ヒトｎｋｇ２ｄに対する抗体とその使用

专利摘要:
本発明は、ヒトにおける治療的使用に有用な、単離された抗ヒトＮＫＧ２Ｄモノクローナル抗体を提供する。通常、抗体は、患者に投与されたときの抗体に対する免疫応答の危険を最小化するために、完全にヒト抗体であるか、又はヒト化抗体である。好ましい抗体には、ヒトモノクローナル抗体ＭＳ及び２１ Ｆ２を含む。本明細書に記載するように、このような抗体から、抗体断片、抗体誘導体、及び多選択性の分子といった他の抗原結合分子を設計又は誘導することができる。
公开号:JP2011506406A
申请号:JP2010537469
申请日:2008-12-15
公开日:2011-03-03
发明作者:ビルギッテ ウルソ，；アンデルス スヴェンソン，；インゲル；ルンド ペデルセン，；ペーター；アンドレアス；ニコライ；ルーメルト ワットマン，
申请人:ノボ・ノルデイスク・エー／エス；
IPC主号:C07K16-00

专利说明:

[0001] 本発明は、ヒトＮＫＧ２Ｄに対する抗体、及びヒトの疾患及び障害の治療又は予防におけるそれらの使用に関する。]
背景技術

[0002] 免疫レセプターＮＫＧ２Ｄは、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞に発現する。ヒトＮＫＧ２Ｄ（ｈＮＫＧ２Ｄ）ホモ二量体レセプターは、前もって活性化させたＣＤ８＋細胞上において、そのＤＡＰ１０会合を介したＴＣＲとＣＤ２８＋ＴＣＲシグナル伝達の同時刺激装置として機能し、ＮＫ細胞においては直接的活性化因子として機能する。ｈＮＫＧ２Ｄの種々のリガンドが同定されて特徴付けられており、これにはＭＨＣクラスＩ関連リガンドであるＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ、ＵＬ１６結合タンパク質（ＵＬＢＰ）ファミリー、及びレチノイン酸初期トランスクリプト１（ＲＡＥＴ１）ファミリーが含まれる。
関節リウマチのような慢性自己免疫疾患では、ｈＮＫＧ２Ｄは、ＣＤ４＋ＣＤ２８−Ｔ細胞のサブセットに発現し、それら細胞の増殖及びＩＦＮγ生成の刺激に関与しており、ＭＩＣ発現は上方制御されている（Grohら、PNAS 2003;100:9452）。クローン病において、ＣＤ４＋ｈＮＫＧ２Ｄを発現するＴ細胞は、ＭＩＣＡ相互作用により炎症性及び細胞障害性の応答を媒介する（Allezら、Gastroenterology 2007;132:2346-2358）。ＮＫＧ２Ｄが自己免疫性炎症の必須ドライバーであるとする当初の示唆は、マウスＮＫＧ２Ｄ（ＣＸ５）に結合してこれを遮断するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が、糖尿病のマウスモデル（ＮＯＤマウス）において糖尿病を引き起こす炎症を予防及び治療する（Ogasawaraら、Immunity 2004; 20:757-767）ことに由来しており、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の治療への応用を示唆するものである。このような使用例は、例えば、米国特許出願公開第２００５０１５８３０７号、国際公開第２００５０９７１６０号、同２００５１１５５１７号、及び同２００６０２４３６７号に記載されている。
ヒトＮＫＧ２Ｄに対するマウスｍＡｂｓは開示されている（例えば、Pendeら、Eur J Immunol 2001;31:1076-86, 国際公開第０２０６８６１５号、Bauerら、Science 1999:285:727-9; Castriconiら、PNAS 2003;100:4120-25; 及びAndreら、Eur J Immunol 2004;34:1-11を参照）か、或いは市販されている（例えば、R&D Systemsの抗体149810（米国ミネソタ州）及びBeckman Coulter Inc.のON72）が、これらは免疫原性である。文献に報告されている唯一の完全なヒト抗ＮＫＧ２Ｄ ｍＡｂは、ＮＫＧ２Ｄシグナル伝達に対し、アゴニスト効果とアンタゴニスト効果の両方を持つと報告されており（Kwongら、J Mol Biol 2008;384:1143-1156）、このために炎症性及び／又は自己免疫性疾患の治療剤としての適性が低い。
したがって、炎症性及び／又は自己免疫性疾患及び障害の治療的使用に最適な特性を有する抗ｈＮＫＧ２Ｄ ｍＡｂｓに対する需要が存在する。本発明は、これらの需要及び他の需要に対応して、複数の追加的利点を提供する。これについては本明細書の残りの部分に説明する。]
[0003] 本発明は、ヒトへの治療的応用に有用な、単離された抗ｈＮＫＧ２Ｄモノクローナル抗体を提供する。通常、抗体は、患者に投与されたときに、当該抗体に対する免疫応答の危険を最小限に抑えるため、完全なヒト抗体又はヒト化抗体である。このような抗体から、例えば、抗原結合抗体断片、抗体誘導体、及び多選択性の分子といった他の抗原結合分子を設計又は誘導することができる。
一態様において、抗体は、一又は複数の機能的特性により、又は機能的特性の組み合わせにより特徴付けられる。例示的な特性には、例えば、ｈＮＫＧ２Ｄを発現するＮＫ細胞又はＴ細胞のｈＮＫＧ２Ｄ媒介性活性を阻害すること、ｈＮＫＧ２Ｄへの結合において、少なくとも１つの天然ｈＮＫＧ２Ｄリガンド、又は複数のリガンドと競合すること、ｈＮＫＧ２Ｄ発現ＮＫ細胞又はＴ細胞の表面におけるｈＮＫＧ２Ｄの量を低減させること、カニクイザル及び／又はアカゲザルのＮＫＧ２Ｄにも結合すること、１つのｈＮＫＧ２Ｄ二量体につき抗体分子が１つだけ結合すること、ｈＮＫＧ２Ｄ発現ＮＫ及び／又はＴ細胞に添加されたとき、３以上のｈＮＫＧ２Ｄ二量体に架橋しないこと、結合時にｈＮＫＧ２Ｄシグナル伝達に対して有意なアゴニスト効果を有さないこと、及び／又は１ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）でｈＮＫＧ２Ｄに結合することなどが含まれる。本発明の特定の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体は、更に又は或いは、抗体ＭＳ及び２１Ｆ２を含む、本明細書に開示される一又は複数の特定のヒト抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体とほぼ同じエピトープと競合してこのエピトープに結合するか、或いは本明細書に開示される一又は複数の特定のヒト抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体と同じか又はそれよりも強い親和性で結合することができる。例えば、一実施態様では、抗体は、更に又は或いは、既知のマウス抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体（例えば、上記に記載の抗体）より高いＭＳ及び／又は２１Ｆ２との競合能、或いはＭＳ及び／又は２１Ｆ２の遮断能を有する。一実施態様では、抗体はＭＳ及び／又は２１Ｆ２と同じｈＮＫＧ２Ｄエピトープに結合する。別の実施態様では、抗体は、更に又は或いは、ＭＳと同じエピトープに結合する。当業者であれば、本発明の一実施態様によって提供される抗体又は本発明の一実施態様において使用される抗体が、３、４、又は５以上の上記特徴を呈しうることが分かるであろう。]
[0004] 別の態様では、抗体は、更に又は或いは、本明細書に記載のＭＳ又は２１Ｆ２のパラトープ及び／又は抗原結合配列と同一又は類似の一又は複数のパラトープ及び／又は抗原結合配列を含む。
他の態様では、本発明は、本発明の抗体をコードする核酸、そのような核酸を含む発現ベクター、そのような核酸を含む宿主細胞、本発明の抗体を生成する宿主細胞、及びそのような宿主細胞を適切な条件下で培養することにより抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体を生成する方法を提供する。
このような抗体の抗体結合断片、並びに、例えば遺伝子操作した抗体断片、抗体誘導体、二重特異性抗体及びその他多選択性分子を含むそのような抗原結合断片を含む分子も提供される。そのような抗体或いは他の分子を含む製薬的組成物及びキット或いはその他の物品も提供される。
更には、そのような抗体、分子、及び組成物を用いた、ｈＮＫＧ２Ｄ活性、ｈＮＫＧ２Ｄシグナル伝達、或いはｈＮＫＧ２Ｄを発現するＮＫ細胞又はＴ細胞の活性を低下させる又は阻害する方法、炎症を低減する方法、並びに自己免疫性及び／又は炎症性疾患又は障害（限定しないが、関節リウマチ、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、乾癬、乾癬性関節炎、多発性硬化症、セリアック病、ウイルス性疾患（例えばウイルス肝炎）、及び種々の器官及び組織の移植片拒絶（限定しないが、心臓及び骨髄を含む）を含む）の治療又は予防方法が提供される。]
図面の簡単な説明

[0005] ＫＭマウス（登録商標）系のｈＮＫＧ２Ｄ免疫化マウス由来の例示的血清の分析を示す。ＮＫＧ２Ｄ発現ＢＡＦ／３細胞又はコントロール細胞に対する様々な時点でのフローサイトメトリー分析により、１μｌの血清中のＮＫＧ２Ｄ選択性結合により抗体の力価が増大することが判明した（Ａ）。６回目の免疫化後に採取した血清（１μｌ）を用いたプレインキュベーションには、ＮＫＧ２Ｄに対するＭＩＣＡ−Ｆｃの結合を防ぐことができる抗体が含まれていた（Ｂ）。
ＮＫＧ２Ｄを発現する細胞（Ａ）に特異的に結合するが、ＮＫＧ２Ｄを発現しない同じ細胞株（Ｂ）には結合しないハイブリドーマの上清の形態のヒト抗体の一実施例を示す。ハイブリドーマの上清の形態の細胞に抗体を添加した。直接標識されたポジティブコントロール細胞である、マウス抗ＮＫＧ２Ｄ抗体１４９８１０の、ＮＫＧ２Ｄ発現細胞（Ｃ）及び非発現細胞（Ｄ）に対する結合を示す。黒のアウトラインはバックグラウンド染色を示し、実線のピークは特異的な染色を示す。
市販のマウス抗体（ＯＮ７２及び１４９８１０）と比較した場合の、組換えで発現されて精製された完全なヒトＩｇＧ４抗体（１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、及び２１Ｆ２）のＮＫＧ２Ｄ発現細胞に対するＮＫＧ２Ｄ結合の用量反応を示す。
ヒト抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体１６Ｆ１６、及び１６Ｆ３１（Ａ）と、ＩｇＧ４アイソタイプのＭＳ及び２１Ｆ２（Ｂ）との重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ）のアミノ酸配列を示しており、可変領域（太字）及びＣＤＲ領域（下線）が強調されている。アミノ酸配列及び種々の強調部分に対応する配列識別子は表１に示されている。
ヒト抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体１６Ｆ１６、及び１６Ｆ３１（Ａ）と、ＩｇＧ４アイソタイプのＭＳ及び２１Ｆ２（Ｂ）との重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ）のアミノ酸配列を示しており、可変領域（太字）及びＣＤＲ領域（下線）が強調されている。アミノ酸配列及び種々の強調部分に対応する配列識別子は表１に示されている。
対応する組換え生殖系列配列とのＶＨ及びＶＬ配列のアラインメントを示す。ＣＤＲ領域は太字のカバット（Ｋａｂａｔ）数で示されており、体細胞突然変異は太字且つ下線で示す文字で示されている。（Ａ）１６Ｆ１６ ＩｇＧ４重鎖；（Ｂ）１６Ｆ１６ ＩｇＧ４軽鎖；（Ｃ）１６Ｆ３１ ＩｇＧ４重鎖；（Ｄ）１６Ｆ３１ ＩｇＧ４軽鎖。配列番号２７〜３０は、それぞれ組換えＶＨ３＿２１／Ｄ３−９／ＪＨ４、ＶＫＩ＿Ｌ１５／ＪＫ２、ＶＨ３＿２０／Ｄ３−１０／ＪＨ６、及びＶＫＩＩＩ＿Ａ２７／ＪＫ３に対応している。
対応する組換え生殖系列配列とのＶＨ及びＶＬ配列のアラインメントを示す。ＣＤＲ領域は太字のカバット（Ｋａｂａｔ）数で示されており、体細胞突然変異は太字且つ下線で示す文字で示されている。（Ｅ）ＭＳ ＩｇＧ４重鎖；（Ｆ）ＭＳ ＩｇＧ４軽鎖；（Ｇ）２１Ｆ２ ＩｇＧ４重鎖；（Ｈ）２１Ｆ２ ＩｇＧ４軽鎖。配列番号６０〜６３は、それぞれ組換えＶＨ４＿５９／ＪＨ３、ＶＫＩＩＩ＿Ａ２７／ＪＫ１、ＶＨ５＿５１／Ｄ３＿１０＿Ｒ３／ＪＨ４、及びＶＫＩＩＩ＿Ｌ６／ＪＫ１に対応している。
例示的ヒト抗ＮＫＧ２Ｄ抗体によるリガンド−（ＭＩＣＡ−）結合の遮断を示しており、これは、ハイブリドーマの上清中での抗体を用いたプレインキュベーションによるリガンド結合の遮断によって示されている。アウトラインはバックグラウンドを示し、グレーの部分はプレインキュベーション無しのリガンド結合を示し、点線を伴う黒い部分はプレインキュベーションによるリガンド結合を示す。
組換えで発現されて精製された完全なヒト抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体（１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、及び２１Ｆ２；ＩｇＧ４アイソタイプ）の種々の濃度を分析する際に得られた用量反応曲線を示し、１μｇのＭＩＣＡ−ｍＦｃ結合の完全な遮断を行うのに必要なＩＣ５０及び用量を示している。
ＮＫＧ２Ｄに対するＯＮ７２のＮＫＧ２Ｄ結合が、１６Ｆ１６を含むハイブリドーマの上清を用いたプレインキュベーションによって完全に遮断されたことを示している。アウトラインはバックグラウンドを示し、グレーの部分はプレインキュベーション無しのＯＮ７２結合を示し、黒い点線はプレインキュベーションによるＯＮ７２結合を示す。
完全なヒト抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体の、ＮＫＧ２Ｄに対するマウス抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体のその後の結合又は逆の結合の遮断能を示している。（Ａ）１６Ｆ１６：組換えで発現されて精製された１６Ｆ１６（０．３μｇ；ＩｇＧ４アイソタイプ）を用いたプレインキュベーションにより、ＮＫＧ２Ｄに対するＯＮ７２（０．３μｇ）の結合が阻止された。インキュベーションの順番を逆にした場合、ＯＮ７２（０．３μｇ）を用いたプレインキュベーションによる、組換えで発現されて精製されたＩｇＧ４アイソタイプ（０．３μｇ）１６Ｆ１６の結合阻止は８５％に過ぎず、完全ヒト抗体による結合に用いられるＮＫＧ２Ｄがいくらか残存していることが示された。これは、ＯＮ７２によって結合されるものに対する少なくとも部分的に異なるエピトープを示唆している。抗体１４９８１０は、１４９８１０対１６Ｆ１６の抗体濃度をそれぞれ１：１（０．３μｇ、０．３μｇ）、及び３：１（１μｇ、０．３μｇ）として試験したとき、組換えで発現されて精製された１６Ｆ１６（ＩｇＧ４アイソトープ）の交差抑制を約５０％しか示さなかった。このことも、ＮＫＧ２Ｄに対する結合エピトープの差異を示す。以下のようなインキュベーション及び検出の組み合わせを使用した：１６Ｆ１６プレインキュベーションを行った場合（ａ）又は行わない場合（ｂ）のＯＮ７２検出；ＯＮ７２のプレインキュベーションを行った場合（ｃ）又は行わない場合（ｄ）の１６Ｆ１６検出；１６Ｆ１６（０．３μｇ）のプレインキュベーションを行った場合（ｅ）又は行わない場合（ｆ）の１４９８１０検出；１４９８１０（１．０μｇ）のプレインキュベーションを行った場合（ｇ）又は行わない場合（ｈ）の１６Ｆ１６検出；１６Ｆ１６のプレインキュベーション（０．３μｇ）を行った場合（ｉ）又は行わない場合（ｊ）の１４９８１０検出；１４９８１０のプレインキュベーション（１．０μｇ）を行った場合（ｋ）又は行わない場合（ｌ）の１６Ｆ１６（０．３μｇ）の検出；１６Ｆ１６の検出（０．３μｇ）。（Ｂ）ＭＳ：０．１μｇのマウス抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体を、０．１μｇのＭＳ抗体を用いたプレインキュベーションを行って、又は行わずに、インキュベートし、その後フローサイトメトリーを使用して抗マウス抗体により検出した。ＭＳによるプレインキュベーションを行わない０．１μｇのＯＮ７２、１Ｄ１１、又は１４９８１０によるインキュベーションを、１００％に正規化してそれぞれ（ａ）、（ｃ）、及び（ｅ）に示した。０．１μｇのＭＳによるインキュベーションを３０分に亘って行った後、ＯＮ７２、１Ｄ１１、又は１４９８１０のインキュベーション及び検出を行った結果をそれぞれ（ｂ）、（ｄ）、及び（ｆ）に示す。ＭＳによるプレインキュベーションは、ＯＮ７２、１Ｄ１１、及び１４９８１０のＮＫＧ２Ｄ結合をそれぞれ９８％、８８％、及び９６．５％抑制し、少なくとも幾つかの抗体に類似のエピトープを示唆した。（Ｃ）２１Ｆ２：２１Ｆ２によるプレインキュベーションを行った場合（ａ）又は行わない場合（ｂ）のＯＮ７２結合の検出；２１Ｆ２によるプレインキュベーションを行った場合（ｃ）又は行わない場合（ｄ）の１Ｄ１１結合の検出、及び２１Ｆ２：２１Ｆ２を用いた（ｅ）又は用いない（ｆ）１４９８１０結合の検出（すべての抗体は０．１μｇ）。
元のハイブリドーマから精製されたＯＮ７２及び１６Ｆ１６抗体によるアカゲザル又はカニクイザル（ｃｙｎｏ）細胞の染色を示す。（Ａ）ｃｙｎｏＮＫ細胞、（Ｂ）ｃｙｎｏ ＣＤ８＋Ｔ細胞、（Ｃ）アカゲザルＮＫ細胞、及び（Ｄ）アカゲザルＣＤ８＋Ｔ細胞。提示された値は、結合の平均蛍光強度（ＭＦＩ）であり、二次抗体の結合のＭＦＩのみを抽出したものである。いずれの種においても、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対する結合は観察されなかった。
異なる抗体濃度での精製された抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるヒト又はカニクイザルＣＤ８陽性細胞に対するヒト抗体ＭＳの結合を示し、これは、ヒトとカニクイザルＮＫＧ２Ｄに対する親和性が類似していることを示唆している。
５１Ｃｒ放出アッセイにおいて、リガンド遮断抗体（ＯＮ７２又は組換えで発現されて精製された１６Ｆ１６（ＩｇＧ４アイソタイプ））の添加により、ＭＩＣＡを発現する標的細胞のＮＫ媒介性の死滅が、用量に依存して遮断されたことを示す。
組換えで発現されて精製された１６Ｆ１６及び１６Ｆ３１（共にＩｇＧ４アイソタイプ）が、用量に依存してＮＫ９２細胞によるＭＩＣＡを有する標的細胞（ＢａＦ／３）（Ａ）及びＵＬＢＰ３を有する標的細胞（ＢａＦ／３）（Ｂ）両方の殺傷を抑制することができ、０．８μｇ／ｍｌの１６Ｆ１６により両方のリガンドについてほぼ完全にブロックすることができ、試験した最高用量である２０μｇ／ｍｌの１６Ｆ３１により、両方のリガンドについて一部遮断することができたことを示す。
組換えで発現されて精製されたＭＳ、２１Ｆ２、及び１６Ｆ１６（すべてＩｇＧ４アイソタイプ）が、リガンドを発現する標的細胞のＮＫ媒介性の殺傷を抑制することができたことを示す。（Ａ）ＭＳ又は２１Ｆ２による、ＮＫ−９２細胞のＵＬＢＰ３−ＢａＦ／３細胞殺傷の抑制。（Ｂ）ＭＳ又は１６Ｆ１６による、ＢａＦ／３−ＭＩＣＡ細胞を死滅させるＮＫＬ細胞の抑制。
ＮＫＧ２Ｄ及びＤＡＰ１０を形質移入したＢａＦ／３細胞を用いた、細胞表面のＮＫＧ２Ｄの抗体誘導性の減少を示す。図は、コントロール（抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を用いずに一晩インキュベートした後の細胞表面ＮＫＧ２Ｄレセプター＝１００％）と比較した場合の、ＯＮ７２（１μｇ）又は組換えで発現されて精製されたヒト抗体１６Ｆ１６（１μｇ；ＩｇＧ４アイソタイプ）又は１６Ｆ３１（３μｇ；ＩｇＧ４アイソタイプ）を用いて一晩インキュベートした後に細胞表面に残ったＮＫＧ２Ｄレセプターの割合（％）を示す。
（図１５の場合と同様に）ＮＫＧ２Ｄ及びＤＡＰ１０を形質移入したＢａＦ／３細胞（Ａ）、又は抹消血から調製された新鮮なヒトＮＫ細胞を用いた、細胞表面のＮＫＧ２Ｄの抗体誘導性の減少を示す。（Ｂ）では、ＩｇＧｓが存在する血液中の状況を模倣するためにヒト血清の存在下で、且つＭＳ抗体の濃度を変化させて、ヒトＮＫ細胞を一晩インキュベートした。最も低い濃度においてさえ、最大の発現低下が達成され、それは、ＮＫＧ２Ｄ＋ ＮＫ細胞で同様の条件下における結合アッセイにおいて測定された約６０％のレセプター飽和に相当するものであった。
図示の各濃度で２１Ｆ２抗体を一晩インキュベーションした後でのヒトＮＫ細胞の細胞表面ＮＫＧ２Ｄの減少割合を示す。
各時点における、ヒト血液試料中の異なる種類の細胞の表面に提示されるＮＫＧ２Ｄに対する、ＯＮ７２、ＭＳ、及び２１Ｆ２の影響を示す。各抗体の濃度は０．１μｇ／ｍｌであった。理論に拘束されずに述べると、実験において表面に提示されるＮＫＧ２Ｄは、ＮＫＧ２Ｄの内部移行を表わしていると考えられる。図（Ａ）〜（Ｃ）は、ＮＫＧ２Ｄを発現するＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びδγＴ細胞それぞれの抗体誘導性ＮＫＧ２Ｄ内部移行を示している。ＭＳ及び２１Ｆ２による表面関連ＮＫＧ２Ｄの減少は、ＯＮ７２より少なかった。
同時刺激を可能にするＣＤ３の２つの異なる最適以下の用量を用いて、Ｔ細胞増殖に対する固定化ＭＳ及びＯＮ７２のアゴニスト作用を試験するアッセイの結果を示している。（Ａ）[ＣＤ３]＝０．１ｎｇ／ｍｌｍｌ；（Ｂ）[ＣＤ３]＝０．３ｎｇ／ｍｌ。図示のように、４日間に亘るＩＬ−２刺激後３日間に亘って固定化抗体により刺激したＰＢＭＣ集団におけるＣＦＳＥ希釈によりＴ細胞の増殖を評価した。ＣＤ２８刺激が同時刺激のポジティブコントロールとして含まれている。ＭＳについては有意なアゴニスト作用は検出されなかったが、ＯＮ７２はＴ細胞増殖に対し、小さいものの有意な作用を有していた。
抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（ＭＳ又はｈｚＯＮ７２）のＦａｂ断片、又はＭＩＣＡリガンドと複合したｈＮＫＧ２Ｄ二量体の３次元重複表示を示す。ｈＮＫＧ２Ｄホモ二量体（「ＮＫＧ２Ｄ」）が表面図に示されており、単量体の１つが他よりも暗い色で示されている。Ｆａｂ断片（それぞれ「ＭＳ」及び「ｈｚＯＮ７２」）が、黒のチューブで示されており、ＭＩＣＡ（「ＭＩＣＡ」が明るい色の概略的二次構造表現で示されている。（Ａ）では、ｈＮＫＧ２Ｄ／ＭＳＦａｂ及びｈＮＫＧ２Ｄ／ＭＩＣＡ結晶複合構造が重ね合わせて示されている（Ｌｉ等、Nat Immunol 2001;2:443-451; PDBコード1HYR、テンプレートとして共通のｈＮＫＧ２Ｄ分子のＣアルファ原子を使用）。ＭＩＣＡ及びＭＳは共にＮＫＧ２Ｄニ量体に非対称に結合し、ＮＫＧ２Ｄ二量体に結合したときの、２つのリガンド分子の可能な相対的結合方向が示されている。この方向について、ｈＮＫＧ２Ｄに対する重ね合わせの計算値においてＭＩＣＡとＭＳ Ｆａｂとの間には大きな重複があり、これはＭＳ Ｆａｂが、ＭＩＣＡのｈＮＫＧ２Ｄレセプターへの結合を遮断する能力を有することを示すものであった。実施例１１を参照。
抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（ＭＳ又はｈｚＯＮ７２）のＦａｂ断片、又はＭＩＣＡリガンドと複合したｈＮＫＧ２Ｄ二量体の３次元重複表示を示す。ｈＮＫＧ２Ｄホモ二量体（「ＮＫＧ２Ｄ」）が表面図に示されており、単量体の１つが他よりも暗い色で示されている。Ｆａｂ断片（それぞれ「ＭＳ」及び「ｈｚＯＮ７２」）が、黒のチューブで示されており、ＭＩＣＡ（「ＭＩＣＡ」が明るい色の概略的二次構造表現で示されている。（Ｂ）では、ｈＮＫＧ２Ｄ／ＭＳ Ｆａｂ及びｈＮＫＧ２Ｄ／ＭＩＣＡ結晶複合構造が重ね合わせて示されている（Ｌｉ等、Nat Immunol 2001;2:443-451; PDBコード1HYR、テンプレートとして共通のｈＮＫＧ２Ｄ分子のＣアルファ原子を使用）。ＭＩＣＡ及びＭＳは共にＮＫＧ２Ｄニ量体に非対称に結合し、ＮＫＧ２Ｄ二量体に結合したときの、２つのリガンド分子の可能な相対的結合方向を示す。この方向について、ｈＮＫＧ２Ｄに対する重ね合わせの計算値においてＭＩＣＡとＭＳ Ｆａｂとの間には大きな重複があり、これはＭＳ Ｆａｂが、ＭＩＣＡのｈＮＫＧ２Ｄレセプターへの結合を遮断する能力を有することを示すものであった。実施例１１を参照。
抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（ＭＳ又はｈｚＯＮ７２）のＦａｂ断片、又はＭＩＣＡリガンドと複合したｈＮＫＧ２Ｄ二量体の３次元重複表示を示す。ｈＮＫＧ２Ｄホモ二量体（「ＮＫＧ２Ｄ」）が表面図に示されており、単量体の１つが他よりも暗い色で示されている。Ｆａｂ断片（それぞれ「ＭＳ」及び「ｈｚＯＮ７２」）が、黒のチューブで示されており、ＭＩＣＡ（「ＭＩＣＡ」が明るい色の概略的二次構造表現で示されている。（Ｃ）では、ｈＮＫＧ２Ｄ／ｈｚＯＮ７２ Ｆａｂ及びｈＮＫＧ２Ｄ／ＭＩＣＡの複合結晶構造が重ね合わせて示されている。ｈＮＫＧ２Ｄの各単量体には、ｈｚＯＮ７２Ｆａｂが結合する。ｈＮＫＧ２Ｄに対する重ね合わせの計算値において、ｈｚＯＮ７２抗体もＭＩＣＡ結合部位と大きく重複しており、ｈｚＯＮ７２がｈＮＫＧ２Ｄに対するＭＩＣＡの結合を遮断できることを示している。実施例１２を参照。
２つのｈＮＫＧ２Ｄ単量体ユニットの配列（配列番号２）中の、ＭＳ ＦａｂのｈＮＫＧ２Ｄニ量体のＮＫＧ２Ｄ単量体ユニットの配列（配列番号２）におけるエピトープ残基を示す。結晶構造リガンド原子から４．０Å以内のＮＫＧ２Ｄは結合エピトープの一部と考え、下線で示す。二重下線で示す残基は、リガンドに対する水素結合に関与していた。Ａは、ｈＮＫＧ２Ｄニ量体におけるｈＮＫＧ２Ｄ単量体ユニット１及び２上の単独のＭＳ Ｆａｂの結合エピトープである。結晶学的モノマーＮ及びＣがＮＫＧ２Ｄ単量体ユニット１に組み込まれており、結晶学的モノマーＭ及びＤがＮＫＧ２Ｄ単量体ユニット２に組み込まれている。単量体ユニット２では、Ｌｙｓ１５０側鎖原子Ｎζだけが、２つの結晶学的に独立の複合体の１つにおける水素結合に関与していた。表９〜１２も参照のこと。
２つのｈＮＫＧ２Ｄ単量体ユニットの配列（配列番号２）中の、ＭＳ ＦａｂのｈＮＫＧ２Ｄニ量体のＮＫＧ２Ｄ単量体ユニットの配列（配列番号２）におけるエピトープ残基を示す。結晶構造リガンド原子から４．０Å以内のＮＫＧ２Ｄは結合エピトープの一部と考え、下線で示す。二重下線で示す残基は、リガンドに対する水素結合に関与していた。Ｂは、ｈＮＫＧ２ｄ単量体ユニット１及び２に同時に結合した２ｈｚＯＮ７２ Ｆａｂの各結合エピトープである。Ｔｒｐ１６６は、結晶学的に独立の分子複合体（１のｈＮＫＧ２Ｄ単量体と複合した１のｈｚＯＮ７２ Ｆａｂ分子）の１つにおける水素結合に関与していたが、他方における水素結合には距離が離れすぎていた。表１４〜１５を参照。
２つのｈＮＫＧ２Ｄ単量体ユニットの配列（配列番号２）中の、ＭＳ ＦａｂのｈＮＫＧ２Ｄニ量体のＮＫＧ２Ｄ単量体ユニットの配列（配列番号２）におけるエピトープ残基を示す。結晶構造リガンド原子から４．０Å以内のＮＫＧ２Ｄは結合エピトープの一部と考え、下線で示す。二重下線で示す残基は、リガンドに対する水素結合に関与していた。Ｃは、ｈＮＫＧ２Ｄ単量体ユニット１及び２上のＭＩＣＡ分子の結合エピトープである。ＭＩＣＡは、ｈＮＫＧ２Ｄニ量体に対して非対称な結合を示し、したがってＭＳ−Ｆａｂに対して２つの方向に結合する。ＭＩＣＡの第２の方向は、２つの単量体ユニットの発現量を単純に交換することにより得られる。
ｈＮＫＧ２Ｄ分子を、表面図において他よりやや暗い色で示している。それぞれの結晶構造ＭＳ／ｈｚＯＮ７２／ＭＩＣＡ Ｆａｂ原子から４．０Å以内のＮＫＧ２Ｄ原子を黒色で示しており、（Ａ）はＭＳ Ｆａｂを、（Ｂ）は２つのｈｚＯＮ７２ Ｆａｂを、（Ｃ）及び（Ｄ）はＭＩＣＡを示している。ＭＩＣＡ及びＭＳ Ｆａｂは、共にＮＫＧ２Ｄニ量体に非対称に結合するので、ＮＫＧ２Ｄに対する結合方向は異なる場合がある。これは、ＭＳに対するＭＩＣＡの２つの可能な相対的結合方向を示す図（Ｃ）及び（Ｄ）に示されている。表９〜１２及び１４〜１５も参照。] 図１５
[0006] （定義）
本明細書で使用する「ｈＮＫＧ２Ｄ」という用語と、更には特に断らない限り「ＮＫＧ２Ｄ」という用語は、「ＮＫＧ２−Ｄ」、「ＣＤ３１４」、「Ｄ１２Ｓ２４８９Ｅ」、「ＫＬＲＫ１」、「キラー細胞レクチン様レセプターサブファミリーＫ、メンバー１」、及び「ＫＬＲＫ１」としても知られ、ヒトキラー細胞活性化レセプター遺伝子、そのｍＲＮＡ（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００７３６０；配列識別番号１）、及びその遺伝子産物（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０３１３８６；配列識別番号２）、又はその自然発生変異体を指す。ＮＫ及びＴ細胞では、ｈＮＫＧ２Ｄレセプターのリガンド結合形態はホモ二量体である（Li等、Nat Immunol 2001;2:443-451）。ｈＮＫＧ２Ｄレセプターは、通常、ＤＡＰ１０との複合体で表面に現れ（Wu等、J Exp Med 2000;192:1059以下参照：ＮＣＢＩ受け入れ番号ＡＡＧ２９４２５、ＡＡＤ５０２９３）、更に高次の複合体も形成することが示唆されている。本明細書でｈＮＫＧ２Ｄによるものとされるあらゆる活性、例えば、細胞活性化、抗体認識等は、複合体の形態のｈＮＫＧ２Ｄ、又はＤＡＰ１０及び／又はその他の構成要素との更に高次の複合体にも帰することができる。
本明細書中の「抗体」なる用語は、最も広義の意味で用いられ、特に、所望の生物学的活性を表す限り、完全長モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、特に断らない限り、抗原結合断片、抗体変異体、及びそれらの多特異性分子を包含する。一般に、完全長抗体は、間をジスルフィド結合又はその抗原結合タンパク質により接続された、少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（ここではＶＨと略す）及び重鎖定常領域とからなっている。重鎖定常領域は、３つのドメイン、即ちＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３からなっている。各軽鎖は軽鎖可変領域（ここではＶＬと略す）及び軽鎖定常領域からなっている。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、即ちＣＬからなっている。ＶＨ及びＶＬ領域は更に、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる高頻度可変領域に小分割されており、そこにはフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるそれよりも保存度の高い領域が散在している。各ＶＨ及びＶＬは３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成されており、アミノ末端からカルボキシ末端まで、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順番で配置されている。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体分子構造と、抗体作製に関連する種々の技術との一般的な原理は、例えば、Harlow and Lane, ANTIBODIES: A LABORATORYMANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988)に提供されている。]
[0007] 抗体の「抗原結合断片」は、抗原に対して検出可能に結合することができる完全長抗体の一部であり、一般に少なくともＶＨ領域の一又は複数の部分を含んでいる。抗原結合断片は、抗体の、１、２、３、又は４以上の抗原結合部分を含む多価の分子と、ＶＬ及びＶＨ領域、又はその選択された部分が合成リンカーによって、又は組換え方法によって接合されて機能的な抗原結合分子を形成する一本鎖構造とを包含する。抗体の一部の抗原結合断片は大きな抗体分子を断片化（例えば、酵素的切断）して得られるが、多くは通常組換え技術により作製される。
本明細書では、用語「抗体誘導体」と「イムノコンジュゲート」とは、交換可能に使用され、完全長抗体又はその抗原結合断片を意味するもので、この場合、例えば第二の分子に抗体を連結させるために、例えばアルキル化、ペグ化、アシル化、エステル形成又はアミド形成などによって一又は複数のアミノ酸が化学的に修飾されているものである。例示的な修飾には、ペグ化抗体（例えばシステイン-ペグ化）、ビオチン化、放射標識、及び第２薬剤（細胞障害性剤）との抱合が含まれる。]
[0008] 「多選択性分子」は、抗体又はその抗原結合断片を含み、これは少なくとも１つの他の機能的分子に関連又は連結していることにより、少なくとも２つの異なる結合部位又は標的分子に結合する分子を形成する。例示的な多選択性分子には、二重特異性抗体、及び可溶性レセプター断片又はリガンドに連結された抗体が包含される。
本明細書で使用する「ヒト抗体」という用語は、フレームワーク領域及びＣＤＲ領域が共にヒトの生殖系列の免疫グロブリン配列に由来している（即ち、同一又はほぼ同一である）可変領域を有する抗体を包含する。更に、この抗体が定常領域を含む場合、この定常領域もヒトの生殖系列の免疫グロブリン配列に「由来」している。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含みうる（例えば、無作為又はin vitroでの部位特異性の変異原生によって、或いはin vivoでの体細胞突然変異によって導入された突然変異）。しかしながら、本明細書で使用する「ヒト抗体」という用語は、マウスのような別の哺乳動物種の生殖系列由来のＣＤＲ配列がヒトのフレームワーク配列に移植されている抗体は含まない。]
[0009] 「ヒト化」抗体は、非ヒト免疫グロブリンから得られた最小配列を含むヒト／非ヒトのキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基は対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、全て又は実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全て又は実質的に全てのＦＲ残基がヒト免疫グロブリン配列の残基である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。ヒト化抗体はまた、場合によって免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。詳しくは、例えばJones等, Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature 332:323-329 (1988)；及び、Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)、国際公報９２／０２１９０、米国特許公開２００６００７３１３７及び米国特許第６７５０３２５号、同第６６３２９２７号、同第６６３９０５５号、同第６５４８６４０号、同第６４０７２１３号、同第６１８０３７０号、同第６０５４２９７号、同第５９２９２１２号、同第５８９５２０５号、同第５８８６１５２号、同第５８７７２９３号、同第５８６９６１９号、同第５８２１３３７号、同第５８２１１２３号、同第５７７０１９６号、同第５７７７０８５号、同第５７６６８８６号、同第５７１４３５０号、同第５６９３７６２号、同第５６９３７６１号、同第５５３０１０１号、同第５５８５０８９号及び同第５２２５５３９号を参照のこと。]
[0010] 本明細書中で用いられる「高頻度可変領域」なる用語は抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。高頻度可変領域は一般に、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」のアミノ酸残基(軽鎖可変ドメインにおいては残基２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７(Ｌ３)、及び重鎖可変ドメインにおいては３１−３５(Ｈ１)、５０−６５(Ｈ２)及び９５−１０２(Ｈ３)；（Kabat等, （1991）Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第５版、米国保健社会福祉省、ＮＩＨ出版番号91-3242)及び／又は「高度可変ループ」の残基(軽鎖可変ドメインにおいては残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)及び９１−９６(Ｌ３)、及び重鎖可変ドメインにおいては２６−３２(Ｈ１)、５３−５５(Ｈ２)及び９６−１０１(Ｈ３);Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987))を含んでなる。一般的に、この領域のアミノ酸残基の番号付けは、上掲のカバット等において記述される方法によって行われる。本明細書中の「カバット位置」、「カバットに記載の可変ドメイン残基番号付け」、及び「カバットによると」などの句は、重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインのためのこの番号付けシステムを指す。カバット番号付けシステムを用いて、実際の直鎖状のペプチドのアミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＣＤＲの短縮又は挿入に応じてアミノ酸が減っていても又は増えていてもよい。例えば、重鎖可変ドメインは、ＣＤＲ Ｈ２の残基５２の後に単一アミノ酸挿入(カバットによると残基５２ａ)を含んでいてもよいし、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基(例えばカバットによると残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど)を含んでいてもよい。残基のカバット番号付けは、抗体の配列の相同領域に「標準の」カバット番号付けした配列と整列させて所定の抗体について決定してもよい。]
[0011] 本明細書において定められるように、「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」残基はＣＤＲ以外のＶＨ又はＶＬ残基である。
「エピトープ」又は「結合部位」とは、抗原結合ペプチド（例えば抗体）が特異的に結合する抗原上の１のエリア又は領域である。タンパク質のエピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基（エピトープの免疫優勢成分とも呼ばれる）と、結合に直接的には関与しないアミノ酸残基、例えば特異的に抗原に結合するペプチドによって効果的にブロックされるアミノ酸残基（つまり、このアミノ酸残基は、特異的に抗原に結合するペプチドの「溶媒排除表面」及び／又は「フットプリント」内に位置する）とを含むことができる。本明細書のエピトープという用語は、特に断らない限り、抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体、又は本発明による他のｈＮＫＧ２Ｄ特異性薬剤に特に結合するｈＮＫＧ２Ｄの任意の特定の領域内の両方の種類のアミノ酸結合部位を包含する（例えば、文脈によっては、本発明は特定のアミノ酸残基に直接結合する抗体に関する）。ＮＫＧ２Ｄは、多数の異なるエピトープを含むことができ、これには、限定しないが、（１）直鎖ペプチド抗原決定基、（２）成熟ＮＫＧ２Ｄ立体構造中において互いに近接する一又は複数の非隣接アミノ酸からなる立体構造抗原決定基、及び（３）全体又は一部が、ＮＫＧ２Ｄに共有結合的に付着した分子構造からなる翻訳後抗原決定基、例えば炭水化物基が含まれる。特に断らず、文脈上矛盾しない限り、立体構造抗原決定基は、抗原結合ペプチドの原子から約４Åの距離内にＮＫＧ２Ｄアミノ酸残基を含む。]
[0012] 「溶媒排除表面」とは、コンピュータの演算において、例えば分子のリガンドへの結合により、どのような水分子も到達し得ない分子の領域である（Lee及びRichards, J Mol Biol 1971;55:379-400、参照により本明細書に包含する）。
対象とする抗体（例えば、ＭＳ又は２１Ｆ２）と「ほぼ同じエピトープ又は決定基に結合する」という表現は、抗体が、対象とする抗体が特異的に結合するＮＫＧ２Ｄ分子について、対象とする抗体と「競合する」ことを意味する。]
[0013] 「パラトープ」とは、抗原に特異的に結合する抗体の抗原結合部の一エリア又は領域である。特に断らず、文脈上明らかに矛盾しない限り、パラトープは、エピトープ結合に直接関与するアミノ酸残基であって、うち幾つかは通常ＣＤＲ内にあるアミノ酸残基と、結合に直接関与しないアミノ酸残基、例えば特異的に結合した抗原によって効果的に遮断されるアミノ酸残基とを含むことができる（即ち、アミノ酸残基は、特異的に結合した抗原の「溶媒排除表面」及び／又は「フットプリント」内にある）。
抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の、天然ＮＫＧ２Ｄリガンド（例えばＭＩＣＡ）に対するＮＫＧ２Ｄ分子の結合を「遮断」する能力は、この抗体が、可溶性の又は細胞表面に関連するＮＫＧ２Ｄ及びリガンド分子を用いたアッセイにおいて、用量に依存して、リガンドに対するＮＫＧ２Ｄ分子の結合を検出可能に低減することができることを意味し、この場合、ＮＫＧ２Ｄ分子は抗体の不在下においてリガンドに検出可能に結合する。抗ＮＫＧ２Ｄ抗体がＭＩＣＡ結合を遮断できるかどうかを決定するための例示的アッセイが実施例３において提供される。同じアッセイを使用して、他のＮＫＧ２Ｄリガンドの抗体媒介性の結合を試験することができる。]
[0014] ポリペプチドの「変異体」は、参照ポリペプチド、一般的に天然又は「親」ポリペプチドと実質的に同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。ポリペプチド変異体は、天然のアミノ酸配列内の特定の位置に一又は複数のアミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を、及び／又は一方又は両方の末端に追加を有してもよい。
２つのアミノ酸配列の関係において「実質的に同一の」なる用語は、例えば初期設定のギャップ加重(default gap weights)を用いたプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴによって、場合によって整列させた場合に、配列が、少なくともおよそ５０パーセントの配列同一性を共有することを意味する。通常、実質的に同一の配列は、少なくともおよそ６０、少なくともおよそ７０、少なくともおよそ８０、少なくともおよそ９０、少なくともおよそ９５、少なくともおよそ９８又は少なくともおよそ９９パーセントの配列同一性を示す。]
[0015] ２つの実質的に同一のアミノ酸配列の「対応する」アミノ酸位は、本明細書中で言及したいずれかのタンパク質分析ソフトウェアを用いて整列したものである。
他の核酸配列と機能的な関係にある場合、核酸配列は、別の核酸配列（又は要素）と「作用可能に連結して」いる。例えば、プレシーケンス(presequence)又は分泌リーダーのＤＮＡは、あるポリペプチドの分泌に関わる前駆体タンパク質として発現する場合、そのポリペプチドのＤＮＡ（即ち、その発現をコードする）と作用可能に結合している。プロモーター又はエンハンサーは、それが配列の転写に影響する場合はコード配列と作用可能に連結している。或いは、リボソーム結合部は、それが翻訳を促す位置にある場合は作用可能にコード配列と連結している。通常、「作用可能に連結した」は、結合したＤＮＡ配列が近接していること、分泌リーダーの場合は近接して読み枠内にあることを意味する。しかし、エンハンサーのような幾つかの要素は、作用可能に連結するためにコード配列と近接する必要はない。連結は、都合のよい制限部位でライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが、従来の慣行に従って使用される。]
[0016] 「単離される」分子は、属する分子の種類に関して見られる組成物中の主な種である分子である(すなわち、それは、組成物中の分子の種類の少なくともおよそ５０％を占め、一般的に組成物中の分子、例えばペプチドの種類の少なくともおよそ７０％、少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ８５％、少なくともおよそ９０％、少なくともおよそ９５％又はより多くを占める)。一般に、抗体分子の組成物は、組成物中に存在するすべてのペプチド種類の関係において、又は、少なくとも提案された使用の関係において実質的に活性なペプチド種類に関して、抗体分子の９８％、９８％又は９９％の均一性を表すであろう。
本発明の前後関係において、前後関係によって否定されない限り、「処置」又は「治療する」は、疾患又は障害の一又は複数の症状又は臨床的に関連する徴候を予防するか、緩和するか、管理するか、治癒するか、又は低減することを指す。例えば、症状又は疾患ないし障害の臨床的に関連する兆候が同定されていない患者の「処置」は予防又は防止的な治療であるのに対して、症状又は疾患ないし障害の臨床的に関連する兆候が同定されている患者の臨床的、治療的、又は対症的な「処置」は一般的に予防又は防止的な治療を成さない。処置の各形態は、本発明の個別の態様と考えることができる。]
[0017] （発明の詳細な説明）
本発明は、例えば、自己免疫性及び炎症性の疾患及び障害など、ＮＫＧ２Ｄに関係する状態に罹患したヒト患者を治療するのに適する特性を有する、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体に部分的に基づく。本発明の抗体は、典型的には、患者自身の免疫系による、該抗体に対する免疫応答の危険性を最小化するために、完全なヒト抗体であるか又はヒト化抗体であり、その活性形態におけるｈＮＫＧ２Ｄ、すなわち、細胞の表面上にあり、ＤＡＰ１０と会合するホモ二量体に結合する。
本発明の抗体は、典型的には、ＮＫＧ２Ｄ活性を低下させるべき状態の治療に有用である。このような抗体は、例えば、ＮＫＧ２Ｄに対する結合について１又は複数の種類の内因性ＮＫＧ２Ｄリガンドと競合するか、又はこれらを遮断すること、結合時に細胞表面のＮＫＧ２Ｄ量を発現低下するか又は他の形でこれを低減すること、及び／又は細胞に対するＡＤＣＣ反応又はＣＤＣ反応を誘発することにより、ＮＫＧ２Ｄを発現するＮＫ細胞及び／又はＴ細胞の活性化を低下させるか又は阻害することができる。]
[0018] 一態様において、本発明の抗体はアンタゴニストであり、ヒトＮＫＧ２Ｄに対する結合について、ＭＩＣＡなど、１又は複数の種類の天然リガンドと競合し、これにより、リガンド誘導性のＮＫＧ２Ｄ活性を低下させる。ＭＩＣＡ分子は炎症性疾患に関係していることが明らかであり、実施例３で示すように、細胞表面のＮＫＧ２Ｄ、特に、ＭＳ及び２１Ｆ２に対するＭＩＣＡ結合の遮断において、数種のヒト抗体が有効であり、エピトープの決定により、ＭＳＦａｂがＭＩＣＡの結合を妨害することが示された（実施例１１、図２０）。ＭＳ及び２１Ｆ２は共に、ＮＫ細胞を介する細胞障害性の遮断において高度に効果的であった（実施例６）。このように、これらの結果は、本発明が、このような特性を有する抗体を提供することを実証する。
より特殊な態様では、本発明の抗体は効率的なアンタゴニストであるが、ｈＮＫＧ２Ｄのシグナル伝達に対するアゴニスト効果は有意でなく、このため、ＮＫＧ２Ｄにより駆動される炎症には寄与しない。例えば、図１９に示すように、ＣＤ３抗原によりトリガーされるＰＢＭＣの増殖に対する固定化ＭＳによる同時刺激が検出できなかったのに対し、固定化ＯＮ７２では、わずかではあるが有意な同時刺激が結果としてもたらされた。理論に拘束されずに述べると、この違いは、図２０〜２２に示すエピトープの違いに少なくとも部分的に起因する可能性がある。２価ＭＳ抗体の抗原結合部分は、ｈＮＫＧ２Ｄ二量体複合体内の１つの単量体に強く結合するが、該第２の単量体に対する第２のＭＳ抗体（又は同じ抗体の第２の抗原結合部分）の結合を遮断する。これに対して、２価ｈｚＯＮ７２抗体の抗原結合部分がｈＮＫＧ２Ｄ二量体内の第１の単量体に結合する場合、これは該第２の単量体に対する第２のｈｚＯＮ７２抗体（又は同じ抗体の第２の抗原結合部分）の結合を遮断しない。] 図１９
[0019] 一実施態様において、本発明は、ＮＫＧ２Ｄを発現するＮＫ細胞又はＴ細胞に添加されると、２つ以下のｈＮＫＧ２Ｄ二量体を架橋するヒト又はヒト化抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を提供する。このような抗体は２価であることが好ましい。１つのＮＫＧ２Ｄ単量体ユニットに対して抗原結合部分が結合すると、第２のＮＫＧ２Ｄ単量体ユニットに対するそのさらなる結合が遮断される２価抗体（例えば、ＭＳなど）は、２つまでのｈＮＫＧ２Ｄ二量体を架橋できる。これに対して、ｈＮＫＧ２Ｄ二量体内における第２のＮＫＧ２Ｄ単量体ユニットに対する結合を遮断することなく、ｈＮＫＧ２Ｄ二量体内におけるＮＫＧ２Ｄ単量体ユニットに結合できる２価抗体は、任意の数のｈＮＫＧ２Ｄ二量体に対する架橋を結果としてもたらすことができる。表面受容体のクラスター形成は、受容体の活性化において生じることが通例である。
一実施態様において、本発明は、ＮＫＧ２Ｄを発現するＮＫ細胞又はＴ細胞に添加されると、ｈＮＫＧ２Ｄ二量体複合体内の１つの単量体だけに強く結合するヒト又はヒト化抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を提供する。理論に拘束されずに述べると、該二量体の両方の単量体に対する強い結合は、ＮＫＧ２Ｄ受容体活性化の前提条件でありうる。ＭＩＣＡ及びｈｚＯＮ７２は、ｈＮＫＧ２Ｄ二量体内における両方の単量体ユニットに対して強く結合する。しかし、ｈＮＫＧ２Ｄ二量体に対するＭＳの結合では、該単量体ユニットの１つに対する結合が優越する一方、第２の単量体ユニットに対する結合は弱く非特異的であり、該第２のｈＮＫＧ２Ｄ単量体上における溶媒排除表面積は減少する（実施例１１）。個別の具体的な好ましい実施態様では、本発明の抗体の結合による、第１及び第２のＮＫＧ２Ｄ単量体ユニットの溶媒排除表面積比は、約１：１より大きく、少なくとも約２：１、又は少なくとも約３：１である。]
[0020] 一実施態様において、本発明は、ＭＳと本質的に同じエピトープに結合するヒト又はヒト化抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を提供する。理論に拘束されずに述べると、ｈＮＫＧ２Ｄ二量体上における特殊な残基又は残基の組合せとリガンドが相互作用すると、アゴニスト活性が回避又は最小化されうる。個別且つ特定の実施態様において、本発明の抗体のエピトープは、ｈＮＫＧ２ＤのＬｙｓ１５０、Ｓｅｒ１５１、Ｔｙｒ１５２、Ｔｈｒ１８０、Ｉｌｅ１８１、Ｉｌｅ１８２、Ｇｌｕ１８３、Ｍｅｔ１８４、Ｇｌｎ１８５、Ｌｅｕ１９１、Ｌｙｓ１９７、Ｔｙｒ１９９、Ｇｌｕ２０１、Ｔｈｒ２０５、Ｐｒｏ２０６、Ａｓｎ２０７、及びＴｈｒ２０８（配列番号２）からなる群から選択される少なくとも１の残基、同群から選択される少なくとも３の残基、同群から選択される少なくとも５の残基、同群から選択される少なくとも８の残基、同群から選択される少なくとも１０の残基、同群から選択される少なくとも１２の残基、又は同群から選択されるすべての残基を含む。
一態様において、本発明は、ｈＮＫＧ２Ｄを発現するＮＫ細胞又はＴ細胞によるＮＫＧ２Ｄ媒介性の細胞障害性を有効に阻止し；ｈＮＫＧ２Ｄに対する結合に対して少なくともＭＩＣＡと競合し；例えば、ｈＮＫＧ２Ｄの発現低下、ｈＮＫＧ２Ｄの内部移行、及び／又はｈＮＫＧ２Ｄの再出現の阻止により、結合時において、細胞表面のｈＮＫＧ２Ｄ量を低減し；ｈＮＫＧ２Ｄに対する親和性が１０ｎＭ以下であって、カニクイザルＮＫＧ２Ｄ及び／又はアカゲザルＮＫＧ２Ｄと交差反応し；例えば、ＩｇＧ４アイソタイプを有することにより、非枯渇性である、完全ヒト抗体又はその抗原結合断片を提供する。特殊な実施態様において、抗体は、ＩｇＧ４アイソタイプの非枯渇性完全ヒト抗体であり、ｈＮＫＧ２Ｄに対する親和性が１ｎＭ以下、好ましくは３００ｐＭ以下であり、内因性ｈＮＫＧ２Ｄ−リガンド結合の少なくとも５０％、少なくとも７０％、又は少なくとも９０％を遮断し、細胞表面のｈＮＫＧ２Ｄ量を少なくとも１０％、少なくとも３０％、又は少なくとも５０％低減する。別の特殊な実施態様において、抗体は、ＩｇＧ４アイソタイプの２価非枯渇性完全ヒト抗体であり、１００ｐＭ未満の親和性を有し、細胞表面と会合したＮＫＧ２Ｄに対する飽和用量のＭＩＣＡ−Ｆｃの結合に対する遮断のＥＣ５０濃度が０．０１ｎｇ／ｍｌ未満であり、結合時において、細胞表面のＮＫＧ２Ｄ量を少なくとも７５％低減する能力を有し、場合によっては、リガンドに誘導されるＮＫ細胞による細胞障害性の軽減に関するＥＣ５０濃度が、細胞表面と会合したＮＫＧ２Ｄに対する結合に必要とされるＥＣ５０濃度よりも低い。抗体は、ＮＫＧ２Ｄ発現細胞を用いるアッセイにおいて、ｈＮＫＧ２Ｄ受容体を飽和させに必要な濃度（すなわち、飽和用量）よりも低濃度で、最高レベルのｈＮＫＧ２Ｄ発現低下を達成する能力をさらに有することが可能である。]
[0021] ｈＮＫＧ２Ｄに特異的に結合し、これらの特性の一部又は全部を有する抗体の作製、特徴付け、及び使用については、実施例を含む以下の節においてより詳細に説明される。]
[0022] 抗ＮＫＧ２Ｄ抗体
本発明の抗体は、特殊な機能及び／又は構造的な特徴もしくは特性を特徴とする。抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体の機能活性を評価するアッセイについては実施例で詳細に説明され、例えば、アミノ酸配列などの構造的な特性については以下で説明される。]
[0023] 機能的特性
本発明の抗体は、ｈＮＫＧ２Ｄに結合する。一実施態様において、本発明の抗体は、高い親和性で、例えば、１０−７Ｍ以下のＫＤ、１０−８Ｍ以下のＫＤ、１ｎＭ以下のＫＤ、０．３ｎＭ以下のＫＤ、０．２ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０５ｎＭ以下、又は０．０１ｎＭ以下のＫＤでｈＮＫＧ２Ｄに結合する。特殊な実施態様において、抗体は、０．１ｎＭ以下の親和性でｈＮＫＧ２Ｄに結合する。
一態様において、本発明は、また、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ、ＮＣＢＩ受託番号第ＡＪ４２６４２９号）及びアカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ、ＮＣＢＩ受託番号第ＡＪ５５４３０２号）などのサルにおける１又は複数の種類のＮＫＧ２Ｄ相同分子種、及び／又はｈＮＫＧ２Ｄホモ二量体、正確にフォールディングされた単量体完全長ｈＮＫＧ２Ｄ、ｈＮＫＧ２Ｄの細胞外部分を含むｈＮＫＧ２Ｄ断片、変性ｈＮＫＧ２Ｄ、もしくは前出のＮＫＧ２Ｄ形態の任意の組合せにも結合する抗体を提供する。例えば、実施例５で実証されるように、具体的なカニクイザル細胞型に対するヒト抗体２１Ｆ２及びＭＳの結合は、対応するＥＣ５０（すなわち、最大有効濃度の１／２）値で、同じヒト細胞型に対するそれらの結合の、それぞれ約６５％及び約７５％を超えた。したがって、一実施態様において、本発明の抗体は、それがｈＮＫＧ２Ｄに結合する場合と同様の親和性又は有効性で、カニクイザル及び／又はアカゲザルのＮＫＧ２Ｄに結合する。例えば、抗体は、ＮＫＧ２Ｄを発現するヒトＮＫ細胞又はヒトＴ細胞の対応する集団のＥＣ５０の約５０％以上、約６５％以上、又は約７５％以上のＥＣ５０で、ＮＫＧ２Ｄを発現するカニクイザル又はアカゲザルのＮＫ細胞又はＴ細胞に結合できる。またないし或いは、抗体は、ｈＮＫＧ２Ｄに対する親和性の約３０％以上、約５０％以上、約６５％以上、又は約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、もしくは約９０％以上の親和性で、カニクイザル又はアカゲザルのＮＫＧ２Ｄに結合できる。このような抗体は、ヒトにおいて使用する前に、最も適する動物モデル（又は複数のモデル）における毒性試験が可能であるという利点を有する。]
[0024] 特定の一態様において、本発明の抗体はまた、ＯＮ７２など、公知のマウス抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体が結合しないＮＫＧ２Ｄの形態にも結合する。具体的には、実施例３で説明するように、ＯＮ７２によるプレインキュベーションでは、その後添加したヒト１６Ｆ１６のｈＮＫＧ２Ｄに対する結合の遮断が約８２％に過ぎなかったのに対し、１６Ｆ１６によるプレインキュベーションでは、その後添加したＯＮ７２のｈＮＫＧ２Ｄに対する結合の遮断は約９５％であった。
その上、本発明の抗体は、ｈＮＫＧ２Ｄ媒介性のＮＫ細胞又はＴ細胞の活性化を低下させるか又は阻害することができ、すなわち、ｈＮＫＧ２Ｄ受容体をアンタゴナイズできる。これは、例えば、本明細書で説明されるか又は当技術分野で公知の１又は複数の種類の細胞障害性アッセイにおいて調べることができる。例えば、ある抗体が、任意の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体の不在下又は非特異的なコントロール抗体の存在下における標的細胞の殺傷と比較して、ＮＫＧ２Ｄリガンドを発現する標的細胞のＮＫ細胞又はＴ細胞媒介性の殺傷を少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも３０％、さらに好ましくは少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％阻害する場合、該抗体は、ｈＮＫＧ２Ｄ媒介性のＮＫ細胞又はＴ細胞の活性化を阻害する。]
[0025] ｈＮＫＧ２Ｄアンタゴニストである本発明の抗体は、アゴニスト活性を全く有さないか又は同活性が低い。このような抗体は、ヒト抗体又はヒト化抗体であることが好ましい。アゴニスト活性は、本明細書で説明されるアッセイ又は当技術分野で公知のアッセイのうち１種において調べることができる。例えば、アッセイの１種は、固定化された抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の存在又は不在下において、低レベルのＣＤ３抗原により刺激された末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ）の増殖を測定する同時刺激アッセイである（実施例１０を参照されたい）。このようなアッセイにおいて、本発明の抗体の存在下における増殖は、抗体の不在下における増殖の３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下であるか、又はこれよりも顕著に高度ではない。本発明の抗体の存在下における増殖は、抗体の不在下における増殖よりも顕著に高度ではないことが好ましい。追加的又は代替的な実施態様において、本発明の抗体のｈＮＫＧ２Ｄアゴニスト活性は、コントロール値の３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下であるか、又はこれよりも顕著に高度ではない。コントロールは、例えば、抗体の不在下、細胞もしくは別の試薬の不在下、及び／又は非対象抗体の存在下などにあるネガティブコントロールであることが好ましい。本発明の抗体のアゴニスト活性は、コントロール値よりも顕著に高度ではないことが好ましい。
本発明の別の態様では、ＮＫ細胞又はＴ細胞の細胞表面ＮＫＧ２Ｄに対する結合のＥＣ５０濃度よりも、リガンドに誘導される細胞障害性の遮断のＥＣ５０濃度の方が低く、好ましくは実質的に低い抗体を提供する。例えば、ＯＮ７２の場合、ＢａＦ／３細胞上に発現する細胞表面ＮＫＧ２Ｄに対する結合のＥＣ５０濃度（０．０６２μｇ／ｍｌ）が、リガンド（ＵＬＢＰ３）を発現する標的細胞に対するＮＫ細胞媒介性の殺傷の遮断のＥＣ５０濃度（０．０６５μｇ／ｍｌ）と同様であったのに対し、細胞表面のＮＫＧ２Ｄに対する結合のＥＣ５０（２１Ｆ２：０．０３３μｇ／ｍｌ；ＭＳ：０．０３２ｇ／ｍｌ）よりも、細胞障害性の遮断のＥＣ５０（２１Ｆ２：０．０２１μｇ／ｍｌ；ＭＳ：０．０１２μｇ／ｍｌ）の方が、２１Ｆ２では低く、ＭＳでは実質的に低かった（実施例６及び９を参照されたい）。さらに、ＭＳは、２１Ｆ２及び１６Ｆ１６（これらは、飽和濃度に対応するか又はそれ以上の濃度であった、図３）よりも低い濃度（細胞と会合するＮＫＧ２Ｄ受容体の約８０％のみの飽和に対応する濃度、図３）で、細胞障害性に対する最大の遮断を達成した。こうして、一実施態様において、本発明は、ＮＫ細胞又はＴ細胞の細胞表面ＮＫＧ２Ｄに対する結合のＥＣ５０濃度よりも、リガンドに誘導される細胞障害性に対する遮断のＥＣ５０濃度の方が低い抗体、好ましくはヒト抗体又はヒト化抗体を提供する。細胞株又は適切な他の調製物のＮＫ細胞又はＴ細胞による細胞障害性の遮断のＥＣ５０は、同じ細胞株又は調製物の細胞表面ＮＫＧ２Ｄに対する結合のＥＣ５０に対して、例えば、約９５％以下、約９０％以下、約８５％以下、約８０％以下、約７０％以下、約５０％以下、又は約４０％以下でありうる。試験用の例示的な細胞株は、ＮＫ−９２細胞及びＮＫＬ細胞を含む。] 図３
[0026] 別の実施態様において、本発明は、結合可能なｈＮＫＧ２Ｄ受容体を飽和させるのに必要な濃度よりも低い濃度で、ＮＫ細胞による細胞障害性の最大の遮断を達成する抗体を提供する。具体的な実施態様において、該抗体はまた、ｈＮＫＧ２Ｄに対する結合においてＭＳとも競合する。別の特定の実施態様において、このような抗体は、ＭＳと本質的に同じｈＮＫＧ２Ｄエピトープに結合する。
該抗体は、例えば、１又は複数の種類の内因性ｈＮＫＧ２ＤリガンドによるｈＮＫＧ２Ｄに対する結合に干渉することにより、ＮＫＧ２Ｄ媒介性の活性を低下させるか又は阻害することが可能である。該抗体は、例えば、ＭＩＣＡ；又はＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ；又はＭＩＣＡ及びＵＬＢＰ３；又はＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、及びＵＬＢＰ３；又はＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ならびにＵＬＢＰ１、同２、同３、及び同４；又はＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、及び１又は複数の種類のＲＡＥＴ１ファミリーメンバーによるｈＮＫＧ２Ｄに対する結合を低下させるか又は阻害することにより、例えば、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ４、及び／又はＲＡＥＴ１ファミリーメンバーによるｈＮＫＧ２Ｄに対する結合を低下させるか又は阻害することが可能である。内因性ＮＫＧ２ＤリガンドによるｈＮＫＧ２Ｄに対する結合を阻害する抗体の能力は、本明細書で説明される結合アッセイ又は競合アッセイを用いて評価することができる。一実施態様において、本発明の抗体は、少なくとも３０％のリガンド結合、又は少なくとも５０％のリガンド結合、又は少なくとも７０％のリガンド結合、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％のリガンド結合を阻害する能力を有する。別の実施態様において、本発明の抗体が１μｇのＭＩＣＡ−ｍＦｃによるｈＮＫＧ２Ｄに対する結合を阻害する場合のＩＣ５０は、１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０５ｎＭ以下、又は０．０２ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、０．００５以下、又は０．００２以下である。別の実施態様において、１μｇのＭＩＣＡ−ｍＦｃによる結合に対する完全な遮断は、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．７ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、又は０．２ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０５ｎＭ以下、又は約０．０２ｎＭ以下の抗体濃度で達成される。一実施態様において、本発明は、例えば、ＭＩＣＡによるｈＮＫＧ２Ｄに対する結合など、リガンドによるｈＮＫＧ２Ｄに対する結合を低下させるか又は阻害するために、ＯＮ７２、ＢＡＴ２２１、５Ｃ６、１Ｄ１１、ＥＣＭ２１７、及び１４９８１０のうちのいずれかと同程度に効果的であるか又はこれよりも効果的な抗体、とりわけ、ヒト抗体を提供する。]
[0027] またないし或いは、本発明の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体は、結合時（すなわち、結合後）に、細胞表面のｈＮＫＧ２Ｄ量を低減する能力を有しうる。抗体結合時における、細胞表面と会合したｈＮＫＧ２Ｄの低減は、これにより、リガンド結合及びその後の活性化に用いられるｈＮＫＧ２Ｄ受容体数が低減されるため、有利な特徴でありうる。理論に拘束されずに述べると、この低減は、ＮＫＧ２Ｄの発現低下、内部移行、又は他の機構により引き起こされる可能性がある。本明細書で示すように、ヒト抗体など、ヒトＦｃ領域を有する抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体は、細胞表面のｈＮＫＧ２Ｄ量を有効に低減する能力を有する。例えば、ヒト抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体である１６Ｆ１６、ＭＳ、及び２１Ｆ２はすべて、血清不在下における一晩に亘るインキュベーション後において、細胞表面のｈＮＫＧ２Ｄ量を約７５％以上低減したが、ＭＳが最も有効であり、低濃度で７５〜９０％の発現低下を達成した（図１５〜１７）。血清存在下においても、ｈＮＫＧ２Ｄを発現するＢａＦ／３細胞上における飽和濃度未満に対応するＭｓ濃度で、最大の発現低下が達成された（図１６Ｂ）。したがって、一実施態様において、本発明は、飽和濃度未満でｈＮＫＧ２Ｄに対する最大の発現低下を達成できる、ｈＮＫＧ２Ｄに結合する抗体を提供する。別の実施態様において、このような抗体はまた、ｈＮＫＧ２Ｄに対する結合において、ＭＳとも競合する。別の実施態様では、このような抗体も、ＭＳと本質的に同じｈＮＫＧ２Ｄエピトープに結合する。本発明の抗体は、抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体の不在下又は非特異的なコントロール抗体の存在下において、細胞表面のｈＮＫＧ２Ｄと比較して、細胞表面のｈＮＫＧ２Ｄを少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、又は少なくとも９０％低減する能力を有しうる。該抗体は、細胞表面のＮＫＧ２Ｄに対する低減を達成する一方で、ＮＫＧ２Ｄ受容体のシグナル伝達に対する活性化を全く又はほとんど引き起こさない、すなわちアゴニスト活性を全く又はほとんど有さないことが好ましい。本明細書で、細胞表面のｈＮＫＧ２Ｄ及び抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体のアゴニスト活性を評価する例示的なアッセイが説明される。一実施態様において、本発明は、ＯＮ７２、ＢＡＴ２２１、５Ｃ６、１Ｄ１１、ＥＣＭ２１７、及び１４９８１０から選択されるコントロール抗体よりも高度の発現低下能力を有する抗体、特に、ヒト抗体を提供する。別の実施態様において、本発明の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体は、飽和濃度よりも低濃度で、細胞又は細胞株により発現される細胞表面のｈＮＫＧ２Ｄに対する最大の発現低下を達成する能力を有しうる。
別の実施態様において、本発明は、１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、及び／又は２１Ｆ２、より好ましくはＭＳ及び／又は２１Ｆ２と競合し、且つ／又はこれらと同じｈＮＫＧ２Ｄ上のエピトープに結合する抗体を提供する。このような抗体は、本明細書で説明される標準的なｈＮＫＧ２Ｄ結合アッセイにおいて、１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２と交差競合するそれらの能力に基づき同定することができる。ｈＮＫＧ２Ｄに対する１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２の結合を阻害する試験抗体の能力により、該試験抗体が、ｈＮＫＧ２Ｄに対する結合について、１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２と競合でき、このため、１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２と同じｈＮＫＧ２Ｄ上におけるエピトープに結合できることが裏付けられる。好ましい実施態様において、１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２と同じｈＮＫＧ２Ｄ上のエピトープに結合する抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。このようなヒトモノクローナル抗体は、実施例で説明されるように調製及び単離することができる。] 図１５ 図１６ 図１６Ｂ 図１７
[0028] 別の好ましい実施態様において、該抗体は、マウスモノクローナル抗体であるＯＮ７２、ＢＡＴ２２１、５Ｃ６、１Ｄ１１、ＥＣＭ２１７、及び１４９８１０のうちのうちのいずれとも異なるエピトープに結合し、列挙されたマウスモノクローナル抗体のいずれよりも、１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２と強く交差競合する。
一実施態様において、本発明の抗体のエピトープは、ｈＮＫＧ２ＤのＬｙｓ１５０、Ｓｅｒ１５１、Ｔｙｒ１５２、Ｔｈｒ１８０、Ｉｌｅ１８１、Ｉｌｅ１８２、Ｇｌｕ１８３、Ｍｅｔ１８４、Ｇｌｎ１８５、Ｌｅｕ１９１、Ｌｙｓ１９７、Ｔｙｒ１９９、Ｇｌｕ２０１、Ｔｈｒ２０５、Ｐｒｏ２０６、Ａｓｎ２０７、及びＴｈｒ２０８（配列番号２）から選択される１つ又は複数の残基を含む。一実施態様において、本発明の抗体のエピトープは、ｈＮＫＧ２ＤのＬｙｓ１５０、Ｓｅｒ１５１、Ｔｙｒ１５２、Ｔｈｒ１８０、Ｉｌｅ１８１、Ｉｌｅ１８２、Ｇｌｕ１８３、Ｍｅｔ１８４、Ｇｌｎ１８５、Ｌｅｕ１９１、Ｌｙｓ１９７、Ｔｙｒ１９９、Ｇｌｕ２０１、Ｔｈｒ２０５、Ｐｒｏ２０６、Ａｓｎ２０７、及びＴｈｒ２０８（配列番号２）から選択される５つ以上の残基を含む。一実施態様において、本発明の抗体のエピトープは、ｈＮＫＧ２ＤのＬｙｓ１５０、Ｓｅｒ１５１、Ｔｙｒ１５２、Ｔｈｒ１８０、Ｉｌｅ１８１、Ｉｌｅ１８２、Ｇｌｕ１８３、Ｍｅｔ１８４、Ｇｌｎ１８５、Ｌｅｕ１９１、Ｌｙｓ１９７、Ｔｙｒ１９９、Ｇｌｕ２０１、Ｔｈｒ２０５、Ｐｒｏ２０６、Ａｓｎ２０７、及びＴｈｒ２０８（配列番号２）から選択される８、１０、１２以上の残基を含む。一実施態様において、本発明の抗体のエピトープは、ｈＮＫＧ２Ｄの残基Ｌｙｓ１５０、Ｓｅｒ１５１、Ｔｙｒ１５２、Ｔｈｒ１８０、Ｉｌｅ１８１、Ｉｌｅ１８２、Ｇｌｕ１８３、Ｍｅｔ１８４、Ｇｌｎ１８５、Ｌｅｕ１９１、Ｌｙｓ１９７、Ｔｙｒ１９９、Ｇｌｕ２０１、Ｔｈｒ２０５、Ｐｒｏ２０６、Ａｓｎ２０７、及びＴｈｒ２０８（配列番号２）を含む。一実施態様において、本発明の抗体のエピトープは、ｈＮＫＧ２Ｄの残基Ｌｙｓ１５０、Ｓｅｒ１５１、Ｔｙｒ１５２、Ｔｈｒ１８０、Ｉｌｅ１８１、Ｉｌｅ１８２、Ｇｌｕ１８３、Ｍｅｔ１８４、Ｇｌｎ１８５、Ｌｅｕ１９１、Ｌｙｓ１９７、Ｔｙｒ１９９、Ｇｌｕ２０１、Ｔｈｒ２０５、Ｐｒｏ２０６、Ａｓｎ２０７、及びＴｈｒ２０８（配列番号２）から本質的になる。一実施態様において、本発明の抗体のエピトープは、ｈＮＫＧ２ＤのＬｙｓ１５０、Ｓｅｒ１５１、Ｔｙｒ１５２、Ｔｈｒ１８０、Ｉｌｅ１８１、Ｉｌｅ１８２、Ｇｌｕ１８３、Ｍｅｔ１８４、Ｇｌｎ１８５、Ｌｅｕ１９１、Ｌｙｓ１９７、Ｔｙｒ１９９、Ｇｌｕ２０１、Ｔｈｒ２０５、Ｐｒｏ２０６、Ａｓｎ２０７、及びＴｈｒ２０８（配列番号２）から選択される１つ又は複数の残基からなる。一実施態様において、本発明の抗体のエピトープは、ｈＮＫＧ２Ｄの残基Ｌｙｓ１５０、Ｓｅｒ１５１、Ｔｙｒ１５２、Ｔｈｒ１８０、Ｉｌｅ１８１、Ｉｌｅ１８２、Ｇｌｕ１８３、Ｍｅｔ１８４、Ｇｌｎ１８５、Ｌｅｕ１９１、Ｌｙｓ１９７、Ｔｙｒ１９９、Ｇｌｕ２０１、Ｔｈｒ２０５、Ｐｒｏ２０６、Ａｓｎ２０７、及びＴｈｒ２０８（配列番号２）からなる。]
[0029] 一実施態様において、本発明の抗体のエピトープは、ｈＮＫＧ２ＤのＬｙｓ１５０、Ｓｅｒ１５１、Ｔｙｒ１５２、Ｉｌｅ１８１、Ｍｅｔ１８４、Ｇｌｎ１８５、Ｌｙｓ１９７、Ｔｈｒ２０５、及びＡｓｎ２０７（配列番号２）から選択される、水素結合に関与する１つ又は複数の残基を含む。一実施態様において、本発明の抗体のエピトープは、ｈＮＫＧ２ＤのＬｙｓ１５０、Ｓｅｒ１５１、Ｔｙｒ１５２、Ｉｌｅ１８１、Ｍｅｔ１８４、Ｇｌｎ１８５、Ｌｙｓ１９７、Ｔｈｒ２０５、及びＡｓｎ２０７（配列番号２）から選択される、水素結合に関与する５つ以上の残基を含む。一実施態様において、本発明の抗体のエピトープは、ｈＮＫＧ２ＤのＬｙｓ１５０、Ｓｅｒ１５１、Ｔｙｒ１５２、Ｉｌｅ１８１、Ｍｅｔ１８４、Ｇｌｎ１８５、Ｌｙｓ１９７、Ｔｈｒ２０５、及びＡｓｎ２０７（配列番号２）を含む。
本発明の好ましい抗体は、以下の特性、すなわち：（ａ）ＮＫＧ２Ｄを発現するＮＫ細胞又はＴ細胞のＮＫＧ２Ｄ媒介性の活性を、場合によって、該細胞に対する結合のＥＣ５０よりも低い、リガンド誘導性の細胞障害性の低減のＥＣ５０により阻止すること；（ｂ）ＮＫＧ２Ｄに対する結合において少なくとも１種のＮＫＧ２Ｄリガンドと、好ましくは、少なくともＭＩＣＡ及びＵＬＢＰ３と競合すること；（ｃ）ＮＫＧ２Ｄを発現するＮＫ細胞又はＴ細胞の表面上のｈＮＫＧ２Ｄ量を、好ましくは少なくとも７５％低減すること；（ｄ）好ましくは、ｈＮＫＧ２Ｄに対する結合の親和性の５０％以上の親和性で、カニクイザル及び／又はアカゲザルのＮＫＧ２Ｄに結合すること；（ｅ）ＮＫＧ２Ｄの複数の形態又は立体構造に結合すること；（ｆ）１ｎＭ以下、好ましくは０．１ｎＭ以下のＫｄでＮＫＧ２Ｄに結合すること；（ｇ）ｈＮＫＧ２Ｄに対する結合において、１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２のうちのうちの１つ又は複数と競合すること；（ｈ）ｈＮＫＧ２Ｄに対する結合において、ＯＮ７２、ＢＡＴ２２１、５Ｃ６、１Ｄ１１、ＥＣＭ２１７、及び１４９８１０のうちのいずれよりも、１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２と強く競合すること；（ｉ）細胞表面のｈＮＫＧ２Ｄに対する１６Ｆ１６、ＭＳ、又は２１Ｆ２の結合を、９０％を超えて遮断すること；（ｊ）アゴニスト活性が有意ではないこと；ならびに（ｋ）１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、及び／又は２１Ｆ２のうちのうちのいずれかと本質的に同じエピトープ、好ましくは、ＭＳ及び／又は２１Ｆ２と本質的に同じエピトープに結合することのうち、少なくとも１つ、より好ましくは２つ、３つ、４つ、５つ以上を呈する。本発明の抗体は、上記で説明した機能的特徴、及び／又は実施例で説明される機能的特徴のあらゆる組合せを呈示することができる。]
[0030] 構造的特性
本発明の好ましい抗体は、実施例で説明される通りに作製され、単離され、構造的に、また機能的に特徴付けされる、ヒトモノクローナル抗体１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、及び２１Ｆ２である。これらの抗体の完全長配列、可変配列、及びＣＤＲ配列を、表１に記載する。
表１
１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、及び２１Ｆ２の完全長アミノ酸配列、可変アミノ酸配列、及びＣＤＲアミノ酸配列]
[0031] 本発明の特定の抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、ＭＳと同じであるか又は類似のパラトープを有する。一実施態様において、該抗体は、ＭＳＬ鎖のＴｙｒ３３及びＴｒｐ９７（配列番号４１）のうちの１又は複数、及び／又はＭＳＨ鎖のＧｌｎ１、Ａｓｐ２６、Ａｓｐ２７、Ｓｅｒ３０、Ｓｅｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｙｒ３３、Ｈｉｓ５０、Ｓｅｒ５２、Ｔｙｒ５３、Ｓｅｒ５４、Ｓｅｒ５６、Ａｌａ５７、Ａｓｎ５８、Ｔｒｐ９８、及びＡｓｐ９９（配列番号４０）のうちの１又は複数に対応する残基を含むパラトープを有する。一実施態様において、該抗体は、ＭＳ Ｌ鎖のＴｙｒ３３及びＴｒｐ９７（配列番号４１）、及び／又はＭＳ Ｈ鎖のＧｌｎ１、Ａｓｐ２６、Ａｓｐ２７、Ｓｅｒ３０、Ｓｅｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｙｒ３３、Ｈｉｓ５０、Ｓｅｒ５２、Ｔｙｒ５３、Ｓｅｒ５４、Ｓｅｒ５６、Ａｌａ５７、Ａｓｎ５８、Ｔｒｐ９８、及びＡｓｐ９９（配列番号４０）のうちの３、５、７、１０以上に対応する残基を含むパラトープを有する。一実施態様において、該抗体は、ＭＳ Ｌ鎖のＴｙｒ３３及びＴｒｐ９７（配列番号４１）、ならびにＭＳ Ｈ鎖のＧｌｎ１、Ａｓｐ２６、Ａｓｐ２７、Ｓｅｒ３０、Ｓｅｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｙｒ３３、Ｈｉｓ５０、Ｓｅｒ５２、Ｔｙｒ５３、Ｓｅｒ５４、Ｓｅｒ５６、Ａｌａ５７、Ａｓｎ５８、Ｔｒｐ９８、及びＡｓｐ９９（配列番号４０）に対応する残基を含むパラトープを有する。一実施態様において、該抗体は、ＭＳ Ｌ鎖のＴｙｒ３３及びＴｒｐ９７（配列番号４１）、ならびにＭＳ Ｈ鎖のＧｌｎ１、Ａｓｐ２６、Ａｓｐ２７、Ｓｅｒ３０、Ｓｅｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｙｒ３３、Ｈｉｓ５０、Ｓｅｒ５２、Ｔｙｒ５３、Ｓｅｒ５４、Ｓｅｒ５６、Ａｌａ５７、Ａｓｎ５８、Ｔｒｐ９８、及びＡｓｐ９９（配列番号４０）に対応する残基から本質的になるパラトープを有する。一実施態様において、該抗体は、ＭＳ Ｌ鎖のＴｙｒ３３及びＴｒｐ９７（配列番号４１）、ならびにＭＳ Ｈ鎖のＧｌｎ１、Ａｓｐ２６、Ａｓｐ２７、Ｓｅｒ３０、Ｓｅｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｙｒ３３、Ｈｉｓ５０、Ｓｅｒ５２、Ｔｙｒ５３、Ｓｅｒ５４、Ｓｅｒ５６、Ａｌａ５７、Ａｓｎ５８、Ｔｒｐ９８、及びＡｓｐ９９（配列番号４０）に対応する残基からなるパラトープを有する。
１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、２１Ｆ２、及びＭＳのすべてがｈＮＫＧ２Ｄに結合できることを踏まえると、これらの抗体それぞれのＶＨ配列及びＶＬ配列を「混合して調和させて」、本発明の他の抗ｈＮＫＧ２Ｄ結合分子を作成できる場合がある。このように「混合して調和させた」抗体のｈＮＫＧ２Ｄに対する結合は、本明細書で説明される結合アッセイ（例えば、フローサイトメトリー、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＥＬＩＳＡ）及び／又は本明細書で説明される細胞障害性アッセイを用いて調べることができる。ＶＨ鎖とＶＬ鎖とを混合して調和させる場合は、特殊なＶＨ／ＶＬ対に由来するＶＨ配列を、構造的に類似するＶＨ配列により置換することが好ましい。同様に、特殊なＶＨ／ＶＬ対に由来するＶＬ配列を、構造的に類似するＶＬ配列により置換することが好ましい。]
[0032] したがって、一態様において、本発明は、単離されたモノクローナル抗体、又はその抗原結合部分であって、（ａ）配列番号１１、１３、４４、及び４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ領域と、（ｂ）配列番号１２、１４、４５、及び４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ領域とを含み、ｈＮＫＧ２Ｄに結合する単離されたモノクローナル抗体、又はその抗原結合部分を提供する。好ましい重鎖及び軽鎖の組合せは、（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨ領域、及び（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（ａ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＨ領域、及び（ｂ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（ａ）配列番号４５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び（ｂ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
別の態様において、本発明は、１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２の重鎖及び軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３、或いはこれらの組合せを含む抗体を提供する。該ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔシステム（Ｋａｂａｔら（１９９１年）、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、第５版、米国保健福祉省、ＮＩＨ刊行物第９１−３２４２号）を用いて表わされる。例えば、図４及び５を参照されたい。これらの抗体の各々がｈＮＫＧ２Ｄに結合でき、抗原結合特異性が主に、ＣＤＲ１、２、及び３領域によりもたらされることを踏まえると、ＶＨのＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列ならびにＶＬのＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列を「混合して調和させ」て（すなわち、各抗体は、ＶＨ ＣＤＲ１、２、及び３ならびにＶＬ ＣＤＲ１、２、及び３を含有しうるが、異なる抗体に由来するＣＤＲを混合して調和させることができる）、本発明の他の抗ｈＮＫＧ２Ｄ結合分子を作成することができる。このような「混合して調和させた」抗体のｈＮＫＧ２Ｄに対する結合は、上記及び実施例で説明される結合アッセイ（例えば、フローサイトメトリー、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＥＬＩＳＡ）を用いて調べることができる。ＶＨＣＤＲ配列を混合して調和させる場合は、特殊なＶＨ配列に由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３配列を、構造的に類似する（１又は複数の種類の）ＣＤＲ配列により置換することが好ましい。同様に、ＶＬ ＣＤＲ配列を混合して調和させる場合は、特殊なＶＬ配列に由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３配列を、構造的に類似する（１又は複数の種類の）ＣＤＲ配列により置換することが好ましい。例えば、１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、及び２１Ｆ２のＶＬ ＣＤＲ１及び３と、ＭＳ及び２１Ｆ２のＶＬ ＣＤＲ２配列とは、ある構造的な類似性を共有し、そのために、混合して調和させるのに適する。１又は複数の種類のＶＨ及び／又はＶＬのＣＤＲ領域配列を、モノクローナル抗体１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、及び２１Ｆ２について本明細書で開示されるＣＤＲ配列に由来する構造的に類似する配列により置換することにより、新規のＶＨ配列及びＶＬ配列を作成できることは、当業者には容易に明らかであろう。]
[0033] したがって、別の態様において、本発明は、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分であって、（ａ）配列番号１５、２１、４８、及び５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１と、（ｂ）配列番号１６、２２、４９、及び５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２と、（ｃ）配列番号１７、２３、５０、及び５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３と、（ｄ）配列番号１８、２４、５１、及び５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１と、（ｅ）配列番号１９、２５、５２、及び５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２と、（ｆ）配列番号２０、２６、５３、及び５９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３とを含み、ｈＮＫＧ２Ｄに結合する単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。
好ましい実施態様において、該抗体は、（ａ）配列番号１５を含むＶＨ ＣＤＲ１と、（ｂ）配列番号１６を含むＶＨ ＣＤＲ２と、（ｃ）配列番号１７を含むＶＨ ＣＤＲ３と、（ｄ）配列番号１８を含むＶＬ ＣＤＲ１と、（ｅ）配列番号１９を含むＶＬ ＣＤＲ２と、（ｆ）配列番号２０を含むＶＬ ＣＤＲ３とを含む。]
[0034] 別の好ましい実施態様において、該抗体は、（ａ）配列番号２１を含むＶＨＣＤＲ１と、（ｂ）配列番号２２を含むＶＨ ＣＤＲ２と、（ｃ）配列番号２３を含むＶＨ ＣＤＲ３と、（ｄ）配列番号２４を含むＶＬ領域ＣＤＲ１と、（ｅ）配列番号２５を含むＶＬ ＣＤＲ２と、（ｆ）配列番号２６を含むＶＬ ＣＤＲ３とを含む。
別の好ましい実施態様において、該抗体は、（ａ）配列番号４８を含むＶＨ ＣＤＲ１と、（ｂ）配列番号４９を含むＶＨ ＣＤＲ２と、（ｃ）配列番号５０を含むＶＨ ＣＤＲ３と、（ｄ）配列番号５１を含むＶＬ領域ＣＤＲ１と、（ｅ）配列番号５２を含むＶＬ ＣＤＲ２と、（ｆ）配列番号５３を含むＶＬ ＣＤＲ３とを含む。]
[0035] 別の好ましい実施態様において、該抗体は、（ａ）配列番号５４を含むＶＨＣＤＲ１と、（ｂ）配列番号５５を含むＶＨ ＣＤＲ２と、（ｃ）配列番号５６を含むＶＨ ＣＤＲ３と、（ｄ）配列番号５７を含むＶＬ領域ＣＤＲ１と、（ｅ）配列番号５８を含むＶＬ ＣＤＲ２と、（ｆ）配列番号５９を含むＶＬ ＣＤＲ３とを含む。
別の好ましい実施態様において、該抗体は、（ａ）配列番号１５からなるＶＨ ＣＤＲ１と、（ｂ）配列番号１６からなるＶＨ ＣＤＲ２と、（ｃ）配列番号１７からなるＶＨ ＣＤＲ３と、（ｄ）配列番号１８からなるＶＬ ＣＤＲ１と、（ｅ）配列番号１９からなるＶＬ ＣＤＲ２と、（ｆ）配列番号２０からなるＶＬ ＣＤＲ３とを含む。]
[0036] 別の好ましい実施態様において、該抗体は、（ａ）配列番号２１からなるＶＨＣＤＲ１と、（ｂ）配列番号２２からなるＶＨ ＣＤＲ２と、（ｃ）配列番号２３からなるＶＨ ＣＤＲ３と、（ｄ）配列番号２４からなるＶＬ領域ＣＤＲ１と、（ｅ）配列番号２５からなるＶＬ ＣＤＲ２と、（ｆ）配列番号２６からなるＶＬ ＣＤＲ３とを含む。
別の好ましい実施態様において、該抗体は、（ａ）配列番号４８からなるＶＨ ＣＤＲ１と、（ｂ）配列番号４９からなるＶＨ ＣＤＲ２と、（ｃ）配列番号５０からなるＶＨ ＣＤＲ３と、（ｄ）配列番号５１からなるＶＬ領域ＣＤＲ１と、（ｅ）配列番号５２からなるＶＬ ＣＤＲ２と、（ｆ）配列番号５３からなるＶＬ ＣＤＲ３とを含む。]
[0037] 別の好ましい実施態様において、該抗体は、（ａ）配列番号４８からなるＶＨＣＤＲ１と、（ｂ）配列番号４９からなるＶＨ ＣＤＲ２と、（ｃ）配列番号５０からなるＶＨ ＣＤＲ３と、（ｄ）配列番号５１からなるＶＬ領域ＣＤＲ１と、（ｅ）配列番号５２からなるＶＬ ＣＤＲ２と、（ｆ）配列番号５３、ならびにＭＳＨ鎖中のＧｌｎ１、Ａｓｐ２６、及びＡｓｐ２７（配列番号４０）のうちの１つ、２つ、又はすべてに対応する残基からなるＶＬ ＣＤＲ３とを含む。
別の好ましい実施態様において、該抗体は、（ａ）配列番号５４からなるＶＨ ＣＤＲ１と、（ｂ）配列番号５５からなるＶＨ ＣＤＲ２と、（ｃ）配列番号５６からなるＶＨ ＣＤＲ３と、（ｄ）配列番号５７からなるＶＬ領域ＣＤＲ１と、（ｅ）配列番号５８からなるＶＬ ＣＤＲ２と、（ｆ）配列番号５９からなるＶＬ ＣＤＲ３とを含む。]
[0038] 特定の実施態様において、本発明の抗体は、特殊な生殖細胞系列のＨ鎖免疫グロブリン遺伝子、もしくは複数の特殊な生殖細胞系列のＨ鎖免疫グロブリン遺伝子の組合せに由来するＶＨ領域；及び／又は特殊な生殖細胞系列のＬ鎖免疫グロブリン遺伝子、もしくは複数の特殊な生殖細胞系列のＬ鎖免疫グロブリン遺伝子の組合せに由来するＶＬ領域を含む。このような組合せは、例えば、Ｂ細胞内における体細胞組換えによりｉｎ ｖｉｖｏにおいて得ることができる。
例えば、一実施態様において、本発明は、単離された抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体又はその抗原結合断片であって、（ａ）ヒトＤ３〜９遺伝子、同Ｄ３〜１０遺伝子、又は同Ｄ３＿１０＿Ｒ３遺伝子、及び同ＪＨ３遺伝子、同ＪＨ４遺伝子、又は同ＪＨ６遺伝子により組み換えられたヒトＶＨ３＿２１遺伝子、同ＶＨ３＿２０遺伝子、同ＶＨ４＿５９遺伝子、又は同ＶＨ５＿５１遺伝子に由来するＶＨ領域を含み、（ｂ）ヒトＪＫ１遺伝子、同ＪＫ２遺伝子、又は同ＪＫ３遺伝子により組み換えられたヒトＶＫＩ＿Ｌ１５遺伝子、又は同ＶＫＩＩＩ＿Ａ２７遺伝子、又は同ＶＫＩＩＩ＿Ｌ６遺伝子に由来するＶＬ領域を含み、また（ｃ）ｈＮＫＧ２Ｄに結合する単離された抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体又はその抗原結合断片を提供する。]
[0039] 別の実施態様において、本発明は、単離された抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体又はその抗原結合断片であって、ヒトＶＨ３＿２１遺伝子、同Ｄ３〜９遺伝子、及び同ＪＨ４遺伝子の組換えにより得られるＶＨ領域と、ヒトＶＫＩ＿Ｌ１５遺伝子及び同ＪＫ２遺伝子の組換えにより得られるＶＬ領域とを含む、単離された抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体又はその抗原結合断片を提供する。
別の実施態様において、本発明は、単離された抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体又はその抗原結合断片であって、ヒトＶＨ３＿２０遺伝子、同Ｄ３〜１０遺伝子、及び同ＪＨ６遺伝子の組換えにより得られるＶＨ領域と、ヒトＶＫＩＩＩ＿Ａ２７遺伝子及び同ＪＫ３遺伝子の組換えにより得られるＶＬ領域とを含む、単離された抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体又はその抗原結合断片を提供する。]
[0040] 別の実施態様において、本発明は、単離された抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体又はその抗原結合断片であって、ヒトＶＨ４＿５９遺伝子、同Ｄ遺伝子、及び同ＪＨ３遺伝子の組換えにより得られるＶＨ領域と、ヒトＶＫＩＩＩ＿Ａ２７遺伝子及び同ＪＫ１遺伝子の組換えにより得られるＶＬ領域とを含む、単離された抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体又はその抗原結合断片を提供する。
別の実施態様において、本発明は、単離された抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体又はその抗原結合断片であって、ヒトＶＨ５＿５１遺伝子、同Ｄ３＿１０＿Ｒ３遺伝子、及び同ＪＨ４遺伝子の組換えにより得られるＶＨ領域と、ヒトＶＫＩＩＩ＿Ｌ６遺伝子及び同ＪＫ１遺伝子の組換えにより得られるＶＬ領域とを含む、単離された抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体又はその抗原結合断片を提供する。]
[0041] 個別且つ特定の実施態様において、本発明は、上記で説明された抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体のＶＨ領域及び／又はＶＬ領域において、１つ、２つ、３つ、４つ以上のアミノ酸置換及び／又は体細胞超変異を導入することにより得られる単離された抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を提供する。
本明細書で用いられるヒト抗体が、特殊な生殖細胞系列配列「の」重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域、又は同配列「に由来する」同領域を含むか、又は同配列「の産物」である同領域を含むのは、該抗体の該可変領域が、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子を用いる系（以下で説明される）から得られる場合である。このような「系」は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを対象抗原で免疫化すること、又はファージ上において表面提示されるヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーを対象抗原によりスクリーニングすることを含む。ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列「の」ヒト抗体、又は同配列「に由来する」同抗体、又は同配列「の産物」である同抗体は、該ヒト抗体のアミノ酸配列を、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、該ヒト抗体の配列に配列内で最も近接する（すなわち、最大の％同一性）ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列を選択することにより、そのようなものとして同定することができる。特殊なヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列「の」ヒト抗体、又は同配列「に由来する」同抗体、又は同配列「の産物」である同抗体は、例えば、天然の体細胞突然変異又は（１カ所又は複数カ所の）部位特異的突然変異（置換の選択でありうる）の意図的な導入に起因して、該生殖細胞系列の配列と比較されるアミノ酸の違いを含有する可能性がある。]
[0042] しかしながら、ヒト抗体は、典型的には、組換え生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有し、通常、他の動物種の生殖細胞系列の免疫グロブリンアミノ酸配列（例えば、マウス生殖細胞系列の配列）と比較した場合にヒト抗体であると同定することができる。特定の場合において、ヒト抗体は、組換え生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と、少なくとも９５％、又はさらに少なくとも９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有する可能性がある。
特殊なヒト生殖細胞系列の配列に由来するヒト抗体は、典型的には、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と１０アミノ酸以下の相違を示す。特定の場合において、該ヒト抗体は、組換え生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と８つ以下、５つ以下又はさらに４つ、３つ、２つ、又は１つ以下のアミノ酸の相違を示す場合がある。]
[0043] さらに別の実施態様において、本発明の抗体は、本明細書で説明される好ましい抗体のアミノ酸配列に対して相同的なアミノ酸配列を含み、該抗体が、本発明の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体の所望の機能的特性を保持する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。例えば、本発明は、単離された抗体又はその抗原結合断片であって、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、（ａ）該ＶＨ領域が、配列番号１１、１３、４４、及び４６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含み、（ｂ）該ＶＬ領域が、配列番号１２、１４、４５、及び４７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含み、（ｃ）ｈＮＫＧ２Ｄに結合し、本明細書で説明される機能的特性のうちの少なくとも１つ、好ましくは、本明細書で説明される機能的特性のうちのいくつかを呈示する、単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
他の実施態様において、ＶＨ及び／又はＶＬのアミノ酸配列は、上記の配列と８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の可能性がある。上記の配列のＶＨ領域及びＶＬ領域と高度の（すなわち、８０％以上の）同一性を有するＶＨ領域及びＶＬ領域を有する抗体は、配列番号１１〜１４又は同４４〜４７をコードする核酸分子に対する突然変異誘発（例えば、部位特異的な突然変異誘発又はＰＣＲを介する突然変異誘発）に続き、本明細書で説明される機能アッセイを用いて機能（例えば、ｈＮＫＧ２Ｄに対する結合親和性、ｈＮＫＧ２Ｄ−リガンド間の遮断、ｈＮＫＧ２Ｄの発現低下、又はＮＫ細胞もしくはＴ細胞のＮＫＧ２Ｄ媒介性の活性化の低減）の保持についてコードされた改変抗体を調べることにより得ることができる。]
[0044] ２つの配列間における百分率による同一性とは、該配列により共有される同一位置数の関数（すなわち、％同一性＝同一位置数／総位置数×１００）であり、該２つの配列を最適な形で整列するのに導入する必要があるギャップ数、及び各ギャップ長を考慮に入れている。２つの配列間における配列の比較及び百分率による同一性の決定は、配列解析ソフトウェア中の数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む各種の置換、欠失、及び他の修飾に割り当てられる類似性の尺度を用いて類似の配列を整合させる。
２つのアミノ酸配列間における百分率による同一性は、例えば、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックス、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、又は４のギャップの重み及び１、２、３、４、５、又は６の全長の重みを用いるＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）内に組み込まれた、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)）によるアルゴリズムを用いて決定することができる。]
[0045] デフォルト又は推奨のパラメータを適用するＦＡＳＴＡプログラムを用いて、ポリペプチド配列も比較することができる。ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１、ＦＡＳＴＡ中のプログラム（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）では、問い合わせ配列と検索配列との間の最良のオーバーラップ領域に対するアライメント及び百分率による配列同一性が提供される（Pearson, MethodsEnzymol. 1990;183:63-98; Pearson, Methods Mol. Biol. 2000;132:185-219）。
２つのアミノ酸配列間における百分率による同一性はまた、ＰＡＭ１２０の重み残基表、ギャップ長ペナルティー１２、及びギャップペナルティー４を用いるＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）内に組み込まれた、Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Comput. Appl. Biosci., 1988;11-17）によるアルゴリズムを用いて決定することもできる。]
[0046] ある配列をデータベース内に包含される他の配列と比較する別のアルゴリズムは、コンピュータプログラムであるＢＬＡＳＴ、とりわけ、デフォルトパラメータを用いるｂｌａｓｔｐである。例えば、Altschul等、J. Mol. Biol. 1990;215:403-410; Altschul等、Nucleic AcidsRes. 1997;25:3389-402 (1997)（各々が出典明示によりここに援用される）を参照されたい。該プログラムでは、本発明のタンパク質配列を「問い合わせ配列」として用いて公開されたデータベースに対する検索を実施し、例えば、関連の配列を同定することができる。このような検索は、Altschul等、1990年（前掲）によるＸＢＬＡＳＴプログラムを用いて実施することができる。ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３によりＢＬＡＳＴタンパク質検索を実施して、本発明の抗体分子と相同的なアミノ酸配列を得ることができる。比較を目的としてギャップアライメントを得るためには、Altschul等、1997年（前掲）において説明されるようにして、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを用いることができる。ＢＬＡＳＴプログラム及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメータを用いることができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。
特定の実施態様において、本発明の抗体は、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列を含むＶＨ領域ならびにＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列を含むＶＬ領域であって、これらのＣＤＲ配列の１つ又は複数が、本明細書で説明される好ましい抗体である１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２に基づく指定のアミノ酸配列を含み、１つ又は複数のＣＤＲが、場合によっては、１カ所又は複数カ所の保存的アミノ酸修飾を含有し、該抗体が、本発明の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体の所望の機能的特性を保持する、ＶＨ領域及びＶＨ領域を含む。したがって、本発明は、単離された抗体又はその抗原結合断片であって、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域とを含み、（ａ）該ＶＨ領域のＣＤＲ３配列が、配列番号１７、２３、５０、及び５６のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、（ｂ）該ＶＬ領域のＣＤＲ３配列が、配列番号２０、２６、５３、及び５９のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、（ｃ）１つ又は複数のＣＤＲが、場合によって、１カ所又は複数カ所の保存的アミノ酸置換を含有し、（ｄ）ｈＮＫＧ２Ｄに結合し、本発明で説明される機能的特性のうちの少なくとも１つ、より好ましくは、本明細書で説明される機能的特性のうちのいくつかを呈示する、単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。]
[0047] さらなる実施態様では、ＶＨ領域のＣＤＲ２配列が配列番号１６、２２、４９、及び５５のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＶＬ領域のＣＤＲ２配列が配列番号１９、２５、５２、及び５８のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、１つ又は複数のＣＤＲが、場合によって、１カ所又は複数カ所の保存的アミノ酸修飾を含有する。
さらなる実施態様では、ＶＨ領域のＣＤＲ１配列が配列番号１５、２１、４８、及び５４のアミノ酸配列ならびにこれらの保存的修飾からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＶＬ領域のＣＤＲ１配列が配列番号１８、２４、５１、及び５７のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、１つ又は複数のＣＤＲが、場合によっては、１カ所又は複数カ所の保存的アミノ酸修飾を含有する。]
[0048] 本明細書で用いられる「保存的アミノ酸修飾」という用語は、該アミノ酸配列を含有する抗体の結合特性に著明な影響を及ぼすか又はこれを顕著に改変することのないアミノ酸修飾を指す。このような保存的修飾は、アミノ酸の置換、付加、及び欠失を含む。修飾は、例えば、部位特異的な突然変異誘発及びＰＣＲを介する突然変異誘発など、当技術分野で公知の標準的な技法により、本発明の抗体内に導入することができる。親抗体と比較されるアミノ酸修飾を含む抗体配列は、典型的には、該親抗体内における対応するアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であり、好ましくは少なくとも９５％、９８％、又は９９％同一であり、かつ／又は該親抗体配列と比較して最大で１０カ所、好ましくは最大で５カ所、４カ所、３カ所、２カ所のアミノ酸修飾を含む。
「保存的」アミノ酸置換とは、典型的には、アミノ酸残基が、類似の物理化学的特性を伴う側鎖を有するアミノ酸残基により置換されるアミノ酸置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で規定されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分枝状側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。]
[0049] こうして、本発明の抗体のＣＤＲ領域内における１つ又は複数のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーに由来する他のアミノ酸残基により置換することができ、本明細書で説明される機能アッセイを用いて、改変抗体を、機能（すなわち、上記の（ｃ）、（ｄ）、及び（ｅ）に記載の機能）の保持について調べることができる。]
[0050] 抗原結合断片
本発明の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体は、完全長抗体又はそれらの抗原結合断片として調製することができる。抗原結合断片の例は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ａｂ）３断片、Ｆｖ（典型的には、抗体の１本のアームのＶＬドメイン及びＶＨドメイン）断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ；例えば、Bird等、Science 1988;242:423-426;及びHuston等、PNAS 1988;85:5879-5883を参照されたい）断片、ｄｓＦｖ断片、Ｆｄ（典型的には、ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメイン）断片、及びｄＡｂ（典型的には、ＶＨドメイン）断片；ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ＶｈＨドメイン、及びＶ−ＮＡＲドメイン；１本のＶＨ鎖及び１本のＶＬ鎖を含む１価分子；ミニボディー、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー、及びカッパボディー（例えば、Ill等、Protein Eng 1997;10:949-57を参照されたい）；ラクダＩｇＧ；ＩｇＮＡＲのほか；単離ＣＤＲ又は抗原結合残基もしくは抗原結合ポリペプチドが、機能的な抗体断片を形成するように共に会合するか又は連結されうる、１又は複数の単離ＣＤＲ又は機能的パラトープを含む。例えば、Holliger及びHudson, Nat Biotechnol 2005;23:1126-1136;国際公開第２００５０４０２１９号；ならびに米国特許出願公開第２００５０２３８６４６号及び同第２００２０１６１２０１号では、各種の抗体断片が説明又は総説されている。
抗体断片は、従来の組換え法又はタンパク質の操作法を用いて得ることができ、該断片は、完全抗体と同じ方法で、抗原結合機能又は他の機能についてスクリーニングすることができる。]
[0051] 抗体断片の作製には、各種の技法が開発されている。従来、これらの断片は、完全長抗体に対するタンパク質分解的な消化により誘導された（例えば、Morimoto等、Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24:107-117 (1992);及びBrennan等、Science, 229:81 (1985)を参照されたい）。しかし、今日、これらの断片は、組換え宿主細胞により直接作製することができる。代替的に、Ｆａｂ’−ＳＨ断片を大腸菌から直接回収し、化学的に連結して、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成することができる（Carter等、Bio/Technology, 10:163-167 (1992)）。別の手法によれば、組換え宿主細胞培養物から直接にＦ（ａｂ’）２断片を単離することもできる。他の実施態様において、最適の抗体は、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。国際公開第１９９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照されたい。抗体断片はまた、例えば、米国特許第５６４１８７０号で説明される「直鎖抗体」でもありうる。このような直鎖抗体断片は、単特異性又は二重特異性でありうる。]
[0052] 多重特異性分子
別の態様において、本発明は、本発明の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体又はその抗原結合断片を含む多重特異性分子を対象とする。このような多重特異性分子は、ｈＮＫＧ２Ｄに対する少なくとも１つの第１の結合特異性及び第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性を含む二重特異性分子を含む。
二重特異性分子の１つの種類は、二重特異性抗体である。二重特異性抗体とは、少なくとも２種の異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。二重特異性抗体を作製する方法は当技術分野において公知であり、在来の全長二重特異性抗体の作製は、通常、２本の鎖が異なる特異性を有する２本の免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づく（Millstein等、Nature, 305: 537-539 (1983)）。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）又は本明細書で説明される他の任意の抗原結合断片として調製することができる。]
[0053] 本発明による二重特異性抗体では、少なくとも１つの結合エピトープが、ｈＮＫＧ２Ｄタンパク質上にある。炎症促進性のｈＮＫＧ２Ｄ発現細胞に対する細胞防御機構に焦点を絞るよう、抗ｈＮＫＧ２Ｄ結合部分を、炎症促進性白血球、例えば、Ｔ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、又はＣＤ８）上における分子に結合する第２の部分と組み合わせることができる。この実施態様では、二重特異性抗体を用いて、例えば、ＮＫＧ２Ｄを発現する炎症促進細胞に対して細胞障害性剤を方向づけることもでき、ＡＤＣＣ／ＣＤＣによる同細胞に対する攻撃を方向づけることもできる。細胞障害性剤ならば、例えば、サポリン、抗インターフェロン−アルファ剤、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサート、又は放射性同位体でありうる。
別の実施態様において、第２の部分は、癌、ウイルス感染など、正常時にはエフェクターリンパ球により調節される疾患状態と関連する細胞により提示又は発現される、細胞関連標的に結合する。こうして、例えば、典型的な標的は、ＭＩＣ分子（例えば、ＭＩＣ−Ａ又はＭＩＣ−Ｂ）もしくはＵＬＢＰ（例えば、Ｒａｅ−１、Ｈ−６０、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＨＣＭＶ ＵＬ１８、又はＲａｅ−１β）などの細胞ストレス関連分子又はウイルスヘマグルチニンなどの病原体関連分子でありうる。]
[0054] 他の多重特異性分子は、１又は複数の種類の他の非抗体タンパク質に対するｈＮＫＧ２Ｄ結合抗体の融合から作製される分子を含む。このような多重特異性タンパク質、及びこれらを構築する方法については、当技術分野で説明されている。例えば、Dreier等、(Bioconjug. Chem. 9(4): 482-489 (1998)); 米国特許第６０４６３１０号；米国特許出願公開第２００３０１０３９８４号；欧州特許出願公開第１４１３３１６号；米国特許出願公開第２００４００３８３３９号；von Strandmann等、Blood (2006;107:1955-1962)；及び国際公開第２００４０５６８７３号を参照されたい。本発明によるならば、非抗体タンパク質は、例えば、前節で説明した「第２の部分」に対する抗原のうちのいずれかに適するリガンド、例えば、Ｔ細胞もしくはＦｃ受容体、又はＭＩＣ−Ａ、ＭＩＣ−Ｂ、ＵＬＢＰなどの細胞ストレス分子、又はウイルスヘマグルチニンなどの病原体関連分子に対するリガンドでありうる。
２価以上の多重特異性分子もまた検討される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる（Tutt等、J. Immunol, 147: 60 (1991)）。]
[0055] 本発明の多重特異性抗体は、当技術分野において公知の方法を用いて、構成要素の結合特異性分子をコンジュゲートすることにより調製することができる。例えば、多重特異性分子の各結合特異性分子を個別に発生させ、次いで、互いに対してコンジュゲートさせることができる。結合特異性分子がタンパク質又はペプチドである場合、各種の連結剤又は架橋剤を、共有結合によるコンジュゲーションに用いることができる。架橋剤の例は、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、及びスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を含む（例えば、Karpovsky等(1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA等(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照されたい）。他の方法は、Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan等(1985) Science 229:81-83), 及びGlennie等(1987) J. Immunol. 139: 2367-2375)において説明される方法を含む。好ましいコンジュゲーション形成剤は、Pierce Chemical社（イリノイ州、ロックフォード）製のＳＡＴＡ及びスルホＳＭＣＣである。
結合特異性分子が抗体である場合、それらは、２本の重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合によりコンジュゲートすることができる。特定の好ましい実施態様において、該ヒンジ領域は、コンジュゲーション前に、奇数のスルフヒドリル残基、好ましくは１つのスルフヒドリル残基を含有するように修飾される。]
[0056] 代替的には、両方の結合特異性分子ともに、同じベクター内でコードし、同じ宿主細胞内で発現させて組み立てることもできる。この方法は、該二重特異性分子が、ｍＡｂ×ｍＡｂ融合タンパク質、ｍＡｂ×Ｆａｂ融合タンパク質、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２融合タンパク質、又はリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に特に有用である。本発明の二重特異性分子は、１本の単鎖抗体及び結合決定基を含む単鎖分子でもありえ、２つの結合決定基を含む単鎖二重特異性分子でもありうる。二重特異性分子は、少なくとも２つの単鎖分子を含みうる。二重特異性分子を調製する方法は、例えば、米国特許第５２６０２０３号；米国特許第５４５５０３０号；米国特許第４８８１１７５号；米国特許第５１３２４０５号；米国特許第５０９１５１３号；米国特許第５４７６７８６号；米国特許第５０１３６５３号；米国特許第５２５８４９８号；米国特許第５４８２８５８号；米国特許出願公開第２００３００７８３８５号；Kontermann等、(2005) Acta Pharmacological Sinica 26(1):1-9; Kostelny等、(1992) J. Immunol. 148(5):1547-1553; Hollinger等、(1993) PNAS (USA) 90:6444-6448;及びGruber等(1994) J. Immunol. 152: 5368に説明又は総説されている。]
[0057] 抗体変異体
本明細書で開示される１又は複数の種類のＶＨ配列及び／又はＶＬ配列を有する抗体を、該親抗体から特性が改変される可能性がある修飾抗体又は抗体「変異体」を操作するための出発材料として用いて、本発明の抗体をさらに調製することもできる。一方又は両方の可変領域（すなわち、ＶＨ及び／又はＶＬ）内、例えば、１又は複数のＣＤＲ領域内及び／又は１又は複数のフレームワーク領域内における１つ又は複数の残基を修飾することにより、抗体を操作することができる。またないし或いは、（１つ又は複数の）定常領域内における残基を修飾することによって抗体を操作して、例えば、該抗体の（１つ又は複数の）エフェクター機能を改変することができる。さらに、抗体の抗原結合部分からは、抗原結合断片、抗体誘導体、免疫コンジュゲート、及び多重特異性分子など、他の構築物も調製することができる。
標準的な生物学的技法を用いて、改変された抗体配列を調製し、発現させることができる。]
[0058] 抗体の変異体又は誘導体は、典型的には、「親」抗体と比較して改変された少なくとも１つの特性を有するが、該抗体の変異体又は誘導体は、本明細書で説明される抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体の機能的特性の１つ、一部、又は大半を保持することができ、これらの機能的特性は、（ａ）ＮＫＧ２Ｄを発現するＮＫ細胞又はＴ細胞のＮＫＧ２Ｄ媒介性の活性を、場合によっては、該細胞に対する結合のＥＣ５０よりも低い、リガンドに誘導される細胞障害性のＥＣ５０により阻止すること；（ｂ）ＮＫＧ２Ｄに対する結合において少なくとも１種のＮＫＧ２Ｄリガンドと、好ましくは、少なくともＭＩＣＡ及びＵＬＢＰ３と競合すること；（ｃ）ＮＫＧ２Ｄを発現するＮＫ細胞又はＴ細胞の表面上におけるＮＫＧ２Ｄ量を、好ましくは少なくとも７５％低減すること；（ｄ）好ましくは、実質的に同様の効果又は親和性で、カニクイザル及び／又はアカゲザルのＮＫＧ２Ｄに結合すること；（ｅ）ＮＫＧ２Ｄの複数の形態又は立体構造に結合すること；（ｆ）１ｎＭ以下、好ましくは０．１ｎＭ以下のＫｄでＮＫＧ２Ｄに結合すること；（ｇ）１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２のうちのうちの１つ又は複数と競合すること；（ｈ）ｈＮＫＧ２Ｄに対する結合において、ＯＮ７２、ＢＡＴ２２１、５Ｃ６、１Ｄ１１、ＥＣＭ２１７、及び１４９８１０のうちのいずれとよりも、１６Ｆ１６、ＭＳ、又は２１Ｆ２とより強く競合すること；（ｉ）細胞表面のｈＮＫＧ２Ｄに対する１６Ｆ１６、ＭＳ、又は２１Ｆ２の結合を、９０％を超えて遮断すること；（ｊ）ＯＮ７２、ＢＡＴ２２１、５Ｃ６、１Ｄ１１、ＥＣＭ２１７、及び１４９８１０のうちのいずれかよりもアゴニスト活性が低いことを含むがこれらに限定されない。上記で説明した機能的特徴、及び／又は実施例で説明される機能的特徴の任意の組合せを、本発明の抗体により呈示することが可能である。
抗体の変異体及び誘導体の機能的特性は、当技術分野において用いられ、かつ／又は本明細書で説明される標準的なアッセイを用いて評価することができる。例えば、実施例で記載されるアッセイなど、標準的な結合アッセイ（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ）を用いて、ｈＮＫＧ２Ｄに対する抗体の結合能を決定することができる。]
[0059] 可変領域の修飾
可変領域に対して実施できる操作の１つの種類は、ＣＤＲ移植である。抗体は、主として、６本の重鎖及び軽鎖による相補性決定領域（ＣＤＲ）内に位置するアミノ酸残基を介して、標的抗原と接触する。この理由で、ＣＤＲ内におけるアミノ酸配列は、ＣＤＲ以外の配列よりも個々の抗体間で多様である。ＣＤＲ配列が大半の抗体−抗原間相互作用の一因をなすため、異なる特性を有する異なる抗体に由来するフレームワーク配列上に移植された、特異的な天然抗体に由来するＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特異的な天然抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である（例えば、Riechmann, L.等(1998) Nature 332:323-327; Jones, P.等(1986) Nature 321:522-525; Queen, C. 等(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033；Winter米国特許第５２２５５３９号；ならびにQueen等による米国特許第５５３０１０１号、同第５５８５０８９号、同第５６９３７６２号、及び同第６１８０３７０号を参照されたい）。したがって、本発明の別の実施態様は、単離抗体又はその抗原結合部分であって、それぞれ、配列番号１５、２１、４８、及び５４；配列番号１６、２２、４９、及び５５；ならびに配列番号１７、２３、５０、及び５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列を含むＶＨ領域と、それぞれ、配列番号１８、２４、５１、及び５７；配列番号１９、２５、５２、及び５８；ならびに配列番号２０、２６、５３、及び５９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列を含むＶＬ領域とを含む単離された抗体又はその抗原結合部分に関係する。こうして、このような抗体は、抗体１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２のＶＨ ＣＤＲ配列及びＶＬ ＣＤＲ配列を含有するが、これらの抗体とは異なるフレームワーク配列も含有する可能性がある。
本発明はまた、ｈＮＫＧ２Ｄに結合するマウス抗ｈＮＫＧ２Ｄモノクローナル抗体もしくはその抗原結合部位のキメラ又はヒト化バージョン、及びこのような抗体の使用（例えば、哺乳動物宿主におけるｈＮＫＧ２Ｄ媒介性の生理学的過程の調節における）も提供する。一実施態様において、該マウス抗体は、ＯＮ７２、ＢＡＴ２２１、５Ｃ６、１Ｄ１１、１４９８１０、及びＥＣＭ２１７のうちの１つである。別の実施態様において、該マウス抗体は、ＯＮ７２、ＢＡＴ２２１、５Ｃ６、１Ｄ１１、１４９８１０、及びＥＣＭ２１７のうちの１つではない。こうして、このような抗体は、ＯＮ７２、ＢＡＴ２２１、５Ｃ６、１Ｄ１１、１４９８１０、又はＥＣＭ２１７のＶＨ ＣＤＲ配列及びＶＬ ＣＤＲ配列、又はＯＮ７２、ＢＡＴ２２１、５Ｃ６、１Ｄ１１、１４９８１０、ＥＣＭ２１７とは異なるマウスモノクローナル抗体、或いはこれらの抗体とは異なるフレームワーク配列を含有する。一実施態様において、ヒト化抗体は、ＯＮ７２のヒト化バージョンであり、例えば、それぞれ配列番号７０及び７１の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を含む。]
[0060] このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列の抗体遺伝子配列を含む、公開されているＤＮＡデータベース又は公表された参考文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖可変領域遺伝子及び同軽鎖可変領域遺伝子のための生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、「ｄＢａｓｅ」と称するヒト生殖細胞系列の配列データベース（ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅにおいてインターネット上でアクセス可能）のほか、各々の内容が出典明示によりここに援用される、Kabat, E. A.,等(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., 等(1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; 及びCox, J. P. L. 等(1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836において見出すことができる。
本発明の抗体において用いるのに好ましいフレームワーク配列は、本発明の選択された抗体により用いられるフレームワーク配列に構造的に類似する配列、例えば、１６Ｆ１６抗体、１６Ｆ３１抗体、ＭＳ抗体、及び２１Ｆ２抗体により用いられる、ＶＨ３＿２１、Ｄ３〜９、ＪＨ４、ＶＫＩ＿Ｌ１５、及びＪＫ２、又はＶＨ３＿２０、Ｄ３〜１０、ＪＨ６、ＶＫＩＩＩ＿Ａ２７、及びＪＫ３、又はＶＨ４＿５９、ＪＨ３、ＶＫＩＩＩ＿Ａ２７、及びＪＫ１、又はＶＨ５＿５１、Ｄ３＿１０＿Ｒ３、ＪＨ４、ＶＫＩＩＩ＿Ｌ６、及びＪＫ１のフレームワーク配列に類似する配列である。１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２のＶＨＣＤＲ１配列、同ＣＤＲ２配列、及び同ＣＤＲ３配列と、１６Ｆ６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２のＶＬ ＣＤＲ１配列、同ＣＤＲ２配列、及び同ＣＤＲ３配列とを、該フレームワーク配列が由来する生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子内で見出される配列と同じ配列を有するフレームワーク領域上に移植することもでき、又は該ＣＤＲ配列を、該生殖細胞系列の配列と比較して１カ所又は複数カ所の突然変異を含有するフレームワーク領域上に移植することもできる。例えば、特定の場合には、該フレームワーク領域内の残基を突然変異させて、該抗体の抗原結合能を維持又は増強することが有益であることが分かっている（例えば、Queen等による米国特許第５５３０１０１号、同第５５８５０８９号、同第５６９３７６２号、及び同第６１８０３７０号を参照されたい）。]
[0061] 本発明の別の態様では、本発明の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体、例えば、１６Ｆ１６及び１６Ｆ３１の構造的特徴を用いて、ｈＮＫＧ２Ｄに対する結合など、本発明の抗体の少なくとも１つの機能的特性を保持した構造的関連性を有する抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体が作成される。例えば、１６Ｆ１６もしくは１６Ｆ３１の１又は複数のＣＤＲ領域、又はこれらの変異体を、組換え法により公知のフレームワーク領域及び／又は他のＣＤＲと組み合わせて、組換え法により操作された本発明の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体をさらに作成することができる。操作法のための出発材料は、本明細書で提供される１又は複数の種類のＶＨ配列及び／又はＶＬ配列、或いはこれらの１つ又は複数のＣＤＲ領域である。操作された抗体を作成するには、本明細書で提供される１又は複数の種類のＶＨ配列及び／又はＶＬ配列、或いはこれらの１つ又は複数のＣＤＲ領域を実際に調製する（すなわち、タンパク質として発現させる）必要はない。そうではなく、（１又は複数の種類の）配列内に含有される情報を出発材料として用いて、（１又は複数の種類の）元の配列に由来する（１又は複数の種類の）「第２世代の」配列を作成し、次いで、（１又は複数の種類の）該「第２世代の」配列を、タンパク質として調製し、発現させる。
したがって、別の実施態様において、本発明は、抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体を調製する方法であって、（ａ）（ｉ）配列番号１５、２１、４８、及び５４から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号１６、２２、４９、及び５５から選択されるＣＤＲ２配列、及び／又は配列番号１７、２３、５０、及び５６から選択されるＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域の抗体配列と、（ｉｉ）配列番号１８、２４、５１、及び５７から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号１９、２５、５２、及び５９から選択されるＣＤＲ２配列、及び／又は配列番号２０、２６、５３、及び５９から選択されるＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域の抗体配列とを供給するステップと、（ｂ）該第１の抗体配列及び／又は該第２の抗体配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改変して、少なくとも１種の改変された抗体配列を作成するステップと、（ｃ）該改変された抗体配列を調製するステップと、（ｄ）該改変された抗体配列をタンパク質として発現させるステップとを含む方法を提供する。]
[0062] 可変領域修飾の別の種類は、ＶＨ及び／又はＶＬのＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及び／又はＣＤＲ３領域内におけるアミノ酸残基を突然変異させ、これにより、対象抗体の１つ又は複数の結合特性（例えば、親和性）を改良する修飾である。部位特異的な突然変異誘発又はＰＣＲを介する突然変異誘発を実施して（１カ所又は複数カ所の）突然変異を導入し、抗体結合に対する効果又は他の対象となる機能的特性を、本明細書で説明され、実施例において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏのアッセイにおいて評価することができる。保存的修飾（上記で論じた）を導入することが好ましい。該突然変異は、アミノ酸置換の場合もあり、同付加の場合もあり、同欠失の場合もある。さらに、単一のＣＤＲ領域内では、典型的には８つ以下、より典型的には５つ以下の残基が改変される。
したがって、別の実施態様において、本発明は、単離された抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体であって、（ａ）配列番号１５、２１、４８、及び５４から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号１５、２１、４８、及び５４から選択されるアミノ酸配列と比較して１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、６カ所、７カ所、もしくは８カ所のアミノ酸の置換、欠失、もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１領域と、（ｂ）配列番号１６、２２、４９、及び５５から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号１６、２２、４９、及び５５から選択されるアミノ酸配列と比較して１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、６カ所、７カ所、もしくは８カ所のアミノ酸の置換、欠失、もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２領域と、（ｃ）配列番号１７、２３、５０、及び５６から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号１７、２３、５０、及び５６から選択されるアミノ酸配列と比較して１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、６カ所、７カ所、もしくは８カ所のアミノ酸の置換、欠失、もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３領域とを含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号１８、２４、５１、及び５７から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号１８、２４、５１、及び５７から選択されるアミノ酸配列と比較して１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、６カ所、７カ所、もしくは８カ所のアミノ酸の置換、欠失、もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１領域と、（ｅ）配列番号１９、２５、５２、及び５８からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号１９、２５、５２、及び５８からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、６カ所、７カ所、もしくは８カ所のアミノ酸の置換、欠失、もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２領域と、（ｆ）配列番号２０、２６、５３、及び５９からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号２０、２６、５３、及び５９からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、６カ所、７カ所、もしくは８カ所のアミノ酸の置換、欠失、もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３領域とを含む単離された抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体を提供する。]
[0063] 本発明の操作された抗体は、例えば、ＶＨ及び／又はＶＬ内のフレームワーク残基に対して該抗体の特性を改良する修飾が行われた抗体を含む。このようなフレームワーク修飾は、典型的には、該抗体の免疫原性を低下させるために行われる。例えば、１つの手法では、１つ又は複数のフレームワーク残基を、対応する生殖細胞系列の配列へと「復帰突然変異」させる。具体的には、体細胞突然変異を受けた抗体は、該抗体が由来する生殖細胞系列の配列とは異なるフレームワーク残基を含有する可能性がある。このような残基は、該抗体フレームワーク配列を、該抗体が由来する生殖細胞系列の配列と比較することによって同定することができる。
例えば、１６Ｆ１６の場合、ＶＨのアミノ酸残基Ｒ１１１（Ｋａｂａｔ残基１０３；ＦＲ４内）がアルギニンであるのに対し、対応する生殖細胞系列の配列中におけるこの残基はトリプトファンである（図５Ａを参照されたい）。該フレームワーク領域の配列を、それらの生殖細胞系列の構成へと復帰させるために、例えば、部位特異的な突然変異誘発又はＰＣＲを介する突然変異誘発により、体細胞突然変異の一部又は全部を、生殖細胞系列の配列へと「復帰突然変異」させることができる（例えば、１６Ｆ１６のＶＨの残基１１１を、トレオニンからアラニンへと「復帰突然変異」させることができる）。別の例としては、１６Ｆ３１の場合、ＶＨ領域のアミノ酸残基Ｙ９５（ＦＲ３内）がチロシンであるのに対し、対応する生殖細胞系列の配列中におけるこの残基はヒスチジンである（図５Ｃを参照されたい）。該フレームワーク領域の配列を、それらの生殖細胞系列の構成へと復帰させるために、体細胞突然変異をチロシンからヒスチジンへと「復帰突然変異」させることができる。別の例として、ＭＳの場合、ＶＨ領域のＫａｂａｔ残基３、６、及び７が、それぞれ、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン酸（Ｄ）、及びＤであるのに対し、対応する生殖細胞系列の配列中におけるこれらの残基は、それぞれ、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、及びＧである（図５Ｅを参照されたい）。２１Ｆ２の場合、Ｋａｂａｔ残基１３、２４、７６、及び９３が、それぞれ、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、Ｎ、及びＧであるのに対し、対応する生殖細胞系列の配列中におけるこれらの残基は、それぞれ、リシン（Ｋ）、Ｇ、セリン（Ｓ）、及びアラニン（Ａ）である。該フレームワーク領域の配列を、それらの生殖細胞系列の構成へと復帰させるために、該体細胞突然変異を同様に「復帰突然変異」させることができる。このような「復帰突然変異」した抗体も、本発明に包含される。] 図５Ａ
[0064] 別の種類のフレームワーク修飾は、該フレームワーク領域内、又はさらに１又は複数のＣＤＲ領域内における１つ又は複数の残基を突然変異させてＴ細胞エピトープを除去し、これにより、該抗体の潜在的な免疫原性を低下させることを伴う。この手法は「脱免疫化」とも称し、Ｃａｒｒらによる米国特許出願公開第２００３０１５３０４３号においてさらに詳細に説明されている。]
[0065] Ｆｃ修飾
フレームワーク領域又はＣＤＲ領域内において行われた修飾に加えて、又はこれらの代替として、Ｆｃ領域内における修飾を含むように、典型的には、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、タンパク質の安定性、及び／又は抗原依存性細胞障害性もしくはその欠如などの、本発明の抗体の１つ又は複数の機能的特性を改変するように、該抗体を操作する場合がある。その上、本発明の抗体は、化学修飾（例えば、１つ又は複数の化学的部分を抗体に付着させることができる）する場合もあり、そのグリコシル化を改変し、さらには該抗体の１つ又は複数の機能的特性を改変するように修飾する場合もある。これらの実施態様のそれぞれについて後述でさらに詳細に説明する。Ｆｃ領域内における残基は、Ｋａｂａｔにより番号付けされている。
必要に応じて、公知の技法により、抗体のクラスを「スイッチ」することができる。このような技法は、例えば、直接的な組換え法（例えば、米国特許第４８１６３９７号を参照されたい）、及び細胞間融合法（例えば、米国特許第５９１６７７１号を参照されたい）の使用を含む。例えば、元はＩｇＭ分子として作製された抗体を、ＩｇＧ抗体へとクラススイッチすることができる。クラススイッチ法はまた、１つのＩｇＧサブクラスから別のサブクラスへ、例えば、ＩｇＧ１からＩｇＧ２へと転換させるのにも用いられる場合がある。こうして、各種の治療的使用に応じて、例えば、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、ＩｇＧ４抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＥ抗体、又はＩｇＭ抗体へのアイソタイプスイッチングにより、本発明の抗体のエフェクター機能を変化させることができる。定常領域に対応する例示的なｃＤＮＡ配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ及び他の公開のウェブサイトによりアクセス可能）により入手可能であり、出典明示により全体がここに援用されるその各々は：
ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号第Ｊ００２２８号
ヒトＩｇＧ２重鎖定常領域：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号第Ｊ００２３０号
ヒトＩｇＧ３重鎖定常領域：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号第Ｘ０４６４６号
ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号第Ｋ０１３１６号
ヒトカッパ軽鎖定常領域：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号第Ｊ００２４１号
である。]
[0066] 一実施態様では、ヒンジ領域内におけるシステイン残基数が改変される、例えば、増加又は減少するように、ＣＨ１のヒンジ領域を修飾する。この手法は、Bodmerらによる米国特許第５６７７４２５号においてさらに説明されている。例えば、軽鎖及び重鎖のアセンブリーを容易とするか、又は抗体の安定性を上昇もしくは低下させるように、ＣＨ１のヒンジ領域内におけるシステイン残基数を改変する。
別の実施態様では、抗体の生物学的半減期を短縮するように、該抗体のＦｃヒンジ領域を突然変異させる。より具体的に述べると、天然のＦｃヒンジドメインにおけるブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｙｌ）プロテインＡ（ＳｐＡ）結合と比べて該抗体のＳｐＡ結合が損なわれるように、Ｆｃヒンジ断片のＣＨ２ドメイン−ＣＨ３ドメイン間のインターフェース領域内に１カ所又は複数カ所のアミノ酸突然変異が導入される。この手法は、Ward等による米国特許第６１６５７４５号においてさらに説明されている。別の実施態様では、その生物学的半減期を延長するように抗体が修飾される。各種の手法が可能である。例えば、Wardによる米国特許第６２７７３７５号において説明される通り、以下の突然変異：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、及びＴ２５６Ｆのうちの１つ又は複数を導入することができる。代替的に、Presta等による米国特許第５８６９０４６号及び同第６１２１０２２号において説明される通り、生物学的半減期を延長するため、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから採取されたサルベージ受容体結合エピトープを含有するように、ＣＨ１領域又はＣＬ領域内において抗体を改変することができる。さらに他の実施態様では、抗体の（１つ又は複数の）エフェクター機能を改変するように、少なくとも１つのアミノ酸残基を、異なるアミノ酸残基により置換することにより、Ｆｃ領域を改変する。例えば、エフェクターリガンドに対する抗体の親和性は改変するが、親抗体の抗原結合能は保持するように、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０、及び３２２から選択される１つ又は複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基により置換することができる。それに対する親和性が改変されるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体、又は補体のＣ１成分でありうる。この手法は、いずれもがWinter等による米国特許第５６２４８２１号及び同第５６４８２６０号においてさらに詳細に説明されている。別の例では、抗体のＣ１ｑ結合を改変し、かつ／又は補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）を低下又は消失させるように、アミノ酸残基３２９、３３１、及び３２２から選択される１つ又は複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基により置換することができる。この手法は、Idusogie等による米国特許第６１９４５５１号においてさらに説明されている。別の例では、アミノ酸の位置２３１及び２３９内における１つ又は複数のアミノ酸残基を改変し、これにより、抗体の補体結合能を改変する。この手法は、Bodmer等による国際公開第９４／２９３５１号においてさらに説明されている。さらに別の例では、以下の位置：２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８、又は４３９における１つ又は複数のアミノ酸を修飾することにより、抗体が抗体依存性細胞障害性（ＡＤＣＣ）を媒介する能力を増大させ、かつ／又はＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を増大させるように、Ｆｃ領域を修飾する。この手法は、Prestaによる国際公開第００／４２０７２号においてさらに説明されている。さらに、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、及びＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位もマップされ、結合が改良された変異体も説明されている（Shields, R.L.等(2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604）。位置２５６、２９０、２９８、３３３、３３４、及び３３９における具体的な突然変異は、ＦｃＲＩＩＩに対する結合を改良することが示された。加えて、以下の組合せ突然変異：Ｔ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４Ａ、及びＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａも、ＦｃγＲＩＩＩに対する結合を改良することが示された。]
[0067] 抗体を安定化させる、例えば、２価抗体が２つの１価ＶＨ−ＶＬ断片へと分離する危険性を低下させるように、定常領域をさらに修飾する場合がある。例えば、ＩｇＧ４定常領域では、残基Ｓ２４１をプロリン（Ｐ）へと突然変異させて、ヒンジにおける完全なジスルフィド架橋形成を可能とする場合がある（例えば、Angal等、Mol Immunol. 1993;30:105-8を参照されたい）。]
[0068] グリコシル化の修飾
さらに別の実施態様では、抗体のグリコシル化を修飾する。例えば、非グリコシル化された抗体（すなわち、グリコシル化を欠く抗体）を作製することができる。例えば、抗原に対する抗体の親和性を増大させるように、グリコシル化を改変することができる。このような炭水化物の修飾は、例えば、抗体配列内における１つ又は複数のグリコシル化部位を改変することによって達成することができる。例えば、１つ又は複数の可変領域フレームワークのグリコシル化部位の除去を結果としてもたらす、１カ所又は複数カ所のアミノ酸置換を作製し、これにより、その部位におけるグリコシル化を除去することができる。このような非グリコシル化により、抗原に対する抗体の親和性を増大させることができる。このような手法は、Ｃｏらによる米国特許第５７１４３５０号及び同第６３５０８６１号においてさらに詳細に説明されている。またないし或いは、少量のフコース残基を有する低フコシル化抗体又はＧｌｃＮａｃの二分構造を増大させる抗体など、グリコシル化の種類が改変された抗体も作製することができる。このようなグリコシル化パターンの改変は、抗体のＡＤＣＣ能を上昇させることが実証されている。炭水化物のこのような修飾は、例えば、グリコシル化「機構」が改変された宿主細胞内において抗体を発現させることにより達成することができる。このような改変を伴う細胞は当技術分野で開示されており、本発明の組換え抗体を発現させることにより、グリコシル化が改変された抗体を作製するための宿主細胞として用いることができる。例えば、Hanai等によるＥＰ１１７６１９５は、そこに発現する抗体が低フコシル化を呈するように、フコシルトランスフェラーゼをコードする、機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を伴う細胞株について説明している。Prestaによる国際公開第０３／０３５８３５号は、Ａｓｎ（２９７）を連結した炭水化物へとフコースを付着させる能力を低下させ、また、その結果として、その宿主細胞に発現する抗体の低フコシル化ももたらす変異体ＣＨＯ細胞株であるＬｅｃｌ３細胞についても説明している（Shields, R.L.等(2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照されたい）。Umana等による国際公開第９９／５４３４２号は、操作された細胞株に発現する抗体が、該抗体のＡＤＣＣ活性の上昇を結果としてもたらすＧｌｃＮａｃの二分構造の増大を呈するよう、糖タンパク質を修飾するグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ（ｌ，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作された細胞株について説明している（Umana等(1999) Nat. Biotech. 7:176 180も参照されたい）。]
[0069] 本発明の抗体を操作する方法に関する特定の実施態様では、抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体をコードする配列（例えば、１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２をコードする配列）の全部又は一部に沿って無作為に又は選択的に突然変異を導入することができ、本明細書で説明されるように、結合活性及び／又は他の機能的特性について、結果としてもたらされる修飾抗体をスクリーニングすることができる。突然変異法は、当技術分野において説明されている。例えば、Shortによる国際公開第０２／０９２７８０号は、飽和突然変異誘発、合成ライゲーションアセンブリー、又はこれらの組合せを用いる抗体突然変異を作成及びスクリーニングする方法について説明している。
代替的に、Lazarらによる国際公開第０３／０７４６７９号は、抗体の物理化学的特性を最適化する、コンピュータによるスクリーニング法を用いる方法についても説明している。]
[0070] 抗体誘導体
本発明の範囲内の抗体誘導体（又はイムノコンジュゲート）には、第二薬剤にコンジュゲートさせた又は共有結合させた抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体が含まれる。
例えば、一態様では、本発明は、細胞障害性剤にコンジュゲートさせた又は共有結合させた抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。本明細書中で用いる「細胞障害性剤」なる用語は、表面上にｈＮＫＧ２Ｄレセプターを有する細胞を殺傷することができる分子である。細胞障害作用又は細胞抑制作用を有する任意の種類の部分は、本発明の抗体にコンジュゲートさせて、本発明の細胞障害性コンジュゲートを形成させ、特定のＮＫレセプター発現細胞を阻害ないしは殺傷させることができ、治療用放射性同位体、毒性タンパク質、毒性小分子、例えば薬剤、毒素、免疫調節剤、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、オリゴヌクレオチド、酵素阻害剤、治療用放射性核種、血管形成阻害剤、化学療法剤、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、エピドフィロトキシン、タキサン、代謝拮抗物質、アルキル化剤、抗生物質、ＣＯＸ-２阻害剤、ＳＮ-３８、抗有糸分裂剤、抗血管形成及びアポトーシス剤、特にドキソルビシン、メトトレキセート、タキソール、ＣＰＴ-１１、カンプトテカン、ナイトロジェンマスタード、ゲムシタビン、スルホン酸アルキル、ニトロソ尿素、トリアゼン、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、白金配位錯体、緑膿菌外毒素、リシン、アブリン、５-フルオロウリジン、リボヌクレアーゼ(ＲＮアーゼ)、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌エンテロトキシン-Ａ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン(gelonin)、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素、及び緑膿菌内毒素及び他のものが含まれる(例として、Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Ed. (Mack Publishing Co. 1995)；Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics (McGraw Hill, 2001)；Pastan等 (1986) Cell 47:641；Goldenberg (1994) Cancer Journal for Clinicians 44:43；米国特許第6077499号；その全ての開示が出典明示によりここに援用される)。毒素は、動物、植物、真菌又は微生物由来のものであってよく、又は化学合成により新たに作製することもできると解されるであろう。]
[0071] 他の実施態様では、抗体は、放射性同位体、例えば治療用放射性核種又は検出目的のために適切な放射性核種によって誘導体化される。多くの適切な放射性同位体の任意のものを使用することができ、限定されるものではないが、インジウム-１１１、ルテチウム-１７１、ビスマス-２１２、ビスマス-２１３、アスタチン-２１１、銅-６２、銅-６４、銅-６７、イットリウム-９０、ヨード-１２５、ヨード-１３１、リン-３２、リン-３３、スカンジウム-４７、銀-１１１、ガリウム-６７、プラセオジミウム-１４２、サマリウム-１５３、テルビウム-１６１、ジスプロシウム-１６６、ホルミウム-１６６、レニウム-１８６、レニウム-１８８、レニウム-１８９、鉛-２１２、ラジウム-２２３、アクチニウム-２２５、鉄-５９、セレン-７５、ヒ素-７７、ストロンチウム-８９、モリブデン-９９、ロジウム-１０５、パラジウム-１０９、プラセオジミウム-１４３、プロメチウム-１４９、エルビウム-１６９、イリジウム-１９４、金-１９８、金-１９９、及び鉛-２１１が含まれる。一般的に、放射性核種は、オージェエミッターで好ましくは２０〜６０００ＫｅＶの範囲、好ましくは６０〜２００ＫｅＶの範囲、ベータエミッターで１００〜２５００ＫｅＶ、アルファエミッターで４０００〜６０００ＫｅＶの崩壊エネルギーを有する。また、アルファ粒子の生成を伴い、実質的に崩壊する放射性核種が好ましい。]
[0072] 本発明の抗体抱合体を使用することにより、所定の生物学的応答を修正することができ、この場合、薬剤成分は、古典的な化学的治療剤に限定されない。例えば、薬剤成分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質又はポリペプチドとすることができる。このようなタンパク質には、例えば、酵素的に活性な毒素、又はその活性な断片、例えば脳、リシンＡ、シュードモナス外毒素、又はジフテリア毒素、タンパク質、例えば腫瘍壊死因子、又はインターフェロンｙ、或いは生物学的応答モディファイヤー、例えば、リンホカイン、インターロイキン１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、又はその他の増殖因子が含まれる。
第ニ薬剤は、可能な多数の方法のうちのいずれかを使用して、抗体に対して直接的に又は間接的に連結することができる。例えば、１の薬剤を、Ｎ−サクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）等の架橋結合を用いることにより、ジスルフィド結合の形成を介して、或いは、抗体のＦｃ領域の糖鎖を介して、縮小した抗体成分のヒンジ領域に付着させることができる（例えば、Yu等、(1994) Int. J. Cancer 56: 244; Wong、 Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking (CRCPress 1991); Upeslacis等、"Modification of Antibodies by Chemical Methods、" in Monoclonal antibodies: principles and applications、 Birch等(編)、187-230頁(Wiley-Liss、 Inc. 1995); Price、 "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies、" in Monoclonal antibodies: Production、 engineering and clinical application、Ritter等(編)、60-84頁(Cambridge University Press 1995)、 Cattel等(1989) Chemistry today 7:51-58、 Delprino等(1993) J. Pharm. Sci 82:699-704; Arpicco等(1997) Bioconjugate Chernistry 8:3; Reisfeld等(1989) Antihody、 Immunicon. Radiopharrn. 2:217; the entire disclosures of each of which are herein incorporated by reference).。更には、例えば、Arnon等、"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy"、 in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy、 Reisfeld等(編)、243-56頁(Alan R. Liss、 Inc. 1985); Hellstrom等、"Antibodies For Drug Delivery"、 in Controlled Drug Delivery (第２版)、Robinson等(編)、623-53頁(Marcel Dekker、 Inc. 1987); Thorpe、 "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review"、 in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications、 Pinchera等(編)、475-506頁(1985); "Analysis、 Results、 And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy"、 in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy、 Baldwin et a/. (編)、303-16頁(Academic Press 1985)、 and Thorpe et a/.、 "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates"、 Immunol. Rev.、 62:119-58 (1982)等も参照されたい。
治療剤を抗体にコンジュゲートさせるための細胞毒、リンカー、及び方法の種類に関する更なる説明については、Saito, G.等、(2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A.等、(2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. and Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. and Springer, C.J. (2001)Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264も参照されたい。]
[0073] 他の実施の形態では、第二薬剤は検出可能な部分であり、それは量的ないしは質的に観察されるか又は測定されうる任意の分子であってもよい。本発明のコンジュゲート抗体に有用な検出可能なマーカーの例は、放射性同位体、蛍光色素、又は相補的に結合する対のいずれか、例えば抗原／抗体(ＮＫＧ２Ｄに対する抗体以外)、レクチン／糖質；アビジン／ビオチン；レセプター／リガンド；又は、分子的にインプリントされたポリマー／プリント分子システムのいずれか１のメンバーである。
またないしは或いは、第二薬剤は、例えば、抗体の循環半減期を増やすことを目的とするポリマーであってもよい。例示的なポリマー及び、該ポリマーをペプチドに接着させる方法は、例えば米国特許第４７６６１０６号；同第４１７９３３７号；同第４４９５２８５号；及び同第４６０９５４６号に例示される。更なる例示的なポリマーには、ポリオキシエチラート化ポリオール及びポリエチレングリコール(ＰＥＧ)部分が含まれる。本明細書で使用される「ポリエチレングリコール」という用語は、他のタンパク質の誘導体化に使用されているＰＥＧのあらゆる形態、例えば、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−又はアリールオキシ−ポリエチレングリコール、或いはポリエチレングリコール−マレイミドを包含する。例えば、完全長抗体ないし抗体断片は、およそ１０００〜およそ４００００、例えばおよそ２０００〜およそ２００００、例としておよそ３０００〜１２０００の間の分子量を有する一又は複数のＰＥＧ分子にコンジュゲートさせてもよい。抗体又はその断片をペグ化するために、通常、抗体又はその断片を、一又は複数のポリエチレングリコール基が抗体又は抗体断片に付着する条件下において、ＰＥＧのアルデヒド誘導体又は反応性エステルといったポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と反応させる。好ましくは、ペグ化は、反応性のＰＥＧ分子（又は類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応を介して起こる。特定の実施態様では、ペグ化対象の抗体は、グリコシル化抗体である。複数のタンパク質のペグ化方法が従来技術に既知であり、本発明の抗体に適用可能である。例えば、Nishimura等によるＥＰ１５４３１６、Ishikawa等による国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０４／１１４９４、及びＥＰ４０１３８４を参照されたい。]
[0074] 核酸
本発明の別の態様は、本発明の抗体をコードする核酸分子に関係する。該核酸は、全細胞、細胞溶解物、又は部分的に精製された形態もしくは実質的な純粋形態において存在しうる。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌ分染、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、及び当技術分野で周知の他の方法を含む標準的な技法により他の細胞内成分又は他の夾雑物、例えば、他の細胞内核酸又は細胞内タンパク質から精製される場合に、「単離」されるか又は「実質的に純粋」となる。F. Ausubel等編 (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New Yorkを参照されたい。本発明の核酸は、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡでありえ、イントロン配列を含有する場合も、そうでない場合もある。好ましい実施態様において、核酸はｃＤＮＡ分子である。以下の段落ではＤＮＡ配列又はこれらの使用に言及するが、同じ方法又は原理は一般に、ｍＲＮＡ配列にも適用することができる。
本発明の核酸は、標準的な分子生物学の技法を用いて得ることができる。ハイブリドーマにより発現する抗体（例えば、以下でさらに説明される、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスから調製されるハイブリドーマ）の場合、ハイブリドーマにより作製される抗体の軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲ増幅法又はｃＤＮＡクローニング法により得ることができる。免疫グロブリンの遺伝子ライブラリーから得られる（例えば、ファージディスプレイ法を用いる）抗体の場合、該抗体をコードする核酸は、該ライブラリーから回収することができる。]
[0075] 本発明の好ましい核酸分子は、ＩｇＧ４アイソタイプの１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２抗体のＨ鎖配列及びＬ鎖配列をコードする（又はこれらをコードする核酸配列を含む）核酸分子である。１６Ｆ１６のＶＨ配列及びＶＬ配列をコードするＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号３及び４に示される。１６Ｆ３１のＶＨ配列及びＶＬ配列をコードするＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号５及び６に示される。ＭＳのＶＨ配列及びＶＬ配列をコードするＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号４４及び４５をコードする配列である。２１Ｆ２のＶＨ配列及びＶＬ配列をコードするＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号４６及び４７をコードする配列である。
ＶＨセグメント及びＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られたら、これらのＤＮＡ断片を標準的な組換えＤＮＡ法によりさらに操作して、例えば、該可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子、又はｓｃＦｖ遺伝子へと転換させることができる。これらの操作において、ＶＬ又はＶＨをコードするＤＮＡ断片は、抗体の定常領域又は可撓性リンカーなど、別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片に作用可能に連結される。この文脈で用いられる「作用可能に連結される」という用語は、２つのＤＮＡ断片によりコードされるアミノ酸配列がフレーム内にとどまるよう、該２つのＤＮＡ断片を接合することを意味する。]
[0076] ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子へと作用可能に連結することにより、ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡを全長重鎖遺伝子へと転換させることができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野において既知であり（例えば、Kabat, E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest、第５版、米国保健福祉省、NIH Publication No. 91-3242を参照されたい）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、又はＩｇＤの定常領域でありうるが、ＩｇＧ４の定常領域であることが最も好ましい。Ｆａｂ断片による重鎖遺伝子の場合、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖ＣＨ１定常領域だけをコードする別のＤＮＡ分子へと作用可能に連結することができる。
ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域であるＣＬをコードする別のＤＮＡ分子へと作用可能に連結することにより、ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡを全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）へと転換させることができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野において知られており（例えば、Kabat, E. A.等(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest、第５版、米国保健福祉省、NIH Publication No. 91-3242を参照されたい）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。軽鎖定常領域は、カッパ定常領域又はラムダ定常領域でありうるが、カッパ定常領域であることが最も好ましい。]
[0077] ｓｃＦｖ遺伝子を作成するには、ＶＬ領域及びＶＨ領域が可撓性リンカーにより接合される形で、ＶＨ配列及びＶＬ配列が隣接する単鎖タンパク質として発現されうるように、ＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ断片が、可撓性リンカーをコードする別の断片、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする別の断片へと作用可能に連結される（例えば、Bird等(1988) Science 242:423-426; Huston等、(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty等、(1990) Nature 348:552-554を参照されたい）。]
[0078] 抗体の作製
本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、従来のモノクローナル抗体法、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）、Kohler及びMilstein (1975) Nature 256: 495による標準的な体細胞ハイブリダイゼーション法を含む各種技法により作製することができる。原則としては、体細胞ハイブリダイゼーション手順が好ましいが、モノクローナル抗体を作製する他の技法、例えば、Ｂリンパ球のウイルス又は癌遺伝子による形質転換も用いることができる。
ハイブリドーマを調製するのに好ましい１つの動物系は、マウス系である。融合のために免疫化された脾臓細胞を単離するための免疫化のプロトコール及び技法は、融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）及び融合手順と同様、当技術分野で既知である。確立された技法を用いると、本発明のキメラ抗体又はヒト化抗体も、マウスモノクローナル抗体の配列に基づいて調製することができる。例えば、重鎖免疫グロブリン及び軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、対象のマウスハイブリドーマから得ることができ、標準的な分子生物学の技法を用いて、非マウス（例えば、ヒト）の免疫グロブリン配列を含有するように操作することができる。例えば、キメラ抗体を作成するためには、当技術分野で公知の方法を用いて、マウス可変領域をヒト定常領域へと連結することができる（例えば、Cabilly等による米国特許第４８１６５６７号を参照されたい）。ヒト化抗体を作成するためには、当技術分野で公知の方法を用いて、マウスＣＤＲ領域をヒトフレームワーク内へと挿入することができる（例えば、Winterによる米国特許第５２２５５３９号；ならびにQueenらによる米国特許第５５３０１０１号、同第５５８５０８９号、同第５６９３７６２号、及び同第６１８０３７０号を参照されたい）。]
[0079] 好ましい実施態様において、本発明の抗体はヒトモノクローナル抗体である。ｈＮＫＧ２Ｄを対象とするこのようなヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなく、ヒト免疫系の一部を保有するトランスジェニックマウス又は導入染色体マウスを用いて発生させることができる。これらのトランスジェニックマウス又は導入染色体マウスは、本明細書でそれぞれＨｕＭＡｂマウス及びＫＭマウスと称するマウスを含め、本明細書では「ヒトＩｇマウス」と総称される。ＨｕＭＡｂマウス（Medarex社製）は、内因性のｕ鎖及びＫ鎖の遺伝子座を不活化する標的となる突然変異と共に、位置変えされないヒト重（ｐ及びｙ）鎖及びＫ軽鎖の免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子のミニ遺伝子座を含有する（例えば、Lonberg等、(1994) Nature 368: 856-859を参照されたい）。したがって、該マウスは、マウスＩｇＭ又は同Ｋ鎖の発現低下を示し、免疫化に対する反応では、導入されたヒト重鎖及び軽鎖の導入遺伝子がクラススイッチング及び体細胞突然変異を受けて、高親和性のヒトＩｇＧＫモノクローナルを発生させる（Lonberg N等、(1994)、前掲；Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N.及びHuszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93、及びHarding, F.及びLonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546において総括されている)。ＨｕＭＡｂマウスの調製及び使用、ならびにこのようなマウスにより保有されるゲノム修飾は、それらすべての全体を出典明記によりここに援用される、Taylor, L.等 (1992) Nucleic AcidsResearch 20:6287-6295; Chen, J. 等 (1993)International Immunology 5: 647-656; Tuaillon等 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi等 (1993) Nature Genetics 4: 117-123; Chen, J. 等 (1993)EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon等 (1994) J. Immunol. 152:2912 2920; Taylor, L.等 (1994) International immunology 6: 579-591; 及びFishwild, D. 等 (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851においてさらに説明されている。さらに、すべてLonberg及びKayによる米国特許第５５４５８０６号、同第５５６９８２５号、同第５６２５１２６号、同第５６３３４２５号、同第５７８９６５０号、同第５８７７３９７号、同第５６６１０１６号、同第５８１４３１８号、同第５８７４２９９号、及び同第５７７０４２９号；Suraniらによる米国特許第５５４５８０７号；すべてLonberg及びKayによる国際公開第９２／０３９１８号、同第９３／１２２２７号、同第９４／２５５８５号、同第９７／１３８５２号、同第９８／２４８８４号、及び同第９９／４５９６２号；ならびにKorman等による国際公開第０１／１４４２４号を参照されたい。別の実施態様では、ヒト重鎖導入遺伝子及びヒト軽鎖導入染色体を保有するマウスなど、導入遺伝子及び導入染色体上においてヒト免疫グロブリン配列を保有するマウスを用いて、本発明のヒト抗体を生成することができる。本明細書では「ＫＭマウス」と称するこのようなマウスは、Ishida等による国際公開第０２／４３４７８号において詳細に説明されている。またさらに、当技術分野ではヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替的なトランスジェニック動物系も用いられており、これらを用いて本発明の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体を生成することができる。例えば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ社製）と称する代替的なトランスジェニック系も用いることができ、このようなマウスは、例えば、Kucherlapati等による米国特許第５９３９５９８号；同第６０７５１８１号；同第６１１４５９８号；同第６１５０５８４号；及び同第６１６２９６３号において説明されている。さらに、当技術分野ではヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替的な導入染色体動物系も用いられており、これらを用いて本発明の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体を生成することができる。例えば、「ＴＣマウス」と称する、ヒト重鎖導入染色体及びヒト軽鎖導入染色体を保有するマウスも用いることができ、このようなマウスは、例えば、Tomizuka等（2000）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727において説明されている。その上、当技術分野ではヒト重鎖導入染色体及びヒト軽鎖導入染色体を保有するウシも説明されており（Kuroiwa等（2002）、Nature Biotechnology 20:889-894）、これらを用いて本発明の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体を生成することができる。]
[0080] 本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするファージディスプレイ法を用いて調製することもできる。ヒト抗体を単離するこのようなファージディスプレイ法は、当技術分野で確立されている。例えば、Ladner等による米国特許第５２２３４０９号、同第５４０３４８４号、及び同第５５７１６９８号；Dower等による米国特許第５４２７９０８号及び同第５５８０７１７号；McCafferty等による米国特許第５９６９１０８号及び同第６１７２１９７号；ならびにGriffiths等による米国特許第５８８５７９３号、同第６５２１４０４号、同第６５４４７３１号、同第６５５５３１３号、同第６５８２９１５号、及び同第６５９３０８１号を参照されたい。本発明のヒトモノクローナル抗体は、免疫化時にヒト抗体反応を発生させうるように、その中へとヒト免疫細胞を再構成したＳＣＩＤマウスを用いて調製することもできる。このようなマウスは、例えば、Wilson等による米国特許第５４７６９９６号及び同第５６９８７６７号において説明されている。
ヒトＩｇマウスを用いて本発明のヒト抗体を生成する場合、Lonberg, N.等 (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D.等 (1996) NatureBiotechnolo,gy 14: 845-851；及び国際公開第９８／２４８８４号及び同第０１／１４４２４号により説明される通り、精製又は濃縮されたｈＮＫＧ２Ｄ抗原の調製物、及び／又はｈＮＫＧ２Ｄを発現する細胞により、このようなマウスを免疫化することができる。初回の注入時において、マウスは６〜１６週齢であることが好ましい。例えば、精製又は濃縮されたｈＮＫＧ２Ｄ抗原の調製物（５〜５０μｇ）を用いて、腹腔内を介してヒトＩｇマウスを免疫化することができる。精製又は濃縮されたｈＮＫＧ２Ｄ抗原の調製物を用いる免疫化の結果として抗体が得られない場合は、ｈＮＫＧ２Ｄを発現する細胞、例えば、ヒトＮＫ細胞株もしくはＴ細胞株、又は、ＤＡＰ１０を伴う場合であれ、そうでない場合であれ、組換えｈＮＫＧ２Ｄを発現する哺乳動物細胞によりマウスを免疫化して免疫応答を促進することもできる。]

权利要求:

請求項1
ヒトＮＫＧ２Ｄ（ｈＮＫＧ２Ｄ）に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片であって、（ａ）ｈＮＫＧ２Ｄを発現するＮＫ細胞又はＴ細胞のｈＮＫＧ２Ｄ媒介性の活性を低減する特性、（ｂ）ｈＮＫＧ２Ｄに対する結合においてＭＩＣＡと競合する特性、（ｃ）ＮＫＧ２Ｄを発現するＮＫ細胞又はＴ細胞の表面上におけるＮＫＧ２Ｄの量を低減する特性、（ｄ）固定化すると、ＣＤ３によってトリガーされる抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖を有意に同時刺激しなくなる特性、（ｅ）カニクイザル及びアカゲザルのＮＫＧ２Ｄに結合する特性、及び（ｆ）１ｎＭ以下のＫＤでｈＮＫＧ２Ｄに結合する特性のうちの１又は複数を有する抗体又は抗原結合断片。
請求項2
特性（ａ）から（ｄ）までを有し、場合によっては（ｅ）及び／又は（ｆ）を有する、請求項１に記載の抗体又は抗原結合断片。
請求項3
ＮＫＧ２Ｄを発現するＮＫ細胞又はＴ細胞に添加されると、ｈＮＫＧ２Ｄに結合して２つ以下のｈＮＫＧ２Ｄ二量体に架橋結合する、単離された抗体又はその抗原結合断片。
請求項4
ｈＮＫＧ２Ｄ二量体の第１のｈＮＫＧ２Ｄ単量体に結合すると、第２のｈＮＫＧ２Ｄ単量体に対する抗体又は抗原結合断片の結合を遮断する、請求項３に記載の抗体又は抗原結合断片。
請求項5
ｈＮＫＧ２Ｄ二量体の第１のｈＮＫＧ２Ｄ単量体上と第２のｈＮＫＧ２Ｄ単量体上との溶媒排除面積の比が、約２：１であるか、それより大きい、請求項４に記載の抗体又は抗原結合断片。
請求項6
ヒト又はヒト化された、請求項３ないし５のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片。
請求項7
ｈＮＫＧ２Ｄに対する結合において標準抗体と競合する、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片であって、標準抗体が、（ａ）配列番号４４の配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４５の配列を含む軽鎖可変領域と、（ｂ）配列番号４６の配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４７の配列を含む軽鎖可変領域とを含んでなる、抗体又は抗原結合断片。
請求項8
配列番号２のＬｙｓ１５０、Ｓｅｒ１５１、Ｔｙｒ１５２、Ｔｈｒ１８０、Ｉｌｅ１８１、Ｉｌｅ１８２、Ｇｌｕ１８３、Ｍｅｔ１８４、Ｇｌｎ１８５、Ｌｅｕ１９１、Ｌｙｓ１９７、Ｔｙｒ１９９、Ｇｌｕ２０１、Ｔｈｒ２０５、Ｐｒｏ２０６、Ａｓｎ２０７、又はＴｈｒ２０８、或いはこれらの任意の組み合わせを含むエピトープに結合する、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片。
請求項9
配列番号４４のＧｌｎ１、Ａｓｐ２６、Ａｓｐ２７、Ｓｅｒ３０、Ｓｅｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｙｒ３３、Ｈｉｓ５０、Ｓｅｒ５２、Ｔｙｒ５３、Ｓｅｒ５４、Ｓｅｒ５６、Ａｌａ５７、Ａｓｎ５８、Ｔｒｐ９８又はＡｓｐ９９、或いは配列番号４５のＴｙｒ３３又はＴｒｐ９７に対応する残基を含むパラトープを含んでなる、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合媒体。
請求項10
（ａ）配列番号４８の配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４９の配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号５０の配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３と、随意で（ｄ）配列番号５１の配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号５２の配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号５３の配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３とを含んでなる、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片。
請求項11
（ａ）配列番号５４の配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号５５の配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号５６の配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３と、随意で（ｄ）配列番号５７の配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号５８の配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号５９の配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含んでなる、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片。
請求項12
（ａ）配列番号４４の配列を含む重鎖可変領域と配列番号４５の配列を含む軽鎖可変領域、又は（ｂ）配列番号４６の配列を含む重鎖可変領域と配列番号４７の配列を含む軽鎖可変領域を含んでなる、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片。
請求項13
抗ＮＫＧ２Ｄ抗体、又はその抗原結合断片の生産方法であって、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片をコードする核酸を含む宿主細胞を、適切な条件下で培養し、そこから前記抗体又は抗原結合断片を回収する方法。
請求項14
炎症性疾患又は自己免疫疾患の治療法であって、炎症性疾患又は自己免疫疾患に罹患しているか、又は罹患する危険のあるヒト対象者に対し、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片を投与する方法。
請求項15
炎症性疾患又は自己免疫疾患が、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）、乾癬、セリアック病、潰瘍性大腸炎、クローン病、移植片拒絶、又は移植片対宿主病である、請求項１４に記載の方法。