を含む任意の細胞であってもよい。本明細書で用いる用語「細胞」は、特に明記しない限り、状況次第で単一の細胞、複数の細胞又は細胞集団を指し、且つそれらを含む。細胞は、対象から外植される細胞を含むインビトロの細胞であってもよく、又は、それは対象内のインビボ細胞であってもよい。同様に、「細胞」への言及は、特に明記しない限り、状況次第で単一の細胞への言及も含む。]
[0082] ［００１３０］細胞は、任意の生物体、例えば昆虫、細菌を含む微生物、又はヒトを含む哺乳動物を含む動物に由来してもよい。]
[0083] ［００１３１］本方法の細胞は、線維症疾患若しくは癌を有する対象内、線維症疾患若しくは癌の治療を必要とする対象内、又は線維症疾患若しくは癌の予防が望まれる対象内にあってもよい。一部の実施形態では、対象はヒト対象である。]
[0084] ［００１３２］線維症疾患は、過剰な線維組織の発達又は器官若しくは組織の細胞外マトリックスの過剰生産によって特徴づけることができるかそれによって引き起こされることがある状態を指すものと当分野の技術者によって理解され、それには、例えば肝臓線維症、腎臓線維症、肺線維症、骨線維症、全身性硬化症、混合性結合組織を含めることができる。線維症疾患のさらなる例は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第２００７／００４３０１６号で提供される。]
[0085] ［００１３３］本方法の一実施形態では、抗線維症剤は、肝臓線維症を有する対象の細胞に送達されてもよい。化合物は、例えば１，３−ジイソプロピルイミダゾリウム、又は薬学的に許容されるその塩であってもよい。]
[0086] ［００１３４］熟練者は、細胞が異常な細胞増殖及び近くの組織に侵入する能力を示す疾患クラスを癌が包含することを理解する。癌の一部の形態では、異常な細胞は、体の他の場所に広がることもできる。異なる型の癌には、例えば、乳癌、結腸直腸癌、脳癌、前立腺癌、子宮頸癌、卵巣癌、骨癌、皮膚癌、肺癌、膵臓癌、膀胱癌、胆嚢癌、腎臓癌、食道癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、喉頭癌、白血病、多発性骨髄腫、口内癌、胸膜中皮腫、小腸癌、精巣癌、子宮癌、甲状腺癌及び胃癌が含まれる。]
[0087] ［００１３５］本方法の一実施形態では、抗癌剤は、肝細胞癌、肺癌、乳癌、胃癌又は膠腫を有する対象の細胞に送達されてもよい。化合物は、例えば１，３−ビスベンジルイミダゾリウム、１，３，−ジベンジル−２−メチルイミダゾリウム，１−（２，４，６−トリメチルフェニル）−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１，３−ジベンジル−５−フェニルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテート−ベンジル）−２−メチル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルベンジル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（２−トリフルオロメチルベンジル）−２−メチルイミダゾリウム又は１，３−ジ（２−フェニルエチル）−イミダゾリウム、又は薬学的に許容されるその塩であってもよい。]
[0088] ［００１３６］本明細書で用いる用語「有効量」は、所望の結果を達成するのに、例えば線維症疾患又は癌を治療するのに必要な投薬量及び期間の、有効な量を意味する。投与されるＩＭＳの総量は、障害の程度及びタイプ、投与様式並びに対象の年齢及び健康を含むいくつかの因子によって異なる。線維症疾患又は癌を治療するための特定のＩＭＳの有効量を決定する方法は、当分野の技術者に容易に明らかとなる。]
[0089] ［００１３７］線維症疾患又は癌を「治療すること」は、臨床上の結果を含む有益であるか所望の結果を得るための手法を指す。有益であるか所望の臨床上の結果には、１つ又は複数の症状若しくは状態の緩和又は改善、障害若しくは疾患の程度の縮小、疾患の状態の安定化、障害若しくは疾患の発達の予防、障害若しくは疾患の広がりの予防、障害若しくは疾患の進行の遅延又は緩徐化、障害若しくは疾患の開始の遅延又は緩徐化、障害若しくは疾患の状態の改善又は緩和、及び寛解（部分的又は全体的）を含めることができるが、これらに限定されない。「治療すること」は、治療不在下で予想されるものを越えて対象の生存期間を長くすることを意味することもできる。「治療すること」は、障害若しくは疾患の進行を阻害すること、障害若しくは疾患の進行を一時的に遅くすることを意味することもできるが、より好ましくは、それは障害若しくは疾患の進行を恒久的に停止させることを含む。]
[0090] ［００１３８］投与を助けるために、ＩＭＳを医薬組成物の成分として製剤化してもよい。組成物は、薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、防腐剤及び様々な適合する担体又は希釈剤を含むことができる。]
[0091] ［００１３９］薬学的に許容される担体の割合及び素性は、選択される投与経路、ＩＭＳ分子との適合性及び標準の製薬業務を含む様々な因子に依存する。一般に、医薬組成物は、ＩＭＳの生物特性をあまり損なわない成分で製剤化される。]
[0092] ［００１４０］適する媒体及び希釈剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ．、２００６）に記載されている。適する医薬組成物の調製方法は、当分野の技術者に分かるであろう。]
[0093] ［００１４１］当分野の技術者によって理解されるように、医薬組成物は、選択される投与経路によって様々な形態で対象に投与することができる。本発明の組成物は、例えば経口投与によって、外科的に、又は所望部位への注射によって投与することができる。]
[0094] ［００１４２］異なる実施形態では、組成物は、所望の部位、例えば治療すべき線維症疾患又は癌の近くにおける直接的注射（皮下、静脈内、筋内など）によって投与される。]
[0095] ［００１４３］用いられる医薬組成物の用量は、治療される特定の線維症疾患又は癌障害、状態の重症度、年齢、身体状態、サイズ及び重量を含む個々の患者のパラメータ、治療期間、併用療法（ある場合）の性質、特定の投与経路、及び医療臨床医の知識及び専門知識の範囲内である他の類似した因子によって決まる。これらの因子は当業者に公知であり、最小限の通常の実験で対処することができる。]
[0096] ［００１４４］医薬組成物を様々な剤形で提供することができ、したがって、異なる実施形態において、ＩＭＳを例えばピル、錠剤、カプセル、溶液、懸濁液、粉末及び注射を含む異なる剤形で投与することができることが理解されよう。異なる剤形を調製し、投与するための従来の手順及び成分は、当業者に分かるであろうし、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ．、２００６）に記載されている。]
[0097] ［００１４５］インビボで細胞に抗線維症剤又は抗癌剤を送達するための、及びインビボで細胞に抗線維症剤又は抗癌剤を送達するための医薬の調製における、一般式Ｉの構造を有する化合物、薬学的に許容されるその塩、又はそのオリゴマー若しくはポリマーを含む本明細書で記載のＩＭＳの使用も企図される。]
[0098] ［００１４６］本方法のＩＭＳは、多数の分子機構を通して機能することができる抗酸化特性の結果として、それらの抗線維症効果及び抗癌効果を発揮することができる。一般に抗酸化剤は、主に下記３つの異なる経路によってそれらの効果を発揮する。（１）代謝及び免疫応答の間に生成される細胞のフリーラジカルＲＯＳの中和、（２）内因性抗酸化酵素活性の誘導、及び（３）ヒドロキシル基の生成を触媒する鉄又は銅イオンのキレート化。いかなる特定の理論にも限定されることなく、ＩＭＳの抗酸化特性は、少なくとも一部、ラジカルスカベンジャーとしてのそれらの活性のために生じるようである。ＩＭＳによるフリーラジカルの中和は、（１）好ましくは塩基性条件下でのＩＭＳからＮＨＣへの自然発生の変換、（２）中間体活性ラジカルの形成及びフリーラジカルの中和をもたらす、ＮＨＣの炭素２位置でのＲＯＳなどのフリーラジカルとの相互作用を含む一連の化学反応の後に起こることができるようである。]
[0099] ［００１４７］本発明者らは、本明細書で記載されるＩＭＳが抗炎症特性も示すことを発見した。いかなる特定の理論にも限定されることなく、ＩＭＳの二重の抗酸化特性及び抗炎症特性は、少なくとも一部、酸化的ストレスと炎症との間の相互作用に帰することができる。例えば、肝臓線維症の治療では、本明細書で定義されるＩＭＳ化合物の抗炎症効果は、ＨＳＣ活性化を、したがってそれから生じる炎症誘発性サイトカインの生成を阻害するＩＭＳの抗酸化特性に帰することができると仮定される。同様に、いかなる特定の理論にも限定されることなく、ＩＭＳによる炎症媒介物質ＩＬ−６の阻害は、炎症性サイトカインの分泌の重要な調節因子である転写因子ＮＦ−κＢの活性化を抑制する、ＩＭＳの抗酸化特性に一部帰することができる。]
[0100] ［００１４８］それらの抗酸化特性及び抗炎症特性に加えて、ＩＭＳは線維症疾患及び癌の治療で有用である他の効果を示すことができる。抗酸化剤は、アポトーシスを誘導する特性も有することが見出されている。例えば緑茶抽出物ＥＧＣＧは、培養細胞株及び異種移植モデルでヒト肝細胞癌のアポトーシスを誘導する（Ｎｉｓｈｉｋａｗａら２００６）ことを示し、天然の抗酸化剤であるニンニク抽出物も、酸化的ストレスを誘導することによってヒトグリア芽細胞腫細胞（Ｄａｓら２００７）及び結腸癌細胞（Ｊａｋｕｂｉｌｏｖａら２００６）でアポトーシスを誘導することが示されている。]
[0101] ［００１４９］いかなる特定の理論にも限定されることなく、ＩＭＳはアポトーシスの誘導及び細胞周期の停止を通しての細胞増殖の阻害によって、癌の治療で有効であることができるようである。例えば、ＩＭＳは、例えばサバイビン、カスパーゼ９、カスパーゼ３、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂａｋ、ＢＡＸ、ＡＴＭ、ｐ５３、Ｃｄｃ２５Ａ、Ｃｄｃ２、ＳＥＳＮ２及びＡＰ−１を含む、アポトーシス及び細胞周期に関与する分子の活性及び発現を増加又は減少させることによって、アポトーシス及び細胞周期停止を誘発することができる。]
[0102] ［００１５０］本方法及び化合物を、以下の非限定的実施例を通してさらに例示する。]
[0103] ［００１５１］
［実施例］
［００１５２］材料及び方法
［００１５３］ＩＭＳの抗酸化、抗炎症及び抗線維症特性]
[0104] ［００１５４］ＩＭＳの合成及び特性評価
［００１５５］ＤＢＺＩＭ、ＴＤＢＺＩＭ及びＤＢＺＢＩＭは、社内で合成した。ＤＰＩＭ、ＤＢＩＭ、ＡＭＩＭ、ＴＭＰＨＩＭ及びＤＰＰＨＩＭは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ＵＳＡ）から購入した。ＤＢＺＩＭ（１，３−ビスベンジルイミダゾリウムブロミド）、ＤＢＺＢＩＭ（１，３−ビスベンジル−ベンゾイミダゾリウムブロミド又は１，３−ジベンジル−ベンゾイミダゾリウムブロミド）及びＴＤＢＺＩＭ（１，３，５−トリス（４−メチル−イミダゾリウム）に連結したシクロファン・３Ｂｒ）の化学構造を、表１に例示する。ＤＢＺＩＭ及びＤＢＺＢＩＭは、文献（Ｈａｒｌｏｗら１９９６）に開示の方法を用いて合成した。ＴＤＢＺＩＭは、反応バイアル内の２００ｍｌのＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で４−メチルイミダゾール（１２３ｍｇ、１，５ｍｍｏｌ）及び２，４，６−トリス（ブロモメチル）メシチレン（４００ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を混合することによって合成した。反応混合液を、２日間１００℃に加熱した。ＴＤＢＺＩＭの無色結晶を沈殿させ、４０％の収率（１６０ｍｇ）で収集した。核磁気共鳴を行い、以下の結果を得た。１Ｈ核磁気共鳴（ＮＭＲ）（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）：δ７．７７（ｓ、１Ｈ）、５．５３（ｓ、２Ｈ）、５．４１（ｓ、２Ｈ）、４．６０（ｓ、１Ｈ）、２．５５（ｓ、３Ｈ）、２．１９（ｓ、６Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）：δ１４３．４９、１３６．２７、１３１．７３、１３１．５４、１２３．４５、６７．０６、１６．３５、９．５７。ＴＤＢＺＩＭ（Ｃ３６Ｈ４５Ｂｒ３Ｎ６）の元素分析は、以下の結果を与えた。Ｃ、５３．２１；Ｈ、５．８８；Ｎ、１０．１２（計算値Ｃ、５３．９５；Ｈ、５．６６；Ｎ、１０．４９）。]
[0105] ［００１５６］一次ＨＳＣ単離及びＨＳＣ−Ｔ６株
［００１５７］ウィスターラット肝臓からの一次ＨＳＣの単離を、主に過去の報告書（Ｗｅｉｓｋｉｒｃｈｅｎら２００５）で提供されている方法に従って実施した。簡潔には、肝細胞除去の後の細胞懸濁液の上清を洗浄し、９．５ｍｌのＧｅｙの均衡塩溶液（ＧＢＳＳ）で再懸濁し、ＧＢＳＳ中の８ｍｌの２８．７％（ｗ／ｖ）Ｈｉｓｔｏｄｅｎｚと混合した。６ｍｌのＧＢＳＳの下に細胞懸濁液を置くことによって勾配を調製し、Ｈｉｓｔｏｄｅｎｚ勾配において１４００×ｇで２０分間遠心分離した。星状細胞は、Ｈｉｓｔｏｄｅｎｚ溶液及び水性緩衝液の界面の直上のファジーバンドに分離した。星状細胞バンドを収集、洗浄し、１ウェルにつき１×１０６個の細胞を６ウェル培養プレートの１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を加えたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に播種した。ＨＳＣの生存度はトリパンブルー排除染色による判定で＞９５％であり、ＨＳＣの純度は計数した２００個を超える細胞でのグリア原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）ポジティブ染色による調査で＞９０％であった。一次ＨＳＣは３７℃の加湿ＣＯ２インキュベータ内で、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭで通常の方法によって培養し、それらが集密まで増殖したときにトリプシン処理（０．０５％トリプシン／０．５３ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））によって１：４の比に分割した。ＨＳＣ−Ｔ６細胞株は、Ｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｎｅｗ ＹｏｒｋのＳｃｏｔｔ Ｆｒｉｅｄｍａｎ博士が快く提供された。既報（Ｍａｕｂａｃｈら２００６）のように、安定したＴ６／ＧＦＡＰ−ＬａｃＺクローン細胞株が確立された。ＨＳＣ−Ｔ６及びＴ６／ＧＦＡＰ−ＬａｃＺ細胞は、一次ＨＳＣと同じ条件で培養した。]
[0106] ［００１５８］ＩＭＳによる細胞処理
［００１５９］ＩＭＳの保存溶液を、それらの溶解性によってジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又はＨ２Ｏで調製した。培地中の最終ＤＭＳＯ濃度は、０．２％（ｖ／ｖ）以下に維持した。ＮＡＣはＭｅｒｃｋ ＫＧａＡ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から得、ＥＧＣＧはＳｉｇｍａから購入し、さらなる精製なしで直接用いた。先ず細胞を細胞培養プレート又はフラスコ内の１０％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭに１８〜２４時間播種し、その後、様々な濃度の化合物を異なる時間加えた。各処理の詳細を、図の凡例で見ることができる。]
[0107] ［００１６０］細胞のＲＯＳ判定
［００１６１］処理されたＨＳＣ−Ｔ６細胞のＲＯＳレベルは、ジクロロフルオレセイン（ＤＣＦ）標識法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．、ＯＲ、ＵＳＡ）を用いて判定した。培養した細胞をトリプシン処理によって収集し、無フェノールレッドＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁した。次に細胞をＤＭＥＭ中の１０μｇ／ｍｌの２’，７’−ジクロロ−フルオレセイン二酢酸（ＤＣＦＨ−ＤＡ）と１５分間インキュベートし、その後アッセイのためにＤＭＥＭに再懸濁した。細胞溶液を黒壁の９６ウェルプレートに３反復で注入し、Ｔｅｃａｎ Ｓａｆｉｒｅ ＩＩプレートリーダーによりＥｘ＝４８５ｎｍ及びＥｍ＝５３０ｎｍで蛍光を読み取った。蛍光単位は、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴアッセイ、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ、ＵＳＡ）を用いて測定した、生存細胞数に対して正規化した。細胞のＲＯＳレベルは、対照試料と比較して表した。]
[0108] ［００１６２］グルタチオン（ＧＳＨ）及びＧＳＨ／グルタチオンジスルフィド二量体（ＧＳＳＧ）アッセイ
［００１６３］総細胞ＧＳＨ及びＧＳＳＧレベルは、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ、ＵＳＡ）からのアッセイキットを、製造業者の指示に従って用いて測定した。簡潔には、ＤＢＺＩＭ、ＴＤＢＺＩＭ、ＮＡＣ又はＥＧＣＧで処理したＨＳＣ−Ｔ６細胞を剥離し、６０％周波数の超音波処理によってリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３０秒間ホモジナイズし、４℃で１０分間の１６，０００×ｇによる遠心分離の後上清を収集した。試料のタンパク含有量は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイで測定した。]
[0109] ［００１６４］ＧＳＨアッセイのために、タンパク質試料をメタリン酸（Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログＮｏ．２３９２７−５）によって脱タンパクし、マニュアルに従ってｐＨをトリエタノールアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログＮｏ．Ｔ５８３０−０）で調節した。試料は、還元形態及び酸化形態の両方を含む総ＧＳＨの分析の準備ができた。最初にＧＳＨを２−ビニルピリジンで誘導体化し、別々に分析することによって、ＧＳＨを除くＧＳＳＧの定量化を実施した。Ｔｅｃａｎ Ｓａｆｉｒｅ ＩＩプレートリーダーを用いて、比色シグナルを４０５ｎｍで記録した。ＧＳＨ又はＧＳＳＧのレベルは、ｎｍｏｌ／μｇのタンパク質として測定した。]
[0110] ［００１６５］グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）、カタラーゼ（ＣＡＴ）及びスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）アッセイ
［００１６６］３つの抗酸化酵素、ＧＰｘ、ＣＡＴ及びＳＯＤの活性レベルを、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌからのアッセイキットを用いて測定した。ＧＰｘ及びＣＡＴ活性を試験するために、１ｍＭのＥＤＴＡを含む氷冷ＰＢＳにタンパク質試料を収集した。ＳＯＤ活性を試験するために、１ｍＭのエチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、２１０ｍＭのマンニトール及び７０ｍＭのショ糖を含む、２０ｍＭのＮ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液でタンパク質試料を調製した。タンパク含有量は、ＢＣＡアッセイで測定した。]
[0111] ［００１６７］ＧＰｘ活性は、ＧＳＨレダクターゼによる共役反応によって間接に測定した。ＧＰｘによるＨ２Ｏ２の還元後に生成される酸化されたＧＳＨは、グルタチオンレダクターゼ（ＧＲ）及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）によってその還元状態に再循環される。ＮＡＰＤＨの酸化はＧＰｘ活性に比例し、３４０ｎｍにおける吸光度の低下として測定することができる。ＧＰｘ活性は、ｎｍｏｌ／分／ｍｇのタンパク質として表した。]
[0112] ［００１６８］ＣＡＴ活性は、Ｈ２Ｏ２存在下での酵素とメタノールとの反応に基づいて測定した。生成したホルムアルデヒドは、色素原としてＰｕｒｐａｌｄを用いて５４０ｎｍで分光測光法により測定した。ＣＡＴ活性は、ｎｍｏｌ／分／ｍｇのタンパク質として表した。]
[0113] ［００１６９］全３種類のＳＯＤ（Ｃｕ／Ｚｎ−、Ｍｎ−及びＦｅ−ＳＯＤ）を含む総ＳＯＤは、キサンチンオキシダーゼ及びハイポサンチン（ｈｙｐｏｓａｎｔｈｉｎｅ）によって生成されたスーパーオキシドラジカルを検出するためにテトラゾリウム塩を用いて定量した。１単位のＳＯＤは、スーパーオキシドラジカルの５０％のジスムテーションを示すために必要とされる酵素の量と定義された。ＳＯＤ活性は、Ｕ／ｍｇのタンパク質として表した。]
[0114] ［００１７０］グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）アッセイ
［００１７１］第ＩＩ相抗酸化酵素ＧＳＴの活性は、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌからのキットを用いて分析した。１ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ緩衝液でタンパク質試料を収集し、タンパク質濃度をＢＣＡアッセイで測定した。総ＧＳＴ（サイトゾル及びミクロソーム）活性は、１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＣＤＮＢ）と還元型ＧＳＨとのコンジュゲーションを測定することによって分析し、３４０ｎｍにおける吸光度の増加によって監視した。ＧＳＴ活性は、ｎｍｏｌ／分／ｍｇのタンパク質として表した。]
[0115] ［００１７２］総ＲＮＡの単離及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
［００１７３］総ＲＮＡはＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡＩＩ単離キット（Ｎａｃｈｅｒｅｙ ＆ Ｎａｇｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて単離し、ＮＤ−１００分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＤＥ、ＵＳＡ）によって定量した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの詳細は、他で報告された（Ｚｈａｎｇら２００６）。簡潔には、Ｔａｑｍａｎ化学を用いる二段階リアルタイムＲＴ−ＰＣＲであった。総ＲＮＡは、先ずｃＤＮＡに逆転写し、リアルタイムＰＣＲを実行し、ＡＢＩ７５００高速リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）で検出した。ラットＧＦＡＰ、ＳＭＡＡ、コラーゲンＩａ１、フィブロネクチン、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β受容体Ｉ（ＴＧＦβＲＩ）及びＩＬ−６のためのプライマー及びプローブは、Ｔａｑｍａｎのアッセイ−オン−デマンドデータベースに注文した。ラットβ−アクチンを正規化遺伝子として用い、その発現レベルは、この試験の実験設定を通じて一定であった（ＣＴ差は＜±０．５であった）。標的ｍＲＮＡの相対的定量化は、比較閾値サイクル法（ΔΔＣＴ）をＵｓｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ＃２（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）に記載のように用いて計算した。相対的定量化は、対照と比較して処理下での標的遺伝子の上方制御又は下方制御を表す、２−ΔΔＣＴによって与えられた。]
[0116] ［００１７４］
ウェスタンブロット法
［００１７５］タンパク質抽出物は、ＧＦＡＰのためには沸騰させた１０容量の１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（９０〜９５℃）中で細胞ペレットを１０分間溶解することによって、又は核タンパク質のためのＰｉｅｒｃｅ（ＩＬ、ＵＳＡ）からのＮＥ−ＰＥＲ核及び細胞質抽出試薬若しくはＳＭＡＡ、フィブロネクチン、コラーゲンαＩ（Ｉ）、ＴＧＦ−β１及びＴＧＦβＲＩのためのＲＩＰＡ（Ｐｉｅｒｃｅ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いることによって調製した。タンパク含有量は、ＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いて定量した。１５μｇの総タンパクを４〜１２％勾配ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）ゲルに溶解し、ニトロセルロース膜に移した。次に膜を、ＧＦＡＰ（Ｄａｋｏ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＳＭＡＡ（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）、プロコラーゲンαＩ（Ｉ）、フィブロネクチン、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｆｏｓ、ＪｕｎＢ、ＪｕｎＤ、Ｆｒａ−１、Ｆｒａ−２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＮＦ−κＢ Ｐ６５、ＴＧＦ−β１及びＴＧＦβ ＲＩ（Ａｂｃａｍ、ＵＫ）に対する一次抗体で精査し、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって検出した。フィブロネクチン及びｃｏｌ１ａ１のブロッティングのために、タンパク質抽出物を３〜８％トリス−アセテートゲルで分離した。タンパク質バンドは、ＥＣＬ化学発光試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）と反応させることによって、Ｘ線フィルムに記録した。αチューブリン（Ａｂｃａｍ、ＵＫ）を総タンパクのための負荷対照として用い、Ｔａｔａ結合性タンパク質（ＴＢＰ）（Ａｂｃａｍ、ＵＫ）を核タンパク質のための負荷対照として用いた。]
[0117] ［００１７６］β−ガラクトシダーゼ活性の定量化
［００１７７］ＤＢＺＩＭ又はＴＤＢＺＩＭによって処理されたＴ６／ＧＦＡＰ−ｌａｃＺ細胞からの抽出物中のβ−ガラクトシダーゼ活性は、９６ウェルプレートフォーマットで化学発光アッセイキット（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造業者の指示通りに用いて測定した。簡潔には、細胞を氷冷１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄し、溶解緩衝液中で、室温で３０分間溶解した。Ｔｅｃａｎ Ｓａｆｉｒｅ ＩＩプレートリーダーによるアッセイのために、上清を収集した。タンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、ＩＬ、ＵＳＡ）で測定した。特異的β−ガラクトシダーゼ活性は、総細胞タンパク含有量に対して正規化することによって得られた。]
[0118] ［００１７８］マウスにおけるＩＭＳの一般毒性
［００１７９］ＩＭＳ（ＤＰＩＭ及びＤＢＺＩＭ）を生理食塩水に溶解し、フレンドウイルスＢ型（ＦＶＢ）マウス（約２５〜３０ｇ重）に２週間の間隔日、腹腔内投与した。投薬量は、ＤＰＩＭについては０、２００、３００、３５０、４００及び５００ｍｇ／ｋｇ、ＤＢＺＩＭについては０、１０、３０、３５、４０及び５５ｍｇ／ｋｇであった。注射容量は、１００〜１６０μｌに維持した。処理の後、マウスの死亡率を評価した。動物実験プロトコルは、Ｂｉｏｐｏｌｉｓ、ＳｉｎｇａｐｏｒｅにあるＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＲＣ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）に承認された。]
[0119] ［００１８０］統計分析
［００１８１］すべての定量結果を、平均値及び平均値の標準誤差（ＳＥＭ）で示した。実験データは、不均等な分散を仮定してスチューデントの両側ｔ検定を用いて分析した。≦０．０５のＰ値は、統計的に有意であるとみなした。]
[0120] ［００１８２］マウスの肝臓線維症に対するＩＭＳの効果
［００１８３］肝臓毒素チオアセタミド（ＴＡＡ）モデルについては、マウスで肝臓線維症を誘導するために、ＴＡＡを体重１ｋｇにつき２００ｍｇの腹腔内注射によって週３回、１２週間与えた。胆管結紮モデル（ＢＤＬ）については、ケタミン（１５０ｍｇ／ｋｇ）／キシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）による腹腔内注射を通して成体マウスに麻酔をかけた。中央線の開腹手術を行って総胆管を曝露させ、次にそれを５−０の絹糸縫合により結紮した。対照動物では、胆管を曝露させるが、結紮しない。ＤＢＺＩＭ又はＤＰＩＭは、１〜１０００ｍｇ／リットルの濃度で飲料水に含ませてマウスに与えた。線維症肝臓のコラーゲン含有量は、肝臓組織切片のシリウスレッド染色によって調査した。]
[0121] ［００１８４］ＢＤＬによって誘導された肝臓線維症に対するＤＰＩＭの効果に関して、追加の研究を実施した。ＤＰＩＭは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。]
[0122] ［００１８５］マウス及び化合物投与
［００１８６］１２時間の明暗周期で、特定病原体未感染（ＳＦＰ）設備で飼育され、水及び食事を自由摂取させた雄ＦＶＢ／Ｎマウス（８〜１０週齢）を試験で用いた。動物実験プロトコルは、ＳｉｎｇａｐｏｒｅのＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ（ＢＭＲＣ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）に承認された。]
[0123] ［００１８７］胆汁うっ滞線維症を、ＢＤＬによって誘導した。簡潔には、マウスをケタミン（１５０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって麻酔をかけ、中央線開腹の後、総胆管を５−０の絹糸縫合で２回結紮した。胆管を二重結紮しなかったことを除き、疑似手術を同様に実施した。実験マウスを４群に分けた。１）対照のみ（疑似手術をしたがＢＤＬはなし）、２）対照＋ＤＰＩＭ、３）ＢＤＬだけ、４）ＢＤＬ＋ＤＰＩＭ。各群は、６〜８匹のマウスからなる。処理のためのＤＰＩＭ化合物は、それぞれ５００ｍｇ／ｌ、７５０ｍｇ／ｌ、１ｇ／ｌの３つの濃度で飲料水に入れて与えた。ＤＰＩＭを含有する飲料水は、毎週交換した。平均して、各マウス（正常であるか手術された）は、約３〜４ｍｌの真水又はＤＰＩＭを含有する水を毎日飲んだことが観察された。ＮＭＲ分析による試験も実施し、ＤＰＩＭが室温条件で少なくとも２週間、水中で安定であることが確認された。化合物による処理は、動物がＢＤＬ処置から回復した後の３日目に開始した。４週間後に、肝臓をマウスから取り出し、１０％ホルマリンで固定し、その後パラフィンで包埋した。]
[0124] ［００１８８］肝酵素の測定
［００１８９］血清を眼窩後法によって収集し、Ｃｏｂａｓｅ ｃ １１１（Ｒｏｃｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）による自動手順で血清アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）活性を測定した。]
[0125] ［００１９０］シリウスレッドによるコラーゲン染色
［００１９１］コンシステンシーについては、コラーゲン量を視覚化するために、左及び中央の葉から調製したパラフィン切片をシリウスレッドで染色した。簡潔には、ワックス除去、再水和、自然乾燥の後、切片を０．１％シリウスレッド溶液で１時間染色し、０．５％酢酸で２回洗浄し、次にエタノールを３回交換して脱水し、最後に切片をキシレンで透明にし、Ｈｉｓｔｏｍｏｕｎｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｇｅｏｒｇｉａ、ＵＳＡ）でマウントした。それぞれ左及び中央の各葉について、コラーゲンの染色領域を低倍率（４×）の下で少なくとも６つの独立視野で測定し、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアで定量化した。]
[0126] ［００１９２］統計分析
［００１９３］特に明記しない限り、全表示画像は、６〜８匹のマウスを代表する。すべての定量データは、平均値±ＳＥで表し、異なる処理群の間の差は、対応のないスチューデントの両側ｔ検定によって分析し、０．０５未満のＰ値は、統計的に有意であるとみなした。]
[0127] ［００１９４］肝細胞癌及び他の腫瘍細胞に対するＤＢＺＩＭの効果
［００１９５］ＤＢＺＩＭ（１，３−ビスベンジルイミダゾリウムブロミド）は、公開された方法（Ｈａｒｌｏｗら１９９６）に基づいて合成した。]
[0128] ［００１９６］細胞培養及び化合物による処理
［００１９７］ヒト肝細胞癌細胞株。ＨＬＥ（未分化細胞株）及びＨｅｐＧ２（分化細胞株）は、ＪＣＲＢ（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）から購入した。ヒト胃癌細胞株ＡＧＳ及びＭＫＮ２８、肺癌細胞株Ｈ１２９９、乳癌細胞株ＭＣＦ−７、グリオーマ細胞株Ｕ８７ ＭＧ及びＣ６のすべては、ＡＴＣＣから購入した。細胞株は、３７℃の加湿ＣＯ２インキュベータ内で、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭで通常の方法によって培養し、それらが集密まで増殖したときにトリプシン処理（０．０５％トリプシン／０．５３ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））によって１：４の比に分割した。
［００１９８］ＤＢＺＩＭの保存溶液は、水で調製した。先ず細胞を細胞培養プレート又はフラスコ内の１０％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭに１８〜２４時間播種し、その後、様々な濃度の化合物を異なる時間加えた。各処理の詳細を、図の凡例で見ることができる。]
[0129] ［００１９９］ＤＮＡ含量分析
［００２００］９６ウェルプレートで増殖させたＨＬＥ細胞を、６反復により化合物で２４時間処理した。次に細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＤＡＰＩで染色した。細胞は、ＡｒｒａｙＳｃａｎＶＴＩ ＨＣＳリーダー（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰＡ、ＵＳＡ）で分析、画像化し、ＤＮＡ含量（２Ｎ対４Ｎ）は、ＤＡＰＩ染色に基づいて測定した。]
[0130] ［００２０１］細胞増殖アッセイ
［００２０２］ＨＬＥ細胞を増殖させ、９６ウェルプレートにおいて６反復により化合物で４８時間処理した。次に細胞を４％パラホルムアルデヒドによって固定し、Ｈｉｔｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いてＤＡＰＩ及びＢｒｄＵ抗体で染色した。細胞は、ＡｒｒａｙＳｃａｎＶＴＩ ＨＣＳリーダー（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰＡ、ＵＳＡ）で画像化、分析した。核染色に基づいて細胞数を計数し、ＢｒｄＵの取込みを測定して、陽染性細胞の割合で表した。]
[0131] ［００２０３］グリオーマ細胞株の増殖。ＤＢＺＩＭ処理下のＵ８７ ＭＧ及びＣ６を、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＳ）に基づく増殖アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ、ＵＳＡ）を用いて調べた。対照及び処理細胞（４８時間後）に直接ＭＴＳ試薬を加え、Ｔｅｃａｎ Ｓａｆｉｒｅ ＩＩプレートリーダーを用いて吸光度シグナルを４９０ｎｍで読み取った。胃癌細胞株ＡＧＳ、肺癌細胞株Ｈ１２９９及び乳癌細胞株ＭＣＦ−７についても同様に増殖を実施したが、ＩＣ５０値は４８時間の代わりに７２時間時に測定した。]
[0132] ［００２０４］細胞ベースのカスパーゼ３／７及びＬＤＨアッセイ
［００２０５］カプスパーゼ（Ｃａｐｓｐａｓｅ）３／７活性及び乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出は、蛍光定量アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．、ＷＩ、ＵＳＡ）によって測定した。ＨＣＣ細胞を９６ウェルプレートで培養し、様々な濃度のＤＢＺＩＭによって６時間処理した後アッセイにかけた。カスパーゼ３／７アッセイについては、培地を除去し、基質緩衝液を加えて細胞を溶解し、カスパーゼ３／７と反応させ、蛍光シグナルを発生させ、それを１時間のインキュベーションの後、Ｔｅｃａｎ Ｓａｆｉｒｅ ＩＩプレートリーダーによりＥｘ＝４８５ｎｍ及びＥｍ＝５３０ｎｍで読み取った。化合物処理による試料細胞のカスパーゼ３／７活性は、対照細胞への正規化の後の相対的な倍率変化で表した。ＬＤＨアッセイ（膜統合性を示す）は、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐからのキットを製造業者の指示に従って用いて実施した。]
[0133] ［００２０６］タンパク質抽出物に基づくカスパーゼ３／８／９比色アッセイ
［００２０７］カプスパーゼ３／８／９活性は、出発物質として総タンパク抽出物を用いて測定した（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ Ｉｎｃ．、ＣＡ、ＵＳＡ）。ＨＬＥ細胞をＴ７５フラスコ中で培養し、様々な濃度のＤＢＺＩＭで処理した。サイトゾルタンパク質抽出物は、細胞をペレット化、溶解し、遠心分離によって破片を除去することによって収集した。カプスパーゼ３、８及び９の活性は、同じタンパク質抽出物を用いたが、それぞれの基質を加えて分析した。吸光度は、Ｔｅｃａｎ Ｓａｆｉｒｅ ＩＩプレートリーダーを用いて、４０５ｎｍで読み取った。結果は、化合物処理のない対照細胞に正規化することによって、相対カスパーゼ活性で表した。]
[0134] ［００２０８］アネキシンＶ染色及びサイトメトリーによる分析
［００２０９］ＨＬＥ及びＨｅｐＧ２細胞を様々な濃度のＤＢＺＩＭ又はＴＲＡＩＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）で２４時間処理し、収集し、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）で標識した。標識細胞は、フローサイトメトリーＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｄｉｃｋｓｏｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）及びＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアによって分析した。原形質膜の緑色の染色を示す細胞は、アポトーシス細胞とみなした。]
[0135] ［００２１０］ＡＩＦ／サバイビン転位アッセイ
［００２１１］９６ウェルプレートで培養したＨＬＥ細胞をＤＢＺＩＭで２４時間処理した後、染色及び画像化を実施した。次に細胞を固定し、アポトーシス誘導性タンパク質（ＡＩＦ）及びサバイビン（Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐ．ＣＡ、ＵＳＡ）に対する抗体、並びにＨｉｔｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＩＬ、ＵＳＡ）からの緩衝試薬で染色した。細胞を、ＡｒｒａｙＳｃａｎＶＴＩ ＨＣＳリーダー（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰＡ、ＵＳＡ）で画像化し、分析した。細胞質から核への転位を表示するために、細胞質及び核領域の蛍光強度をプロットした。]
[0136] ［００２１２］ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット
［００２１３］タンパク質抽出物は、細胞ペレットを、総タンパク抽出のためにはＲＩＰＡ緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ、ＩＬ、ＵＳＡ）で、又は核及び細胞質分画のためにはＰｉｅｒｃｅ（Ｐｉｅｒｃｅ、ＩＬ、ＵＳＡ）からのＮＥ−ＰＥＲ試薬で、又はミトコンドリア及びサイトゾル分画のためにはＢｉｏＶｉｓｉｏｎ（ＣＡ、ＵＳＡ）からのキットで溶解することによって調製した。ＢＣＡ Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いて、タンパク含有量を定量した。１５マイクログラムのタンパク質を４〜１２％勾配ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）ゲルに溶解し、ニトロ細胞（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌａｒ）膜に移した。次に膜をそれぞれＢｃｌ−ＸＬ、Ｂａｋ、Ｂｃｌ−２α、Ｂａｘ（Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐ．、ＣＡ、ＵＳＡ）、サバイビン、ｘＩＡＰ、ｃＩＡＰ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、ＭＮ、ＵＳＡ）、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｆｏｓ、ＪｕｎＢ、ＪｕｎＤ、Ｆｒａ−１、Ｆｒａ−２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）に対する一次抗体で精査し、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって検出した。タンパク質バンドは、ＥＣＬ化学発光試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）と反応させることによって、Ｘ線フィルムに記録した。αチューブリン（Ａｂｃａｍ、ＵＫ）を総タンパクのための負荷対照として用い、Ｔａｔａ結合性タンパク質（ＴＢＰ）（Ａｂｃａｍ、ＵＫ）を核タンパク質のための負荷対照として用い、Ｃｏｘ４（Ａｂｃａｍ、ＵＫ）をミトコンドリアタンパク質のための負荷対照として用いた。]
[0137] ［００２１４］ＲＯＳ測定
［００２１５］酸化的ストレスは、Ｃｅｌｌｏｍｉｃ ＨｉｔＫｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いて測定した。ＨＬＥ細胞をＤＢＺＩＭで２４時間処理し、固定し、ＲＯＳ生成の定量化のためにはジヒドロエチジウムプローブで、核染色のためにはヘキスト色素で標識した。結果を、Ｔａｒｇｅｔ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ＢｉｏＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎソフトウェアによって分析した。ＲＯＳ量の指標として、陽性応答細胞の割合をプロットした。]
[0138] ［００２１６］細胞毒性及びアポトーシスのための高含有量分析
［００２１７］Ｈｉｔｋｉｔ：追加のＩＭＳの細胞毒性及びアポトーシスプロフィールを調べるために、多パラメータ細胞毒性１及び多パラメターアポトーシス１アッセイキット（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰＡ、ＵＳＡ）を用いた。細胞を９６−ウェルプレートで２４時間培養、処理した後に検査した。細胞は、基本的に製造業者の指示に従って固定、染色した。画像は、それぞれ、ＡｒｒａｙＳｃａｎＶＴＩ ＨＣＳリーダー（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰＡ、ＵＳＡ）によってとり、Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ＢｉｏＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎソフトウェアを用いて分析した。]
[0139] ［００２１８］ＨＣＣ異種移植モデル及び投薬
［００２１９］５〜６週齢のＢａｌｂ／ｃヌードマウスを、０．２ｍｌ容量のマトリゲル／ＤＭＥＭミックス中の１×１０７個のＨｕｈ７細胞で接種した。ＨＣＣ細胞の植え付け後にすべてのマウスが腫瘍を発達させたわけではないので、可視的腫瘍（植え付け後約８週間）を有するものだけを以降の実験のために用いた。担癌マウスは、それぞれ対照及び処理群（ｎ＝３）にランダムに分割した。処理群のマウスはＤＢＺＩＭ（２グラム／リットル）を含有する飲料水だけを自由摂取させ、対照群のマウスは水だけを自由摂取させた。化合物処理は、３週間続いた。腫瘍サイズは毎週測定し、腫瘍容量は、式０．５２×幅２×長さを用いて計算した。]
[0140] ［００２２０］追加のＩＭＳの抗癌活性
［００２２１］ＩＭＳの合成及び特性評価
［００２２２］特に明記しない限り、すべての溶媒及び化学物質は、民間納入業者から得たまま用いた。遠心分離は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ５８１０Ｒ（４０００ｒｐｍ、１０分間）で実施された。１Ｈ及び１３ＣＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＶ−４００（４００ＭＨｚ）装置に記録した。１Ｈ及び１３Ｃ ＮＭＲのデータは、化学シフト（δｐｐｍ）及び多重度（ｓ＝一重項、ｄ＝二重項、ｔ＝三重項、ｑ＝四重項、ｍ＝多重項）で記録した。ＧＣ−ＭＳは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＧＣＭＳ ＱＰ２０１０で実施した。気液クロマトグラフィー（ＧＬＣ）は、分割モード毛細管注入系及び炎イオン化検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ ６８９０Ｎガスクロマトグラフで実施した。]
[0141] ［００２２３］置換されたイミダゾールを調製するために、ＮａＨ（油中に６０％、４２０ｍｇ、１０．５ｍｍｏｌ）を０℃のイミダゾール（Ａ１）（６８０ｍｇ、１０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液に加え、生じた懸濁液を室温で２時間撹拌した。ベンジルブロミド（１．７１ｇ、１０ｍｍｏｌ）を、残留物に加えた。生じた溶液を、室温でさらに４時間撹拌した。溶媒を、減圧下で除去した。生成物をジクロロメタン（ＤＣＭ）で抽出し、溶媒を除去した後にＢ１を定量的な収量で得た。Ｂ２〜Ｂ４は、イミダゾール出発物質でＡ２〜Ａ４と同じプロトコルで合成した。生成物は、ＭＳ及びＮＭＲによって確認した。]
[0142] ]
[0143] ［００２２４］ＤＢＺＩＭ、ＤＢＺＢＩＭ、１，３−ジベンジル−２−メチルイミダゾリウムブロミド（ＤＢＺＭＩＭ、化合物Ｃ）、ＩＢＮ−２、３、４、６、８、９（化合物）、１２、１３、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、３４は、１ｍｌのＤＭＦ中で１ｍｍｏｌの置換されたイミダゾール（Ｂ１〜Ｂ４など）及び１ｍｍｏｌの置換された臭化（塩化）ベンジル又は臭化（塩化）アルキルを混合することによって合成した。混合液を１００℃で１６時間撹拌した。反応混合液を室温に冷却し、エーテル（１０ｍｌ）を加えて生成物を沈殿させた。粉状又はゲル状沈殿物をイミダゾリウム生成物として収集し、再結晶又はクロマトグラフ法によって精製し、ＮＭＲによって特性を決定した。]
[0144] ［００２２５］ＩＢＮ−２２、２３、２９は、文献の方法に基づいて調製した（Ｚｈａｎｇら２００７、Ｃｈｉａｎｅｓｅ ａｎｄ Ｃｒａｔｒｅｅ ２００５、Ｂｏｙｄｓｔｏｎら２００５）。]
[0145] ［００２２６］表２に記載の残りのＩＭＳは、Ｓｉｇｍａから購入した。]
[0146] ［００２２７］一般的に、ＩＭＳの１００ｍＭの保存溶液をＤＭＳＯで調製した。保存溶液の一定量を、使用時まで−２０℃で保存した。]
[0147] ［００２２８］細胞株及び細胞培養
［００２２９］ヒト肝細胞癌細胞株ＨＬＥ（ｐ５３突然変異体）及びヒト胃癌細胞株ＭＫＮ ２８は、Ｊａｐａｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（大阪、日本）から得た。ヒト乳癌細胞株ＭＤＡＭＢ２３１（突然変異体ｐ５３）及び乳房上皮細胞ＭＣＦ−１０Ａ（野生型ｐ５３）は、ＡＴＣＣから得た。これらの細胞株は、５％ＣＯ２の雰囲気で３７℃でインキュベートした、１０％ウシ胎児血清並びにペニシリン及びストレプトマイシンの混合物１％を加えたＤＭＥＭ培地（ＭＤＡＭＢ２３１についてはＲＰＭＩ１６４０）で維持した。]
[0148] ［００２３０］増殖阻害アッセイ
［００２３１］増殖阻害率は、生存細胞を測定するためにＭＴＴアッセイを用いて判定した。ＭＴＴアッセイのために、１ウェルにつき１×１０３個の細胞を９６ウェルプレートで培養し、０〜１００μＭの各種のＩＭＳで７２時間処理した。加湿インキュベータ内で３７℃で指定時間のインキュベーションの後、１０μＬのＭＴＴ試薬（５ｍｇ／ｍＬ）で置換した１００μＬの培地を含む培地を各ウェルに加え、さらに４時間インキュベートした。１００μＬのＤＭＳＯを加えることによって、反応を停止させた。吸光度は、マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒｏＭａｘ １９０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により５７０ｎｍで測定した。データは３つの別々の実験から提供され、ＩＭＳによって誘導された細胞増殖阻害の割合を判定し、そこではＤＭＳＯ処理細胞（対照）を１００％とした。]
[0149] ［００２３２］細胞周期分析
［００２３３］細胞周期分布分析を実施するために、４×１０５個の細胞を１０ｃｍ培養皿に平板培養した。細胞（７０％集密度）を２４時間血清不足にして、それらを細胞周期のＧ０期に同期させた。２４時間のインキュベーションの後、細胞を新しい１０％ＤＭＥＭ培地に置換し、次に６０μＭのＩＢＮ−１５、９０μＭのＩＢＮ−１９、９０μＭのＩＢＮ−２４、３０μＭのＩＢＮ−２４及び２０μＭのＩＢＮ−３２、並びに対照として０．０４５％ＤＭＳＯで７２時間処理した。浮遊性及びトリプシン処理をした接着性細胞を収集し、ＰＢＳで洗浄した。細胞ペレットを１ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、７０％氷冷エタノールの添加によって固定し、−２０℃で保存した。２４時間のインキュベーションの後、遠心分離によって細胞を再ペレット化し、細胞をＰＢＳで１度洗浄し、１００μｇ／ｍｌのＲＮアーゼを含む０．１ｍＬのＰＢＳで再懸濁し、次に３７℃で１５分間インキュベートした。最後に、０．５ｍｌのＰＩ溶液（ＰＢＳ中に１００μｇ／ｍＬ）で細胞を３０分間染色した。細胞周期分布は、ＢＤＦＡＣＳアレイフローサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって検出した。Ｇ０未満のＤＮＡを有する細胞は、アポトーシス細胞と分類した。]
[0150] ［００２３４］アポトーシスアッセイ
［００２３５］アポトーシス分析を判定するために、４×１０５個の細胞を１０ｃｍ培養皿に平板培養した。次に、細胞を６０μＭのＩＢＮ−１５、９０μＭのＩＢＮ−１９、９０μＭのＩＢＮ−２４、３０μＭのＩＢＮ−２５及び２０μＭのＩＢＮ−３２、並びに対照として０．０４５％ＤＭＳＯで７２時間処理した。浮遊性の及びトリプシン処理をした接着性細胞を収集し、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ試薬（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）及びＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者のプロトコルに従って用いてアポトーシスを定量化した。簡潔には、細胞を冷たいＰＢＳで２回洗浄し、次に、１０μｌのアネキシンＶ−ＦＩＴＣ（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎａｇｅｎ）及び１００μｇ／ｍｌのストックからの２μｌのＰＩを含む１００μｌの等倍結合緩衝液に細胞を再懸濁した。細胞を穏やかに撹拌し、暗所において室温で１５分間インキュベートした。その後、４００μｌの１×結合緩衝液を各チューブに加え、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって試料を直ちに分析した。アネキシン−Ｖコンジュゲート及びＰＩの蛍光シグナルは、蛍光強度ＦＬ１及びＦＬ２（ソフトウェアＢＤを含むＢＤ ＬＳＲ ＩＩ）のチャネルで検出した。]
[0151] ［００２３６］ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット法
［００２３７］ＨＬＥ細胞を、１０ｃｍ培養皿に４×１０５の密度で播種した。２４時間のインキュベーションの後、細胞を新しい１０％ＤＭＥＭ培地に置換し、次に６０μＭのＩＢＮ−１５、９０μＭのＩＢＮ−１９、９０μＭのＩＢＮ−２４、３０μＭのＩＢＮ−２５及び２０μＭのＩＢＮ−３２、並びに対照として０．０４５％ＤＭＳＯで７２時間処理した。３日目に溶解緩衝液［１２５ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、２％ドデシル硫酸ナトリウム、１０％グリセロール、６Ｍ尿素及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）並びに０．０２％ブロモフェノールブルー］で全細胞溶解物を調製した。溶解物を３０秒間超音波処理し、次に沸点で５分間加熱した。溶解物を１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ＢＣＡタンパク質アッセイを用いて各試料のタンパク質濃度を推定した。次に溶解物を５％の２−メルカプトエタノールと混合し、−８０℃で保存した。ウェスタンブロット法のために、５０μｇの総細胞溶解物を含む試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードし、電気泳動にかけた。タンパク質をニトロセルロース膜に移し、次に、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝生理食塩水中の５％脱脂粉乳により、３７℃で６０分間ブロックした。５％ウシ血清アルブミンを含むＴＢＳＴで、４℃で一晩膜を一次抗体で精査した。次に、膜を西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗ウサギ又は抗マウス二次抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ ｃａｒｅ、Ｃｈａｌｆｏｎｔ Ｓｔ Ｇｉｌｅｓ、ＵＫ）とインキュベートした。検出は、製造業者のプロトコルに従って、増強化学発光（ＥＣＬ）試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）で実施した。ウサギポリクローナルホスホ−ｐ５３（Ｓｅｒ１５、２０、４６、３９２）、抗カスパーゼ−９、抗カスパーゼ−３、抗ＰＡＲＰ抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入した。ｐ５３及びｐ２１に対する抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。マウス抗βアクチンモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で膜を精査することによって、同等のタンパク質負荷が証明された。]
[0152] ［００２３８］免疫染色及び共焦鏡検
［００２３９］免疫染色のために、８ウェルチャンバスライドに１×１０４の密度でＨＬＥ細胞を播種した。２４時間のインキュベーションの後、細胞を２００μｌの新しい１０％ＤＭＥＭ培地に置換し、次に６０μＭのＩＢＮ−１５、９０μＭのＩＢＮ−１９、９０μＭのＩＢＮ−２４、３０μＭのＩＢＮ−２５及び２０μＭのＩＢＮ−３２、並びに対照として０．０４５％ＤＭＳＯで２４時間及び４８時間処理した。洗浄後、４％ホルムアルデヒドで細胞を１５分間固定し、ＰＢＳ中の０．５％トリトンＸ−１００で１０分間透過性化した。次に、３％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳで細胞を６０分間ブロックし、次に、ヌクレオリンに対するマウス抗体と１時間インキュベートした（ＭＳ−３、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ブロック緩衝液中で１：１００）。ＰＢＳで長時間洗浄した後、次に、暗所において室温で１時間、細胞をマウスＩｇＧ（１：２０希釈）に対するＦＩＴＣ結合抗体とインキュベートした。スライドは、ＤＡＰＩを含むＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄ培地（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）でマウントした。鏡検は、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０ Ｍｅｔａ（直立スタンド）共焦点顕微鏡で実施した。]
[0153] ［００２４０］リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ分析
［００２４１］細胞を、１０ｃｍ培養皿に１皿につき４×１０５細胞数の密度で播種した。翌日、細胞を９０μＭのＩＢＮ−１９、９０μＭのＩＢＮ−２４、４０μＭのＩＢＮ−２５、及び対照として０．０４５％のＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に曝露させた。４８時間後、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＲＮＡ ＩＩキットを製造業者の指示に従って用いて、細胞から総ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡの質及び収量は、分光光度測定の後評価した。]
[0154] ［００２４２］製造業者の指示（Ｓｕｐｅｒ Ａｒｒａｙ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に従ってヒトアポトーシスＰＣＲアレイ（ＲＴ２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ）を用い、９６ウェルフォーマットでアポトーシスに関与する８４個の重要な遺伝子のｍＲＮＡレベルを分析した。第１鎖のｃＤＮＡは、ＰＣＲアレイ第１鎖−合成キット（Ｃ−０３、Ｓｕｐｅｒ ａｒｒａｙ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、１μｇのＲＮＡで合成した。このキットは、逆転写酵素（Ｐｏｗｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ、Ｓｕｐｅｒ ａｒｒａｙ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びランダムプライマーとオリゴｄＴプライマーとの組合せを用いる。反応の総容量は、１００μＬに希釈した２０μＬであった。リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ２リアルタイムＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲマスターミックスＰＡ−０１２を有する７９ｓ００ＨＴ９６ウェルブロック、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ７５００）を用いて、ＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応の総容量は、２５μｌであった。１μｇのＲＮＡの同等量を、ＰＣＲ反応に加えた。サーモサイクラーパラメータは、９５℃で１０分間、その後、９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間を４０サイクルであった。遺伝子発現の相対変化は、ΔΔＣｔ（周期閾値）法を用いて計算した。５個のハウスキーピング遺伝子、ＧＡＰＤＨ、アクチン−β、β２ｍ、Ｈｐｒｔ１及びＲｐｌ１３ｄのサイクル数の平均を用いて、試料間の発現を正規化した。発現データは、調節倍率で示す。データを正規化する内部対照として、ＧＡＰＤＨ遺伝子発現レベルを利用した。記録された発現の変化倍率は、対照値に対する処理値の比である。]
[0155] ［００２４３］化合物９によるＨＣＣマウスの処理
［００２４４］５〜６週齢のＢａｌｂ／ｃヌードマウスを、０．２ｍｌ容量のマトリゲル／ＤＭＥＭミックス中の１×１０７個のＨｕｈ７細胞で接種した。ＨＣＣ細胞の植え付け後にすべてのマウスが腫瘍を発達させたわけではないので、可視的腫瘍（植え付け後約８週間）を有するものだけを以降の実験のために用いた。担癌マウスは、それぞれ対照及び処理群（ｎ＝３）にランダムに分割した。処理群のマウスは０．６ｇ／ｌ又は１．５ｇ／ｌの化合物９（ＩＢＮ−９）を含有する飲料水だけを自由摂取させ、対照群のマウスは水だけを自由摂取させた。化合物処理は、３週間続いた。腫瘍サイズは毎週測定し、腫瘍容量は、式０．５２×幅２×長さを用いて計算した。]
[0156] ［００２４５］統計分析
［００２４６］すべてのデータは、平均値±ＳＤで示す。群間の有意差は、対応のないスチューデントのｔ検定を用いて判定した。有意水準は、以下の通りに定義した：ｐ＜０．０５（＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）及びｐ＜０．００１（＊＊＊）。]
[0157] ［００２４７］結果
［００２４８］ＩＭＳの抗酸化、抗炎症及び抗線維症特性]
[0158] ［００２４９］培養ＨＳＣ Ｔ６細胞及びＦＶＢマウスに対するＩＭＳの毒性の判定
［００２５０］先ず、培養ＨＳＣ−Ｔ６細胞に対するＤＢＺＩＭ及びＴＤＢＺＩＭの毒性を、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＳ）に基づく増殖アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ、ＵＳＡ）を用いて調べた。図１ａ及び１ｂは、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで培養したＴ６細胞の増殖に対するＤＢＺＩＭ（０〜４００μＭ）及びＴＤＢＺＩＭ（０〜２００μＭ）の効果を示す。２５０〜４００μＭの高い濃度で、ＤＢＺＩＭは細胞増殖を統計的に有意に３．５〜８．９％阻害した。１２５〜２００μＭの高い濃度で、ＴＤＢＺＩＭは対照と比較して１３〜１９％のより強い阻害を証明した。] 図１ａ
[0159] ［００２５１］予備毒性試験では、ＦＶＢ近交系マウスでのインビボ試験のために、２つの形態のＩＭＳを選択した。ＤＢＺＩＭについては、致死投薬量は５０ｍｇ／ｋｇであり、ＬＤ５０は３０〜４０ｍｇ／ｋｇと推定された。ＤＰＩＭについては、致死投薬量は５００ｍｇ／ｋｇ、ＬＤ５０は約３００〜４００ｍｇ／ｋｇであった。]
[0160] ［００２５２］ＤＢＺＩＭ及びＴＤＢＺＩＭは細胞のＲＯＳレベルを減弱させ、ＧＳＨ／ＧＳＳＧ比を高めた。
［００２５３］ＩＭＳで処理したＨＳＣ Ｔ６細胞の細胞内酸化的ストレスレベルを測定するために、完全血清培地でＤＢＺＩＭ（１０、５０、１００及び３００μＭ）又はＴＤＢＺＩＭ（１０、５０及び１００μＭ）と４８時間培養した細胞を、ＲＯＳ、ＧＳＨ及びＧＳＳＧについて試験した。ＮＡＣ（１又は５ｍＭ）及びＥＧＣＧ（２５μＭ）で処理した細胞を、参照として含めた。ＩＭＳ処理は、有意に減弱された細胞ＲＯＳレベルをもたらした。図２ａに示すように、ＲＯＳはＤＢＺＩＭによって投薬量依存的に抑制された（５０μＭで２５％（Ｐ＜０．００５）、３００μＭで３４％（Ｐ＜０．０００５））。ＤＢＺＩＭの三量体を含むＴＤＢＺＩＭは、１０μＭで細胞のＲＯＳレベルを１９％（Ｐ＜０．０１）、１００μＭで３６％（Ｐ＜０．００００１）実質的に抑制した（図２ｂ）。比較では、ＥＧＣＧは２５μＭでＲＯＳを１４％（Ｐ＜０．００５）減弱させることができたが、ＮＡＣは１ｍＭでさえＲＯＳレベルに対する明らかな阻害を示さなかった。] 図２ａ 図２ｂ

权利要求:

請求項1
一般式Ｉの化合物又はそのオリゴマー若しくはポリマー、又は薬学的に許容されるその塩の有効量と、細胞を接触させることを含む、抗線維症剤又は抗癌剤を細胞に送達する方法。［式中、破線は不在であるか、Ｒ１及びＲ３が結合する炭素とＲ２及びＲ４が結合する炭素との間で第２の結合を形成する結合として存在し、Ｒ１及びＲ２は、（ｉ）各々独立にＨ、直鎖若しくは分枝状のＣ１〜Ｃ６アルキル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルケニル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ６〜Ｃ１０アリールであるか、（ｉｉ）それらの環原子と一緒に６〜１０員環の縮合した飽和、不飽和若しくは芳香族の環系を形成するか、（ｉｉｉ）Ｒ１及びＲ５がそれらの環原子と一緒に、又はＲ２及びＲ６がそれらの環原子と一緒に、５〜１０員環の縮合した飽和、不飽和若しくは芳香族の環系を形成し、Ｒ１及びＲ２の他のものが前記（ｉ）で定義される通りであるか、又は、（ｉｖ）Ｒ１及びＲ５がそれらの環原子と一緒に、並びにＲ２及びＲ６がそれらの環原子と一緒に各々５〜１０員環の縮合した飽和、不飽和若しくは芳香族の環系を形成し、Ｒ３及びＲ４の両方がＨであるか、又は、Ｒ１及びＲ２がそれらの環原子と一緒に６〜１０員環の縮合芳香環系を形成する場合、若しくは破線が結合として存在する場合、Ｒ３及びＲ４が不在であり、Ｒ５又はＲ６は、（ｉ）Ｒ１及びＲ２について上で定義される通りであるか、又は（ｉｉ）各々独立に直鎖若しくは分枝状のＣ１〜Ｃ６アルキル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルケニル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルキニル、縮合シクロアルキル環系を含むＣ３〜Ｃ１８シクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ６〜Ｃ１０アリール−Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール−Ｃ２〜Ｃ６アルケニル若しくはＣ６〜Ｃ１０アリール−Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル−Ｃ６〜Ｃ１０アリール若しくはＣ２〜Ｃ６アルキニル−Ｃ６〜Ｃ１０アリールであり、Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル又はハロであり、その際、該当する場合、Ｒ１〜Ｒ７のいずれかは、１つ又は複数の炭素原子が、Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＰから選択されるヘテロ原子で任意選択で置き換えられ、且つ直鎖若しくは分枝状のＣ１〜Ｃ６アルキル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルケニル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルキニル、縮合シクロアルキル環系を含むＣ３〜Ｃ１８シクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、フルオロ、トリフルオロメチル、シアナト、イソシアナート、カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ６アシロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アシル、カルボニル、アミノ、アセチル、アセトキシ、オキソ、ニトロ、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ６アルキルカルボキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ２〜Ｃ６アルケノキシ、Ｃ２〜Ｃ６アルキノキシの１つ又は複数によって任意選択で置換され、Ｒ１及びＲ５が結合する環炭素原子並びにＲ２及びＲ６が結合する環炭素の１つが窒素原子によって任意選択で置換される。］
請求項2
前記化合物がイミダゾリウム又はイミダゾリウム塩である、請求項１に記載の方法。
請求項3
前記化合物がイミダゾリニウム又はイミダゾリニウム塩である、請求項１に記載の方法。
請求項4
Ｒ５がＲ６と同じである、請求項１に記載の方法。
請求項5
Ｒ５及びＲ６が炭化水素である、請求項１に記載の方法。
請求項6
薬学的に許容される前記塩が、塩化物、臭化物、テトラフルオロホウ酸又はヘキサフルオロリン酸塩である、請求項１に記載の方法。
請求項7
前記化合物が、１−エチル−３−メチルイミダゾリウム、１，３−ビスベンジルイミダゾリウム、１，３−ジイソプロピルイミダゾリウム、１，３−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルイミダゾリニウム、１，３−ビス（１−アダマンチル）イミダゾリウム、１，３−ビス（２，４，６−トリメチルフェニル）−イミダゾリニウム、１，３−ビス（２，６−ジイソプロピル−フェニル）−イミダゾリニウム、１，３−ジアリルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−メチルイミダゾリウム、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム、１−（１−アダマンチル）−３−（２，４，６−トリメチルフェニル）−４，５−ジヒドロイミダゾリウム、２−ベンジルイミダゾ［１，５−ａ］キノリニウム、１，３−ビス（１−アダマンチル）−ベンゾイミダゾリウム、１，３−ジシクロヘキシルベンゾイミダゾリウム、１，３−ジイソプロピルイミダゾリニウムテトラフルオロボレート、１，３−ジイソプロピルイミダゾリウム、２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−メチルイミダゾ［１，５−ａ］ピリジニウム、１−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−３−（２，４，６−トリメチルフェニル）−イミダゾリニウム、２−メシチル−５−メチルイミダゾ［１，５−ａ］ピリジニウム、２−メシチル−２，５，６，７−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアゾール−４−イウム、１，３−ビス（１−アダマンチル）イミダゾリニウム、１−ブチル−３−（２−ピリジニルメチル）−１Ｈ−イミダゾリウム、６，７−ジヒドロ−２−ペンタフルオロフネイル−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］−１，２，４−トリゾリウム、１−メチル−３−（２−ヒドロキシルエチル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−イソシアナトベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−カルボキシルベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（２，２−ジメトキシエチル）−イミダゾリウム、１−（２，４，６−トリメチルフェニル）−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１，３−ジベンジル−５−フェニルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−カルボキシルベンジル）−２−メチルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（３，４，５−トリメトキシベンジル）−２−メチルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテート−ベンジル）−２−メチル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルカルボキシレートベンジル）−２−メチル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（２，２−ジメトキシエチル）−２−メチル−イミダゾリウム、２，６−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウム）−ピリジン、２，２’−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウム）−１，１’−ビナフタレン、１−ベンジル−３−（４−メチルベンジル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（２−トリフルオロメチルベンジル）−２−メチルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルカルボキシレートベンジル）−５−フェニル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテートベンジル）−５−フェニル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルベンジル）−５−フェニルイミダゾリウム、（１，２−４，５−ジイミダゾリウム）−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラベンジル−ベンゼン、１−ベンジル−３−（２−プロピン−１−イル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（３−ヒドロキシル−プロピル）−イミダゾリウム、１，３−ジ（２−フェニルエチル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテートベンジル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（ピリジン−２−イル）−イミダゾリウム、１，３，５−トリス−（４−メチル−イミダゾリウム）−ｌｉｎｋｅｄシクロファン、１，３−ジベンジル−２−（１，３−ジベンジル−１Ｈ−イミダゾール−２（３Ｈ）−イリデン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール、１−ベンジル−３−メチル−イミダゾリウム、１−（４−シアナトベンジル）−３−メチル−イミダゾリウム、１−（４−カルボキシベンジル）−３−メチル−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（２，２−ジメトキシエチル）−イミダゾリウム、又は１−（２，４，６−トリメチルフェニル）−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、又は薬学的に許容されるその塩である、請求項１に記載の方法。
請求項8
前記化合物が、一般式Ｉの構造を有する化合物の二量体である、請求項１に記載の方法。
請求項9
前記化合物が、１，３−ジベンジル−２−（１，３−ジベンジル−１Ｈ−イミダゾール−２（３Ｈ）−イリデン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール、（１，２−４，５−ジイミダゾリウム）−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラベンジル−ベンゼン、２，６−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウム）−ピリジン又は２，２’−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウム）−１，１’−ビナフタレン、又は薬学的に許容されるその塩である、請求項８に記載の方法。
請求項10
前記化合物が、一般式Ｉの構造を有する化合物の三量体である、請求項１に記載の方法。
請求項11
前記化合物が、１，３，５−トリス（４−メチル−イミダゾリウム）に連結しているシクロファン又は薬学的に許容されるその塩である、請求項１０に記載の方法。
請求項12
前記細胞がインビトロである、請求項１に記載の方法。
請求項13
前記細胞がインビボである、請求項１に記載の方法。
請求項14
線維症疾患の治療のために対象に前記剤を投与することを含む、請求項１３に記載の方法。
請求項15
前記線維症疾患が肝線維症である、請求項１４に記載の方法。
請求項16
前記化合物が１，３−ジイソプロピルイミダゾリウム又は薬学的に許容されるその塩である、請求項１５に記載の方法。
請求項17
癌の治療のために対象に剤を投与することを含む、請求項１３に記載の方法。
請求項18
前記癌が肝細胞癌、肺癌、乳癌、胃癌又は神経膠腫である、請求項１７に記載の方法。
請求項19
前記化合物が、１，３−ビスベンジルイミダゾリウム、１，３，−ジベンジル−２−メチルイミダゾリウム，１−（２，４，６−トリメチルフェニル）−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１，３−ジベンジル−５−フェニルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテート−ベンジル）−２−メチル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルベンジル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（２−トリフルオロメチルベンジル）−２−メチルイミダゾリウム又は１，３−ジ（２−フェニルエチル）−イミダゾリウム、又は薬学的に許容されるその塩である、請求項１８に記載の方法。
請求項20
一般式Ｉの構造を有する化合物又はそのオリゴマー若しくはポリマー、又はその薬学的に許容される塩の、インビボで細胞に抗線維症剤又は抗癌剤を送達するための使用。［式中、破線は不在であるか、Ｒ１及びＲ３が結合する炭素とＲ２及びＲ４が結合する炭素との間で第２の結合を形成する結合として存在し、Ｒ１及びＲ２は、（ｉ）各々独立にＨ、直鎖若しくは分枝状のＣ１〜Ｃ６アルキル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルケニル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ６〜Ｃ１０アリールであるか、（ｉｉ）それらの環原子と一緒に６〜１０員環の縮合した飽和、不飽和若しくは芳香族の環系を形成するか、（ｉｉｉ）Ｒ１及びＲ５はそれらの環原子と一緒に、又はＲ２及びＲ６はそれらの環原子と一緒に、５〜１０員環の縮合した飽和、不飽和若しくは芳香族の環系を形成し、Ｒ１及びＲ２の他のものは前記（ｉ）で定義される通りであるか、又は、（ｉｖ）Ｒ１及びＲ５はそれらの環原子と一緒に、並びにＲ２及びＲ６はそれらの環原子と一緒に各々５〜１０員環の縮合した飽和、不飽和若しくは芳香族の環系を形成し、Ｒ３及びＲ４の両方がＨであるか、又は、Ｒ１及びＲ２がそれらの環原子と一緒に６〜１０員環の縮合芳香環系を形成する場合、若しくは破線が結合として存在する場合、Ｒ３及びＲ４は不在であり、Ｒ５又はＲ６は、（ｉ）Ｒ１及びＲ２について上で定義される通りであるか、又は（ｉｉ）各々独立に直鎖若しくは分枝状のＣ１〜Ｃ６アルキル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルケニル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルキニル、縮合シクロアルキル環系を含むＣ３〜Ｃ１８シクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ６〜Ｃ１０アリール−Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール−Ｃ２〜Ｃ６アルケニル若しくはＣ６〜Ｃ１０アリール−Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル−Ｃ６〜Ｃ１０アリール若しくはＣ２〜Ｃ６アルキニル−Ｃ６〜Ｃ１０アリールであり、Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル又はハロであり、その際、該当する場合、Ｒ１〜Ｒ７のいずれかは、１つ又は複数の炭素原子が、Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＰから選択されるヘテロ原子で任意選択で置き換えられ、且つ直鎖若しくは分枝状のＣ１〜Ｃ６アルキル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルケニル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルキニル、縮合シクロアルキル環系を含むＣ３〜Ｃ１８シクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、フルオロ、トリフルオロメチル、シアナト、イソシアナート、カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ６アシロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アシル、カルボニル、アミノ、アセチル、アセトキシ、オキソ、ニトロ、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ６アルキルカルボキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ２〜Ｃ６アルケノキシ、Ｃ２〜Ｃ６アルキノキシの１つ又は複数によって任意選択で置換され、Ｒ１及びＲ５が結合する環炭素原子並びにＲ２及びＲ６が結合する環炭素の１つが窒素原子によって任意選択で置換される。］
請求項21
一般式Ｉの構造を有する化合物又はそのオリゴマー若しくはポリマー、又はその薬学的に許容される塩の、インビボで細胞に抗線維症剤又は抗癌剤を送達するための医薬の製造における使用。［式中、破線は不在であるか、Ｒ１及びＲ３が結合する炭素とＲ２及びＲ４が結合する炭素との間で第２の結合を形成する結合として存在し、Ｒ１及びＲ２は、（ｉ）各々独立にＨ、直鎖若しくは分枝状のＣ１〜Ｃ６アルキル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルケニル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ６〜Ｃ１０アリールであるか、（ｉｉ）それらの環原子と一緒に６〜１０員環の縮合した飽和、不飽和若しくは芳香族の環系を形成するか、（ｉｉｉ）Ｒ１及びＲ５はそれらの環原子と一緒に、又はＲ２及びＲ６はそれらの環原子と一緒に、５〜１０員環の縮合した飽和、不飽和若しくは芳香族の環系を形成し、Ｒ１及びＲ２の他のものは上の（ｉ）で定義される通りであるか、又は、（ｉｖ）Ｒ１及びＲ５がそれらの環原子と一緒に、並びにＲ２及びＲ６がそれらの環原子と一緒に各々５〜１０員環の縮合した飽和、不飽和若しくは芳香族の環系を形成し、Ｒ３及びＲ４の両方がＨであるか、又は、Ｒ１及びＲ２がそれらの環原子と一緒に６〜１０員環の縮合芳香環系を形成する場合、若しくは破線が結合として存在する場合、Ｒ３及びＲ４が不在であり、Ｒ５又はＲ６は、（ｉ）Ｒ１及びＲ２について上で定義される通りであるか、又は、（ｉｉ）各々独立に直鎖若しくは分枝状のＣ１〜Ｃ６アルキル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルケニル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルキニル、縮合シクロアルキル環系を含むＣ３〜Ｃ１８シクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ６〜Ｃ１０アリール−Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール−Ｃ２〜Ｃ６アルケニル若しくはＣ６〜Ｃ１０アリール−Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル−Ｃ６〜Ｃ１０アリール若しくはＣ２〜Ｃ６アルキニル−Ｃ６〜Ｃ１０アリールであり、Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル又はハロであり、その際、該当する場合、Ｒ１〜Ｒ７のいずれかは、１つ又は複数の炭素原子が、Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＰから選択されるヘテロ原子で任意選択で置き換えられ、且つ直鎖若しくは分枝状のＣ１〜Ｃ６アルキル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルケニル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルキニル、縮合シクロアルキル環系を含むＣ３〜Ｃ１８シクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、フルオロ、トリフルオロメチル、シアナト、イソシアナート、カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ６アシロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アシル、カルボニル、アミノ、アセチル、アセトキシ、オキソ、ニトロ、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ６アルキルカルボキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ２〜Ｃ６アルケノキシ、Ｃ２〜Ｃ６アルキノキシの１つ又は複数によって任意選択で置換され、Ｒ１及びＲ５が結合する環炭素原子並びにＲ２及びＲ６が結合する環炭素の１つは窒素原子によって任意選択で置換される。］
請求項22
前記化合物がイミダゾリウム又はイミダゾリウム塩である、請求項２０又は２１に記載の使用。
請求項23
前記化合物がイミダゾリニウム又はイミダゾリニウム塩である、請求項２０又は２１に記載の使用。
請求項24
Ｒ５がＲ６と同じである、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の使用。
請求項25
Ｒ５及びＲ６が炭化水素である、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の使用。
請求項26
薬学的に許容される前記塩が、塩化物、臭化物、テトラフルオロホウ酸又はヘキサフルオロリン酸塩である、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の使用。
請求項27
前記化合物が、１−エチル−３−メチルイミダゾリウム、１，３−ビスベンジルイミダゾリウム、１，３−ジイソプロピルイミダゾリウム、１，３−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルイミダゾリニウム、１，３−ビス（１−アダマンチル）イミダゾリウム、１，３−ビス（２，４，６−トリメチルフェニル）−イミダゾリニウム、１，３−ビス（２，６−ジイソプロピル−フェニル）−イミダゾリニウム、１，３−ジアリルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−メチルイミダゾリウム、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム、１−（１−アダマンチル）−３−（２，４，６−トリメチルフェニル）−４，５−ジヒドロイミダゾリウム、２−ベンジルイミダゾ［１，５−ａ］キノリニウム、１，３−ビス（１−アダマンチル）−ベンゾイミダゾリウム、１，３−ジシクロヘキシルベンゾイミダゾリウム、１，３−ジイソプロピルイミダゾリニウムテトラフルオロボレート、１，３−ジイソプロピルイミダゾリウム、２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−メチルイミダゾ［１，５−ａ］ピリジニウム、１−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−３−（２，４，６−トリメチルフェニル）−イミダゾリニウム、２−メシチル−５−メチルイミダゾ［１，５−ａ］ピリジニウム、２−メシチル−２，５，６，７−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアゾール−４−イウム、１，３−ビス（１−アダマンチル）イミダゾリニウム、１−ブチル−３−（２−ピリジニルメチル）−１Ｈ−イミダゾリウム、６，７−ジヒドロ−２−ペンタフルオロフネイル−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］−１，２，４−トリゾリウム、１−メチル−３−（２−ヒドロキシルエチル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−イソシアナトベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−カルボキシルベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（２，２−ジメトキシエチル）−イミダゾリウム、１−（２，４，６−トリメチルフェニル）−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１，３−ジベンジル−５−フェニルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−カルボキシルベンジル）−２−メチルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（３，４，５−トリメトキシベンジル）−２−メチルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテート−ベンジル）−２−メチル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルカルボキシレートベンジル）−２−メチル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（２，２−ジメトキシエチル）−２−メチル−イミダゾリウム、２，６−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウム）−ピリジン、２，２’−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウム）−１，１’−ビナフタレン、１−ベンジル−３−（４−メチルベンジル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（２−トリフルオロメチルベンジル）−２−メチルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルカルボキシレートベンジル）−５−フェニル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテートベンジル）−５−フェニル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルベンジル）−５−フェニルイミダゾリウム、（１，２−４，５−ジイミダゾリウム）−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラベンジル−ベンゼン、１−ベンジル−３−（２−プロピン−１−イル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（３−ヒドロキシル−プロピル）−イミダゾリウム、１，３−ジ（２−フェニルエチル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテートベンジル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（ピリジン−２−イル）−イミダゾリウム、１，３，５−トリス−（４−メチル−イミダゾリウム）−ｌｉｎｋｅｄシクロファン、１，３−ジベンジル−２−（１，３−ジベンジル−１Ｈ−イミダゾール−２（３Ｈ）−イリデン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール、１−ベンジル−３−メチル−イミダゾリウム、１−（４−シアナトベンジル）−３−メチル−イミダゾリウム、１−（４−カルボキシベンジル）−３−メチル−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（２，２−ジメトキシエチル）−イミダゾリウム、又は１−（２，４，６−トリメチルフェニル）−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、又は薬学的に許容されるその塩である、請求項２０又は２１に記載の使用。
請求項28
前記化合物が、一般式Ｉの構造を有する化合物の二量体である、請求項２０又は２１に記載の使用。
請求項29
前記化合物が、１，３−ジベンジル−２−（１，３−ジベンジル−１Ｈ−イミダゾール−２（３Ｈ）−イリデン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール、（１，２−４，５−ジイミダゾリウム）−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラベンジル−ベンゼン、２，６−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウム）−ピリジン又は２，２’−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウム）−１，１’−ビナフタレン、又は薬学的に許容されるその塩である、請求項２８に記載の使用。
請求項30
前記化合物が、一般式Ｉの構造を有する化合物の三量体である、請求項２０又は２１に記載の使用。
請求項31
前記化合物が、１，３，５−トリス（４−メチル−イミダゾリウム）に連結しているシクロファン又は薬学的に許容されるその塩である、請求項３０に記載の使用。
請求項32
前記抗線維症剤が線維症疾患の治療のために送達される、請求項２０〜３１のいずれか一項に記載の使用。
請求項33
前記線維症疾患が肝線維症である、請求項３２に記載の使用。
請求項34
前記化合物が１，３−ジイソプロピルイミダゾリウム又は薬学的に許容されるその塩である、請求項３３に記載の使用。
請求項35
前記抗癌剤が癌の治療のために送達される、請求項２０〜３１のいずれか一項に記載の使用。
請求項36
前記癌が肝細胞癌、肺癌、乳癌、胃癌又は神経膠腫である、請求項３５に記載の使用。
請求項37
前記化合物が、１，３−ビスベンジルイミダゾリウム、１，３，−ジベンジル−２−メチルイミダゾリウム、１−（２，４，６−トリメチルフェニル）−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１，３−ジベンジル−５−フェニルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテート−ベンジル）−２−メチル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルベンジル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（２−トリフルオロメチルベンジル）−２−メチルイミダゾリウム又は１，３−ジ（２−フェニルエチル）−イミダゾリウム、又は薬学的に許容されるその塩である、請求項３６に記載の使用。
請求項38
１−エチル−３−メチルイミダゾリウム、１−メチル−３−（２−ヒドロキシルエチル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−イソシアナトベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−カルボキシルベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（２，２−ジメトキシエチル）−イミダゾリウム、１−（２，４，６−トリメチルフェニル）−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１，３−ジベンジル−５−フェニルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−カルボキシルベンジル）−２−メチルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（３，４，５−トリメトキシベンジル）−２−メチルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテート−ベンジル）−２−メチル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルカルボキシレートベンジル）−２−メチル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（２，２−ジメトキシエチル）−２−メチル−イミダゾリウム、２，６−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウム）−ピリジン、２，２’−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウム）−１，１’−ビナフタレン、１−ベンジル−３−（４−メチルベンジル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（２−トリフルオロメチルベンジル）−２−メチルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルカルボキシレートベンジル）−５−フェニル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテートベンジル）−５−フェニル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルベンジル）−５−フェニルイミダゾリウム、（１，２−４，５−ジイミダゾリウム）−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラベンジル−ベンゼン、１−ベンジル−３−（２−プロピン−１−イル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（３−ヒドロキシル−プロピル）−イミダゾリウム、１，３−ジ（２−フェニルエチル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテートベンジル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（ピリジン−２−イル）−イミダゾリウム、１，３，５−トリス−（４−メチル−イミダゾリウム）−ｌｉｎｋｅｄシクロファン、１，３−ジベンジル−２−（１，３−ジベンジル−１Ｈ−イミダゾール−２（３Ｈ）−イリデン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール、１−ベンジル−３−メチル−イミダゾリウム、１−（４−シアナトベンジル）−３−メチル−イミダゾリウム、１−（４−カルボキシベンジル）−３−メチル−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（２，２−ジメトキシエチル）−イミダゾリウム、又は１−（２，４，６−トリメチルフェニル）−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、又は薬学的に許容されるその塩であるイミダゾリウム又はイミダゾリニウムである化合物。