Verfahren zur Reparatur und zur Regeneration menschlicher Dura Mater

专利摘要:
Ein Verfahren zur Verwendung von im Wesentlichen nichtporöser equiner Kollagenfolie zur Reparatur und Regeneration von Dura mater-Gewebe von Säugern, wenn das Dura mater-Gewebe als Resultat von Verletzung, Tumoren, Operation und dergleichen beschädigt ist. Die nichtporöse equine Kollagenfolie umfasst Kollagenfibrilen, die eine Ersatz-Dura mater-Zusammensetzung zur Verfügung stellen, die elastisch, flüssigkeitsdicht ist und die eine hohe Zugfestigkeit aufweist. Die nichtporöse equine Kollagenfolie ist weiterhin resorbierbar und stellt eine Biomatrix zur Verfügung, worin eine Neodura sich schnell bildet, die von der autologen Dura mater innerhalb von Wochen ununterscheidbar wird. Das Verfahren zur Herstellung einer equinen Kollagenfolie reduziert die Wahrscheinlichkeit von Krankheitsübertragungen.
公开号:DE102004027363A1
申请号:DE102004027363
申请日:2004-06-04
公开日:2005-01-27
发明作者:Johann Odar；Ralph Schachtler；Abolghassem Sepehrnia；Axel W. Stemberger
申请人:Baxter Healthcare SA；Baxter International Inc；
IPC主号:A61L27-24

专利说明:
[0001] Dievorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von im WesentlichennichtporösenKollagenfolienzusammensetzungen als Transplantatmaterial zur Reparaturund/oder zur Regeneration von Dura mater-Gewebe von Säugern. Insbesonderebetrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung Kollagenfolienzusammensetzungennichtmenschlichen Ursprungs als Ersatz für Dura mater-Material und alseine Biomatrix zur Regeneration der Dura.
[0002] DieDura mater ist eine funktionell wichtige Struktur in der Anatomiedes zentralen Nervensystems, und bildet ein Membransystem, das dasgesamte zentrale Nervensystem umhüllt und es vor äußeren Einflüssen schützt.
[0003] DieDura mater kann aus einer Anzahl von Gründen einer Reparatur bedürfen, umfassendein Trauma, Entzündungs-oder neoplastische Prozesse, Operationen oder angeborene Abnormalitäten. DieNotwendigkeit, Dura-Schädenzu schließen,insbesondere nach Operationen und in der Gegenwart von posttraumatischenFisteln, hat eine Suche nach einem idealen Dura mater-Ersatz ausgelöst. DieseDefekte könnenpostoperative Komplikationen hervorrufen, insbesondere das Aussickernder zerebrospinalen Flüssigkeit,Infektionen und davon hervorgerufene Gehirnschläge. Bei ungefähr 30 %aller Kraniotomien ist eine Art Dura-Transplantationsverfahren erforderlich.Da die erste Schließungdes Dura-Schadens oftmals nicht erfolgreich ist, ist die Verfügbarkeiteines Dura-Ersatzes zur Vermeidung der vorstehenden Komplikationenvon großerpraktischer Bedeutung.
[0004] Einepermanente flüssigkeitsdichteSchließungder Dura mater ist zur Verhinderung des Auslaufens der zerebrospinalenFlüssigkeitnach Schädelverletzungenoder operativen Eingriffen zur Entfernung maligner Tumore im Gehirnoder in der Wirbelsäuleerforderlich. Neurochirurgen verwenden derzeit resorbierbare oder nichtresorbierbare Dura mater-Ersatze und befestigen diese für gewöhnlich ander Dura mater im Schädel oderan der Wirbelsäulemit Nähtenund/oder Fibrinklebstoff. Beispiele von resorbierbaren Materialienumfassten die menschliche Dura mater aus Leichen, menschliche Fascialata, bovines Pericardium, xenogene Kollagenschwämme und Implantate aus gewebtenMaterialien, die aus resorbierbarem Polyester (Polyglaktin und/oderPoly-p-di-oxanon) bestehen. Beispiele nicht resorbierbarer Dura-Ersatzeumfassen Materialien, die aus Polytetrafluorethylen (PTFE) oderPolyesterurethan hergestellt sind.
[0005] Fastalle Dura-Transplantatmaterialien, die bisher untersucht wurden,sind mit Komplikationen verbunden, einige davon mit größeren Komplikationen.Die Hauptkomplikationen, überdie berichtet wurde, sind chronische Entzündungs- und Abstoßungsreaktionenund die Bildung von corticomeningalen Adhäsionen, die unter anderen zurEntwicklung von epileptogenischen Brennpunkten führen. Hämatome und zerebrospinale Flüssigkeitsfistelnwerden ebenfalls beobachtet, die ebenfalls einen Eintrittspunktfür verschiedenekrankheitsverursachende Organismen bilden.
[0006] ZahlreicheMaterialien und Verfahren wurden in den letzten Dekaden auf derSuche nach dem idealen Dura-Transplantat getestet, umfassend verschiedeneMetalle, Implantate, synthetische Materialien, autologe Gewebetransplantateund konservierte Dura mater aus menschlichen Leichen. Die meistendieser Produkte sind ungeeignet, da sie mit postoperativen Komplikationen,einige davon ernsthafter Natur verbunden sind. Beispiele dieserKomplikationen umfassen chronische Entzündungen und Abstoßungsreaktionen,die Entwicklung corticomeningaler Adhäsionen, Hämorrhagen und die Einkapselungvon Dura mater-Transplantaten in einer dicken Schicht Bindegewebes.FrühereStudien auf dem Gebiet von geeigneten Dura-Ersatzmaterialien zeigen, daß eine frühe Transplantatabsorptiongekoppelt mit der Bildung einer endogenen Neodura die Hauptfaktorensind, die füreine komplikationsfreie und dauerhafte Dura-Verschmelzung nötig sind.
[0007] Mehrereautologe Gewebe wurden in der Vergangenheit als Dura mater-Ersatzverwendet. 1911 verwendete Kostling den Bruchsack eines Patientenzur Bildung eines Dura-Transplantats. Kosting, W., Med. Wochenschr.,58, 1042 (1991). Andere autologe Gewebe wie temporale Fascia, Fascialata femoris und Periostlappen wurden seither verwendet. Barrowet al. rekonstruierte erfolgreich eine große Dura-Läsion mit einem endogenen größeren Omentum.Barrow et al., J. Neurosurg. 60; 305-1 (1987). Der Vorteil autologerTransplantate besteht darin, daß siekeine Übertragungvon Pathogenen oder eine Gewebeabstoßung hervorrufen. Jedoch vergrößert diezusätzlicheEntfernung von Gewebe Operationstraumata und verlängert daswas wahrscheinlich in jedem Fall eine komplizierte operative Prozedurist.
[0008] Konserviertemenschliche Dura aus Leichen wurde routinemäßig über viele Jahre als ein Duramater-Ersatz fürden Dura-Ersatz in Menschen verwendet. Diese Präparate bestehen aus Bindegewebefasern, dieuntereinander wie die körpereigeneDura mater verwoben sind. Nachdem die aus Leichen stammende menschlicheDura mater in der Neurochirurgie verwendet wurde, wird davon gesagt,daß sieeine flüssigkeitsdichteSchließung, ähnlich derkörpereigenenDura mater ausbildet und sie wird schließlich durch das körpereigeneGewebe in einen Abbauprozess übereinen längerenZeitraum hinweg ersetzt. Das aus Leichen stammende Material wirddurch Gefriertrocknen (Lyophilisierung) und Gammasterilisierung(Lyodura, B. Braun Mels ungen Aktiengesellschaft, Melsungen, Deutschland)oder in einem mehrstufigen chemischen Verfahren (Tutoplast^® Verfahren;Tutoplast^® Dura,Tutogen Medical GmbH, Neunkirchen am Brand, Deutschland) konserviert.Jedoch wurden menschliche Dura mater-Transplantate aus Leichen miterhöhtenRisiken in Verbindung gebracht, nämlich daß sie Viren und Prionen tragen,die die gefürchteteKrankheit des spongiformen Enzephalitis verursachen können (Creutzfeld-JakobKrankheit oder Gerstmann Streussler Syndrom). Aufgrund von zahlreichenTodesfällen,die nach der Implantation von menschlicher Dura mater auftraten,wurde die Verwendung von menschlichen, aus Leichen stammenden Duramater-Transplantaten in einer Anzahl von Ländern eingeschränkt odergänzlichverboten.
[0009] Eswurden ebenfalls menschliche Fascia lata und Pericardiumpräparate alsDura mater-Ersatzmaterialien verwendet, die mit einer geringerenGefahr der Übertragungvon infektiösenStoffen als bei der menschlichen, aus Leichen stammenden Dura materverbunden sind. Währenddiese Präparatezwar ein geringeres Risiko der Übertragungvon Krankheiten mit sich bringen, werden sie nur langsam über Monateoder Jahre hinweg resorbiert, was zu der Bildung von Narben undder Einkapselung des Dura-Ersatzmaterials führen kann.
[0010] Dura-Ersatzwurde ebenfalls aus nichtmenschlichen Quellen entnommen, wie Rinder-oderSchweine-Kollagen, das aus der Haut oder Knorpel und bovinem Pericardiumgewebeisoliert wurde. Ähnlichden aus Menschen stammenden Dura-Ersatzen, wurde von einigen RinderDura-Ersatzen angenommen, daß sieeine Krankheit, insbesondere die bovine spongiforme Enzephalopathie(BSE), auf den Patienten übertragen,der das Dura mater-Transplantat erhält. Die Verwendung von ausSchweinen stammendem Dura-Ersatz führte jedoch zu Adhäsionen mitdem darunterliegenden Gehirngewebe.
[0011] Narotamet al., U.S. 5,997,895 offenbaren Dura-Ersatze, die aus behandeltemxenogenen Kollagen in der Form von porösen Kollagenschwamm, Filz oderFilmen stammen. Die Behandlung von Kollagen inaktiviert Virus- undPrionenverunreinigungen, so daß derErsatz keine infektiösenMengen an Viren oder Prionen enthält. Die Porosität der Dura-Ersatzewird als notwendig offenbart, um es den Gefäßen, Zellen und meningalen Gewebezu erlauben, den Dura-Ersatz zu infiltrieren. In der klinischenPraxis ist jedoch die Anwendung der erhältlichen porösen Materialienmit Nachteilen verbunden, da die Formstabilität und primär die Flüssigkeitsdichtheit nicht immergarantiert sind. Narotam et al. offenbaren ebenfalls einen Dura-Ersatz,der ein Sandwich von zwei oder mehr Formen von Kollagenschwämmen, Filzoder Filmen ist, wobei wenigstens eine Form hinreichend porös ist, damitsich meningeales Gewebe darin einwachsen kann.
[0012] ResorbierbarePolyester sind ebenfalls fürdie klinische Verwendung erhältlich,aber haben den Nachteil der geringen Elastizität und einer langsamen Abbaubarkeit.In speziellen Situationen rufen diese Implantate Wundheilungsproblemehervor und erhöhendie Gefahr einer Infektion.
[0013] Folienoder Blätterbestehend aus einem Metall wie Gold, Platin, Silber, Nickel, Tantaloder Stahl oder Polymere wie Polytetrafluorethylen (PTFE) oder anderePolyester wurden ebenfalls als Dura mater-Ersatz verwendet. DieseErsatze werden jedoch nicht von dem Patienten absorbiert, sondernwerden in einer dichten Lage aus Bindegewebe eingekapselt und verbleibenwährenddes gesamten Lebens des Patienten im Körper als Fremdkörper ohnevon den körpereigenenStrukturen ersetzt zu werden. Dies kann zu einem hohen Risiko inBezug auf das Wachstum von Erregern in den inneren Poren resultieren,die aufgrund der porösenStruktur der PTFE-Folienmembranennicht durch die körpereigenenAbwehrmechanismen kontrolliert werden können.
[0014] KollagenbasierteProdukte werden zunehmend populär.Chemische Verfahren könnenzur Modifikation von Strukturen mit einem hohen Anteil an Bindegewebeverwendet werden, wie das Pericardium oder die Dermis, so daß nur eineazellulare, antigenfreie Kollagenplattform erhalten wird. Es sindProdukte erhältlich, dieim allgemeinen ganz aus Kollagenfibern oder aus mit Kollagen beschichtetensynthetischen Materialien bestehen. In beiden Fällen fungiert das Kollagenfasernetzwerkals Matrix fürdas Wachstum des endogenen Bindegewebes.
[0015] Chaplinet al. testeten ein Produkt in einem Tiermodell, das aus Meerschweinchenhaut(XenoDerm, Lifecell Corp., The Woodlands, TX) erhalten wurde. Neurosurgery, 45:2,320-7 (August 1999). Der Vergleichsstoff war autologes Pericranium.Die Epidermis, alle zellulärenBestandteile und andere potenziell antigenen oder infektiösen Elementewurden in dem Herstellungsverfahren chemisch entfernt. Die Kollagenfasernund die strukturelle Architektur der Haut wurden unverändert beibehalten.Es wurde berichtet, daß dasProdukt schnell mit der umgebenden Dura in der Gegenwart einer mildenzellulärenAntwort eingebaut wurde. Eindringende Fibroblasten wurden vorzugsweisean der Implantationsstelle beobachtet. Es wurde beobachtet, daß das Transplantatund die ursprünglicheDura mater am Ende der postoperativen 6 Monate langen Studie voneinanderkaum unterscheidbar waren.
[0016] ImAnschluß andiese Ergebnisse, untersuchten Warren et al. (2000) AlloDerm^® (LifeCellCorp., The Woodlands, TX) fürden Dura-Ersatz bei Menschen. Neurosurgery 46(6):1391-96 (2000).Zweihundert Patienten erhielten während der Studien ein AlloDermDura-Transplantat. Dieses Material wird aus der menschlichen Dermiserhalten. Es wird gesagt, daß dasHerstellungsverfahren das gleiche wie für XenoDerm ist, indem eine azelluläre Kollagenbiomatrixhergestellt wird, die frei ist von Haupt-Histkompatibilitätskomplex (MHC)-Antigen ist.Sieben der 200 Patienten entwickelten postoperative Komplikationenwie Infektion und Fisteln der zerebrospinalen Flüssigkeit (CSF), aber es wurdenicht berichtet, daß einerdieser Zwischenfälledurch das Transplantat selbst verursacht wurde. Es wurde berichtet,daß diechirurgische Nachuntersuchung zeigte, daß keiner dieser Patienten eineAdhäsionoder eine Abstoßungsreaktionan der Stelle des Dura-Transplantats entwickelt hatte. Es wurdegesagt, daß dasMaterial bei makroskopischer Untersuchung in hohem Maße ähnlich zurumgebenden Dura war. Langzeitstudien sind bei diesem Produkt nochnicht erhältlich.
[0017] Filippiet al. (2001) beschrieben Experimente zur Verwendung von lösungsmittelkonserviertengammasterilisierten Rinder-Pericardium (Tutopatch^®, TutogenMedical GmbH, Neunkirchen, Deutschland) für den Dura-Ersatz bei 32 Personen.Filippi et al. Neurosurg. Rev. 24:103-107 (2001). Es wurde berichtet,daß der nachoperativeVerlaufmit Ausnahme eines Patienten ereignislos war, der an Herzproblemenkurz nach der Operation starb. Es wurde beschrieben, daß das Transplantateinfach in der Handhabung, dauerhaft und kostengünstig war. Langzeitstudien,die die MöglichkeitspäterKomplikationen ausräumenwürden,sind noch nicht erhältlich.
[0018] Kollagenproduktesind zur Verwendung als Biomaterial in vielerlei Hinsicht geeignet:die chemotaktische Wechselwirkung bei der sie involviert sind, erleichtertdie schnelle Infiltration diese endothelialen Zellen und Fibroblasten,die wiederum Kollagenfasern herstellen und ablagern; eine damitzusammenhängendebeschränkteLymphozyten- Entzündungsantwortin umgebenden Strukturen fördertdie Absorption der Kollagenbiomatrix. Kollagen besitzt ebenfallshämostatischeEigenschaften, die füreine therapeutische Verwendung eingesetzt werden. Die Plättchen lagernsich selbst auf der Kollagenstruktur ab, und indem sie disintegrieren setzensie die Gerinnungsfaktoren frei, die die Fibrinbildung im Zusammenhangmit Plasmafaktoren erleichtern.
[0019] BekannteDura-Ersatzmaterialien und verwandte Methoden zur Verwendung derartigerMaterialien schaffen es jedoch nicht, eine flüssigkeitsdichte, resorbierbareErsatz Dura mater zur Verfügungzu stellen, die eine Einkapselung, die Bildung von Dura-Narben, oder dieAdhäsionan das Gehirngewebe vermeidet und weiter ein geringes Risiko für die Übertragungvon Krankheitserregern, Viren und Prionen aufweist, die spongiformeEnzephalitis oder andere Krankheiten hervorrufen können. Einidealer Dura mater-Ersatz sollte keine Immunantwort oder eine Entzündung hervorrufenund muss nichttoxisch sein. Es sollte schnell absorbiert werden undes der Bindegewebsarchitektur zur gleichen Zeit ermöglichen,sich aufzubauen, so daß sicheine endogene Neodura entwickelt. Das Transplantat sollte während diesesVerfahrens nicht an das Gehirngewebe oder mit Knochen binden oderdamit verschmelzen. Das Material sollte gegenüber Zugkräften widerstandsfähig sein,seine Form bewahren und einer Durchlässigkeit gegenüber zerebrospinalerFlüssigkeitwiderstehen. Die Ersatz Dura mater sollte ebenso in ihrem Volumenund in ihrer Form stabil sein, so daß sie der Expansion oder Kontraktionnach ihrer Implantation widersteht. Andere wichtige Kriterien sindvirale und Prionensicherheit, Anwendungsfreundlichkeit für den Benutzerund wirtschaftliche Herstellungskosten.
[0020] Unterden verschiedenen Aspekten der vorliegenden Erfindung ist einerdavon daher die Bereitstellung eines Dura mater-Ersatzmaterials,das resorbierbar, flüssigkeitsdicht,elastisch, stabil in Bezug auf sein Volumen und seine Form ist undein hervorragendes Sicherheitsprofil in Bezug auf das Risiko vonKrankheitsübertragungenzur Verfügungstellt.
[0021] Daherbetrifft die vorliegende Erfindung kurz gesagt ein Verfahren zurReparatur und/oder zur Regeneration von Dura mater-Gewebe in einemSäuger.Das Dura mater-Gewebe wird mit einer equinen Kollagenfolie in Kontaktgebracht, die eine Biomatrix von Kollagenfibrillen umfasst. Dieequine Kollagenfolie wird durch ein Verfahren gebildet, wobei eineSuspension von Kollagenfibrillen ausgefällt wird, um die Folie vonKollagenfibrillen zu bilden und wobei die Kollagenfibrillen nichtdurch Chemikalien oder durch Strahlung vernetzt wurden.
[0022] Ineinem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Reparaturvon Dura mater-Gewebe in einem Säuger,umfassend das Inkontaktbringen des Dura mater-Gewebes mit einer im Wesentlichen nichtporösen equinenKollagenfolie, umfassend eine nicht natürlicherweise vorkommende Biomatrixvon Kollagenfibrillen, wobei die Pferde Kollagenfolie im Wesentlichenaus azellulärenKomponenten besteht und wobei die Kollagenfibrillen nicht durchChemikalien oder Strahlung quervernetzt werden.
[0023] Ineinem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Reparaturund/oder Regeneration von Dura mater-Gewebe in einem Säuger, umfassenddas Inkontaktbringen des Dura mater-Gewebes mit einer im Wesentlichennicht porösenequinen Kollagenfolie bestehend im Wesentlichen aus einer Kollagenbiomatrix, wobeidie Kollagenbiomatrix nicht durch Chemikalien oder Strahlung quervernetztwird.
[0024] AndereAspekte und Merkmale der vorliegenden Erfindung sind teilweise offensichtlichund teilweise nachstehend ausgeführt.
[0025] 1 ist eine SEM (Rasterelektronenmikroskop)Fotographie, die die Oberflächeeiner trockenen equinen Kollagenfolie veranschaulicht. Kollagenfibrillensind klar erkennbar. Die im wesentlichen nichtporöse Oberfläche istauf dem Bild ersichtlich.
[0026] Die 2A und 2B sind Fotographien, die unter ESEM-Bedingungen(Umgebungsrasterelektronenmikroskop) aufgenommen wurden, das bedeutetnahe an natürlichenBedingungen in einer leicht feuchten Atmosphäre, die die obere Fläche darstellen,gesehen von der Seite einer equinen Kollagenfolie aus. Die im wesentlichennichtporöseOberflächeist auf den Fotographien ersichtlich.
[0027] Die 3A und 3B sind Fotographien, die unter ESEM-Bedingungenaufgenommen wurden und die untere Oberfläche einer equinen Kollagenfoliezeigen. Kollagenfibrillen sind in 3A dargestellt.Die im im wesentlichen nichtporöseOberflächeist auf den Bildern ersichtlich.
[0028] 4 ist eine SEM-Fotographie,die die Oberflächeeiner hydratisierten equinen Kollagenfolie darstellt. Kollagenfibrillensind klar in 4 dargestellt.Die im wesentlichen nichtporöseOberflächeist auf diesem Bild ersichtlich.
[0029] Die 5A, 5B und 5C sindFotographien, die unter ESEM-Bedingungen aufgenommen wurden (feuchteAtmosphäre)und die den Querschnitt einer equinen Kollagenfolie darstellen.Die Materialien offenbaren eine Struktur wie ein Stapel von Blättern, dieeng zusammengepackt sind. Einlagerungen zwischen den Kollagenlagensind in dem Bild gezeigt.
[0030] Die 6A und 6B sind SEM-Fotographien, die den Querschnitteiner trocknen equinen Kollagenfolie illustrieren. Mehrere Lagenaus Kollagen und Lückenzwischen den Kollagenlagen sind den Bildern dargestellt.
[0031] 7 ist eine Fotographie,die einen intraoperativen Aspekt des linksseitigen Dura-Schadens nach Insertionder equinen Kollagenfolie zeigt, die umgebende Dura-Ecken sind von Blutgerinnselnbedeckt.
[0032] 8 ist eine Fotographie,die eine Trichrom gefärbtemikroskopische Übersicht(Frontalschnitt) der Operationsstelle darstellt, die Kortexstrukturenzeigt und die darüberliegendeDura mater mit beiden Transplantaten (equine Kollagenfolie auf derrechten Seite; Tutoplast^® Dura auf der linken Seite)(8-fache Vergrößerung).
[0033] 9 ist eine Fotographie,die Dura mater-Transplantate acht Wochen nach der Operation zeigt.Auf der linken Seite, sieht die Tutoplast^® Dura,die aus einer Dura einer Leiche stammt, unverändert aus mit klar sichtbarenRändern.Die verbleibenden Teile der dünnenBindegewebsmembran, die das Transplantat bedecken kann gesehen werden.Auf der rechten Seite, erscheint das equine Kollagenfolien Biomatrixtransplantat alsvölligin die es umgebende Dura eingebaut. Die dunklen Flecken werden durchkleine Blutgerinnselreste in der Neodura hervorgerufen.
[0034] 10 ist eine Fotographie,die acht Wochen nach der Operation einen makroskopischen Aspektdes equinen Kollagenfolien-Biomatrixtransplantas, das dem Kortexgegenüberliegt, zeigt. Das Transplantat erscheint weich, mobil und völlig indie umgebende Dura inkorporiert. Es können keine kortikalen Läsionen gesehenwerden.
[0035] 11 ist eine Fotographie,die einen makroskopischen Aspekt einer von einem Leiche stammenden Tutoplast^® Dura-Transplantatacht Wochen nach der Operation zeigt, das dem Kortex gegenüberliegt.Das Transplantat erscheint weich und homogen, aber es können keineAnzeichen des Einbaus des Transplantats erkannt werden. CorticomeningialeAdhäsionensind abwesend.
[0036] 12 ist eine Fotographie,die zwei polynukleare gigantische Zellen mit intrazellulären Fragmenten desequinen Kollagenfolienbiomatrixtransplantats zwei Wochen nach derOperation zeigt (Hematoxillin-Eosin-(HE)-Färbung; 800-fache Vergrößerung).
[0037] 13 ist eine Fotographie,die fibroblastische und phagozytische Zellen zeigt, die das equineKollagenfolienbiomatrixtransplantat infiltriert haben, und zwarvier Wochen nach der Operation. Neokapillaren mit Eryhtrozyten sindebenso sichtbar (HE-Färbung, 600-facheVergrößerung).
[0038] 14 ist eine Fotographie,die vier Wochen nach der Operation Fragmente des equinen Kollagenfolienbiomatrixtransplantatszeigt, die von Phagozytenzellen umgeben ist und eine milde Lymphozyten-Entzündung zeigen(HE-Färbung,600-fache Vergrößerung).
[0039] 15 ist eine Fotographie,die eine Dura aus einer Leiche von Tutoplast^® Durazeigt, und zwar vier Wochen nach der Operation. Die aus dem Leichestammende Dura zeigt minimale Anzeichen an zellulärer Infiltrationoder eines Transplantatumbaus. Eine dichte Lymphozyten-Entzündungsreaktionwird oberhalb und unterhalb des Transplantats angetroffen (HE-Färbung, 250-facheVergrößerung).
[0040] 16 ist eine Fotographieeines mikroskopischen Aspekts der Neodura und zwar acht Wochen nach derOperation und zeigt neu gebildete Lagen von Kollagenfibrillen, Fibroblasten,und Reste des equinen Kollagenfolienbiomatrixtransplantats (Trichromfärbung, 150-facheVergrößerung).
[0041] 17 ist eine Fotographieeines mikroskopischen Aspekts der Neodura sechzehn Wochen nach der Implantationder equinen Kollagenfolie und zeigt dichte Kollagenfibrillen undneu gebildete Kapillaren, die mit Erythrozyten gefüllt sind(van Gieson Färbung,200-fache Vergrößerung).
[0042] 18 ist eine Zeichnung, dieeinen Testapparat veranschaulicht, der zur Messung der Dichte gegenüber Wasser,der Zugfestigkeit und der Elastizität/Flexibilität des Duramater-Ersatzmaterials verwendet wird. Das Ausmaß der Wölbung des Materials, das auseiner spezifischen Wassersäulenhöhe resultierte,wurde zur Bestimmung des Grades an Elastizität/Flexibilität gemessen.Die Menge an Wasser, das durch die Testmaterialien gedrückt wurde,wurde gemessen, um die Wasserdichte zu testen.
[0043] 19 ist ein Schaubild, dasdas Ausmaß derWölbungder equinen Kollagenfolie (Kollagengehalt 5,6 mg/cm²)gegenübererhöhtemhydrostatischen Druck (Wassersäulenhöhen) zeigt.
[0044] 20 ist ein Schaubild, dasdas Ausmaß derWölbungeiner Kollagenfolie (Kollagengehalt: 4 mg/cm²)gegenübererhöhtemhydrostatischen Druck (Wassersäulenhöhen) zeigt.
[0045] 21 ist ein Schaubild, dasdas Ausmaß derWölbungvon DuraGen gegenübererhöhtemhydrostatischen Druck (Wassersäulenhöhen) zeigt.DuraGen riß bei200 cm H₂O hydrostatischen Druck.
[0046] 22 ist ein Schaubild, dasdas Ausmaß derWölbungvon mehreren Dura mater-Ersatzprodukten gegenüber erhöhtem hydrostatischenDruck zeigt (Wassersäulenhöhen).
[0047] 23 ist ein Schaubild, dasdas Ausmaß derWölbungund den Verlust von Wasser von equiner Kollagenfolie (Kollagengehalt:5,6 mg/cm²) gegenüber erhöhtem hydrostatischen Druck(Wassersäulenhöhen) zeigt.
[0048] 24 ist ein Schaubild, dasdas Ausmaß derWölbungund den Wasserverlust einer Kollagenfolie (Kollagengehalt: 4 mg/cm²) gegenübererhöhtemhydrostatischen Druck (Wassersäulenhöhen) zeigt.
[0049] 25 ist ein Schaubild, dasdas Ausmaß derWölbungund den Verlust von Wasser von DuraGen gegenüber erhöhtem hydrostatischen Druck(Wassersäulenhöhen) zeigt.
[0050] 26 ist ein Schaubild, dasdas Ausmaß derWölbungund einen Wasserverlust von mehreren Dura mater-Ersatzproduktengegenübererhöhtemhydrostatischen Druck (Wassersäulenhöhen) zeigt.
[0051] 27 ist ein Schaubild, dasdie Reißwiderstandsfähigkeit/maximaleZugkraft verschiedener Kollagener Implantate zeigt. Beispiel E isteine equine Kollagenfolie.
[0052] Erfindungsgemäß wurde überraschenderweiseentdeckt, daß eineim Wesentlichen nichtporöseFolie umfassend equine Kollagenfibrillen in einer nicht in natürlicherWeise vorkommenden Biomatrix effizient als ein resorbierbarer Duramater-Ersatz zur Reparatur der Dura, ihrer Regeneration und ihrerWiederherstellung in Säugern,umfassend Menschen, Labortiere und dergleichen verwendet werdenkann. Die equine Kollagenfolie der vorliegenden Erfindung ist flüssigkeitsdichtund stellt Hochsicherheitscharakteristika gegenüber dem Risiko der Übertragungvon Viren oder Prionen zur Verfügung.Außerdemist die equine Kollagenfolie flexibel und elastisch unter Beibehaltungeiner hohen Zugfestigkeit. Diese Folie, die nachstehend als "euqine Kollagenfolie" bezeichnet wird,entspricht bei Implantation in wichtigen Eigenschaften der menschlichenDura mater. Die equine Kollagenfolie dient als Biomatrixplattformfür daszellulärenin vivo Einwachsen und wird währendder Regeneration und Wiederherstellung durch eine Neodura ersetzt.
[0053] Ineiner Ausführungsformumfasst die equine Kollagenbiomatrixfolie Bindegewebeproteine, dieim Wesentlichen aus Kollagenfibrillen bestehen. Vorzugsweise umfasstdie equine Kollagenfolienbiomatrix Bindegewebeproteine, die Kollagenfibrillenumfassen. Bevorzugt umfasst die equine Kollagenfolienbiomatrix Bindegewebeproteine,die aus Typ I Kollagenfibrillen bestehen.
[0054] Außer daß sie Kollagenfibrillenumfasst, kann die equine Kollagenfolie weiter einen Trägerstoff,einen Konservierungsstoff, einen Wachstumsfaktor oder ein Additivumfassen, das fürdie Flexibilitätund Elastitzität desEndprodukts hilfreich ist.
[0055] Dieequine Kollagenfolie der vorliegenden Erfindung ist eine Biomatrixaus Kollagenfibrillen, die behandelt sind, um zelluläre Bestandteilezu entfernen und ein Folie aus Kollagenfibrillen zu bilden.
[0056] Dieequine Kollagenfolie, die in der Ausführungsform der vorliegendenErfindung verwendet wird, ist eine nicht natürlicherweise vorkommende ausmehreren Schichten bestehende Kollagenmembran, die aus zahlreichenin verschiedenen Richtungen untereinander verwobenen Kollagenfibrillenbesteht. Eine Darstellung einer trockenen equinen Kollagenfolieist in 1 dargestellt.Die Mikroaufnahme (SEM) zeigt die Oberfläche einer equinen Kollagenfolie,in der Kollagenfibrillen eingebettet sind. Eine Aufnahme ist inden 2A bis 2B der oberen Oberfläche einerequinen Kollagenfolie unter ESEM-(Umgebungsrasterelektronenmikroskop)-Bedingungengezeigt, bei der eine leicht feuchte Atmosphäre nahezu natürliche Bedingungenzur Verfügungstellt. Die Kollagenfibrillen sind auf der Oberfläche sichtbar.Die Oberflächeerscheint weich und im Wesentlichen nicht porös. Aufnahmen (ESEM) der unterenOberflächeder equinen Kollagenfolie sind in 3A und 3B gezeigt. Die untere Oberfläche derAufnahme zeigt ebenfalls die im Wesentlichen Nichtporosität der equinenKollagenfolie.
[0057] Vorder Verwendung der equinen Kollagenfolie zur Reparatur des Duramater-Gewebes einesSäugers,kann die trockene equine Kollagenfolie hydratisiert werden. 4 ist eine SEM-Aufnahme,die die Oberflächeeiner hydratisierten equinen Kollagenfolie zeigt, wobei die Kollagenfibrillenklar gezeigt sind. Die Oberfläche,die im wesentlichen nichtporösist, ist auf diesem Bild ersichtlich.
[0058] Dieeinzigartige Orientierung der Kollagenfibrillen in zweidimensionalenRichtungen in den Mehrfachschichten ist primär für die Flüssigkeitsdichtigkeit selbstunter hohem hydrostatischem Druck verantwortlich und ermöglicht einegroßeStärkeverbunden mit einer hohen Elastizität. Aufgrund der zahlreichenparallel zueinander orientierten dünnen Kollagenfibrillenschichtender equinen Kollagenfolie, ist das Material für den zeitweisen Ersatz derkörpereigenenDura mater geeignet, um den Schaden nach der Implantation zu bedecken umeine flüssigkeitsdichteSchließungeines zerebrospinalen Flüssigkeitsleckszu erzielen und stellt eine Biomatrixplattform für das Zelleinwachstum zur Bildungeiner Neodura zur Verfügung.Diese Eigenschaft ist beim Wundheilungsprozess wichtig, da es dasRisiko reduziert, daß derPatient eine Liquorrhöeentwickelt.
[0059] Dieequine Kollagenfolie wird durch den Säuger, in dem es implantiertwird, resorbiert. Es wird angenommen, daß diese Eigenschaft durch dieStruktur der equinen Kollagenfolie verstärkt wird. Das Verfahren, daszur Herstellung der equinen Kollagenfolie verwendet wird, bildetgestapelte Schichten von Kollagenfibrillen. Zwischen jeder Schichtsind Lücken,in die Zellen und Gefäße des Patienteneinwandern könnenund ein Neoduragewebe bilden.
[0060] JedeSchicht der Kollagenfibrillen ist im Wesentlichen nicht porös. Die wenigenPoren die vorhanden sein können,sind typischerweise voneinander isoliert und sind nicht über verschiedeneLagen von Kollagenfibrillen hinweg miteinander verbunden. Die multipleSchichtstruktur der vorliegenden Erfindung vergrößert die Flüssigkeitsdichtecharakteristikader equinen Kollagenfolie. Die rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen der 1 bis 4 zeigen die nicht poröse Naturder equinen Kollagenfolie.
[0061] Während dieequine Kollagenfolie im Wesentlichen nicht porös ist, existieren Zwischenräume zwischenden Schichten der Kollagenfibrillen. Die Zwischenräume undSchichtcharakteristika könneneinfach in den 5A, 5B und 5C beobachtet werden, die Querschnittsaufnahmender equinen Kollagenfolie unter ESEM-Bedingungen (feuchte Atmosphäre) sind.Die 6A und 6B sind SEM-Aufnahmen der trockenenequinen Kollagenfolie. Daher ist die equine Kollagenfolie einemBlätterstapelanalog, wobei jedes Blatt im Wesentlichen weich und nicht porös ist, miteinem Zwischenraum zwischen jedem Blatt. In ihrer trockenen Form (6A und 6B) sind die Zwischenräume ausgeprägter. DieZwischenräumewerden kleiner, wenn die equine Kollagenfolie unter nahezu natürlichenBedingungen in einer leicht feuchten Atmosphäre beobachtet wird. Die 5A, 5B und 5C sindAufnahmen von Querschnitten von equinen Kollagenfolien in einerfeuchten Atmosphäre,wobei die Reduktion der Zwischenräume der equinen Kollagenfoliedargestellt ist.
[0062] Außer zurVerbesserung der flüssigkeitsdichtenEigenschaften, dienen die zahlreichen parallel orientierten dünnen Kollagenfibrillenschichtender equinen Kollagenfolie gleichzeit als Biomatrixgerüst für den Zelleinwachstumfür diede novo Bildung der körpereigenenDura. Es war vorher im Allgemeinen angenommen worden, daß eine poröse Plattformstrukturnötig war,um das Einwachstum des autonomen Gewebes und der Gefäße in einemErsatz des Dura mater-Gewebes zu fördern. Es wurde überraschenderweiseentdeckt, daß dienicht poröseSchichtenstruktur der equinen Kollagenfolie das Einwachsen der Zellen,des Gefäßsystems unddie Bildung von neuen Kollagenstrukturen durch die equine Kollagenfoliefördertund sich in den Zwischenräumendie zwischen den verschiedenen Lagen existieren, eine Neodura miteiner typischen Schichtstruktur einer natürlichen Dura innerhalb vonWochen nach der Implantation ausbildet. Wie nachstehend und in Beispiel1 weiter beschrieben, ist das Einwachsen von Zellen, der Gefäße und derneuen Kollagenstruktur so extensiv, daß innerhalb von Wochen nachder Operation, die Neodura nur schwer von einem vorher im Patienten existierendenDura mater-Gewebe unterschieden werden kann. Nach ungefähr vierbis acht Wochen nach der Operation, beträgt die zelluläre Organisationder meningealen Zellen ungefähr40 bis 70 %. Nach ungefähr sechzehnWochen ist das Transplantat vollständig organisiert (100 %).
[0063] Tierexperimentezeigen, daß eineschnelle zelluläreInfiltration in das Gebiet der mehrschichtigen equinen Kollagenfoliestattfindet. Histologisch gesehen, wurde eine dichte Infiltrationder Kollagenbiomatrix mit Lymphozyten, Makrophagen und Fibroblasteninnerhalb 14 Tagen nach Implantation beobachtet. Kapillaren bildensich in dem Transplantat etwas später. Ein kontinuierlicher Übergangzwischen der equinen Kollagenfolie und der umgebenden Dura aufgrundder Neogenese der Kollagenfibrillen ist leicht ersichtlich. Nachnur vier Wochen, ist die equine Kollagenfolie teilweise durch körpereigeneswenig strukturiertes Gewebe ersetzt. Nach 24 Wochen ist es schwierigzu unterscheiden zwischen der vorher existierenden Dura im Patientenund der der neu geformten Neodura ähnlichen Verbindungsgewebearchitektur,die die implantierte equine Kollagenfolie in der beschädigten Gebietersetzt.
[0064] Einbedeutsamer Vorteil bei der Verwendung von equiner Kollagenfolieder vorliegenden Erfindung ist das im Wesentlichen geringe Risikoder Übertragungeiner Krankheit an den Patienten in die sie implantiert wird. DerHerstellungsprozess, bei dem die Kollagenfibrillen um die equineKollagenfolien herzustellen, mit Säuren (beispielsweise Salzsäure, Essigsäure unddergleichen) und mit Basen, wie Natriumhydroxid, behandelt werden,funktioniert vorteilhafterweise dahingehend, daß dadurch die infektiösen Spiegelan Bakterien, Viren und Prionen, die vorhanden sein können, inaktiviertoder reduziert werden. Die Behandlung von Biomaterial mit Salzsäure, Natriumhydroxid,Ethylenoxid (ETO) und dergleichen wurde von Regierungsagenturenals zugelassene Methoden bei Arzneimittel- und Biomaterialzulassungenzur Inaktivierung von Prionen und Viren anerkannt. Eine derartigeBehandlung kann bei einigen Zulassungen die Zulassungserfordernissezum Testen der equinen Kollagenfolie auf einer Batch-by-Batch-Basisreduzieren. Daher erhöhtdie Behandlung der Kollagenfibrillen während des Herstellungsverfahrensdie Produktsicherheit und reduziert das Risiko der Übertragungvon Krankheiten auf einen Patienten.
[0065] Vonequinem Material, das dem vorstehend beschriebenen Herstellungsprozessunterzogen wurde, ist nicht bekannt, daß es irgendwelche Pathogeneauf Patienten überträgt. Zusätzlich zumHerstellungsverfahren, kann die Verwendung von equin basierten KollagenDaher ferner die Risiken der Übertragungvon spongiformer Enzephalitis vermeiden, die vorher mit Ersatzenaus menschlichen Leichen verbundenen waren. Die Verwendung von Kollagenequinem Ursprung, wie Kollagen, das aus Pferdeachillessehnen stammt,vermindert das Risiko der Übertragungvon übertragbarerspongiformer Enzephalopathie (TSE), die ebenso als bovine spongiformeEnzephalopathie (BSE) oder Scrapie bekannt ist. Die Übertragungdieser Krankheit wurde mit der Verwendung von biologischen Materialienin Verbindung gebracht, das aus Wiederkäuern stammt (beispielsweisebiologisches Material von Rindern, Ziegen, Schafen und dergleichen).
[0066] Dieequine Kollagenfolie der vorliegenden Erfindung, bei der das Kollagenaus equinem Ursprungs ist und weiter behandelt wurde (beispielsweisemit Enzymen) reduziert das Risiko, eine Immunantwort hervorzurufen.Es wurden keine Immunantworten übereinen Zeitraum von zehn Jahren berichtet, in denen equin basiertesKolla gen in Gewebetransplantationsverfahren verwendet wurde (für Gewebedie nicht Dura mater sind).
[0067] Dievon Pferden stammende Kollagenfolie führt ebenso zu einer reduziertenEntzündungsantwort. Verglichenmit Dura mater-Ersatzen, die Kollagen enthalten, das von Quellenwie einer menschlichen Fascia lata stammt, wird die Anzahl der Entzündungszellen,die von der Implantation der equinen Ersatz-Kollagenfolie stammen,beträchtlichreduziert. Die Entzündungsprozesse,die durch die Implantation der equinen Kollagenfolie hervorgerufenwerden, sind ebenfalls kürzerin ihrer Dauer, verglichen mit einer Ersatz Dura mater, die ausanderen Quellen stammt. Diese Eigenschaften reduzieren das Risikoder Transplantatabstoßungder equinen Kollagenfolie durch das Immunsystem eines Patientenbeträchtlichund verbessern daher den Erfolg von neurochirurgischen Verfahren,die einen Dura mater-Ersatz erfordern.
[0068] Eskönnendann Probleme auftreten, wenn eine Ersatz-Dura mater sich beträchtlichvergrößert oder kontraktiert,wenn sie hydratisiert wird. PoröseKollagen-Dura mater-Ersatzprodukteaus dem Stand der Technik haben in einigen Fällen dazu tendiert, signifikantnach der Hydratisierung zu schrumpfen. Bei derartigen Fällen, kanndie Ersatz-Dura mater an Nähtenkleben, die sie an die Dura mater des Patienten binden und so demImplantat sowie der autologen Dura mater und der OperationsstelleSchaden zufügen.Andere Komplikationen umfassen den Druck der an der Operationsstelleausgeübtwird, wenn die Ersatz-Dura mater fortfährt zu expandieren, nachdemsie implantiert wurde, und einen unerwünschten Druck auf das benachbarteneurologische Gewebe ausübt.
[0069] DieVeränderungdes Volumens der equinen Kollagenfolie der vorliegenden Erfindungist klein oder vernachlässigbarwenn sie hydratisiert ist. Im Gegensatz zu porösen Ersatzprodukten, behält die equineKollagenfolie im Wesentlichen ihre Größe und Form bei, wenn sie hydratisiertwird, und daher weist sie eine exzellente Formstabilität auf undbleibt biostabil selbst nach Hydratisierung und verursacht keine Problemein Bezug auf Schwellen oder Schrumpfen im Gehirn nach der Implantation.Einmal hydratitisiert und implantiert, expandiert die equine Kollagenfolienicht wesentlich oder kontrahiert in Bezug auf ihre Gegend oderdie Dicke nicht in einem Ausmaß,daß sieOperationsnähtezerstörenwürde oderfibrilläreKlebstoffsiegel aufbrechen würde,die die equine Kollagenfolie an der Patienten-Dura mater halten.
[0070] Ineiner Ausführungsformkann das Schrumpfen oder das Schwellen des Bereichs der trockenenequinen Kollagenfolie von ungefähr –5 % bisungefähr20 % variieren, wenn sie vollständighydratisiert wird. In einer anderen Ausführungsform kann der Bereichder trockenen equinen Kollagenfolie zwischen ungefähr –5 % bisungefähr10 % variieren, wenn sie vollständighydratisiert ist. In einer anderen Ausführungsform kann der Bereichder trockenen equinen Kollagenfolie zwischen ungefähr –5 % bisungefähr5 % variieren, wenn sie vollständighydratisiert ist. In anderen Ausführungsformen kann der Bereichder trockenen equinen Kollagenfolie nicht mehr als ungefähr 4 % zunehmen,wenn sie vollständighydratisiert ist.
[0071] Ineiner Ausführungsformvergrößert sichdie Trockendichte der equinen Kollagenfolie ungefähr um dasungefähr4-fache, wenn sie vollständighydratisiert ist. In einer weiteren Ausführungsform, vergrößert die equineKollagenfolie ungefährdreimal ihre Trockendichte, wenn sie vollständig hydratisiert ist. In einerweiteren Ausführungsform,vergrößert dieequine Kollagenfolie ungefährzweimal ihre Trockendichte, wenn sie vollständig hydratisiert ist.
[0072] DieDicke der adulten menschlichen Dura variiert von ungefähr 0,5 mman der Schädelbasisbis ungefähr2,0 mm. Die Dicke der Dura mater kann ebenfalls in Abhängigkeitvom Alter des Patienten variieren, wobei bei Kleinkindern und jungeKindern typischerweise erwartet werde würde, daß sie ein dünneres Dura mater-Gewebe alsErwachsene aufweisen. Die Dicke der equinen Kollagenfolie der vorliegendenErfindung kann so formuliert werden, daß sie in Abhängigkeitvon dem gewünschtenAnwendungsgebiet und dem zu behandelnden Patienten variiert.
[0073] Ineiner Ausführungsform,hat die equine Kollagenfolie der vorliegenden Erfindung in ihrertrockenen Form eine Dicke zwischen ungefähr 0,01 mm bis ungefähr 3,0 mm.In einer anderen Ausführungsformhat die equine Kollagenfolie eine Dicke von zwi schen ungefähr 0,02mm bis ungefähr2,0 mm. In einer weiteren Ausführungsformhat die equine Kollagenfolie eine Dicke von zwischen ungefähr 0,03mm bis ungefähr1,5 mm. In einer weiteren Ausführungsformhat die equine Kollagenfolie eine Dicke von zwischen ungefähr 0,05mm bis ungefähr1 mm. In noch einer weiteren Ausführungsform hat die equine Kollagenfolieeine Dicke von ungefähr1,0 mm oder weniger.
[0074] DasTrockengewicht der equinen Kollagenfolie hängt von der gewünschtenDicke ab. In einer Ausführungsformliegt das Trockengewicht der equinen Kollagenfolie zwischen ungefähr 1 mg/cm² bis ungefähr 50 mg/cm².In einer weiteren Ausführungsformbeträgtdas Trockengewicht der equinen Kollagenfolie zwischen ungefähr 1,5 mg/cm² bis ungefähr 30 mg/cm².In einer weiteren Ausführungsformbeträgtdas Trockengewicht der equinen Kollagenfolie zwischen ungefähr 2 mg/cm² bis ungefähr 20 mg/cm².In einer weiteren Ausführungsformbeträgtdas Trockengewicht der equinen Kollagenfolie zwischen ungefähr 2,5 mg/cm² bis ungefähr 15 mg/cm².In einer weiteren Ausführungsformbeträgtdas Trockengewicht der equinen Kollagenfolie zwischen ungefähr 3 mg/cm² bis ungefähr 10 mg/cm².
[0075] Ineiner Ausführungsformerhöhtsich das Gewicht der equinen Kollagenfolie bis das ungefähr 15-facheseines Trockengewichts nach Hydratisierung. In einer anderen Ausführungsformerhöhtsich das Gewicht der equinen Kollagenfolie bis zum ungefähr 10-fachenihres Trockengewichts nach Hydratisierung. In einer weiteren Ausführungsformerhöhtsich das Gewicht der equinen Kollagenfolie bis auf das ungefähr 7-fache seines Trockengewichtsnach Hydratisierung. In noch einer weiteren Ausführungsform erhöht sichdas Gewicht der equinen Kollagenfolie bis auf ungefähr das 5-fache nach Hydratisierungvon ihrem Trockenstadium an.
[0076] Umals angemessene Dura mater-Ersatze zu dienen, sollten die implantiertenDura-Ersatze nichtzu weich werden, sondern stattdessen eine ziemlich hohe Stabilität/Zugfestigkeitaufweisen selbst wenn sie hydratisiert sind. Die equine Kollagenfolieder vorliegenden Erfindung hat vorzugsweise eine hohe Zugfestigkeit, wasdie Handhabung der equinen Kollagenfolie während ihrer Verwendung beider Operation verbessert und unterstützt und stellt eine erhöhte mechanischeStabilitätnach ihrer Implantation zur Verfügung.Vergleichsexperimente sind in den nachstehenden Beispielen aufgeführt, worindie Zugefestigkeit der equinen Kollagenfolie verglichen mit porösen Kollagenpräparationen(z.B. Kollagenschäumen)sich als besser herausstellte. Außerdem kann die Erhöhung derDicke equinen Kollagenfolie die Zugfestigkeit in beträchtlichemMaße erhöhen.
[0077] DieNeigung von equinem Kollagenfolienmaterial unter erhöhtem Druckzu zerreißenkann als seine "höchste Zugbeladung" oder "höchste Zugkraft" gemessen werden,die nachstehend als "endgültige Zugkraft" bezeichnet wird.Die höchsteZugkraft einer equinen Kollagenfolie kann bestimmt werden, indemDruck auf einen Streifen einer equinen Kollagenfolie mit einer genauenWeite ausgeübtwird und indem die Menge des angewandten Drucks bestimmt wird, derim Bruch (beispielsweise Reißenoder Zerbrechen) der equinen Kollagenfolie resultiert. Die höchste Zugkraftkann quantifiziert werden, indem die nachstehende Gleichung verwendetwird: "höchste Zugkraft" = angewandte Kraft/Breiteder equinen Kollagenfolienstreifen = Newtons/cm-Streifen.
[0078] Ineiner Ausführungsform,besitzt die equine Kollagenfolie eine höchste Zugkraft von zwischenungefähr1 bis ungefähr30 Newton/cm-Streifen, vorzugsweise von zwischen ungefähr 1,5 undungefähr15 Newton/cm-Streifen, vorzugsweise zwischen ungefähr 2 undungefähr10 Newton/cm-Streifen, noch mehr bevorzugt zwischen ungefähr 3 undungefähr6 Newton/cm-Streifen.
[0079] Obwohldie equine Kollagenfolie der vorliegenden Erfindung eine hohe Zugfestigkeitaufweist, bleibt sie elastisch und flexibel wenn sie hydratisiertwird. Diese Eigenschaft erlaubt es der equinen Kollagenfolie, sichoptimal an den anatomischen Bedingungen (beispielsweise Rundungen)anzupassen, die an der Implantationsstelle vorhanden sind.
[0080] Wennsie sich in ihrem hydratisierten Stadium befindet, kann die equineKollagenfolie leicht in der Operationsstelle bewegt werden und optimalin die Form des Schadens modelliert werden, wo sie implantiert wird. Einmalimplantiert, bleibt das equine Kollagenfolientransplantat weichund beweglich. Im Laufe der Zeit, wandern Zellen und Gefäße durchdie equine Kollagenfolie und ersetzen sie schließlich mit einer duraähnlichen Neodura.Nach der zellulärenOrganisation mit meningealen Zellen, haftet die equine Kollagenfolienicht am Neuralen-, Gehirn-, Schädel-oder Wirbelsäulengewebe.
[0081] Dieequine Kollagenfolie der vorliegenden Erfindung kann ausgehend vonSuspensionen aus Kollagenfibrillen mit hohem Molekulargewicht über einenkontrollierten Trockenprozess hergestellt werden. Eine allmähliche Fällung derKollagenfibrillensuspension resultiert aus der Verdampfung von Wasserund gleichzeitiger Erhöhungdes pH-Wertes. Der kontrollierte Trockenprozess resultiert in einerMehrschichtkonstruktion einer Kollagenfolie, die von Neurochirurgenals Ersatz fürdie menschliche Dura mater implantiert werden kann. Die mehrschichtigeKollagenfolienkonstruktion stellt eine Anzahl der vorstehend beschriebenenEigenschaften zur Verfügung,die in einem Dura mater-Ersatz und als Biomatrix für die Regenerationvon lebendem Dura-Gewebe von Vorteil sind.
[0082] Ineiner Ausführungsform,entfernt das Verfahren zur Herstellung der equinen Kollagenfolieder vorliegenden Erfindung alle zellulären Komponenten und erzeugteine equine Kollagenfolie aus Kollagenfibrillen, die im Wesentlichenaus azellulärenBestandteilen besteht.
[0083] UnterVerwendung von etablierten Verfahren in der Kollagenchemie, wirdKollagenhaltiges Gewebe als Ausgangsmaterial für die Herstellung der equinenKollagenfolie der vorliegenden Erfindung verwendet. In einer Ausführungsformwerden equine Sehnen als Ausgangsmaterial verwendet. In einer weiterenAusführungsformwerden equine Achillessehnen als Ausgangsmaterial verwendet.
[0084] Ineiner Ausführungsform,wird das Ausgangsmaterial, beispielsweise equine Achillessehnenzuerst gemahlen und wenigstens eine Stunde mit 1 N Natriumhydroxidlösung behandeltund mit Salzsäureneutralisiert. Das Kollagenausgangsmaterial wird unter Säurebedingungenbei einem pH-Wert von 2 behandelt. Die verwendete Säure kannSalzsäuresein, Essigsäureoder dergleichen. Nachfolgend werden nicht-Kollagenproteine und intermolekulareVernetzungsbindungen, die in dem Ausgangsmaterial vorhanden sind,enzymatisch mit Pepsin abgebaut, um eine Kollagensuspension herzustellen.
[0085] DieSuspension wird anschließendneutralisiert. In einer Ausführungsformwird die Suspension auf einen pH-Wert von ungefähr 6,5 bis ungefähr 8,0 neutralisiert.In einer weiteren Ausführungsform,wird die Suspension auf einen pH von ungefähr 6,9 bis ungefähr 7,5 neutralisiert.In noch einer weiteren Ausführungsform wirddie Suspension auf einen pH von ungefähr 7 neutralisiert.
[0086] DieKollagensuspension wird zentrifugiert, der Überstand entfernt und das Präzipitatin Essigsäurebei einem pH von ungefähr2–4,5wieder suspendiert. NichtKollagene Proteine werden damit erfolgreichaus der Kollagensuspension entfernt.
[0087] DieWiederholung der vorstehend beschriebenen Schritte kann so oft wienötig ausgeführt werden,um Reste von NichtKollagenproteinen, die im Präzipitat vorhanden sein können, zuentfernen.
[0088] Ein überraschendesErgebnis des Herstellungsverfahrens der equinen Kollagenfolie bestehtdarin, daß einekontrollierte pH-Erhöhungder Kollagensuspension in Essigsäureerzielt wird, aufgrund der spezifischen Entfernung von Wasser durchVerdampfung übereinen langen Zeitraum, beispielsweise 24 Stunden. Die spezifischeErhöhungdes pH-Werts verursacht die Ausfällungvon multidirektional untereinander verwobenen Kollagenfibrillenin zweidimensionaler Ausrichtungsschichten die eine mehrschichtigeKonstruktion der equinen Kollagenfolie bilden. In einer Ausführungsformwird das Verfahren in einem Trockenofen mit einer Ausrüstung zumEntfernen des Dampfes und zur gleichzeitigen Dampfneutralisationder Essigsäurebei einer Temperatur von ungefähr20°C bisungefähr55°C durchgeführt. Ineiner weiteren Ausführungsformwird das Verfahren in einem Trockenofen bei einer Temperatur vonungefähr30°C bisungefähr45°C durchgeführt.
[0089] Dieequine Kollagenfolie, die das Ergebnis dieses Herstellungsverfahrensist, wird als Trockenform angesehen, wenn ein weiterer Wasserverlustnicht entdeckt wird oder vernachlässigbar ist. Der Wassergehaltder "trockenen Form" der equinen Kollagenfolieliegt typischerweise zwischen ungefähr 2 % bis ungefähr 18 Gew.-%.Der relativ hohe Restwassergehalt, der in der "Trockenform" der equinen Kollagenfolie vorhandenist, verhindert oder hemmt die Denaturierung der Kollagenmoleküle, diedie equine Kollagenfolie umfassen.
[0090] Dasvorstehend beschriebene Verfahren ist für die Ausfällung der Kollagenfibrillenaus der Suspension verantwortlich, da Bestandteile mit einer niedrigenLöslichkeitam Anfang des Verfahrens bei einer niedrigen pH-Erhöhung ausfallen.Diese Technik resultiert in einer Ausfällung der Kollagenfibrillenwährendder Wasserverdampfung und gleichzeitiger Erhöhung des pH-Werts.
[0091] Während derAusfällung,werden die Kollagenfibrillen natürlichuntereinander vernetzt, wenn die Fibrillen aus der Lösung ausfallen,um eine Kollagenfolie zu bilden. Ungleich dem Vernetzen von Kollagenfibrillen mitChemikalien oder mit Strahlung (beispielsweise ionisierende oderultraviolette Strahlung), das in erhöhten Resorptionszeiten resultierenkann, ermöglichtdas GewährennatürlichenQuervernetzens der Kollagenfibrillen reduzierte Resorptionszeitensobald die equine Kollagenfolie implantiert ist. Das natürliche Quervernetzen derFibrillen in der Kollagenfolie, die in der Erfindung verwendet wird,entsteht durch natürliche,Physiologie-ähnlicheMittel. Primärerfolgt dieses natürlicheQuervernetzen übernichtkovalente Wechselwirkungen (beispielsweise van der Waals- oderDipol-Dipol-Wechselwirkungen) oder durch die Bildung von einfachdissoziierbaren Schift-Basebindungen zwischen den Aminosäureseitenkettendes Kollagenmoleküls.Intermolekulares Quervernetzen von Kollagen ist für die physikalischeund chemische Stabilitätverantwortlich. Der Schlüsselschrittbei der Bildung von Kollagenquervernetzung hängt von der enzymatischen Umwandlungvon Lysin oder Hydroxylysinresten ab und ergibt Aldehyde, Allysineund Hydroxyallysine. Diese Aldehydgruppen reagieren spontan mitreaktiven Aminogruppen, was zur Bildung von Schift-Baseverbindungenführt,die labile Aldolkondensationsprodukte mit labilen Aldiminbindungen(-CH=N-) bilden. Daher, könnendie Fibrillen des Produkts der vorliegenden Erfindung durch eineBehandlung mit beispielsweise einer schwachen Säure dissoziiert werden. DieQuervernetzung, die von der Verwendung von chemischen Quervernetzungsmittelnherrührt,kann über dasVorliegen von stabilen kovalenten quervernetzten Quervernetzungseinheitennachgewiesen werden. Im Allgemeinen wird dies durch die Verwendungvon Schiff-Basereagenzien(beispielsweise Glutaraldehyd) erreicht, die Schiff-Basereaktionsproduktebilden und anschließenddie Bindungen überentweder eine Amadori-Umlagerung oder unter reduzierenden Bedingungenstabilisieren. Außerdemkann Kollagen durch verschiedene bifunktionelle Carbodiimidreagenzienquervernetzt werden. Quervernetzung, die vom Einsatz von Strahlungherrührt,kann durch das Vorliegen von stabilen kovalenten Bindungen zwischenden Kollagenfibrillen nachgewiesen werden, die durch die Reaktionvon freien Radiakaleinheiten, die während der Strahlung erzeugtwerden, hervorgerufen werden. Die Fibrillen im Produkt der vorliegendenErfindung sind auf der anderen Seite im Wesentlichen nicht mit irgendwelchenstabilen kovalenten Bindungen quervernetzt und wurden nicht chemischoder strahlungsmäßig behandelt.Daher ist eine Assoziierung zwischen den Fibrillen im erfindungsgemäßen Produktim Wesentlichen nicht kovalent oder einfach reversibel und sie sindnicht stabil quervernetzt. Chemikalien wie Cyanamid, Gluaraldehyd,Formaldehyd, Acrylamid, Carbodiimidedione, Diimidat, Bisacrylamidund dergleichen wurden in der Vergangenheit verwendet, um Kollagenfibrillenin Dura mater-Ersatzen chemisch querzuvernetzen. Die Verwendungvon derartigen Chemikalien kann jedoch in Toxizitätsrisikenresultieren, die mit versehentlichem Inkontaktbringen von Gehirngewebemit verbleibenden Chemikalien in dem Dura mater-Ersatz zusammenhängen. DasAusfällverfahrenvermeidet daher die Toxizitätsrisikenvon quervernetzenden Chemikalien und längeren Resorptionszeiten, diemit der Quervernetzung der Kollagenfibrillen mit Chemikalien oderStrahlung in Verbindung stehen.
[0092] Dieentstehende getrocknete, ausgefällteKollagenzusammensetzung bildet eine equine Kollagenfolie, die einMehrschichtkollagenmembran mit hohem molekularen Gewicht umfasst,die aus zahlreichen multidirektional, natürlich untereinander verwobenenKollagenfibrillen besteht. Die equine Kollagenfolie enthält primär interstitiellesTyp I Kollagen. Die equine Kollagenfolie hat im Wesentlichen keinePoren und ist vor allem flüssigkeitsdicht.Immundiffusionstests könnenmit dem Produkt durchgeführtwerden, um die Abwesenheit von Fremdproteinen zu garantieren.
[0093] Dasvorstehend beschriebene Verfahren, das zur Herstellung von equinenKollagenfolien zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung verwendetwird, wird ebenfalls von der Resorba Wundversorgung GmbH & Co. KG, Nürnberg,Deutschland bei der Herstellung von Kollagenfolien verwendet, diekommerziell von Baxter AG, Wien, Österreich erhältlich sind.Von den kommerziell erhältlichenFolien wird angegeben, daß sieals hämostatischeWirkstoffe, als temporäreGewebe-Ersatze, zur Bedeckung von Wunden und als FibrinversiegelungsträgersubstanzenVerwendung finden.
[0094] DieDicke der equinen Kollagenfolie zur Verwendung in der vorliegendenErfindung kann entsprechend der besonderen Anwendung variieren.Beispielsweise kann bei der Reparatur des pädiatrischen Dura mater-Gewebeseine dünnereequine Kollagenfolie verwendet werden, während eine dickere equine Kollagenfoliebei der Reparatur des adulten Dura mater-Gewebes verwendet werdenkann.
[0095] DieDicke der equinen Kollagenfolie kann durch Variation der Menge desAusgangsmaterials, das zur Herstellung einer besonderen Größe der equinenKollagenfolie verwendet wird, kontrolliert werden.
[0096] Dieequine Kollagenfolie wird mit Ethylenoxid (ETO) oder ähnlichemSterilisationsgas oder durch Strahlung gassterilisiert.
[0097] Vordem Einsatz, kann die trockene equine Kollagenfolie hydratisiertwerden, beispielsweise in physiologischer Salzlösung. In einer Ausführungsform,umfasst die physiologische Salzlösungeine 0,9 % Natriumchloridlösung.In einer weiteren Ausführungsformist die equine Kollagenfolie in Trägerstoffen oder Arzneimittel enthaltendenLösungenhydratisiert. Die Zeitdauer, die zur Hydratisierung der equinenKollagenfolie notwendig ist, hängtvon der Dicke der Folie ab. Die equine Kollagenfolie wird hydratisiert,bis sie eine konsistente Dicke überihre gesamte Flächeaufweist. In einer Ausführungsformwird die equine Kollagenfolie zwischen ungefähr 5 Sekunden und ungefähr 1 Stundein physiologischer Salzlösunghydratisiert. In einer weiteren Ausführungsform, wird die equineKollagenfolie zwischen ungefähr5 Se kunden und ungefähr30 Minuten in physiologischer Salzlösung hydratisiert. In einerweiteren Ausführungsform,wird die equine Kollagenfolie zwischen ungefähr 5 Sekunden und ungefähr 20 Minutenin einer physiologischen Salzlösunghydratisiert. In einer weiteren Ausführungsform wird die equineKollagenfolie zwischen ungefähr5 Sekunden und ungefähr10 Minuten in physiologischer Salzlösung hydratisiert. In nocheiner weiteren Ausführungsformwird die equine Kollagenfolie zwischen ungefähr 1 Minute und ungefähr 6 Minutenin physiologischer Salzlösunghydratisiert. In einer weiteren Ausführungsform wird die equineKollagenfolie ungefähr5 Minuten in physiologischer Salzlösung hydratisiert. In einerweiteren Ausführungsformwird die equine Kollagenfolie vor Implantation nicht hydratisiert.
[0098] Dieequine Kollagenfolie kann an die Patienten Dura mater über übliche chirurgischeTechniken, beisipelsweise überFibrinklebstoffe, Gewebeklebstoffe, Operationsnähte oder durch Druckoperationstechniken befestigtwerden. Alternativ dazu, kann die natürliche Anziehungskraft zwischender equinen Kollagenfolie und dem Dura mater-Gewebe dazu verwendet werden, die equineKollagenfolie an das Dura mater-Gewebezu heften, ohne ein Klebmittels, ein Versiegelungsmittels, Nähte oderDruckfittingtechniken zu verwenden. Einmal hydratisiert, kann dieequine Kollagenfolie etwas größer alsdie Operationsöffnungin der Patienten-Dura mater zugeschnitten werden. Die equine Kollagenfolie überlapptdadurch leicht mit der Patienten-Dura mater an die sie befestigtwird. In einer Ausführungsformwird die hydratisierte equine Kollagenfolie so dimensioniert, daß sie ungefähr 0,5 cmbis ungefähr1 cm mit der Dura überlappt.Das Ausmaß der Überlappungkann in Abhängigkeitvon den Vorlieben und dem Geschick des Neurochirurgen variieren.
[0099] Ineiner Ausführungsform,kann die equine Kollagenfolie an die Dura mater gemäß der gutbekannten Wechselwirkung von Kollagen mit Fibrin mit einem Fibrinversiegelungsmittel,das fürneurologische Verwendung zugelassen ist, befestigt werden. Beispielevon Fibrinversiegelungsmitteln, die für die neurologische Verwendungzugelassen sind, umfassen Tissucol und Tisseel Fibrinversiegelungsmittel(Baxter AG, Wien, Österreich).Alternativ dazu, kann ebenfalls ein Gewebeklebstoff, der für die neurologischeVerwendung zugelassen ist, verwendet werden. Das Fibrinversiegelungsmitteloder der Gewebeklebstoff kann in einer ununterbrochenen Linie umden Teil der equinen Kollagenfolie herum aufgebracht werden, dermit der Dura mater überlappt umeine flüssigkeitsdichteVersiegelung zu bilden. Wie vorstehend beschrieben, ist eine flüssigkeitsdichteVersiegelung bevorzugt, da sie Komplikationen, die mit dem Verlustder zerebrospinalen Flüssigkeitwie Liquorrhöeverbunden ist, vermeidet.
[0100] Ineiner weiteren Ausführungsformerzeugt die equine Kollagenfolie ein flüssigkeitsdichtes Siegel, wennsie an die autologe Dura mater mit einer kontinuierlichen Linievon Fibrinversiegelungsmittel oder Gewebeklebstoff befestigt wird.
[0101] Ineiner weiteren Ausführungsformkann die equine Kollagenfolie, die mit der Dura mater überlappt, punktförmig mitFibrinversiegelungsmittel oder mit Gewebeklebstoff versehen werden,um diese an der Dura mater zu befestigen.
[0102] Ineiner weiteren Ausführungsformist die equine Kollagenfolie überchirurgische Nähtean der Dura mater befestigt, sobald sie an der gewünschtenImplantationsstelle positioniert ist. Während diese Ausführungsformdazu verwendet werden kann, die equine Kollagenfolie an die autologeDura mater des Patienten zu befestigen, können die Nähte Zweigkanäle hervorrufen,die ihrerseits Fisteln und das Auslaufen von zerebrospinaler Flüssigkeithervorrufen können.Wenn die equine Kollagenfolie genäht werden soll, müssen spannungsfreieNähtechnikenverwendet werden, um zu verhindern, daß die Folie reißt. Es istempfehlenswert, Nahtlinien zu versiegeln, beispielsweise mit einemFibrinversiegelungsmittel.
[0103] Ineiner weiteren Ausführungsformist die equine Kollagenfolie gemäß den Druckanpasstechniken,die aus dem Stand der Technik bekannt sind, positioniert und implantiert.Bei dieser Technik wird die equine Kollagenfolie an der gewünschtenImplantationsstelle positioniert und wird an dieser Stelle durchnatürlichenInnendruck, der im Gehirn oder der Wirbelsäule vorhanden ist, am Platzgehalten. Daher bleibt das Transplantat am Platz, ohne daß chirurgischeNähte,Fibrinversiegelungsmittel oder Gewebeklebstoff verwendet werden.
[0104] Ineiner weiteren Ausführungsformist die equine Kollagenfolie ohne die Verwendung von einem Versiegelungsmittel,Klebstoff, Nähteoder Druckanpaßtechnikenpositio niert und implantiert. Bei dieser Technik, wird die equineKollagenfolie an die gewünschteImplantationsstelle positioniert und durch die natürliche Anziehungoder Adhäsion,die zwischen der equinen Kollagenfolie und dem Dura mater-Gewebeexistiert, an seinem Platz gehalten.
[0105] Dieequine Kollagenfolie der vorliegenden Erfindung kann als ein Ersatz-Duramater Transplantat verwendet werden zur Reparation von menschlichemDura mater-Gewebeaufgrund eines angeborenen Leidens, einem Geburtsfehler, Krankheit,Verletzung, Tumorentfernung oder anderen chirurgischen Verfahren,die die Dura mater eines Patienten zerstören oder durchdringen oderjeder anderen Störung,bei der die Dura mater eine Reparatur braucht. Die equine Kollagenfoliekann ebenfalls dazu verwendet werden, um Dura mater-Gewebe von anderenSäugernzu reparieren, umfassend aber nicht beschränkt auf Schafe, Affen, Pferde,Labortiere oder andere Säugere.Die equine Kollagenfolie kann dazu verwendet werden, um Dura mater-Gewebe imGehirn oder entlang der Wirbelsäulezu reparieren.
[0106] Dievorliegende Erfindung ist weiterhin auf einen Kit gerichtet, dereine equine Kollagenfolie und Anleitungen zu seiner Zubereitungund Verwendung als eine Ersatz Dura mater umfasst.
[0107] EinPatient, von dem bekannt ist, daß er allergische ReaktionengegenüberPferden oder equinen Produkten aufweist, würde eine Kontraindikation aufweisen,die equine Kollagenfolie zu erhalten.
[0108] AndereKontraindikationen könntenPatienten umfassen, die einer Strahlungstherapie kurz nach der Operationunterzogen werden, beispielsweise werden Patienten, die eine Strahlungstherapiekurz nach einer Gehirntumorentfernung erleiden, keine guten Kandidatensein, d.h. Empfängerfür dieequine Kollagenfolie der vorliegenden Erfindung sein. Die Strahlungstherapiekann langsam sein oder das Wachstum der Neodura inhibieren, dieaus schnell sich teilenden Zellen besteht, wobei die equine Kollagenfolieresorbiert. In einer derartigen Situation können nicht resorbierbare Er satzDura mater wie Teflon mehr geeignet sein. Ein kundiger Chirurg würde jedochdie Behandlungen erkennen, bei denen ein nicht resorbierbarer Ersatznötig seinwürde.
[0109] DerBegriff "equineKollagenfolie" bedeuteteine Biomatrix (das heißteine Matrix aus einem biokompatiblen Material) von equinen Kollagenfibrillen,die behandelt sind, um zelluläreKomponenten zu entfernen und eine Folie von Kollagenfibrillen zubilden. Der Begriff "equineKollagenfolie" umfasstkeine Verbundfolie aus einer oder mehreren im Wesentlichen nichtporösenFolien von Kollagenfibrillen, die an ein oder mehrere poröse FolienKollagen gebunden sind.
[0110] DerBegriff "Dura mater-Gewebe" bedeutet das autologeDura mater-Gewebe eines Säugers.
[0111] DerBegriff "nicht natürlich vorkommendeBiomatrix" bedeuteteine hergestellte Matrix oder ein Netzwerk, das Kollagenfibrillenumfasst, die aus (1) einem Material, das in der Natur existiert(d.h. natürlichesMaterial), gebildet werden, das derart vorbehandelt oder behandeltwurde, daß dieKollagenfibrillen, die im natürlichenMaterial vorkommen, aus von ihrem natürlich vorkommenden Arrangementinnerhalb der Kollagenstruktur des natürlichen Materials umpositioniertwurden; oder (2) einem Material gebildet wurden, das in der Natur nichtexistiert (d.h. einem nicht natürlichenMaterial), das mit Kollagenfibrillen behandelt oder verarbeitetwurde. Beispielsweise kann eine nicht natürlich vorkommende Biomatrixausgehend von einem Ausgangsmaterial gebildet werden, das Kollagenumfasst, und das mechanisch oder chemisch behandelt wurde (beispielsweise zerkmahlen,zerhackt, etc.). Im Gegensatz dazu, ist eine Kollagenbiomatrix,die aus der Behandlung oder der Verarbeitung von Ausgangsmaterialderart gebildet wurde, die die Struktur des Kollagennetzwerks erhält, nicht einenicht natürlichvorkommende Biomatrix (d.h. ein Epidermisgewebe das behandelt wurde,um zelluläre Komponentenzu entfernen unter Beibehaltung der natürlich vorkommenden Kollagenstruktur).
[0112] "Im wesentlichen nichtporös" bedeutet, daß jeglichePoren, die in einer equinen Kollagenfolie als Resultat der Ausfällung vonKollagenfibrillen vorkommen, zur Bildung von Kollagenlagen primär voneinanderisoliert sind. Poren, die miteinander verbunden werden können, sindnicht derartig untereinander verbunden, daß sie die gesamte Dicke derequinen Kollagenfolie durchziehen. Mechanische Perforationen, dieLöcherin der equinen Kollagenfolie erzeugen, sind keine Poren. Vorzugsweiseerscheint das Material im Wesentlichen frei von Poren zu sein, dieunter einem Rasterelektronenmikroskop bei einer 1500-fachen Vergrößerung vonsichtbar wären.
[0113] Dienachstehenden Beispiele sollen die Erfindung weiter veranschaulichen.
[0114] DiesesBeispiel zeigt die Ergebnisse von Experimenten bei Schafen zur Beurteilungder Eignung einer equinen Kollagenfolie als Dura mater-Ersatz zurVerwendung bei der Reparatur von Dura mater-Gewebe und als Biomatrixfür dieRegeneration von Dura.
[0115] EinExperiment wurde zur Bestimmung der Eigenschaften einer equinenKollagenfolie zur Verwendung als Gehirn-Dura mater-Ersatz durchgeführt, wiees in einem Schafmodellsystem untersucht wurde. Die equine Kollagenfolieumfasst native equine Kollagenfibrillen (5,6 mg/cm²),die von klein geschnittenen equinen Achillessehnen stammen und keinezellulärenKomponenten enthalten.
[0116] Dasverwendete Vergleichsprodukt war eine konservierte menschliche Duraaus Leichen (Tutoplast^® Dura). Beide Produktewurden in ihrer Lage nur unter Verwendung von Fibrinklebstoff befestigt(Tissucol Duo S Immuno, Baxter AG, Wien, Österreich).
[0117] Diefolgenden Punkte wurden untersucht: Makroskopischer Aspekteder Inkorporation der zwei Transplantate; – Reaktionenvon benachbarten Gewebestrukturen (Entzündung, Adhäsion, Fibrose, Nekrose); und – HistologischeBeurteilung des Inkorporationsprozesses und der Bindegewebeorganisation.
[0118] DerReinigungsprozess zur Herstellung der equinen Kollagenfolie beginntmit wenigstens einer Stunde einer Behandlung der Sehne des Sehnenausgangsmaterialsmit Natriumhydroxidlösung,gefolgt von Neutralisierung in Salzsäure. Pepsin wird anschließend zumAufschluß derSehnen verwendet. Das so hergestellte kolloidale Kollagen wird inform von Fibrillen gefällt.Trocknen und Sterilisation mit Gas ergibt anschließend eineequine Kollagenfolie mit 5,6 mg von nativen Kollagenfibrillen proQuadratzentimeter. Es wird nichts weiter zugegeben und es werdenkeine künstlicheMethoden füreine Quervernetzung (d.h. umfassend Chemikalien oder Strahlung)durchgeführt.Immunodiffusionstests stellen sicher, daß keine Fremdproteine vorhandensind.
[0119] DieStudie wurde an 25 erwachsenen Schafen durchgeführt. Die Schafe waren gemischt-gezüchtete domestizierteTiere, die in der Landwirtschaft Verwendung finden. Die Tiere wogendurchschnittlich 53,0 kg zum Zeitpunkt der Operation und ihr Durchschnittsalterbetrug 2 Jahre. Alle Tiere waren weiblich. Die Tiere wurden in demTierstall der Medizinischen Universität Lübeck gehalten, der mit Dachstrukturenausgestattet ist und ein Freilaufgehege umfasst. Den Tieren wurde üblichesgemischtes Futter verabreicht. Die Tiere wurden in Fünfergruppenfür histologischeTests und zur Charakterisierung von verschiedenen Stadien der Transplantatinkorporationeingeteilt (Gruppe 1 bis Gruppe 5). Die Überlebenszeiten pro Gruppebetrugen 2, 4, 8, 16 und 24 Wochen.
[0120] Dieuntersuchte equine Kollagenfolie besteht aus nativen equinen Kollagenfibrilen(typischerweise vom interstitiellen Typ I Kollagen). Ein Quadratzentimeterdes Materials enthält5,6 Milligramm von Kollagenfibrillen bei Abwensenheit zellulärer Komponenten.Das Vergleichsprodukt (Tutoplast^® Dura,Tutogen Medical GmbH, Neunkirchen a. Brand, Deutschland) ist eineDura aus einer menschlichen Leiche, der gegenüber einem Gewebetrennungsprozesskonserviert wurde.
[0121] Fibrinklebstoff,Tissucol Duo S wurde zur Befestigung der Transplantate an die Duramater verwendet. Dieser biologische Zwei-Komponentenkleber bestehtaus einer vorgefülltenSpritze, die menschliche Plasmaproteine, Fibrinogen, GerinnungsfaktorXIII, Plasmafibronectin und Aprotinin enthält und eine weitere vorgefüllte Spritze,die Thrombin und Calciumchlorid enthält.
[0122] DieTiere wurden mit einer intramuskulären Injektion von Xylazinhydrochlorid(Rompun, 2 %, Bayer AG, Leverkusen, Deutschland) vorbehandelt, Dosierungeines Injektionscocktails aus: 0,1 mg pro kg Körpergewicht, (S)-Ketamin (KetanestS, Parke-Davis GmbH, Karlsruhe, Deutschland) Dosierung: 2 mg prokg Körpergewichtund 0,5 g Atropin, 1 ml Injektionslösung (Atropinsulfat Braun 0,5mg, B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland). Ein venöser undarterieller Zugang wurde im rechten Ohr gelegt. Propofol (Disoprivan 2%, AstraZeneca GmbH, Wedel, Deutschland) 1 mg/kg Körpergewichtwurde fürdie Anästhesieverabreicht. Die Tiere wurden endotracheal intubiert (I.D. 7,0 mm)und 100 % Sauerstoff wurde fürdie kontrollierte Normoventilation verabreicht (Sulla 808V Anästhesieventilator,Dräger,Lübeck,Deutschland).
[0123] Propofol,(S)-Ketamin und Sevofluran wurden verabreicht um eine ausgeglicheneAnästhesiebeizubehalten. Die Verhältnissedes Drucks und der Volumen innerhalb des Atmungszyklus, der eingeatmetenSauerstofftraktion (Oxydig, Dräger,Lübeck,Deutschland), endexpiratorische Kohlenhydratkonzentration (Kapnodig,Dräger,Lü beck,Deutschland), ein Elektrokardiogramm und invasiver Arterienblutdruckwurden während derOperation verfolgt.
[0124] Direktvor der Operation erhielt jedes Tier eine intravenöse Dosisvon 2,0 g Cefazolin (Basocef 2,0 g, Curasan AG, Kleinostheim, Deutschland).Antibiotische Prophylaxe wurde fürweitere 4 Tage postoperativ durch zwei subkutane Dosen eines Depotproduktes,Strepdipen-Suspension beibehalten (1,0 ml enthält 100.000 IU Benzylpenicillinbenzathinund 100.000 IU Dihydrostreptomycinsulfat; Dosierung 1,0 ml pro kgKörpergewicht).Die subkutanen Injektionen wurden sofort nach Vervollständigungdes Verfahrens verabreicht und erneut 48 Stunden später.
[0125] Dasschon intubierte Tier wurde in die linke laterale Position gebracht.Der Kopf wurde anschließend nachrechts gedreht und in einer horizontalen Position durch Befestigenam Operationstisch gehalten. Anschließend wurde der Schädel rasiert,die Haut wurde mit Petroleum entfettet und anschließend desinfiziert. Einsteriles Blatt mit einer Öffnung,die den zu operierenden Bereich exponierte, wurde befestigt unddas gesamte Tier wurde mit sterilen Tüchern bedeckt.
[0126] Dieerste Hautinzision wurde 1,5 cm zur Linken der Mittellinie gemachtund erstreckte sich ungefähr über 6 cm.Jegliches Bluten von dem Skalp wurde unter Verwendung von bipolarenPinzette koaguliert. Ein Retraktor wurde angewendet und der Schädelknochenwurde in der temporoparietalen Region durch Zurückziehen und Aufweiten derGalea aponeurotica exponiert. Zwei Löcher (0,8 cm im Durchmesser),die ungefähr 5cm voneinander entfernt waren, wurden anschließend unter Verwendung einesmanuell betriebenen Bohrers gebohrt. Eine Säge (Mikrotom, Aesculap, Melsungen,Deutschland) wurde anschließenddazu verwendet, um eine longitudinale ovale Scheibe des Knochensvom Schädelzwischen den Löchernzu entfernen.
[0127] JeglichesBluten des Schädelwurde unter Verwendung von Knochenwachs gestoppt. Ein Skalpell wurdezur Durchführungeiner Inzision in der Dura mit ungefähr 0,5 cm Länge verwendet. Anschließend wurdenDurascheren verwendet, um ein ovales Teil der Dura mater bis ungefähr 3×2 cm Maß entlangdem Knochenrad zu schneiden. Es wurde besonders darauf geachtet,daß diearachnoide Mater nicht verletzt wurde. Ein hämostyptisches Mittel, TachoComb^® (NycomedAustria GmbH, Linz, Österreich)wurde verwendet, um das Bluten von Dura-Blutgefäßen zu vermeiden.
[0128] Einovales Teil der equinen Kollagenfolie (3,5×2,5 cm messend) wurde anschließend zurechtgeschnittenund für5 Minuten in sterile 0,9 % physiologische Kochsalzlösung gelegt.Um den Schaden zu beheben, wurde die equine Kollagenfolie unterhalbder Dura mater-Ränderausgebreitet und mit Fibrinklebstoff punktförmig festgeklemmt, um es amPlatz zu halten. Siehe 7.
[0129] DieSchädelscheibewurde anschließendwieder befestigt unter Verwendung von zwei Miniplatten (Bioplates,Codman, Norderstedt, Deutschland). Die Galea wurde unter Verwendungvon absorbierbaren Nähten (Vicryl2,0) geschlossen und die Haut wurde mit Ethilon 3,0 genäht.
[0130] DasTutoplast^® DuraProdukt wurde in ähnlicherWeise am rechten Teil des Schädelsverwendet. Siehe 8.Beide Wunden wurden schließlichmit einem Sprayon Dressing behandelt (Hansaplast Sprühpflaster, BeiersdorfAG, Hamburg, Deutschland).
[0131] DieDurchschnittsoperationszeit betrug 120 Minuten. Die Durchschnittszeitdauervon Beginn der Anästhesiebis zum Beginn der Operation betrug ungefähr 60 Minuten und die Durchschnittszeitvom Ende des Nähensbis zum Ende der Anästhesiebetrug 5 bis 10 Minuten.
[0132] DieTiere wurden in ihren Stall ungefähr 30 Minuten nach Extubierungzurückgeführt. Siewurden in regelmäßigen Intervallenvom Chirurgen, dem Veterinärund Tierpflegern auf Entzündungszeichenoder neurologische Abnormitätenhin untersucht. Die Tiere wurden acht Tage nach der Operation inihr Freilaufgehege gelassen.
[0133] DieTiere wurden fürVersuchszwecke bei vordefinierten Überlebenszeiten von 2, 4, 8,16 und 24 Wochen nach der Operation getötet.
[0134] Bevordie Tiere getötetwurden, wurden sie durch eine intramuskuläre Injektion von 1 mg pro kgKörpergewichtmit Rompun 2 % sediert. Ein Elektrokardiogramm-(ECG)-monitor wurde angeschlossenund es wurde ein venöserund arterieller Zugang im rechten Ohr gelegt. Die stark sediertenTiere wurden anschließenddurch intravenöseInjektion von T-61^® (Hoechst, Roussel Vet,Somerville, New Jersey) getötet;1 ml Injektionslösungenthielt 0,2 g Embutramid, 0,05 g Mebezoniumiodid und 0,005 g Tetracainhydrochlorid;die Dosierung betrug 0,3 ml pro kg Körpergewicht. Das Verfahrenwurde durch EKG und durch Messen des arteriellen Drucks verfolgt.
[0135] DenTieren wurden die Köpferasiert und wie vorgeschrieben fürdie Operationsprozedur positioniert. Eine zirkuläre Inzision, die ungefähr 9 cmim Durchmesser betrug, wurde in die Haut um die zwei Operationsnarbengelegt. Die Galea aponeurotica wurde zurückgezogen um einen großen Teildes Schädelbereichszu exponieren und ein Loch wurde in die rechte frontale Region gebohrt.Eine runde Schädelscheibe,die ungefähr 8cm maß wurdemit einer Sägeentfernt. Die gesamte Transplantatregion, bestehend aus Knochen,Dura und cerebraler Parenchymie wurde durch Schneiden entlang derGrenze des Knochens mit einem Skalpell zugeschnitten. Die Dura undGehirngewebe wurden anschließendsorgfältigvon dem darüberliegendenKnochen getrennt und in Formalin für die histologische Aufbereitungfixiert. Die Transplantatprobe maß ungefähr 7 cm im Durchmesser.
[0136] DieTransplantatproben wurden makroskopisch untersucht und in Frontalschnittegeteilt. Die zwei Operationsstellen wurden gleichzeitig präpariert.Fünf Sektionen,die ungefähr2 bis 3 μmdick waren, wurden von jeder Probe genommen.
[0137] Standardfärbemethodenwurden verwendet, um die Änderungenzu beurteilen und umfassten Hämatoxylineosinfür diezellulärenKomponenten, Elastica van Gieson für mesenchymale Strukturen,Trichrom für mesenchymaleStrukturen und zur Beurteilung der Kollagenfaserneogenese und einEisenfärbungzur Bestimmung des Ausmaßesdes Blutens.
[0138] Anästhesie,Operation und die nachoperative Folgeperiode verlief bei allen mitAusnahme von zwei Tieren ereignislos. Ein Tier starb während derEinleitung der Anästhesieals Resultat von therapierefraktärer HerzArrhythmie. Ein weiteres Tier starb plötzlich und unerwarteterweise14 Tage nach der Operation im Nachgang zu dem was ein unvorhergesehenerpostoperativer Verlauf war. Die mikroskopische Untersuchung des Gehirnszeigte eine extensive Kortex-Nekrose mit Hinweisen auf Narbenbildung.Der wahrscheinlichste Grund des Todes ist daher die lang andauerndecerebrale Ischämiemit unbekannter Etiologie.
[0139] Esgab sehr wenige intraoperative Blutungen die mild verliefen undin den meisten Fällenvon kleinen Blutgefäßen derDura mater stammten. Das Bluten wurde schnell unter Kontrolle gebrachtunter Verwendung von biopolarem Pinzetten oder hämostyptischen Wirkstoffen.
[0140] Keinesder Tiere zeigte neurologische Abnormalitäten während der postoperativen Nachverfolgung. Gleicherweisezeigte keines der Tiere Zeichen von Entzündung, cerebrospinalem Flüssigkeitsauslaufenoder bereinträchtigterWundheilung.
[0141] Dienachstehenden Parameter wurden untersucht und während der Entfernung der Probenvon den Operationsstellen quantifiziert: – Bildungvon Adhäsionenzwischen dem Schädelund der Dura; – Auslaufender cerebrospinalen Flüssigkeitund Entzündungsänderungen; – sichtbareVeränderungder Dura-Transplantate; und – meningocorticaleAdhäsionenund corticale Reaktion.
[0142] Diehistologischen Schnitte wurden systematisch in Bezug auf die nachstehendenParameter untersucht: – Beschreibung und Quantifizierungvon Entzündungsreaktionenan der Transplantationsstelle (epidural, subdural, Übergangszonezwischen Dura und Transplantat); – Ausmaß der Bindegewebsorganisationdes Transplantats; – Ausmaß der Fremdkörperreaktion; – Änderungim Subarachnoidalraum (Entzündungsprozesse,Fibrosen gegenüberoffenem Subarachnoidalraum); und – Änderungim Kortex (Entzündung,Nekrose).
[0143] Diehistologischen Ergebnisse, wie sie nachstehend beschrieben sind,sind in Bezug auf die zelluläre Zusammensetzungidentisch, währendsie jedoch in Bezug auf ihre Intensität, bei verschiedenen Frontalschnittendes gleichen Tieres und bei allen Tieren der gleichen Gruppe variieren.
[0144] DasEntfernen der Schädeldeckenach einem Zeitraum von zwei Wochen offenbarte minimale bilateraleAdhäsionenzwischen den Fibrinklebstoffrückständen unddem darüberliegendenKnochen. Die Adhäsionenkönnenleicht gelöstwerden. Es gab keine Anzeichen von Entzündung oder Auslaufen der cerebrospinalenFlüssigkeitbei irgendeiner Dura-Transplantatstelle. Beide Transplantate warenmit individuellen Blutgerinnseln, die wenige Millimeter im Durchmessermaßen,befleckt.
[0145] Inder linken Hemisphäreist die equine Kollagenfolie noch in Umrissen als solche erkennbarund scheint weniger transparent zu sein als ihr ursprünglichesAussehen wie gestoßenesGlas. Das Kollagenprodukt behältseine Befestigung an den Dura-Rändern bei,wenn die Dura sorgfältigvon der Kortex hochgehoben wird. Es gibt wenige sehr leichte Adhäsionen wenndie Dura vom Kortex abgehoben wird, die sehr leicht entfernt werdenkönnen,ohne den Kortex zu beschädigen.
[0146] DieTutoplast^® Durain der rechten Hemisphäreist fürdas unbewehrte Auge unverändert.Die Tutoplast^® Durawird an Stellen in der transplantatduralen Kontaktzone abgelöst, wenndas Produkt entfernt wird. Es gibt wenige subarachnoidale Adhäsionen,wenn die Dura vom Kortex abgehoben wird, aber sie werden leichtmit Pinzetten entfernt.
[0147] VierWochen nach der Operation gibt es immer noch einige wenige Adhäsionen zwischenden Ränderndes darüberliegendenKnochens und der darunterliegenden Dura; dies liegt an den Fibrinklebstoffresten. DerKnochen wird leicht von der Dura mater ohne Anhaften entfernt undverursacht keine Schädenan der Dura oder am Transplantat. Im equinen Kollagenfoliebereichin der linken Hemisphäre,ist die Demarkationszone zwischen der Dura mater und dem Transplantatnicht längeroffensichtlich. Das Transplantat ist weniger transparent als vorherund hat eine fahle rote Farbe angenommen. Der Aspekt des Transplantats,der der Gehirnoberflächegegenüberliegt,ist homogen, weich und mobil. Die subduralen Adhäsionen sind nicht länger vorhanden.Wenige Blutgerinnselreste sind sichtbar.
[0148] DieTutoplast^® Duraerscheint wiederum fürdas unbewährteAuge unverändert.Die Untersuchung des Kontaktgebiets zwischen dem Transplantat undder Dura offenbart eine inadäquate,leicht zu entfernende Befestigung.
[0149] AchtWochen nach der Operation ist die Übergangszone zwischen der Duraund dem equinen Kollagenfolietransplantat der linken Hemisphäre nichtlängervorhanden. Die strukturelle Kontinuität ist auf beiden Seiten derMeninx offensichtlich. Das Gebiet, wo die equine Kollagenfolie platziertwurde, ist anscheinend nur als eine leicht dünnere Membran mit einer leichtrötlichenErscheinung ersichtlich. Siehe die 9 und 10. Das Tutoplast^® Dura-Transplantatin der rechen Hemisphäreist zu dieser Zeit auf beiden Seiten von einer dünnen Bindegewebsmembran bedeckt.Siehe 11. Die Kantendes Transplantats sind noch klar sichtbar unterhalb der überlappendenDura. Ein leichter Zug an der Tutoplast^® Duraist ausreichend, um sie von der vorgeformten Dura zu entfernen.
[0150] Nach16 Wochen ist die Bildung der Neodura an der Stelle der equinenKollagenfolie weiter fortgeschritten und die Dura und die Neodurasind kaum voneinander unterscheidbar.
[0151] DieBindegewebeinkapselung des Tutoplast^® Dura-Transplantatsin der rechten Hemisphärewar noch ausgeprägter.
[0152] Nacheiner Periode von 24 Wochen unterscheiden sich die Sektionen derbeiden Transplantatstellen makroskopisch nicht von denjenigen dervorhergehenden Gruppe.
[0153] ZweiWochen nach der Operation offenbart die equine Kollagenfolientransplantatstellewie erwartet extensive Gebiete, die sich entzündet hatten. Der gesamte subarachnoidaleBereich ist durch Adhäsionengeschlossen, die von der ausgiebigen Exsudation von Lymphozyten,segmentierten Granulozyten und Makrophagen stammen. Einige Gebieteder sehr extensiven entzündlichenExsudation sind ebenfalls oberhalb des Transplantats ersichtlich.Außerden Lymphozyten- und Monozyten-Komponenten gibt es ebenfalls kleineKnochensplitter mit entsprechenden Fremdkörperreaktionen durch die polynuklearenGigantenzellen.
[0154] Dasequine Kollagenfolientransplantat zeigt selbst die Lockerung homogenerStrukturen und die Invasion von Entzündungszellen, herzförmig oderextensiv auf. Siehe 12.In wenigen Fällengibt es eine (operationsbezogene) ischämische Nekrose von Oberflächengebietendes cerebralen Kortex.
[0155] DieTutoplast^® Duraprobezeigt ebenfalls eine extensive Entzündungsantwort, insbesondereim Subarachnoidalraum. Das Transplantat wird nicht durch Entzündungszelleninfiltriert, sondern Entzündungslymphozytenund Monozyten und Fremdkörperreaktionensind an beiden Enden identifizierbar.
[0156] Nacheiner Periode von vier Wochen regredierten die Entzündungsänderungender equinen Kollagenfolietransplantatstelle beträchtlich, aber rasenähnlicheLymphozyten Monozyten-Exsudate sind noch vorhanden. Siehe 13 und 14. Polynukleare Fremdkörpergigantenzellensind verbreiteter, insbesondere in der Nähe von Knochensplittern. ZahlreicheFibroblasten könneninnerhalb des ursprünglichenequinen Kollagenfolientransplantat gesehen werden. Die typischenhomogenen Strukturen des Transplantats sind in den HE-Schnitten(Hematoxillin-Eosin-Färbung)nicht nachweisbar. Die Proben, die mit EVG (Elastica van Gieson) undTrichrom gefärbtwurden, zeigen eine extensive Neogenese von Kollagenfasern an dervorherigen Transplantatstelle. Die tatsächliche Dura mater gibt langsamden Weg frei fürschwach strukturiertes Gewebe, das aus neu geformten Kollagenfibrillenbesteht, die eine entzündlicheInfiltration zeigen. Die vorher beobachtete entzündliche Adhäsion der Leptomeningen istnicht längervorhanden. Der Subarachnoidalraum ist wieder vorhanden, und hinterlässt eineSpalte. Die Pia mater zeigt an einigen Stellen weiterhin kleineKörnchenvon Lymphozyten-Monozyten-Infiltrationen.
[0157] Esgibt keine Anzeichen von Bindegewebeorganisation an der Tutoplast^® Durastelle.Die Entzündungsexsudationist oberhalb und unterhalb des implantierten Gewebes vorhanden undentzündlicheInfiltrate sind in der Übergangszoneder vorgeformten Dura vorhanden. Der Subarachnoidalraum ist nachweisbarund vorhanden. Siehe 15.
[0158] AchtWochen nach der Operation haben in der equinen Kollagenfoliengruppedie entzündlichenProzesse in der Neodura weiter abgenommen. Nur kleine Cluster vonLymphozyten- und Monozyten-Infiltrationen sind noch vorhanden. DerSubarachnoidalraum ist klar und wieder sind nur kleine Foci derEntzündungsaktivität vorhanden.Die mit EVG und Trichrom gefärbtenStellen zeigen eine ausgeprägteKontinuitätzwischen der hochKollagenen endogenen Dura und den neu gebildetenKollagenfa sern der Neodura. Diese neue Membran scheint in ihrerDicke zu variieren und zeigt in Teilen strukturelle Aufweichung.Siehe 16.
[0159] DieEntzündungsaktivität wurdeebenso in der Tutoplast^® Durastelle aufgeklärt. DieInkorporation in der benachbarten Dura ist an den Stellen abwesendund bei anderen gibt es Zeichen der entzündlichen Infiltration und Adhäsion mitder benachbarten Dura.
[0160] Inder equinen Kollagenfoliengruppe sind noch nach 16 Wochen Clustervon Lymphozyten- und Monozyten-nodularer entzündlicher Infiltraten sichtbar.Die Kontinuitätzwischen der hochKollagenen tatsächlichenDura und der Neodura bleibt unverändert mit Strukturen, die keinegrößeren Änderungengegenüberden Funden bei 8 Wochen zeigten. Die Kollagenfasern mit verschiedenerDicke sind vorhanden, mit einigen strukturellen Aufweichungen angewissen Stellen.
[0161] DieTutoplast^® Durastellezeigt wieder entzündliche Änderungenund Adhäsionenmit der umgebenden Dura; diese Befunde variieren ihrer Intensität.
[0162] Nach24 Wochen sind in der equinen Kollagenfoliegruppe von weiterer Regressionder zellulärenEntzündungsantwortabgesehen keine weiteren relevanten histologischen Unterschiedezu dem Transplantat im Inkorporationsstadium bei 16 Wochen erkennbar.Siehe 17.
[0163] Quantifizierungder Entzündungsantwort,der Bindegewebsorganisation und des Ausmaßes der Fremdkörperreaktionin den Transplantatstellen und der subduralen und epiduralen Bereichesind nachstehend in Tabelle 1 angegeben.Tabelle1 : Untersuchung von Transplantaten, Sub-/Epiduralraum
[0164] Diehistologischen Untersuchungsergebnisse des Subarachnoidalraum anbeiden Transplantatstellen sind in der nachstehenden Tabelle 2 angegeben.Tabelle2 : Untersuchung des Subarachnoidalraum (SAS)
[0165] Beurteilungder chirurgischen Verfahren und die Handhabung beider TransplantateDie equine Kollagenfolie war durch problemfreie intraoperativesHandhabung charakterisiert. Die Rehydriatisierung in physiologischerSalzlösung über 5 Minutenproduzierte einen extrem harten, ungefähr 2 mm dicken Film, der seine Formnicht verlor und nicht konglutinierte und einfach in Form zu schneidenwar. Das Material war im Dura-Schaden einfach in Position zu bringenunter Verwendung von Pinzetten und einen Operationshaken. Aufgrundseiner Mobilität,war es ebenfalls einfach, die Position der equinen Kollagenfolieauf der Gehirnoberflächevor ihrer Fixierung zu korrigieren. Es war nicht erforderlich, denFilm zu nähen,weil das Transplantat schnell und einfach an die Dura-Grenze unterVerwendung von fibrinalen Klebstoff befestigt wurde. VorhergehendeStudien hatten ebenfalls gezeigt, daß Fibrinklebstoff ein verlässlichesVersiegelungsmittel fürden Dura-Verschluß ist.
[0166] Experimentellverabreichte Haltenähte,die sich von der equinen Kollagenfolie bei leichtestem Zug ablösten, zeigten,daß Fibrinklebstoffein zuverläßiges Versiegelungsmitttelzum Verschluß derDura ist.
[0167] Sobalddie Produkte späterentfernt wurden, gab es in einigen Fällen Hinweise, daß eine zueinfache Anwendung des Fibrinklebstoffs zur Adhäsion an gewissen Stellen mitdem darüberliegendenKnochen führte. DieAdhäsionenmussten sorgfältigmit einem Skalpell entfernt werden, um Zug an den Meningen und amKortex zu verhindern. Dieses Problem wurde vermieden, indem geringeMengen bzw. nur in Tropfenmengen des Fibrinklebstoffs aufgebrachtoder aufgetropft wurden. Als die Produkte entfernt wurden, war esklar, daß die Anwendungvon Fibrinklebstoff einen sicheren Dura-Verschluß erzeugt und das Auslaufender cerebrospinalen Flüssigkeitverhindert. Dies war schon nach 2 Wochen nach der Operation offensichtlich,als keines der Tiere subkutane CSF-Leckage der cerebrospinalen Flüssigkeitsfistulaeentwickelte.
[0168] DasTutoplast^® Dura-Produktist ebenfalls einfach handhabbar nach einer kurzen Rehydratisierungszeitvon mehreren Minuten, es ist aber sehr widerstandsfähig undzeigt eine großeFluktuation in Bezug auf sein Kaliber auf.
[0169] Fibrinklebstofferzeugt eine angemessene Adhäsionum die Tutoplast^® Dura zunächst ander Stelle zu halten, aber die Verbindung zwischen der ursprünglichenDura und dem Transplantat war lösen,als die Operationsstelle wieder geöffnet wurde. Die war noch derFall nach 24 Wochen nach der Operation aufgrund der Tatsache, daß die Tutoplast^® Duraselber nicht mit der autologen Dura mater verschmolz. Das Verfahrendieses Transplantats mit individuellen Suturen zu befestigen erscheintdaher gegenüberder Verwendung von Fibrinklebstoff besser zu sein, da die Beobachtungendarauf hinweisen, daß ansonsteneine adäquateInkorporation nicht stattfinden wird. Es gab sehr wenige Adhäsionen inder Übergangszonezwischen der Tutoplast^® Dura und dem Kortex,die einfach unter Verwendung eines Dissektors zu lösen waren.
[0170] DieTechnik die zur Insertion der equinen Kollagenfolie zwischen derDura und dem Kortex verwendet wurde, ist wahrscheinlich ungeeignetfür bestimmteOperationssi tuationen. Insbesondere ist eine adäquate Befestigung mit dieserMethode bei Verfahren, die großeDefekte der cerebralen Parenchymie beinhalten, beispielsweise Tumorkavitäten unwahrscheinlich.
[0171] Immakroskopischen Bereich zeigten alle Tiere einen verlässlichenVerschluß derDura-Schädenohne Transplantatabstoßungsreaktion.Kleine Adhäsionenzwischen dem Implantat und den corticalen Strukturen entwickeltensich in wenigen Fällen,wahrscheinlich aufgrund von geringen Verletzungen der arachnoidenMater währendder Operation. Ein zu großzügiger Gebrauchdes Fibrinklebstoffs resultierte bei einigen Tieren in kleinen Gebietenvon Adhäsionenmit dem darüberliegendenKnochen, die jedoch einfach gelöstwerden konnten.
[0172] Histologischgesehen wurde eine dichte Infiltration der equinen Kollagenfoliemit Lymphozyten, Makrophagen und Fibroblasten 14 Tage nach Implantationbeobachtet. Die Kapillaren bildeten sich in dem Transplantat später. Damiteinhergehende Entzündungsänderungenin dem Subarachnoidal- und Subdural-/Epiduralraum und in der Dura-Transplantatübergangszonegingen schon nach gerade 4 Wochen nach der Operation gut zurück. Einkontinuierlicher Übergangzwischen dem equinen Kollagenfolientransplantat und der umgebendenDura aufgrund der Neogenese von Kollagenfasern ist ebenfalls zudieser Zeit beobachtbar.
[0173] DieseNeodura, die mit der equinen Kollagenfolie induziert wurde, istnicht so dick wie die ursprünglicheDura in der postoperativen Woche 24, wahrscheinlich weil die Duramater-Folie von vorne herein nur eine gewisse Dicke gestattet. Esist jedoch möglich,daß dieserUnterschied am Beginn verschwindet, wenn mehr Kollagenfasern erzeugtwurden.
[0174] ZweiWochen nach der Operation zeigten die Tutoplast^® Duramakroskopisch sichtbare Einkapselung des Produkts in einer dünnen Schichtvon Bindegewebe, das im Laufe der Zeit dicker wird. Wiederum zeigen alleTiere einen akzeptablen Dura-Verschluß ohne CSF-Fistulae,und es waren wenige Adhäsionenzwischen dem Transplantat und der Kortex oder dem Knochen vorhanden.
[0175] Trotz ähnlicherEntzündungsreaktionenin den Strukturen, die das Transplantat umgeben, gibt es keine Anzeichenvon postoperativen Organisationsverfahren und wenig Beweise für zelluläre Infiltrationund Revitalisierung des Transplantats.
[0176] Keinesder Tiere entwickelte neurologische Abnormalitäten oder Wundinfektionen, abgesehenvon einer beabsichtigten lokal eingegrenzten Lymphozyten- und Monozyten-Entzündungsantwort.
[0177] DieUntersuchungen bezüglichder Schwellkapazitätder equinen Kollagenfolie wurden wie nachstehend durchgeführt: 1) Die equine Kollagenfolie wurde zuerst in1 cm2 quadratische Stückegeschnitten. 2) Proben dieser geschnittenen Stücke wurden unter einem üblichenRasterelektronenmikroskop untersucht zur Bestimmung von größerer morphologischerKonsistenz und der Dicke des Materials als Referenz für die Schwellverfahren. 3) Diese Stückewurden anschließendin Plastikulturschalen gegeben. 4) Die Kapazitätder Flüssigkeitsaufnahmeund der Schwellungskapazitätwurde anschließenddurch nachfolgende Titration mit physiologischer Salzlösung untersucht,die unter Verwendung von graduell größer werdenden Mengen von Flüssigkeit,beginnend mit 10 μl/cm2bis zu 150 μl/cm2(siehe Tabelle 3) mit Eppendorf-Mikropipetten verabreicht wurdyen.
[0178] DieMenge der Flüssigkeit,die von der equinen Kollagenfolie aufgenommen wurde, wurde nach1, 2 und 3 Stunden wie vorstehend angegeben bestimmt.
[0179] EinStück desequinen Kollagenfoliematerials, das 1 cm2 maß, absorbierte 10 μl einer physiologischen Kochsalzlösung, ohneein signifikant sichtbares Schwellen in Bezug auf die Dicke zu zeigen.
[0180] EineMenge von 20 μlder physiologischen Kochsalzlösungwurde vollständigdurch das 1 cm2 große Stück der equinenKollagenfolie absorbiert und führtezu einer leichten Zunahme de Dicke des Materials.
[0181] Nureine minimale Zunahme der equinen Kollagenfoliedicke wurde in dergesamten Serie beobachtet. Es wurde geschätzt, daß die Maximaldickenzunahmeungefährdas Doppelte des ursprünglichenVolumens beträgt,selbst nach 3 Stunden.
[0182] Eswurde keine signifikante Zunahme in der Dicke oder Absorption derFlüssigkeitnach der ersten Stunde beobachtet.
[0183] Siebentrockene Stückeder equinen Kollagenfolie, die 1,0 cm² maßen, wurden über 1 Stundein isotonischem Natriumchlorid hydratisiert. Die Durchschnittslängenzunahme,die aufgrund der Hydratisierung von trockenen Teilen der equinenKollagenfolie resultierte, betrug ungefähr 3,4 Prozent. Tabelle4
[0184] Siebentrockene Stückeder equinen Kollagenfolie, die 1,0 cm² maßen, wurdenin isotonischen Natriumchlorid über1 Stunde hydratisiert. Die hydratisierten Stücke der der equinen Kollagenfoliewogen ungefähr fünfmal mehrals im trockenen Stadium. Tabelle5
[0185] DieZugfestigkeit von mehreren Dura mater-Produkten und der equinenKollagenfolie der vorliegenden Erfindung wurde gemessen. Die Beispielewurden am unteren Ende eines Röhrchensmontiert und die Zugfestigkeit wurde durch eine kontinuierlich höher werdendeWassersäulebis zu einem Maximum von 300 cm erhöht. 18 zeigt eine Illustration der Testkammer.
[0186] DieTestkammer war in der Lage, die Stärke des Dura mater-Ersatzproduktszu bestimmen durch die Identifikation des Punktes, bei dem Produktaufgrund des Drucks, der die Produktfestigkeit überschritt versagen würde. Dieequine Kollagenfolie (Kollagengehalt: 5,6 mg/cm²)der vorliegenden Erfindung und eine Kollagenfolie (Kollagengehalt:4,0 mg/cm²) wurde mit Duragen (Integra NeuroSciences,Plainsboro, NJ) verglichen.
[0187] DieTestergebnisse zeigten, daß dieequine Kollagenfolie (Kollagengehalt: 5,6 mg/cm²)und die Kollagenfolie (Kollagengehalt: 4,0 mg/cm²)einer 300 cm SäuleWasser ohne Versagen standhielt. Siehe 19 und 20.Verglichen damit überschreitetder Druck der in einem gesunden Schädel ausgeübt wird nicht mehr als ungefähr eine15 cm hohe Wassersäule;unter pathologischen Bedingungen kann sich der Druck bis zu ungefähr 50 cmerhöhen.
[0188] DuraGenwies eine signifikant niedere Zugfestigkeit auf, und platzte unterdem Druck einer 200 cm hohen Wassersäule. Siehe 21.
[0189] DieTestkammer war ebenso in der Lage die Elastizität der Produkte durch Identifikationdes Ausmaßeszu vergleichen, bei dem sich das Produkt unter dem Druck streckenwürde.Die Elastizität/Flexibilität eines Produkteswurde daher durch die Messung der Wölbung des Produkts unter demGewicht der Wassersäule bestimmt.
[0190] DieElastizität/Flexibilität der equinenKollagenfolie (Kollagengehalt: 5,6 mg/cm²)und der Kollagenfolie (Kollagengehalt: 4,0 mg/cm²)wurden mit DuraGen, einer Kollagentestfolie, Tutoplast Fascia lata(Tutogen, Medical GmbH, Neunkirchen am Brand, Deutschland) und EthisorbDura Patch (Ethicon GmbH & Co.KG, Norderstedt, Deutschland) verglichen. Siehe 22:25.
[0191] ImVergleich zu anderen Produkten zeigte die equine Kollagenfolie (Kollagengehalt:5,6 mg/cm²) eine Mischung der signifikantenZugfestigkeit gekoppelt mit Elastizität/Flexibilität. Dieserlaubt ihr dem Druck der auf sie ausgeübt wird als ein Dura mater-Ersatzzu widerstehen und trotzdem flexibel und elastisch zu bleiben undihr zu ermöglichen,die Konturen des Gehirns und des Schädels nachzumodellieren. ImGegensatz dazu, zeigten Ethisorb und Tutoplast eine hohe Zugfestigkeit,besaß aberim Wassersäulenexperimenteine deutlich geringere Elastizität/Flexibilität.
[0192] DieMessungen der Flüssigkeitsdichtigkeitseigenschaftender Ersatz-Dura mater Produkte wurden unter Verwendung des gleichenexperimentellen Aufbaus, wie in Beispiel 5 diskutiert, bestimmt.
[0193] Indiesem Experiment wurde die Entwicklung von Wassertropfen und dasVolumen des verlorenen Wassers in Bezug auf die Höhe der Wassersäule gemessen.Die Ergebnisse dieses Experiments sind in den 23 bis 26 veranschaulicht.
[0194] Indiesem Experiment blieb die equine Kollagenfolie (Kollagengehalt:5,6 mg/cm²) flüssigkeitsdicht, selbst untereiner mehr als 300 cm hohen Wassersäule. Die Kollagenfolie (Kollagengehalt:4,0 mg/cm²) zeigte einen Verlust von feinenWassertröpfchenbei einer 300 cm hohen Wassersäule.Da es eine poröseStruktur aufweist, war DuraGen nicht wasserdicht, sondern zeigteselbst unter niedrigen Wasserdrückenklar einen sichtbaren Verlust an Wasser. In gleicher Weise war dieTutoplast Fascia lata ebenfalls nicht wasserdicht, und zeigte einenWasserverlust unter niedrigen Drücken.
[0195] NurMaterialien die hinreichend stabil, elastisch und reißwiderstandsfähig in feuchtenund trockenen Umgebungen sind, sind als Implantate in speziellenOperationssituationen geeignet, wie beispielsweise Ersatze für Dura mater.Die Bestimmung der Reißwiderstandsfähigkeit/höchste Zugfestigkeitdes feuchten Materials liefert daher eine wertvolle Informationin Bezug auf Struktur, Stabilitätund die Wahrscheinlichkeit des Verbleibens an der Stelle der Operationsstelle.
[0196] DieReißwiderstandsfähigkeitder Kollagenen Operationsimplantate wurde an hydratierten Probengetestet, um die Bedingungen, die im Körper vorherrschen zu imitieren.Die Materialien wurden anschließendin physiologische Kochsalzlösungfür fünf Minutengelegt.
[0197] ZurMessung der Reißfestigkeit/höchste Zugkraftwurden Streifen des Kollagenen Implantats in einem Zwick Modell1120 All-Purpose Testing Machine (Zwick GmbH & Co. KG, Ulm, Deutschland) festgeklammert. Diegetesteten Kollagenen Implantate sind in Tabelle 6 angegeben: Tabelle6 : Kollagene Implantate
[0198] DieMaschinenkontrolle, die Datenaufnahme und das Testen einschließlich derstatistischen Beurteilung wurden unter Verwendung der TextExpertSoftware (Zwick GmbH & Co.KG, Ulm, Deutschland) durchgeführt.TestschwammstückeA, B und C schienen reichlich fragil zu sein. Die Proben A, B undC wurden in 4 cm Streifen mit einer Breite von 1,4 cm geschnitten.Die Testergebnisse aller dieser Proben wurden proportional für einenStreifen von 1,0 cm Breite berechnet. Die höchsten Zugkraftwerte der Teststreifenwurden in Newton/cm-Streifen gemessen. Die Testergebnisse sind inTabelle 7 und 27 angegeben.
[0199] Tabelle7 : Reißwiderstandsfähigkeit/Zugkraft
[0200] Dieeinzigartige Herstellungsmethode der equinen Kollagenfolie erhöht ihreReißwiderstandsfähigkeit/höchste Zugkraft.
[0201] KollageneFolien zeigten eine signifikant höhere Zugwiderstandsfähigkeit/höchste Zugkraftverglichen mit Kollagenen Schwämmen.
[0202] DieZugwiderstandsfähigkeitvon Kollagenen Folien nahm mit dem Kollagengehalt pro Quadratzentimeterzu (beispielsweise Kollagengehalt 4,0 mg/cm²:3,21 N/cm-Streifen;Kollagengehalt 5,6 mg/cm²: 4,09 N/cm-Streifen).
[0203] InAnbetracht des vorstehend gesagten ist ersichtlich, daß mehrereZiele der Erfindung erreicht worden sind.
[0204] Daverschiedenen Veränderungenin den vorstehenden Zusammensetzungen und Verfahren vorgenommenwerden könnenohne vom Schutzbereich der Erfindung abzuweichen, ist beabsichtigt,daß alleGegenständein der vorstehenden Beschreibung als veranschaulichend und nichtals beschränkendinterpretiert werden sollen.
[0205] InBezug auf die Verwendung der Worte "umfassen" oder "umfasst" oder "umfassend" in der gesamten Beschreibung (einschließlich dienachstehenden Ansprüche)stellen die Anmelder fest, dass, sofern der Kontext nicht andereserfordert, diese Begriffe auf der Grundlage und des klaren Verständnissesverwendet werden, daß sieeinschließendund nicht in einem ausschließlichemSinn interpretiert werden sollen und daß die Anmelder beabsichtigen,daß jedesdieser Worte in Bezug auf die gesamte Beschreibung interpretiertwerden soll.

权利要求:
Claims (27)
[1] Verwendung einer equinen Kollagen Folie umfassendeine nicht natürlichvorkommende Biomatrix equiner Kollagenfibrillen, die weder durchChemikalien noch durch Bestrahlung quervernetzt sind, wobei dieBiomatrix im wesentlichen nicht-porös ist und im wesentlichen ausazellulärenKomponeneten besteht, wobei diese Komponenten Bindegewebsproteineumfassen, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Reparatur undRegeneration von Dura mater-Gewebebei einem Säugerdurch das In-Kontakt-bringen des Dura mater-Gewebes mit der Folie.
[2] Verwendung nach Anspruch 1, wobei die equine KollagenFolie mehrere Schichten Kollagenfibrillen umfasst.
[3] Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die equinenKollagenfibrillen aus Sehnen stammen.
[4] Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Sehnen Achillessehnensind.
[5] Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobeidie equine Kollagenfolie resorbierbar ist.
[6] Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobeidas Dura mater-Gewebe einer Reparatur und Regeneration aufgrundeines angeborenen Leiden, eines Geburtsfehlers, einer Krankheit,Verletzung oder einer Operation bedarf.
[7] Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Operation dieEntfernung eines Tumors ist.
[8] Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobeisich das Dura mater-Gewebe im Schädel befindet.
[9] Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei sich dasDura mater-Gewebein der Wirbelsäule befindet.
[10] Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobeidie equine Collgenfolie in ihrer Trockenform eine Dicke von zwischen0,01 mm und 3,0 mm aufweist, beispielsweise zwischen 0,02 mm und2,0 mm, 0,03 mm und 1,5 mm oder 0,05 mm und 1,0 mm.
[11] Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die equineKollagenfolie in ihrer Trockenform eine Dicke von 1,0 mm oder wenigeraufweist.
[12] Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobeider Schritt des In-Kontakt-bringens das Befestigen der equinen Kollagenfoliean dem Dura mater-Gewebe mit einem Fibrindichtmaterial, Gewebeklebstoffund/oder Operationsnähtenund/oder die Verwendung von Druckanpaßtechniken oder die Verwendungder natürlichenAdhäsionzwischen der equinen Kollagenfolie und dem Dura mater-Gewebe umfasst.
[13] Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche wobeidie equine Kollagenfolie im wesentlichen flüssigkeitsdicht ist.
[14] Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobeidie equine Kollagenfolie vor dem Schritt des In-Kontakt-bringens,beispielsweise für5 Sekunden bis 10 Minuten, vorzugsweise 1 bis 6 Minuten, in einerphysiologischen Salzlösungvor dem Schritt des In-Kontakt-bringens hydratisiert wird.
[15] Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis13, wobei die equine Kollagenfolie nicht vor dem Schritt des In-Kontakt-bringenshydratisiert wird.
[16] Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobeidie vollständighydratisierte equine Kollagenfolie das bis zu 15fache, vorzugsweisenur das bis zu 10 oder bis zu 5fache ihres Trockengewichts wiegt.
[17] Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobeidie equine Kollagenfolie im Trockenzustand zwischen 1 mg/cm² und 50 mg/cm²,beispielsweise zwischen 2,5 mg/cm² und 10mg/cm² beträgt.
[18] Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei die Oberfläche dervollständighydratisierten equinen Kollagenfolie zwischen –5% und 20%, vorzugsweise –5% bis10%, oder –5%bis 5% größer alsin ihrer Trockenform ist, beispielsweise bis zu etwa 4 % größer alsin Ihrer Trockenform.
[19] Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Dicke dervollständighydratisierten equinen Kollagenfolie ungefähr das Zweifache oder das Dreifacheder Dicke ihrer Trockenform beträgt.
[20] Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobeidie equine Kollagenfolie nach der zellulären Organisation mit meningealenZellen nicht an neuralem Gewebe oder Hirngewebe haftet.
[21] Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobeidie equine Kollagenfolie nach der zellulären Reorganisation mit meningealenZellen nicht am Schädeloder Wirbelsäulengewebehaftet.
[22] Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobeider Säugerausgewähltist aus der Gruppe bestehend aus Menschen, Pferden, Schafen, Affenund Labortieren.
[23] Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobeidie equine Kollagenfolie weiter einen Trägerstoff umfasst, der ausgewählt istaus der Gruppe bestehend aus einem Konservierungsmittel, einem Wachstumsfaktor,einem Additiv, daß dieFlexibilitätund Elastizitätder equinen Kollagenfolie unterstützt und Kombinationen davon.
[24] Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobeidie equine Kollagenfolie keine Viren oder Prionen enthält.
[25] Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobeidie Kollagenfibrillen im wesentlichen aus Typ I Kollagen bestehen.
[26] Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobeidie zelluläreOrganisation der meningealen Zellen etwa 16 Wochen nach der Operationvollständigorganisiert ist.
[27] Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobeidie equine Kollagenfolie eine höchste Zugfestigkeitvon zwischen 0,5 Newton/cm-Streifen und 30 Newton/cm-Streifen, beispielsweisezwischen 1 Newton/cm-Streifen und 6 Newton/cm-Streifen aufweist.

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法律状态:
2005-01-27| OP8| Request for examination as to paragraph 44 patent law|

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2007-05-31| 8131| Rejection|

优先权:

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申请号 | 申请日 | 专利标题

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