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    Eswird ein Verfahren zur Herstellung einer biologischen Materialzusammensetzungtierischen, nicht-menschlichen Ursprungs, insbesondere als Futter-oder Lebensmittel, beschrieben, umfassend eine Aggregation von Stammzellenaus differenziertem exokrinen Drüsengewebeeines tierischen Organismus zu organoiden Körpern, und eine Präparationder Materialzusammensetzung aus den organoiden Körpern.
    公开号:DE102004017484A1
    申请号:DE102004017484
    申请日:2004-04-08
    公开日:2005-11-03
    发明作者:Günter Prof. Dr. Fuhr；Charli Dr. Kruse
    申请人:Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV；
    IPC主号:C12N5-071
    专利说明:
    [0001] DieErfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von biologischen Materialzusammensetzungentierischen Ursprungs, insbesondere als Futter- oder Lebensmittel,biologische Materialzusammensetzungen, die insbesondere Proteine,Fette und/oder Kohlenhydrate tierischen Ursprungs enthalten, undderen Verwendung.
    [0002] DieProduktion von Biomasse als Futtermittel zur Ernährung von Tieren ist eine derwichtigsten Herausforderungen der modernen Tierwirtschaft. WichtigeProbleme der konventionellen Produktion von Futtermitteln tierischenUrsprungs, insbesondere fürHaustiere oder Nutztiere, bestehen erstens in der Verfügbarkeit biologischenAusgangsmaterials, dessen Bereitstellung und Gewinnung einen großen wirtschaftlichenAufwand darstellt und ethische Probleme verursacht, und zweitensin der Gefahr, dass Krankheitserreger in den Nahrungskreislauf eingeschleustund ggf. auf den Menschen übertragenwerden.
    [0003] ÄhnlicheProbleme bestehen auch bei der Produktion von Lebensmitteln tierischenUrsprungs zur Ernährungvon Menschen. Die sog. Fleischproduktion (einschließlich Aufzucht,Tierhaltung und Schlachtung) erfolgt heute unter Bedingungen, dieinsbesondere fürdas Befinden von Säugetierenethisch höchstproblematisch sind.
    [0004] Esbesteht ein starkes Interesse an einer wachsenden Futter- und Lebensmittelproduktionauf der Grundlage tierischer Ausgangsmaterialien, um beispielsweiseden Anforderungen des Bevölkerungswachstumsund der Ernährungin Hungergebieten ge recht zu werden. Weder eine erweiterte Tierproduktionnoch ein verstärkterFischfang liefern hierzu dauerhafte Lösungen.
    [0005] DieAufgabe der Erfindung ist es, verbesserte Verfahren zur Herstellungeiner biologischen Materialzusammensetzung tierischen Ursprungs,insbesondere als Futter- oder Lebensmittel, bereitzustellen, mitdenen die Probleme der herkömmlichenFutter- oder Lebensmittelproduktion überwunden werden und die insbesondereermöglichen,Futter- oder Lebensmittel zu produzieren, die in ihrer Zusammensetzungund Verwertbarkeit den bisher gewonnenen Tierprodukten gleichwertigoder identisch sind. Ein weiterer Gesichtspunkt der Aufgabe derErfindung ist es, eine entsprechende biologische Materialzusammensetzungfür Futter-oder Ernährungszweckebereitzustellen, bei deren Produktion die Nachteile der herkömmlichenTierproduktion vermieden werden, d.h. keine Organismen gezüchtet, gemästet undzu Fleischprodukten verarbeitet werden müssen.
    [0006] DieseAufgaben werden durch Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs1 und eine Materialzusammensetzung mit den Merkmalen des Anspruchs21 gelöst.Vorteilhafte Ausführungsformenund Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.
    [0007] Verfahrensbezogenwird die oben genannte Aufgabe durch eine Aggregation von Stammzellen,die aus differenziertem exokrinen Drüsengewebe eines tierischen(nicht-menschlichen) Organismus isoliert wurden, zu dreidimensionalenZellverbändenund eine anschließendePräparationder gewünschtenMaterialzusammensetzung auf der Grundlage der Zellverbände gelöst. DieZellverbändewerden im Folgenden auch als organoide Körper bezeichnet. Ein besondererVorteil dieses Verfahrens besteht in der kompletten Abkopplung derBiomasseproduktion von der herkömmlichenTierproduktion, wobei dennoch der herge stellten Materialzusammensetzungin Abhängigkeitvon dem tierischen Organismus, aus dem die Stammzellen isoliertwurden, und konkreten Differenzierungsbedingungen eine stoffliche,strukturelle und insbesondere geschmackliche Eigenart aufgeprägt werdenkann.
    [0008] DieErfinder haben festgestellt, dass die aus dem exokrinen Drüsengewebeisolierten adulten Stammzellen pluripotent sind und eine hohe Teilungsfähigkeitund ein starkes Wachstum zeigen. Die Biomasseproduktion erfolgtnicht auf natürlichemWeg durch das Wachstum des Tieres, sondern synthetisch insbesondere beider Präparationder Materialzusammensetzung in so genannten in-vitro Laborkulturen.
    [0009] Daserfindungsgemäß verwendeteexokrine Drüsengewebekann von einem nicht-humanen erwachsenen Organismus, juvenilen Organismusoder fötalenOrganismus, vorzugsweise einem postnatalen Organismus, stammen.Der Begriff "adult", wie in der vorliegendenAnmeldung verwendet, bezieht sich somit auf das Entwicklungsstadiumdes Ausgangsgewebes und nicht auf dasjenige des Donororganismus,aus dem das Gewebe stammt. "Adulte" Stammzellen sindnicht-embryonale Stammzellen.
    [0010] Vorzugsweisewird das exokrine Drüsengewebeaus einer Speicheldrüse,Tränendrüse, Talgdrüse, Schweißdrüse, ausDrüsendes Genitaltrakts, einschließlichProstata, oder aus gastrointestinalem Gewebe, einschließlich Pankreas,oder sekretorischem Gewebe der Leber isoliert. In einer stark bevorzugtenAusführungsformhandelt es sich dabei um acinäresGewebe. Ganz besonders bevorzugt stammt das acinäre Gewebe aus dem Pankreas,der Ohrspeicheldrüseoder Unterkieferspeicheldrüse.
    [0011] Einwesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin,dass die Stammzellen aus lebenden Donortieren, z. B. aus Speicheldrüsen vonSchweinen gewonnen werden können,ohne dass das Donortier geschlachtet werden muss. Dies ist sowohlunter ethischen Gesichtspunkten als auch mit Blick auf die Möglichkeitder weiteren Beobachtung des Donortieres hinsichtlich eventuellerKrankheiten von besonderem Vorteil.
    [0012] Allgemeinkann erfindungsgemäß die Materialzusammensetzungunmittelbar aus den organoiden Körperngebildet werden. Gemäß einerbevorzugten Ausführungsformder Erfindung ist jedoch vorgesehen, dass die organoiden Körper nachder Aggregation, z. B. in einer Suspensionskultur oder einer Adhäsionskultur unterNährstoffversorgungzu größeren Körpern wachsen,die im Folgenden als Gewebekörperbezeichnet werden. Die Erfinder haben festgestellt, dass die ausden exokrinen Drüsenisolierten Stammzellen organoide Körper bilden, die bei Nährstoffversorgungein starkes Wachstum zu Gewebekörpernmit Durchmessern von einigen Millimetern oder darüber zeigen.Die Präparationder Materialzusammensetzung auf der Grundlage der Gewebekörper besitztden Vorteil einer erhöhtenEffektivitätder Biomaterialproduktion. Die organoiden Körper enthalten dabei keineOrgane oder ein funktionsfähigesNervensystem, sondern bestehen aus Gewebeschichten verschiedenerZellzusammensetzungen.
    [0013] Wenngemäß einerersten Variante der Erfindung die Aggregation der Stammzellen und/oderdas Wachstum der organoiden Körperin einem Kulturmedium ohne eine Zusatz erfolgen, der die Differenzierung derZellen des organoiden Körpersbeeinflussen könnte,wachsen vorteilhafterweise organoide Körper oder Gewebekörper miteiner Zusammensetzung von verschiedenen Zelltypen, die gemeinsamzur Struktur und Verwendbarkeit, insbesondere dem Geschmack dergewünschtenMaterialzusammensetzung beitragen. Wenn die Aggregation und/oderdas Wachstum hingegen in Gegenwart von mindestens einem die Differenzie rungbeeinflussenden Zusatz erfolgt, können organoide Körper oderGewebekörpermit einem oder mehreren bevorzugten Zelltypen gebildet werden. Eskönnenverschiedene Zelltypen kombiniert werden, die von verschiedenenDonortieren stammen, um bestimmte Nähr- oder Geschmackseigenschaftenzu erzielen.
    [0014] Gemäß einerbevorzugten Ausführungsformder Erfindung werden die organoiden Körper oder die aus diesen gewachsenenGewebekörperzu einem Komposit (Formkörper)zusammengefügt.Wenn die Zellen im Komposit leben, kann vorteilhafterweise ein weiteresWachstum des Komposits bis zu der gewünschten Größe als Futter- oder Lebensmittelerfolgen. Wenn hingegen die Zellen im Komposit abgestorben sindund nicht weiter wachsen, könnensich Vorteile fürdie weitere Bearbeitung der Materialzusammensetzung ergeben.
    [0015] Gemäß bevorzugtenVarianten der Erfindung umfasst daher die Bildung des Kompositseinen oder mehrere der folgenden Schritte. Erstens kann ein Zusammenwachsender beteiligten organoiden Körperoder Gewebekörperzum Komposit vorgesehen sein, das dann vorteilhafterweise weiterwachsen kann. Zweitens kann ein adhärentes Anhaften der beteiligtenorganoiden Körperoder Gewebekörpervorgesehen sein, wobei auch in diesem Fall ein weiteres Wachstumvorgesehen sein kann. Durch ein Zusammenpressen der organoiden Körper oderGewebekörperkann ein Verdichten des Formkörpersund damit eine bestimmte Struktur erzielt werden. Schließlich kanneine Übertragungder organoiden Körperoder Gewebekörperauf ein biokompatibles Trägersubstrataus einem verdaubaren Material vorgesehen sein, auf dem eine weiterePräparation oderFormung der Materialzusammensetzung erfolgt.
    [0016] Gemäß einerweiteren bevorzugten Ausführungsformder Erfindung kann das Komposit einer Formgebung durch eine Prägeein richtungunterzogen werden. In diesem Fall können sich Vorteile für die Präsentationder Futter- oder Lebensmittel fürderen Verbrauch ergeben. Die Prägeeinrichtungkann z. B. durch ein besonders geformtes Kultivierungssubstrat,wie z. B, das Trägersubstrat,eine Stempeleinrichtung mit einer Prägeoberfläche oder einen flexiblen Beutelumfassen, der eine Aufnahmehüllebildet.
    [0017] Gemäß einerweiteren Modifikation des erfindungsgemäßen Verfahrens kann bei derPräparationder Materialzusammensetzung eine Struktureinstellung vorgesehensein. Dadurch kann die Materialzusammensetzung mit einer gewünschtenKonsistenz, wie z. B. fest, zäh,locker oder dgl. gebildet werden, was insbesondere für die Verwendungals Lebensmittel von Vorteil sein kann. Die Struktureinstellungkann bspw. durch die genannte mechanische Verdichtung erfolgen.Alternativ wird insbesondere, wenn die Gewebekörper elektrisch anregbare Muskelzellenenthalten, eine Struktureinstellung durch eine Einwirkung elektrischerFelder realisiert. Das Komposit wird durch ein elektrisches Feldangeregt, so dass die Muskelzellen eine Struktur bilden, die dervon Muskelfleisch ähnlichist.
    [0018] Besondersbevorzugt werden die organoiden Körper einer Differenzierungunterzogen, die zu wenigstens einem der folgenden Zelltypen führt, dieMuskelzellen, Bindegewebszellen, Fettzellen und Enzym-produzierendeZellen umfassen. In diesem Fall enthalten die organoiden Körper oderentsprechende Gewebekörper vorrangigden differenzierten Zelltyp. Die Differenzierung kann allgemeindurch den Zusatz an sich bekannter Differenzierungsfaktoren erfolgen.Besonders bevorzugt erfolgt jedoch bei der Kultivierung der organoiden Körper oderdem Wachstum der Gewebekörperein Zusatz von bereits differenzierten, insbesondere autologen Zellen,die die weitere Differenzierung im organoiden Körper oder Gewebekörper auslösen oderbeeinflussen.
    [0019] Wenndie biologische Materialzusammensetzung aus verschiedenen Gruppenorganoider Körperoder Gewebekörper,die jeweils verschieden differenziert sind, präpariert wird, können sichVorteile fürdie weitere Verwertung der Materialzusammensetzung, insbesonderein Bezug auf die Nährstoffzusammensetzung,die Struktur und den Geschmack ergeben. Alternativ oder ergänzend können derMaterialzusammensetzung erfindungsgemäß Geschmacksstoffe zugesetztwerden, wie sie an sich aus der Lebensmitteltechnik bekannt sind.
    [0020] EinunabhängigerGegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine biologische Materialzusammensetzung,wie zum Beispiel ein Formkörperoder Komposit aus biologischem Material, insbesondere mit Proteinen, Kohlenhydratenund/oder Fetten, die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt wurdeund deren Verwendung als Futter- oder Lebensmittel, wie z. B. alssynthetisches Fleischprodukt.
    [0021] WeitereEinzelheiten und Vorteile der Erfindung werden im Folgenden unterBezug auf die beigefügten Zeichnungenerläutert.Es zeigen:
    [0022] 1:ein Flussdiagramm zur Illustration einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens,
    [0023] 2:eine Illustration der Bildung primärer organoider Körper,
    [0024] 3:ein Flussdiagramm zur Illustration mit weiteren Einzelheiten deserfindungsgemäßen Verfahrens,
    [0025] 4:eine Darstellung der Bildung sekundärer organoider Körper,
    [0026] 5:eine Photographie eines Gewebekörpers,
    [0027] 6:ein Flussdiagramm mit weiteren Einzelheiten des erfindungsgemäßen Verfahrens,
    [0028] 7:eine Schemadarstellung zur Illustration der Kultivierung organoiderKörper,
    [0029] 8:eine Schemadarstellung mit weiteren Einzelheiten einer Ausführungsformdes erfindungsgemäßen Verfahrens,
    [0030] 9:Illustrationen der Präparationsschrittegemäß verschiedenenAusführungsformender Erfindung, und
    [0031] 10:eine Illustration einer elektrischen Struktureinstellung an einererfindungsgemäßen Materialzusammensetzung.
    [0032] Zurerfindungsgemäßen Erzeugungeiner Zusammensetzung aus biologischen Zellen und/oder Gewebe erfolgengemäß 1 zunächst eineBereitstellung der von einem Donororganismus isolierten Stammzellen(Schritt 100), anschließend deren Aggregation zu organoidenKörpern(Schritt 200), die einer Differenzierung und/oder einemWachstum (Schritt 300) und schließlich einer Sammlung und weiterenBearbeitung (Schritt 400) unterzogen werden. Obwohl dieSchritte 100 und 200 im Wesentlichen den erfindungsgemäßen Aggregationsschrittumfassen, währenddie Schritte 300 und 400 im Wesentlichen den erfindungsgemäßen Präparationsschrittrepräsentierenund diese beiden Komplexe im Folgenden getrennt erörtert werden,wird betont, dass Teilschritte der Präparation bereits im Rahmender Aggregation erfolgen und umgekehrt Teilschritte der Aggregationerst im Rahmen der Präparationrealisiert werden können.So kann bspw. die Differenzierung der organoiden Körper bereitsim Rahmen der Aggregation beginnen, oder es können isolierte Stammzellenmit bereits vordifferenzierten organoiden Körpern aggregieren.
    [0033] Dieim Folgenden erläutertenAusführungsformender Erfindung beziehen sich beispielhaft auf die Erzeugung der biologischenMaterialzusammensetzung aus Stammzellen, die Ratten oder Schweinenentnommen wurden. Die Umsetzung der Erfindung ist jedoch nicht aufdiese Tierarten beschränkt.Vielmehr können dieentsprechenden Verfahren an allen nicht-menschlichen Organismenmit differenzierten exokrinen Drüsen mitacinäremGewebe realisiert werden, so z. B. mit Fischen, die acinäres Gewebean der Pankreasdrüsebesitzen, oder Säugetieren,wie zum Beispiel Rindern oder Schafen.
    [0034] Entsprechenddem in 2 dargestellten Schema wird zur Gewinnung derZellen acinäresGewebe – bevorzugteiner Speicheldrüseoder der Bauchspeicheldrüse(Pankreas) – mechanischund enzymatisch zerkleinert in Kultur genommen (Schritt 10 in 2).Entgegen den Angaben von Bachem et al., Gastroenterol. 115:421–432 (1998),und Grosfils et al., Res. Comm. Chem. Pathol. Pharmacol. 79:99–115 (1993),werden keine Gewebeblöckekultiviert, aus denen Zellen auswachsen sollen, sondern unter derBedingung, dass die Zellverbändeder Acini weitestgehend intakt bleiben, das Gewebe stärker zerkleinert.
    [0035] Über mehrereWochen werden diese Zellen und Zellverbände in Kulturgefäßen kultiviert.Alle 2 bis 3 Tage wird das Medium gewechselt, wobei alle differenziertenZellen entfernt werden. Bei den in Kultur persistierenden Zellenhandelt es sich um undifferenzierte Zellen mit uneingeschränkter Teilungsfähigkeit.
    [0036] ÄhnlicheZellen sind unter gleichen Bedingungen aus dem Pankreas isoliertund beschrieben und als eine Art Myofibroblasten bzw. pankreatischeSternzellen bezeichnet worden (Bachem et al., 1998). Im Gegensatzzu den Zellen der vorliegenden Erfindung konnte eine uneingeschränkte Teilungsfähigkeitjedoch nicht beobachtet werden. Weiterhin konnten diese Zellen auchnicht unbegrenzt passagiert werden, ohne an Vitalität zu verlieren.
    [0037] Ineinem zweiten Schritt (12) werden ungefähr 400 bis 800 Zellen in je20 μl Mediumin hängenden Tropfenkultiviert. Dazu werden die Tropfen auf Deckel von bakteriologischenPetrischalen gegeben, umgedreht und über die mit Medium gefüllte Petrischalegelegt, so dass die Tropfen nach unten hängen.
    [0038] Durchdiese Art der Kultivierung bilden sich innerhalb von 48h die alsorganoide Körperbezeichneten Zellaggregate (14), die für ungefähr 6 Tage in eine Suspensionskulturumgesetzt werden (16). Die Teilansicht (18) aus 2 zeigteine mikroskopische Aufnahme eines solchen organoiden Körpers 2.
    [0039] In 3 sinddie verschiedenen Möglichkeiten,organoide Körperals Ausgangsmaterialien fürdie weitere Präparationbereitzustellen, mit weiteren Einzelheiten zusammengestellt. Nachder oben beschriebenen Kultivierung der isolierten Stammzellen imhängendenTropfen (Schritt 210) erfolgt die Aggregation zu den so genanntenprimärenorganoiden Körpern (Schritt 220),die direkt der Differenzierung und dem Wachstum (Schritt 300 in 1)unterzogen werden können.
    [0040] Alternativerfolgt zunächstdie Ablage der primärenorganoiden Körperauf einem Substrat zur Schaffung einer Adhäsionskultur (siehe auch 4).Die Erfinder haben festgestellt, dass die in Suspensionskuttur wachsendenprimärenorganoiden Körperin Adhäsionskulturneue organoide Körperbilden können.Auf dem Substrat folgt durch eine Zellwanderung die Bildung einerMonoschicht (Schritt 240) und aus dieser die Aggregationzu den so genannten sekundärenorganoiden Körpern(Schritt 250). Diese könnenwiederum direkt der weiteren Differenzierung und/oder dem Wachstum(Schritt 300) unterzogen werden.
    [0041] DieBildung der sekundärenorganoiden Körperist auch in 4 illustriert. Die primären organoiden Körper 2 bildenauf dem Substrat der Adhäsionskultur,wie z. B. auf dem Boden der Kulturschale 20, durch ein Wandernoder Wachsen von Zellen 3 zunächst eine Monoschicht, ausder dann die sekundäreorganoide Körper 4 herauswachsen.Mit der Kultivierung der primärenorganoiden Körper 2 zusekundärenorganoiden Körpern 4 wirdeine weitere Vervielfältigungdes Biomaterials geschaffen.
    [0042] Ausjedem der primärenoder sekundärenorganoiden Körper 2, 4 können beiweiterer Kultivierung Gewebekörperwachsen. 5 zeigt beispielhaft einen inder Adhäsionskulturgewachsenen Gewebekörper 5 (derweißeStrich entspricht einer Längevon 2 mm im Original).
    [0043] Inden folgenden, nicht-beschränkendenBeispielen wird die Isolierung und Aggregation von Stammzellen näher erläutert.
    [0044] Dieallgemeinen Arbeitsanweisungen, wie sie für Verfahren zur Kultivierungvon tierischen Zellen und insbesondere von Säugetierzellen gebräuchlichsind, sind zu beachten. Eine sterile Umgebung, in der das Verfahrendurchgeführtwerden soll, ist – auchwenn hierzu keine weitere Beschreibung erfolgt – in jedem Fall einzuhalten.Folgende Puffer und Medien wurden verwendet:
    [0045] StattfötalemKalbserum (FKS) im Nährmediumund Differenzierungsmedium kann gegebenenfalls auch Eigenplasmaoder, weniger bevorzugt, Eigenserum des Gewebedonors verwendet werden.
    [0046] DasNährmediumkann als Basismedium statt des verwendeten DMEM-Mediums auch einanderes für dieKultivierung von eukaryotischen Zellen, insbesondere Säugerzellen,bekanntes, geeignetes Basismedium enthalten, in dem die differenziertenZellen absterben und sich die gewünschten Stammzellen vermehren. AuchIsolationsmedium, Inkubationsmedium und Differenzierungsmedium können einanderes üblichesund geeignetes Basismedium enthalten.
    [0047] Diefolgenden Beispiele 1 und 2 beschreiben detailliert zwei Arbeitsprotokollezur Isolierung und Kultivierung adulter pluripotenter Stammzellenaus acinäremGewebe des Pankreas. Beispiel 3 beschreibt ein entsprechendes Protokollfür dieIsolierung aus acinäremGewebe der Speicheldrüse.
    [0048] Inden Ductus pancreaticus von 2–3Jahre alten Ratten werden mittels einer Spritze und einer stumpfenKanülebei der Ratte 10 ml Digestionsmedium langsam und luftblasenfreiinjiziert. Das gesamte Pankreas wird dadurch aufgeblasen und kannso besser herauspräpariertwerden. Das Pankreas wird dann in ein Becherglas überführt undweitere 5 ml Digestionsmedium dazugegeben. Nachdem man das Fettgewebeund Lymphknoten entfernt hat, wird das Gewebe im Becherglas miteiner feinen Schere sehr fein zerkleinert, oben schwimmendes Fettgewebeabgesaugt und die Suspension wird abschließend 1 min mit Carbogen begast (wennnötig wiederholen)und für20 min bei 37 °Cmit Alufolie bedeckt in einem Schüttler bei 200 Zyklen/min inkubiert.Danach saugt man das Medium vorsichtig ab, zerkleinert erneut miteiner Schere das Gewebe und wäschtdie Gewebestückezweimal mit je 10 ml Isolationsmedium und gibt wieder 5 ml Digestionsmediumzum Gewebe hinzu.
    [0049] Nacherneutem Begasen mit Carbogen füretwa 1 min und Inkubation für15 min bei 37 °Cin einem Schüttlerbei 200 Zyklen/min werden die Gewebestücke durch sukzessives Aufziehenin jeweils einer 10 ml, 5 ml, 2 ml und 1 ml Glaspipette zerkleinertund durch einlagiges Filtergewebe gepresst. Die so vereinzeltenZellen werden nun fünfmalin Inkubationsmedium gewaschen (37 °C), mit Carbogen begast undjedes Mal 5 min bei 90 g zentrifugiert. Das zuletzt erhaltene Pelletwird in Inkubationsmedium resuspendiert, begast und auf Gewebekulturschalenverteilt.
    [0050] DieGewebekulturschalen mit den isolierten Zellen werden im Brutschrankbei 37°Cund 5 % CO2 kultiviert. Alle 2–3 Tagewird das Medium gewechselt. Dabei werden alle differenzierten Zellenentfernt.
    [0051] Amsiebenten Tag in Kultur werden die Zellen mit einer Lösung bestehendaus 2 ml PBS, 1 ml Trypsin und 2 ml Inkubationsmedium passagiert.Dabei lösensich die Zellen vom Boden der Kulturschale. Die Zellsuspension wird5 Minuten zentrifugiert, der Überstandabgesaugt und die Zellen in 2 ml Inkuba tionsmedium resuspendiert,auf eine mittlere Zellkulturflasche überführt und 10 ml Inkubationsmediumdazugegeben. Der Medienwechsel erfolgt alle drei Tage.
    [0052] Amvierzehnten Tag in Kultur werden die Zellen erneut, aber diesmalmit 6 ml PBS, 3 ml Trypsin und 6 ml Inkubationsmedium, passagiert.Die Zellsuspension wird 5 Minuten zentrifugiert, der Überstandabgesaugt und die Zellen in 6 ml Inkubationsmedium resuspendiert,auf 3 mittlere Zellkulturflaschen überführt und jeweils 10 ml Inkubationsmediumdazugegeben.
    [0053] DieZellen werden weiter kultiviert und so oft passagiert und ausgesät, bis dieZellen einen semikonfluenten bis konfluenten Zustand erreichen.
    [0054] Pankreas-Aciniwurden von männlichenSprague-Dawley-Ratten (20–300g) erhalten, die narkotisiert (CO2) und über diedorsale Aorta ausgeblutet worden waren. Eine Kanüle wurde trasduodenal in denPankreasgang eingeführtund dem Pankreas wurde von hinten 10 ml Digestionsmedium, enthaltendHEPES-Eagle-Medium(pH 7,4), 0,1 mM HEPES-Puffer (pH, 7,6), 70% (Vol./Vol.) modifiziertesEagle-Medium, 0,5 % (Vol./Vol.) Trasylol (Bayer AG, Leverkusen,Deutschland), 1 % (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin), 2,4 mM CaCl2 und Kollagenase (0,63 P/mg, Serva, Heidelberg,Deutschland) injiziert.
    [0055] Vorder Entfernung wurde der Pankreas von anhaftendem Festgewebe, Lymphknotenund Blutgefäßen teilweisebefreit. Dann wurde gesundes Pankreasgewebe in Digestionsmediumabgeholt (bei 20 °C,geringerer Stoffwechsel), das Pankreasgewebe mit einer Schere sehrfein zerkleinert, oben schwimmendes Fettgewebe abgesaugt und dieGewebesuspension mit Carbogen (Messer, Krefeld, Deutschland) begast,ohne dass die Düsein das Medi um mit den Zellen gelangt (Verringerung von mechanischemStreß)und damit auf pH 7,4 eingestellt. Danach wurde die Suspension ineinem 25-ml-Erlenmeyerkolben (mit Alufolie bedeckt) unter konstantemSchütteln(150–200Zyklen pro Minute) bei 37 °Cin 10 ml Digestionsmedium inkubiert. Nach 15–20 Minuten wurde das obenschwimmende Fett und das Medium abgesaugt und das Gewebe wurde erneut zerkleinertund mit Medium ohne Kollagenase gespült (Vorgang mindestens zweimalwiederholen, vorzugsweise solange bis Zellfraktion transparent),worauf Digestionsmedium zugegeben und erneut etwa 1 Minute lang mitCarbogen begast wurde. Es folgte wiederum eine Digestion mit Kollagenasefür 15Minuten bei 37°Cim Schüttlerunter Verwendung desselben Puffers. Nach der Digestion wurden dieAcini durch sukzessives Hochziehen und Ausstossen durch 10 ml-,5 ml und 2 ml-Glaspipetten mit engen Öffnungen dissoziiert und durch eineinlagiges Nylonsieb (Polymon PES-200/45, Angst & Pfister AG, Zürich, Schweiz) mit einer Maschengröße von etwa250 μm filtriert.Die Acini wurden zentrifugiert (bei 37°C und 600–800 UpM in einer Beckman-GPR-Zentrifuge, entsprichtetwa 90 g) und weiter gereinigt durch Waschen in Inkubationsmedium,enthaltend 24,5 mM HEPES (pH 7,5), 96 mM NaCl, 6 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2, 5 mM NaH2PO4, 0, mM CaCl2, 11,5 mMGlucose, 5 mM Natriumpyruvat, 5 mM Natriumglutamat, 5 mM Natriumfumarat,1 % (Vol./Vol.) modifiziertes Eagle-Medium, 1 % (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin,mit Carbogen äquilibriertund auf pH 7,4 eingestellt. Die Waschprozedur (Zentrifugation, Absaugen,Resuspension) wurde fünfmalwiederholt. Soweit nicht anders angegeben, wird bei der obigen Isolierungbei etwa 20 °Cgearbeitet.
    [0056] DieAcini wurden in Inkubationsmedium resuspendiert und bei 37°C in einerangefeuchten Atmosphäremit 5 % CO2 kultiviert. Das acinäre Gewebestarb dabei schnell (innerhalb von zwei Tagen) ab und die sterbendendifferenzierten Zellen lösten sichdabei von den benachbarten Zellen, ohne diese zu schädigen (schonendeIsolierung), die nicht absterbenden Stammzellen sanken zu Bodenund hefteten sich an. Die differenzierten Acinizellen sind dazunicht in der Lage. Das Inkubationsmedium wurde am zweiten oder drittenTag nach dem Aussäenerstmals gewechselt, wobei ein Großteil der frei schwimmendenAcini und acinärenZellen entfernt wurde. Zu diesem Zeitpunkt hatten sich die erstenStammzellen bzw. deren Vorläuferam Boden festgesetzt und begannen sich zu teilen. Der Mediumwechselwurde danach an jedem dritten Tag wiederholt und differenzierteacinärePankreaszellen wurden bei jedem Mediumwechsel entfernt.
    [0057] Amsiebenten Tag in Kultur wurden die Zellen mit einer Lösung bestehendaus 2 ml PBS, 1 ml Trypsin (+ 0,05 % EDTA) und 2 ml Inkubationsmediumpassagiert. Dabei lösensich die Zellen vom Boden der Kulturschale. Die Zellsuspension wurde5 Minuten bei etwa 1000 UpM (Beckmann GPR-Zentrifuge) zentrifugiert,der Überstandabgesaugt und die Zellen in 2 ml Inkubationsmedium resuspendiert,auf eine mittlere Zellkulturflasche überführt und 10 ml Inkubationsmediumdazugegeben.
    [0058] Amvierzehnten Tag in Kultur wurden die Zellen erneut, aber diesmalmit 6 ml PBS, 3 ml Trypsin/EDTA und 6 ml Inkubationsmedium, passagiert.Die Zellsuspension wird 5 Minuten bei 1000 UpM zentrifugiert, der Überstandabgesaugt und die Zellen in 6 ml Inkubationsmedium resuspendiert,auf 3 mittlere Zellkulturflaschen überführt und jeweils 10 ml Inkubationsmediumdazugegeben.
    [0059] AmTag 17 erfolgte ein drittes Passagieren auf insgesamt 6 mittlereZellkulturflaschen und am Tag 24 ein viertes Passagieren auf insgesamt12 mittlere Zellkulturflaschen. Spätes tens jetzt waren alle primären Zellenbis auf die Stammzellen aus der Zellkultur entfernt.
    [0060] DieStammzellen könnenweiter kultiviert werden und so oft passagiert und ausgesät wie gewünscht. DasAussäenerfolgt vorzugsweise jeweils in einer Dichte von 2–4 × 105 Zellen/cm2 in Inkubationsmedium.
    [0061] DieIsolierung und Kultivierung aus exokrinem Gewebe der Ohrspeicheldrüse erfolgteanalog dem Pankreas-Protokoll mit den folgenden Abweichungen: 1. Das exokrine Gewebe der Ohrspeicheldrüse war eineMischung von acinäremGewebe und tubulösem Gewebe. 2. Nachdem Speicheldrüsenweniger Proteasen und Amylasen als Pankreas enthalten, ist es möglich, das Speicheldrüsengewebevor der Aufarbeitung einige Zeit im Kühlschrank bei etwa 4°C aufzubewahren,ohne dass das Gewebe zu sehr geschädigt wird. Im konkreten Beispielsfallbetrug die Aufbewahrungszeit 15 h und brachte keine nachteiligenFolgen fürdie Isolierung der gewünschtenStammzellen mit sich.
    [0062] Diefolgenden Beispiele 4 und 5 beschreiben detailliert zwei Arbeitsprotokollezur Herstellung von organoiden Körpernund differenzierten Zellen.
    [0063] Dieundifferenzierten Zellen werden mit einer Lösung aus 10 ml PBS, 4 ml Trypsin,8 ml Differenzierungsmedium abtrypsiniert und 5 Minuten abzentrifugiert.Das resultierende Pellet wird so in Differenzierungsmedium resuspendiert,dass sich eine Verdünnungvon 3000 Zellen je 100 μlMedium einstellt. Anschließend werdendie Zellen nochmals gut mit einer 3 ml Pipette suspendiert.
    [0064] Vonbakteriologischen Petrischalen, die vorher mit jeweils 15 ml PBS(37 °C)pro Platte beschichtet worden sind, wird der Deckel abgenommen undumgedreht. Mit Hilfe einer automatischen Pipette werden auf einenDeckel ca. fünfzig20 μl Tropfengegeben. Der Deckel wird dann schnell umgedreht und auf die mitDifferenzierungsmedium gefülltePetrischale gegeben, sodass die Tropfen nach unten hängen. DiePetrischalen werden anschließendvorsichtig in den Brutschrank gestellt und für 48 h inkubiert.
    [0065] Daraufhinwerden die in den hängendenTropfen aggregierten Zellen, die hier organoide Körper genanntwerden, aus jeweils vier Deckeln in je eine bakteriologische Petrischalemit 5 ml Inkubationsmedium mit 20 % FKS überführt und für weitere 96 h kultiviert.
    [0066] Dieorganoide Körperwerden nun vorsichtig mit einer Pipette aufgesammelt, und in mit0,1 % Gelatine beschichtete Zellkulturgefäße mit Differenzierungsmedium überführt. Ineiner besonders bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens verwendetman als Kulturgefäß mit 0,1% Gelatine beschichtete 6 cm Petrischalen, in die 4 ml Differenzierungsmediumvorgelegt wurde und die anschließend mit je 6 organoiden Körpern beschickt werden.Ein weiteres bevorzugtes Kulturgefäß sind mit 0,1 Gelatine beschichteteChamber Slides, in die 3 ml Differenzierungsmedium vorgelegt wurdeund die anschließendmit je 3–8organoiden Körpernbeschickt werden. Daneben könnenauch 24-Mulden-Mikrotiterplatten verwendet werden, die mit 0,1 Gelatinebeschichtet wurden und in die je 1,5 ml pro Mulde Differenzierungsmediumvorgelegt wurde und anschließendmit je 4 organoiden Körpernbeschickt werden.
    [0067] Derartkultiviert, ist die Differenzierungsfähigkeit der Zellen in den organoideKörperaktiviert und die Zellen differenzieren sich in Zellen der dreiKeimblätterMesoderm, Entoderm und Ektoderm. Die Zellen können sowohl als organoide Körper alsauch als einzelne Zellen gelagert und kultiviert werden und behaltenihre Pluripotenz.
    [0068] Für die Induktionder Differenzierung wurden vorzugsweise Stammzellen nach dem 42.Tag der Kultivierung verwendet. Die Verwendung von Stammzellen nachder 3. oder 4. Passage oder von Zellen, die bei der Temperatur vonflüssigemStickstoff 12–18Monate lang gelagert worden waren, war ebenfalls problemlos möglich.
    [0069] Zunächst wurdendie Zellen in Differenzierungsmedium mit der oben angegebenen Zusammensetzung überführt undauf eine Dichte von etwa 3 × 104 Zellen/ml eingestellt; z.B. durch Trypsinbehandlungeiner Stammzelkultur in Nährmedium,5-minütige Zentrifugationbei 1000 UpM und Resuspendieren des Pellets in Differenzierungsmediumund Verdünnungsoweit erforderlich.
    [0070] Anschließend wurdenmit einer 20-μlPipette ca. 50 20-μl-Tropfen (600 Zellen/20 μl) auf dieInnenseite des Deckels einer bakteriologischen Petrischale gegeben(gestopfte Spitzen) und die Deckel vorsichtig auf die mit PBS gefüllten Petrischalengestülpt,sodass die Tropfen nach unten hängen.Für jedenDeckel wurde eine neue Spitze verwendet. Die Petrischalen wurdenanschließendvorsichtig in den Brutschrank gestellt und 48 h lang bei 37°C inkubiert.
    [0071] Danachwurden die in den hängendenTropfen aggregierten Zellen, die organoide Körper (OB), aus jeweils vierDeckeln in je eine bakteriologische Petrischale mit 5 ml Inkubationsmediummit 20 % FKS überführt (Deckelschräghalten und die OBs mit etwa 2,5 ml Nährmedium abspülen) undfür weitere5–9 Tage,vorzugsweise 96 h, kultiviert.
    [0072] Dieorganoiden Körperwurden nun vorsichtig mit einer Pipette aufgesammelt und in mit0,1 % Gelatine beschichtete Zellkulturgefäße mit Differenzierungsmedium überführt. DieOB vermehrten sich nun und wuchsen in zum Teil einzelnen Zellkolonien,die wieder vermehrt vereinzelt und vermehrt werden konnten. In einer besondersbevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens wurden als Kulturgefäß mit 0,1% Gelatine beschichtete 6 cm Petrischalen verwendet, in die 4 mlDifferenzierungsmedium vorgelegt worden war, und diese mit je 6 organoidenKörpernbeschickt. Ein weiteres bevorzugtes Kulturgefäß waren mit 0,1 % Gelatinebeschichtete Chamber Slides, in die 3 ml Differenzierungsmediumvorgelegt wurde und die anschließend mit je 3–8 organoidenKörpernbeschickt wurden und Thermanox-Platten (Nalge Nonc International,USA) fürelektronenmikroskopische Studien. Ein weitere Alternative waren24-Mulden-Mikrotiterplatten, die mit 0,1 % Gelatine beschichtetwurden und in die je 1,5 ml pro Mulde Differenzierungsmedium vorgelegtwurde und die anschließend mitje 4 organoiden Körpernbeschickt wurden.
    [0073] Ineiner bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens wurden OBs etwa 7Wochen lang in den gelatine-beschichteten 6-cm-Petrischalen kultiviert und danach wurdeneinzelne OBs mit dem Microdissector (Eppendorf, Hamburg, Deutschlandnach den Anweisungen des Herstellers ausgeschnitten und dann z.B.auf frische 6-cm-Petrischalen, Chamber Slides oder Thermanox-Platten überführt.
    [0074] Allgemeinkönnendie Schritte der Sammlung und weiteren Bearbeitung (Schritt 400)die in 6 gezeigten Teilschritte umfassen. Gemäß Teilschritt 410 erfolgtdie Sammlung („Ernten") von organoidenKörpern oderGewebekörpernmit ggf. verschieden differenzierten Zelltypen (Schritt 410).Anschließendwerden die verschiedenen Zelltypen in dem gewünschten Kompositverhältnis gemischt(Schritt 420). Schließlicherfolgt die Formgebung, Verdichtung und/oder Strukturbildung amVerbund (Schritt 430).
    [0075] DieBereitstellung der verschieden differenzierten Zelltypen ist beispielhaftin 7 gezeigt. Bei dieser Variante des erfindungsgemäßen Verfahrenswerden die organoiden Körper 2 unterder Wirkung vordifferenzierter Einzelzellen einer Differenzierungunterzogen. Hierzu werden aus den primär isolierten Stammzellen 1 zunächst differenzierteStammzellen 1a gebildet (Pfeil A). Die differenziertenStammzellen 1a umfassen zum Beispiel Muskelzellen. Parallelwerden aus den primärenisolierten Stammzellen 1 entsprechend den oben genanntenPrinzipien in hängendenTropfen organoide Körper 2 gebildet(Pfeil B). Die Muskelzellen 1a werden in die hängendenTropfen zugefügt(siehe vergrößertes Teilbild),wo sie eine Differenzierung der organoiden Körper 2 zu Muskelzellenauslösen.
    [0076] EinVerfahrensweg zur erfindungsgemäßen Erzeugungeiner fleischartigen Gewebezusammensetzung 6 ist schematischin 8 illustriert. Die primär isolierten Stammzellen 1 umfasseneine wiederholt vermehrbare, nach den oben beschriebenen Prinzipiengewonnene Stammzellenkultur mit pluripotenten, mindestens jedochmultipotenten Zellen. Ausgehend von den primär isolierten Stammzellen 1 erfolgtzunächstdie Bereitstellung von Suspensionskulturen und die Kultivierungim hängendenTropfen (siehe 3, Schritt 210). In 8 sindbeispielhaft drei Suspensionskulturen gezeigt, die im weiteren Verfahrenzu verschiedenen Zelltypen führen,die am Ende zu dem gewünschtenKomposit 6 zusammengefügtwerden sollen. In der ersten Suspensionskultur (Pfeil A) werdenbspw. organoide Körper 2a ausMuskelzellen erzeugt, währendin den übrigen Suspensionskulturen(Pfeile B und C) z. B. organoide Körper 2b aus Fettzellenund 2c aus Bindegewebezellen erzeugt werden. Auf jedemder Pfade A, B und C werden jeweils einige bis zu einigen Hundertoder sogar einigen Tausend Stammzellen 1 in die hängende Tropfenkultur überführt. ZurBildung der Tropfenkultur werden verschiedene Kultivierungsmedienverwendet, die zum Beispiel molekulare Differenzierungsfaktorenoder differenzierte Zellen (siehe 7) enthalten.Die Tropfengröße wirddurch die Schaffung einer gesättigtenAtmosphärein der Umgebung der Tropfenkultur oder in an sich bekannter Weisedurch die Zuführungeines weiteren Kulturmediums konstant gehalten.
    [0077] Nachdemdie organoiden Körper 2a, 2b, 2c gebildetsind und einen Durchmesser von z. B. einigen Hundert Mikrometernbesitzen, werden die organoiden Körper in die Kulturschalen 20 inAdhäsionskulturen überführt. Dorterfolgt ein weiteres Wachstum zu Gewebekörpern 5a, 5b und 5c.Da die Kultivierungsmedien in den Kulturschalen 20 verschiedeneSignalfaktoren enthalten, besitzen die Gewebekörper 5a, 5b und 5c entsprechenddifferenziertes Gewebe. Alternativ kann ein Wachstum mit einem Zelltypengemischvorgesehen sein.
    [0078] Wenndie Gewebekörper 5a, 5b und 5c eineGröße von z.B. einigen Millimetern erreicht haben, werden Sie gesammelt (Schritt 400,siehe auch 1) und zusammengefügt, so dass einlockerer Verbund mit einer vorbestimmten quantitativen Zusammensetzungder Gewebekörper 5a, 5b und 5c entsteht.Dieser wird dann mit Hilfe von mechanischen Druckkräften, Ultraschall,mechanischen Vibrationen in die gewünschte Materialzusammensetzungdes Komposits 6 überführt. Hierzuwerden dem Verbund ggf. Vernetzungsmittel, wie z. B. Gele, Kollagenfasern,Geschmackstoffe, Lebensmittelfarbstoffe oder dgl. zugesetzt.
    [0079] DasKomposit 6 besitzt typische Dimensionen von beispielsweiseeinigen 100 μmbis einige mm, kann aber auch größer sein.Bei der Herstellung von Lebensmitteln kann eine Vielzahl von Kompositenzur gewünschtenGröße kombiniertwerden.
    [0080] 9 illustriertschematisch die Formgebung des erfindungsgemäß hergestellten biologischenKomposits am Beispiel von verschiedenen Verfahrensvarianten.
    [0081] Gemäß einerersten Variante (Pfeil A) werden eine Vielzahl von organoiden Körper 2 oderentsprechend gewachsenen Gewebekörperin eine Prägeeinrichtungeingelegt, die bei diesem Beispiel durch ein Kultivierungssubstrat 21 miteiner vorgegebenen Oberflächenstrukturgebildet wird. Auf dem strukturierten Kultivierungssubstrat 21 erfolgtein Wachstum und die Vermehrung des Zellmaterials. Dabei kann durchOberflächenimmobilisierte,molekulare Wachstumsfaktoren (z. B. Proteine) eine bestimmte Differenzierungwährend desZellwachstums induziert werden. Wenn die Oberflächenstruktur des Kultivierungssubstrats 21 ausgefüllt ist,kann das Komposit 6 entnommen werden und ggf. weiter geformtoder mit anderen Kompositen zusammengesetzt werden (Teilbild linksunten).
    [0082] Beider alternativen Variante (Pfeil B) werden die organoiden Körper aufein Trägersubstrat 22 inForm einer dreidimensionalen Matrize aufgebracht. Diese bestehtaus verdaubaren Stoffen, wie z. B. Polymeren, Biopolymeren oderdgl.. Beim Wachstum wandern die Zellen des organoiden Körpers 2 indie Trägereinrichtung 22 ein.Entsprechend könnenmit bandstreifen- oder schichtförmigenTrägereinrichtungverschiedene Grundbausteine geschaffen werden, die zu einem größeren Komposit 6 zusammenfügbar sind(Teilbild rechts unten).
    [0083] 10 zeigtbeispielhaft die Struktureinstellung an einem schichtförmigen Trägersubstrat 22,die analog zur Variante B in 9 mit organoidenKörpernoder Gewebekörpernbewachsen ist, die vorrangig aus Muskelzellen bestehen. Wenn dasTrägersubstrat 22,das bspw. ein dreidimensionales Kollagen-Vlies aus autologem Kollagen umfasst,vollständigdurchdrungen und bewachsen ist, wird das Komposit 6 einem Strompulsausgesetzt. Daraufhin kontrahieren die Muskelzellen im Komposit 6 entgegenden Kräftender Kollagenmatrix. Es wird eine innere Spannung eingestellt, diemit einer erhöhtenFestigkeit des Komposits verbunden ist.
    [0084] Diein der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen und den Zeichnungen offenbartenMerkmale der Erfindung könnensowohl einzeln oder auch in Kombination für die Verwirklichung der Erfindungin ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.
    权利要求:
    Claims (27)
    [1] Verfahren zur Herstellung einer biologischenMaterialzusammensetzung tierischen, nicht-menschlichen Ursprungs,insbesondere als Futter- oder Lebensmittel, umfassend: – Aggregationvon Stammzellen aus differenziertem exokrinen Drüsengewebe eines tierischenOrganismus zu organoiden Körpern,und – Präparationder Materialzusammensetzung aus den organoiden Körpern.
    [2] Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Aggregationder Stammzellen in einem Kulturmedium ohne einen Zusatz erfolgt,der eine Differenzierung von Zellen beeinflusst.
    [3] Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Aggregationder Stammzellen in einem Kulturmedium erfolgt, das mindestens einenZusatz enthält,der eine Differenzierung der Stammzellen bei der Aggregation beeinflusst.
    [4] Verfahren nach mindestens einem der vorhergehendenAnsprüche,bei dem die Aggregation von Stammzellen zu primären organoiden Körpern führt, wobeidie Präparationder Materialzusammensetzung eine Bildung von sekundären organoidenKörpernaus den primärenorganoiden Körpernumfasst.
    [5] Verfahren nach mindestens einem der vorhergehendenAnsprüche,bei dem die Präparationder Materialzusammensetzung ein Wachstum der organoiden Körper zuGewebekörpernumfasst.
    [6] Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, bei dem die Bildungder sekundärenorganoiden Körperund/oder das Wachstum zu Ge webekörpernin einem Kulturmedium ohne einen Zusatz erfolgt, der eine Differenzierung vonZellen beeinflusst.
    [7] Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, bei dem die Bildungder sekundärenorganoiden Körperund/oder das Wachstum zu Gewebekörpernin einem Kulturmedium erfolgt, das mindestens einen Zusatz enthält, durch densich eine Mehrzahl der zu einem organoiden Körper oder Gewebekörper gehörenden Zellenzu einem bestimmten Zelltyp differenziert.
    [8] Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 3 bis7, bei dem die Differenzierung zu mindestens einem der folgendenZelltypen vorgesehen ist: Muskelzellen, Knorpelzellen, Bindegewebezellen,Fettzellen und Enzym-produzierende Zellen.
    [9] Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 3 bis8, bei dem die Differenzierung durch einen Zusatz von differenziertenZellen beeinflusst wird.
    [10] Verfahren nach Anspruch 9, bei dem die Differenzierungdurch einen Zusatz von differenzierten autologen Zellen beeinflusstwird.
    [11] Verfahren nach mindestens einem der vorhergehendenAnsprüche,bei dem bei der Präparationder Materialzusammensetzung wenigstens ein Teil der Zellen in denorganoiden Körpernoder Gewebekörpernlebende Zellen sind.
    [12] Verfahren nach mindestens einem der vorhergehendenAnsprüche1 bis 10, bei dem bei der Präparationder Materialzusammensetzung die Zellen in den organoiden Körpern oderGewebekörpernin einem toten Zustand sind.
    [13] Verfahren nach mindestens einem der vorhergehendenAnsprüche,bei dem die Präparationder Materialzusammensetzung ein Zusammenfügen der organoiden Körper oderder Gewebekörperzu einem Komposit umfasst.
    [14] Verfahren nach Anspruch 13, bei dem beim Zusammenfügen eineVielzahl von organoiden Körpern oderGewebekörpernwenigstens einem der folgenden Schritte unterzogen werden: – Zusammenwachsen, – gegenseitigesadhärentesAnhaften, – Verdichten,und – Ladenauf oder in eine Trägereinrichtung.
    [15] Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, bei dem dasKomposit nach dem Zusammenfügenweiter wächst.
    [16] Verfahren nach Anspruch 15, bei dem bei der Präparationdie Form des Komposits durch dessen Wachstum eingestellt wird.
    [17] Verfahren nach mindestens einem der vorhergehendenAnsprüche,bei dem bei der Präparationdie Form des Komposits durch die Form einer Prägeeinrichtung eingestellt wird.
    [18] Verfahren nach Anspruch 17, bei dem als Prägeeinrichtungein Kultivierungssubstrat, eine Prägeoberfläche oder ein flexibler Behälter verwendetwird.
    [19] Verfahren nach mindestens einem der vorhergehendenAnsprüche,bei dem bei der Präparationeine innere Struktur der Materialzusammensetzung eingestellt wird.
    [20] Verfahren nach Anspruch 19, bei dem die Strukturder Materialzusammensetzung durch eine Einwirkung eines elektrischenStroms eingestellt wird.
    [21] Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 20, bei dem dasKomposit aus verschieden differenzierten organoiden Körpern oderaus Gewebekörpernzusammengefügtwird, die jeweils aus verschieden differenzierten organoiden Körpern gewachsensind.
    [22] Verfahren nach mindestens einem der vorhergehendenAnsprüche,bei dem ein Zusatz von Geschmacksstoffen vorgesehen ist.
    [23] Verfahren nach mindestens einem der vorhergehendenAnsprüche,bei dem die Stammzellen aus Drüsengewebeeines Wirbeltieres isoliert werden.
    [24] Verfahren nach Anspruch 23, bei dem die Stammzellenaus Drüsengewebeeines Fisches, eines Vogels oder eines nicht-menschlichen Säugetieresisoliert werden.
    [25] Biologische Materialzusammensetzung, die durch einVerfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche hergestelltist.
    [26] Verwendung einer Materialzusammensetzung nach Anspruch25 als Futter oder Lebensmittel.
    [27] Verwendung einer Materialzusammensetzung nach Anspruch25 zur Herstellung eines synthetischen Fleischprodukts.
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