Fluorescence microscope with total internal reflection

专利摘要:
Ein Kondensor (27) ist an einer Stelle angeordnet, die über eine Probe (25) hinweg einer Objektivlinse (20) gegenüberliegt. Ein Reflexionsspiegel (47) ist beweglich in der Nähe eines äußersten Teils eines Durchlassbeleuchtungslichtwegs auf der Seite einer Durchlassbeleuchtungslichtquelle von dem Kondensor (27) aus angeordnet. Außerdem wird ein von einer Laseroszillatoreinheit ausgegebener Laserstrahl von dem Reflexionsspiegel reflektiert und fällt auf den Kondensor (27) ein.A condenser (27) is arranged at a point which is opposite an objective lens (20) over a sample (25). A reflection mirror (47) is movably arranged near an outermost part of a transmission lighting light path on the side of a transmission lighting light source from the condenser (27). In addition, a laser beam output by a laser oscillator unit is reflected by the reflection mirror and is incident on the condenser (27).
公开号:DE102004015587A1
申请号:DE200410015587
申请日:2004-03-30
公开日:2004-11-11
发明作者:Yasushi Hachioji Aono；Tsuyoshi Hachioji Mochizuki；Kazuhiko Hachioji Osa
申请人:Olympus Corp；
IPC主号:G01N21-64

专利说明:
[0001] Dievorliegende Erfindung betrifft ein Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopzur Durchführungeiner Fluoreszenzbeobachtung mit Hilfe des durch eine Totalreflexionsbeleuchtungerzeugten evaneszenten Lichts.TheThe present invention relates to a total reflection fluorescence microscopeto carry outfluorescence observation with the aid of total reflection illuminationgenerated evanescent light.
[0002] Inden letzten Jahren hat die Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie(nachfolgend TIRFM bezeichnet) Aufmerksamkeit als Mikroskop zurFluoreszenzbeobachtung von Lebewesen gewonnen. Bei der TIRFM wird Beleuchtungslichtan einer Grenzflächezwischen einem Deckglas und einer Probe total reflektiert, wobeieine fluoreszierende Substanz von Licht angeregt wird, das evaneszentesLicht genannt wird und in eine kleine Region mit einer Größe von einigenhundert nm oder weniger auf Seiten der Probe eindringt. Nur dieFluoreszenz der kleinen Region in der Nähe des Deckglases wird beider TIRFM beobachtet. Ein TIRFM-Beobachtungsbild liefert einen sehrdunklen Hintergrund. Dementsprechend ist es möglich, Fluoreszenz mit starkemKontrast und schwacher Fluoreszenz zu beobachten.InIn recent years, total reflection fluorescence microscopy has been used(hereinafter referred to as TIRFM) Attention as a microscope forFluorescence observation of living beings obtained. The TIRFM uses illuminating lightat an interfacetotally reflected between a coverslip and a sample, wherebya fluorescent substance is excited by light, the evanescentIs called light and in a small region with a size of somehundred nm or less penetrates on the sample side. Only thatFluorescence of the small region near the cover slip is reducedthe TIRFM observed. A TIRFM observation picture gives you a lotdark background. Accordingly, it is possible to use strong fluorescenceContrast and weak fluorescence can be observed.
[0003] Anbiologischen Forschungsstätten,die TIRFM anwenden, gibt es zudem den Fall, dass eine dünne Schichtmit gutem Kontrast in der Näheder Grenzflächezwischen dem Deckglas und der Probe beobachtet werden soll, sowieden Fall, dass das evaneszente Licht bis zu einem gewissen Gradan Tiefe reicht, um einen breiten Bereich zu beobachten. Es istdaher wünschenswert,die Eindringtiefe des evaneszenten Lichts abhängig von der Probe ändern zukönnen.Onbiological research centers,Apply the TIRFM, there is also the case that a thin layerwith good contrast nearbythe interfacebetween the cover slip and the sample to be observed, andthe case that the evanescent light to a certain extentenough depth to observe a wide range. It istherefore desirablethe penetration depth of the evanescent light changes depending on the samplecan.
[0004] DieEindringtiefe des evaneszenten Lichts ausgehend von der Grenzfläche istbeispielsweise in der Schrift „TotalInternat Reflection Fluorescence at Biological Surfaces" von D. Axelrod beschrieben.Demnach gilt die folgende Gleichung:
[0005] DieEindringtiefe d des evaneszenten Lichts wird demgemäss kleiner,wenn der Einfallswinkel θ₁ des Beleuchtungslichts gegenüber derGrenzfläche,also der Neigungswinkel des Beleuchtungslichts gegenüber derNormalen zur Grenzfläche,größer wird.Bei der wirklichen TIRFM wird ein hochkohärenter Laserstrahl verwendetund der Einfallswinkel des Beleuchtungslichts justiert. Dementsprechend ändert sichder Einfallswinkel des Laserstrahls auf die Grenzfläche, wobeidie Eindringtiefe des evaneszenten Lichts eingestellt wird.The penetration depth d of the evanescent light accordingly becomes smaller if the angle of incidence θ _{1 of} the illuminating light with respect to the interface, that is to say the angle of inclination of the illuminating light with respect to the normal to the interface, becomes greater. The real TIRFM uses a highly coherent laser beam and adjusts the angle of incidence of the illuminating light. The angle of incidence of the laser beam on the interface changes accordingly, the depth of penetration of the evanescent light being adjusted.
[0006] Die 17A bis 17C sind Darstellungen, die die Funktionsweisedes in dem japanischen Patent Nr. 3093145 beschriebenen TIRFM zeigen.Eine Objektivlinse 1 besitzt eine numerische Apertur, dieeine Totalreflexionsbeleuchtung ermöglicht. Eine Probe 3 wirdauf ein Deckglas 2 gesetzt. Ein Spiegel 4 istin einer Richtung beweglich, die die Richtung der optischen Achseder Objektivlinse 1 rechtwinklig schneidet.The 17A to 17C are diagrams showing the operation of the TIRFM described in Japanese Patent No. 3093145. An objective lens 1 has a numerical aperture that enables total reflection illumination. A sample 3 is on a coverslip 2 set. A mirror 4 is movable in a direction that is the direction of the optical axis of the objective lens 1 cuts at right angles.
[0007] Aufden Spiegel 4 fälltein Laserstrahl 5 zur Verwendung als Beleuchtungslichtein. Wie in den 17A bis 17C gezeigt, bewegt sichder Spiegel dabei in einer die optische Achsrichtung der Objektivlinse 1 rechtwinkligschneidenden Richtung. Die Einfallsposition des auf die Objektivlinse 1 einfallendenLaserstrahls bewegt sich daher in Richtung weg von der optischenAchse der Objektivlinse 1. Infolge der Bewegung der Einfallspositiondes Laserstrahls ändertsich der Einfallswinkel des Laserstrahls 5, der von derObjektivlinse 1 zu der Grenzfläche zwischen dem Deckglas 2 undder Probe 3 ausgestrahlt wird. Der von der Objektivlinse 1 ausgehendeLaserstrahl 5 wird an der Grenzfläche zwischen dem Deckglas 2 undder Probe 3 überein Immersionsöl 6 totalreflektiert, wie in 17C gezeigt.On the mirror 4 a laser beam falls 5 for use as an illuminating light. As in the 17A to 17C shown, the mirror moves in an optical axis direction of the objective lens 1 right-angled direction. The incident position of the on the objective lens 1 incident laser beam therefore moves in the direction away from the optical axis of the objective lens 1 , As a result of the movement of the incident position of the laser beam, the angle of incidence of the laser beam changes 5 from the objective lens 1 to the interface between the cover slip 2 and the sample 3 is broadcast. The one from the objective lens 1 outgoing laser beam 5 is at the interface between the coverslip 2 and the sample 3 about an immersion oil 6 totally reflected, like in 17C shown.
[0008] 18 ist eine Darstellung,die den Aufbau eines in der japanischen Patentanmeldung mit derKOKAI-Veröffentlichungsnummer2001-013413 beschriebenen TIRFM zeigt. Das TIRFM umfasst eine Laserbeleuchtungsvorrichtung 7,welche einen Laserstrahl 5 ausgibt. Der Laserstrahl 5 fällt in demTIRFM auf eine Seitenfläche 10 einerKugellinse 9 eines Kondensors 8 zur Transmissionsbeleuchtungein, und es ist eine Totalreflexionsbeleuchtung möglich. DieLaserbeleuchtungsvorrichtung 7 ist relativ zu einem Hauptkörper 11 des Mikroskopsdrehbar. Die Laserbeleuchtungsvorrichtung 7 dreht sichum einen Schnittpunkt der Grenzfläche des Deckglases 2 undder Probe 3 mit der optischen Beobachtungsachse. Dementsprechend ändert derLaserstrahl 5 seinen Einfallswinkel gegenüber derGrenzflächezwischen dem Deckglas 2 und der Probe 3. 18 Fig. 11 is a diagram showing the structure of a TIRFM described in Japanese Patent Application KOKAI Publication No. 2001-013413. The TIRFM includes a laser lighting device 7 which is a laser beam 5 outputs. The laser beam 5 falls on a side surface in the TIRFM 10 a spherical lens 9 a condenser 8th for transmission lighting, and total reflection lighting is possible. The laser lighting device 7 is relative to a main body 11 of the microscope rotatable. The laser lighting device 7 revolves around an intersection of the cover glass interface 2 and the sample 3 with the optical observation axis. The laser beam changes accordingly 5 its angle of incidence relative to the interface between the cover slip 2 and the sample 3 ,
[0009] DerEinfallswinkel des Laserstahls 5 muss außerdem umeinen kritischen Winkel oder mehr geneigt sein, bei dem Totalreflexionauftritt. Unter der Annahme, dass der Brechungsindex auf der Seitedes Deckglases 2 an der Grenzfläche zwischen dem Deckglas 2 undder Probe 3 n₁ ist und der Brechungsindexauf der Seite der Probe 3 n₂ ist,ist dabei der kritische Winkel θ_c durch die folgende Gleichung (2) dargestellt: sinθ_c =n₂/n₁ (2) The angle of incidence of the laser steel 5 must also be tilted by a critical angle or more at which total reflection occurs. Assuming that the refractive index is on the side of the coverslip 2 at the interface between the coverslip 2 and the sample 3 n is ₁ and the refractive index on the sample side 3 n is ₂ , the critical angle θ _{c is represented} by the following equation (2): sinθ _c = n ₂ / n ₁ (2)
[0010] DieBedingung fürden Einfallswinkel θ₁ zur Realisierung einer Totalreflexionsbeleuchtungist daher durch die folgende Gleichung (3) dargestellt: n1·sinθ₁ > n₂ (3) The condition for the angle of incidence θ ₁ for realizing total reflection illumination is therefore represented by the following equation (3): n1 · sinθ ₁ > n ₂ (3)
[0011] Wasdagegen die Neigung des einfallenden Lichts des durch die Objektivlinse 1 hindurchgehenden Laserstrahls 5 anbelangt,wie im japanischen Patent Nr. 3093145, gezeigt in den 17A bis 17C, so hängt der maximale Einfallswinkel θmax, dereingestellt werden kann, von der numerischen Apertur (NA) der Objektivlinse 1 abund ist durch die folgende Gleichung (4) dargestellt: n₁·sinθmax = NA (4) On the other hand, what is the inclination of the incident light through the objective lens 1 passing laser beam 5 as shown in Japanese Patent No. 3093145 shown in U.S. Pat 17A to 17C , the maximum angle of incidence θmax that can be set depends on the numerical aperture (NA) of the objective lens 1 and is represented by the following equation (4): n ₁ Sinθmax = NA (4)
[0012] Für die Bedingungenzur Realisierung einer Totalreflexionsbeleuchtung muss daher dieNA der Objektivlinse 1 größer als der Brechungsindexn₂ sein.The NA of the objective lens must therefore be met for the conditions for realizing total reflection illumination 1 be greater than the refractive index n ₂ .
[0013] Imallgemeinen beträgtder Brechungsindex einer lebenden Zelle etwa 1,37 bis 1,38. DieNA der Objektivlinse 1 muss für den Gebrauch minimal etwa1,4 sein.In general, the refractive index of a living cell is about 1.37 to 1.38. The NA of the objective lens 1 must be at least about 1.4 for use.
[0014] Gegenwärtig istdie Vergrößerung einerObjektivlinse mit einer NA von 1,4 oder mehr auf eine hohe Vergrößerung des60-fachen oder mehr begrenzt. Um eine hohe NA der Objektivlinse 1 beigeringer Vergrößerung zuverwirklichen, muss der effektive Durchmesser der Objektivlinse 1 vergrößert werden.Es ist allerdings schwierig, den effektiven Durchmesser der Objektivlinse 1 zuvergrößern undgleichzeitig einen Standarddurchmesser für eine Anbringungsschraubeder Objektivlinse 1 beizubehalten. Bei dem in den 17A bis 17C gezeigten TIRFM ist daher eine Totalreflexionsfluoreszenzbeobachtungbei einer Vergrößerung des 20-oder 40-fachen unmöglich.Currently, the magnification of an objective lens with an NA of 1.4 or more is limited to a high magnification of 60 times or more. To a high NA of the objective lens 1 To realize at low magnification, the effective diameter of the objective lens 1 be enlarged. However, it is difficult to determine the effective diameter of the objective lens 1 to enlarge and at the same time a standard diameter for an attachment screw of the objective lens 1 maintain. In the in the 17A to 17C TIRFM shown is therefore a total reflection fluorescence observation with a magnification of 20 or 40 times impossible.
[0015] Wennbei dem in 18 gezeigtenTIRFM der Laserstrahl 5 von der Seite des Kondensors 8 zur Transmissionsbeleuchtungeinfällt,kann der Beleuchtungsbereich unabhängig von der Objektivlinse 1 eingestelltwerden. Dementsprechend ist mit der Objektivlinse 1 eineTotalreflexionsfluoreszenzbeobachtung bei geringer Vergrößerung möglich.If at the in 18 shown TIRFM the laser beam 5 from the side of the condenser 8th for transmission lighting, the lighting area can be independent of the objective lens 1 can be set. Accordingly, with the objective lens 1 total reflection fluorescence observation possible at low magnification.
[0016] Beidem in 18 gezeigtenTIRFM ist die Laserbeleuchungsvorrichtung 7 jedoch gleichneben der Kugellinse 9 des Kondensors 8 zur Transmissionsbeleuchtungangeordnet. Auch muss die Laserbeleuchtungsvorrichtung 7 selbstgedreht werden können.Es ist daher beträchtlicherPlatz erforderlich füreine Halterung eines Drehmechanismus sowie Raum für die Bahnder verschwenkten Laserbeleuchtungsvorrichtung 7. Folglichist der Raum, in dem die Probe 3 platziert wird, eingeschränkt.At the in 18 TIRFM shown is the laser lighting device 7 but right next to the ball lens 9 of the condenser 8th arranged for transmission lighting. The laser lighting device must also 7 can be rotated yourself. Considerable space is therefore required for mounting a rotating mechanism and space for the path of the pivoted laser lighting device 7 , Consequently, the room in which the sample is 3 placed, restricted.
[0017] Eswird angenommen, dass die Funktionseigenschaften merklich beeinträchtigt werden.Itit is assumed that the functional properties are noticeably impaired.
[0018] DerEinstrahlungsbereich des Laserstrahls wird in solcher Weise festgelegt,dass ein Beobachtungsbereich der Objektivlinse 1 mit geringererVergrößerung beleuchtetwerden kann. Es wird dann bei einer Beobachtung mit der Objektivlinse 1 mitder geringen Vergrößerung lediglichein Teil des Einstrahlungsbereichs des Laserstrahls beobachtet.Der Laserstrahl, mit dem andere Teile bestrahlt werden, ist dahernutzlos.The irradiation area of the laser beam is determined in such a way that an observation area of the objective lens 1 can be illuminated with lower magnification. It then becomes an observation with the objective lens 1 only a part of the irradiation area of the laser beam was observed with the low magnification. The laser beam with which other parts are irradiated is therefore useless.
[0019] DieEnergiedichte des Laserstrahls auf der Oberfläche der Probe 3 istungefährproportional zur Einstrahlungsfläche.Bei einer Beobachtung mit der Objektivlinse 1 bei geringerVergrößerung istder Einstrahlungsbereich des Laserstrahls so komprimiert, dass lediglichder fürdie Beobachtung benötigteBereich beleuchtet wird, wobei die Energiedichte des Laserstrahlsvorzugsweise erhöhtist.The energy density of the laser beam on the surface of the sample 3 is approximately proportional to the irradiation area. When observing with the objective lens 1 at low magnification, the irradiation area of the laser beam is compressed so that only the area required for observation is illuminated, the energy density of the laser beam preferably being increased.
[0020] Esgibt speziell ein Experiment zum Zweck der Erfassung sehr schwacherFluoreszenz wie etwa eines einzelnen Moleküls. Bei diesem Experiment mussdie Einstrahlungsenergiedichte des Laserstrahls so groß wie möglich sein.Bei einem TIRFM ist andererseits die Eindringtiefe des evaneszentenLichts veränderbar.In jüngerenJahren hat sich das TIRFM in biologischen Forschungsstätten verbreitet.Zudem hat eine Nachfrage nach gleichzeitiger Beleuchtung mit mehrerenoptischen Wellenlängenin optischen Tiefen eingesetzt.There is specifically an experiment for the purpose of detecting very weak fluorescence, such as a single molecule. In this experiment, the irradiation energy density of the laser beam must be as large as possible. With a TIRFM, on the other hand, the penetration depth of evanescent light can be changed. In recent years, the TIRFM has spread to biological research centers. It also has a demand after simultaneous illumination with several optical wavelengths used in optical depths.
[0021] DieserHintergrund hat die folgenden tatsächlichen Umstände. Verbesserungenfluoreszierender Proteine wie etwa GFP sind vorangeschritten, undes ist leicht geworden, einen dynamischen Zustand oder eine Funktioneiner lebenden Zelle mit mehrfarbiger Fluoreszenz zu beobachten.Darüberhinaushängt dieEindringtiefe des evaneszenten Lichts auch von der Wellenlänge desLichts ab, wie auch aus der Axelrod-Formel (Gleichung (1)) gesehenwerden kann. Daher besteht das prinzipielle Problem, dass bei unterschiedlicherWellenlängeselbst bei gleichem Laserstrahlein fallswinkel der zu beobachtendeBereich unterschiedlich ist. Es gibt auch das realistische Problem,dass die tiefenmäßige Positionvon Gewebe in einer Zelle entsprechend der jeweiligen Wellenlänge verschiedenist.ThisBackground has the following actual circumstances. improvementsfluorescent proteins such as GFP have advanced, andit has become easy, a dynamic state or a functionto observe a living cell with multicolored fluorescence.Furthermorehangs thePenetration depth of evanescent light also from the wavelength of theLight as seen from the Axelrod formula (equation (1))can be. Therefore there is the fundamental problem that with differentwavelengththe angle of observation to be observed even with the same laser beamArea is different. There's also the realistic problemthat the deep positiondifferent from tissue in a cell according to the respective wavelengthis.
[0022] Beieinem TIRFM ist es möglich,den Einfallswinkel oder die Wellenlänge des Laserstrahls mit Hilfe mechanischerMittel oder elektrischer Antriebsmittel, wie etwa einem Motor, raschzu verstellen. In Fällenjedoch, wo gleichzeitige Eigenschaften in strenger Bedeutung erforderlichsind, etwa in dem Fall, dass einer schnellen Erscheinung nachgespürt wird,bestehen Einschränkungenbeim raschen Umstellen. In diesem Fall ist es notwendig, einleitendeTeile der Laserstrahlen, die sich an mehreren Orten befinden, gleichzeitigeinzustrahlen.ata TIRFM it is possiblethe angle of incidence or the wavelength of the laser beam using mechanicalMeans or electrical drive means, such as a motor, quicklyto adjust. In caseshowever, where simultaneous properties are required in strict importancein the event that a rapid appearance is tracked down,there are restrictionswhen changing over quickly. In this case, it is necessary to initiateParts of the laser beams that are located in several locations at the same timeirradiate.
[0023] Beidem in 17A gezeigtenTIRFM wird allerdings ein dichroitischer Spiegel verwendet, um denLaserstrahl auf Seiten der Objektivlinse 1 zu reflektierenund die Fluoreszenz auf der Beobachtungsseite weiterzutragen.At the in 17A TIRFM shown, however, uses a dichroic mirror to the laser beam on the side of the objective lens 1 to reflect and carry the fluorescence on the observation side.
[0024] Wennferner mit einer Mehrzahl von Wellenlängen eingestrahlt werden soll,muss der dichroitische Spiegel Wellenlängeneigenschaften des entsprechendenMultibands besitzen. Ein dichroitischer Multiband-Spiegel ist sehrschwierig herzustellen und ist teuer. Außerdem weist ein dichroitischerMultiband-Spiegel einen sehr schlechten Grad an Wellenlängenseparationauf, weswegen die Helligkeit und das SR-Verhältnis des Fluoreszenzbildsverschlechtert sind. Wenn die Beleuchtungswellenlängen aufhalbem Weg weiter angehoben werden sollen, muss der dichroitischeSpiegel wieder neu präpariertwerden.Ifto be irradiated with a plurality of wavelengths,the dichroic mirror must have the corresponding wavelength propertiesOwn multibands. A dichroic multiband mirror is verydifficult to manufacture and expensive. Also shows a dichroicMultiband mirrors a very poor level of wavelength separationon why the brightness and SR ratio of the fluorescent imageare deteriorated. When the lighting wavelengths onhalfway up the dichroicMirror prepared againbecome.
[0025] Umauf der anderen Seite die Verwendung eines dichroitischen Spiegelszu vermeiden, wie in 19 gezeigt,ist es möglich,einen Totalreflexionsspiegel 12 an der Stelle des äußerstenBereichs der Pupillenöffnungder Objektivlinse 1 anzuordnen. Es ist freilich notwendig,einen weiteren Totalreflexionsspiegel 13 ebenfalls im äußerstenBereich der Pupillenöffnungder Objektivlinse 1 auf der gegenüberliegenden Seite anzuordnen,um zu verhindern, dass der an der Grenzfläche zwischen dem Deckglas undder Probe 3 total reflektierte Laserstrahl 5 aufder Beobachtungsseite durchgeht.On the other hand, to avoid using a dichroic mirror, as in 19 shown, it is possible to have a total reflection level 12 at the location of the outermost region of the pupil opening of the objective lens 1 to arrange. Of course, it is necessary to add another total reflection mirror 13 also in the outermost area of the pupil opening of the objective lens 1 to be placed on the opposite side to prevent that at the interface between the coverslip and the sample 3 totally reflected laser beam 5 goes through on the observation side.
[0026] Durchdie Totalreflexionsspiegel 12, 13 geht daher einbeträchtlicherTeil der Pupillenöffnungder Objektivlinse 1 verloren, die ursprünglich zu 100 % zur Beobachtunggenutzt werden sollte. Das Vermögender Objektivlinse 1 wird daher verschlechtert.Through the total reflection mirror 12 . 13 therefore goes a considerable part of the pupil opening of the objective lens 1 lost, which was originally intended to be used 100% for observation. The property of the objective lens 1 is therefore deteriorated.
[0027] Beidem in 18 gezeigtenTIRFM ist die Laserbeleuchtungsvorrichtung 7, wie zuvorbeschrieben, direkt neben der Kugellinse 9 des Kondensors 8 zurTransmissionsbeleuchtung angeordnet, und die Laserbeleuchtungsvorrichtung 7 selbstmuss außerdemschwenkbar sein. Daher ist ein beträchtlicher Platz erforderlich einschließlich desRaums fürdie Bahn der Halterung des Schwenkmechanismus oder der verschwenktenLaserbeleuchtungsvorrichtung 7. Wenn bei dieser Ausbildungeine Laserbeleuchtungsvorrichtung 7 mit einer Emissionswinkeleinstelleinheitfür unabhängige Laserstrahlenvorzusehen ist, könnenmaximal zwei Laserbeleuchtungsvorrichtungen auf gegenüberliegendenSeiten des Kondensors 8 zur Transmissionsbeleuchtung vorgesehenwerden.At the in 18 TIRFM shown is the laser lighting device 7 , as described above, right next to the ball lens 9 of the condenser 8th arranged for transmission lighting, and the laser lighting device 7 itself must also be pivotable. Therefore, a considerable space is required including the space for the path of the holder of the pivot mechanism or the pivoted laser lighting device 7 , If with this training a laser lighting device 7 With an emission angle setting unit for independent laser beams, a maximum of two laser lighting devices can be provided on opposite sides of the condenser 8th be provided for transmission lighting.
[0028] JedesTIRFM hat daneben ein gemeinsames Problem. Es gibt den Fall, dassmehrere Wellenlängen mitHilfe evaneszenten Lichts unterschiedlicher Tiefen beobachtet werden.Wenn beispielsweise ein oberflächlicherBereich mit B-Anregung beobachtet wird und ein tiefer Bereich mitG-Anregung beobachtet wird, können dieB- und G-Anregungengleichzeitig nur in dem oberflächlichenBereich beobachtet werden. Das Bild der G-Anregung kann in diesemFall nur als defokussiertes Hintergrundbild beobachtet werden. Deswegenwird die gesamte Zellhüllebeispielsweise mittels eines Fluoreszenzreagens gefärbt, unddas Bild des TIRFM im tiefen Bereich kann nur für begrenzte Anwendungen genutztwerden, etwa zur Abschätzungder ungefähren Größe einerZelle.eachTIRFM also has a common problem. There is a case thatseveral wavelengths withEvanescent light of different depths can be observed.For example, if a superficialArea with B excitation is observed and a deep area withG excitation is observed, theB and G suggestionsat the same time only in the superficialArea to be observed. The image of the G excitation can be found in thisCase can only be observed as a defocused background image. thereforebecomes the entire cell envelopefor example stained with a fluorescent reagent, andthe image of the TIRFM in the deep area can only be used for limited applications, for example, for assessmentthe approximate size of oneCell.
[0029] Beifeststehender Objektivlinse könnenOberflächenin unterschiedlichen Tiefen gleichzeitig beobachtet werden. DieAnwendung eines Mehrwellenlängen-TIRFM kanndann weiter auf die gleichzeitige Beobachtung der Formen von kleinenOrganen in der Näheder Zellhülleund innerhalb der Zelle ausgedehnt werden.With a fixed objective lens, surfaces at different depths can be observed simultaneously. The application of a multi-wavelength TIRFM can then continue on to simultaneous observation expansion of the shape of small organs near the cell envelope and within the cell.
[0030] Gemäß einemHauptaspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Totalreflexionsfluoreszenzmikroskop vorgesehenmit: mindestens einer Objektivlinse, welche Licht von einer Probeentgegennimmt; einer Bildaufnahmevorrichtung, welche ein Bild desin die Objektivlinse eingeleiteten Lichts aufnimmt; einem optischenBeobachtungsweg, überden das in die Objektivlinse eingeleitete Licht auf die Bildaufnahmevorrichtungkonzentriert wird; einem Kondensor, welcher an einer der Objektivlinse über dieProbe hinweg gegenüberliegenden Stelleangeordnet ist und eine numerische Apertur besitzt, die eine Totalreflexionsbeleuchtungmöglichmacht, und Durchlassbeleuchtungslicht in die Probe leitet; sowieeiner Lasereinleitungssektion, welche den Einfall eines Laserstrahlsin einer den optischen Weg des Durchlassbeleuchtungslichts rechtwinkligschneidenden Richtung gestattet und den einfallenden Laserstrahlauf Seiten des Kondensors nahe eines äußersten Teils des Wegs desDurchlassbeleuchtungslichts einleitet.According to oneThe main aspect of the present invention is a total reflection fluorescence microscopewith: at least one objective lens, which light from a sampleanswers; an image pickup device which receives an image of thereceives light introduced into the objective lens; an opticalObservation path, viathe light introduced into the objective lens onto the image pickup deviceis concentrated; a condenser, which is attached to one of the objective lensesOpposite pointis arranged and has a numerical aperture, the total reflection illuminationpossiblemakes, and directs transmission illumination light into the sample; such asa laser initiation section that detects the incidence of a laser beamin a right angle the optical path of the transmission illuminating lightcutting direction and the incident laser beamon the condenser side near an outermost part of the path of thePass-through lighting initiates.
[0031] 1 ist eine Darstellung,die den Aufbau einer ersten Ausführungsformeines TIRFM gemäß der vorliegendenErfindung zeigt; 1 Fig. 12 is a diagram showing the structure of a first embodiment of a TIRFM according to the present invention;
[0032] 2 ist eine Darstellung,die den Aufbau einer zweiten Ausführungsform des erfindungsgemäßen TIRFMzeigt; 2 Fig. 12 is a diagram showing the construction of a second embodiment of the TIRFM according to the invention;
[0033] 3 ist eine vergrößerte Draufsichtvon oben auf eine Konversionslinseneinheit in dem TIRFM; 3 Fig. 4 is an enlarged top plan view of a conversion lens unit in the TIRFM;
[0034] 4 ist eine vergrößerte Draufsichtvon oben auf die Konversionslinseneinheit in dem TIRFM; 4 Fig. 3 is an enlarged top plan view of the conversion lens unit in the TIRFM;
[0035] 5 ist eine Darstellung,die den Aufbau einer dritten Ausführungsform des TIRFM der vorliegenden Erfindungzeigt; 5 Fig. 12 is a diagram showing the construction of a third embodiment of the TIRFM of the present invention;
[0036] 6 ist eine Darstellung,die einen jeweiligen Objektivlinsenwechselmechanismus in dem TIRFM zeigt; 6 Fig. 12 is a diagram showing a respective objective lens changing mechanism in the TIRFM;
[0037] 7A ist eine Darstellung,die den Aufbau der Konversionslinseneinheit bei einer vierten Ausführungsformdes TIRFM der vorliegenden Erfindung zeigt; 7A Fig. 12 is a diagram showing the construction of the conversion lens unit in a fourth embodiment of the TIRFM of the present invention;
[0038] 7B ist eine Darstellung,die die Funktionsweise der Konversionslinseneinheit zeigt; 7B Fig. 12 is an illustration showing the operation of the conversion lens unit;
[0039] 8 ist eine Darstellung,die den Aufbau einer Abwandlung einer vierten Ausführungsformder vorliegenden Erfindung zeigt; 8th Fig. 12 is an illustration showing the construction of a modification of a fourth embodiment of the present invention;
[0040] 9 ist eine Darstellung,die den Aufbau einer fünftenAusführungsformdes TIRFM der vorliegenden Erfindung zeigt; 9 Fig. 12 is a diagram showing the construction of a fifth embodiment of the TIRFM of the present invention;
[0041] 10 ist eine Darstellung,die die Anordnung einer jeweiligen Lasereinleitungssektion in demTIRFM zeigt; 10 Fig. 12 is a diagram showing the arrangement of each laser initiation section in the TIRFM;
[0042] 11 ist eine Darstellung,die den Zusammenhang zwischen Wellenlängen zeigt, welche von einem jeweiligendichroitischen Spiegel und einem Emissionsfilter in dem TIRFM separiertwerden; 11 Fig. 12 is a graph showing the relationship between wavelengths separated by a respective dichroic mirror and an emission filter in the TIRFM;
[0043] 12 ist eine Darstellung,die den Aufbau einer Abwandlung des TIRFM zeigt; 12 Fig. 12 is a diagram showing the construction of a modification of the TIRFM;
[0044] 13 ist eine Darstellungdes Aufbaus eines Laserkombinierers in dem TIRFM; 13 Fig. 4 is an illustration of the construction of a laser combiner in the TIRFM;
[0045] 14 ist eine Darstellung,die den Aufbau einer fünftenAusführungsformdes TIRFM der vorliegenden Erfindung zeigt; 14 Fig. 12 is a diagram showing the construction of a fifth embodiment of the TIRFM of the present invention;
[0046] 15 ist eine vergrößerte Ansichtdes Innenlebens des optischen Proben- und Beobachtungswegs in demTIRFM; 15 Fig. 4 is an enlarged view of the inside of the optical sample and observation path in the TIRFM;
[0047] 16 ist eine Darstellung,die einen Zustand zeigt, in dem eine Bilderzeugungsposition vonFluoreszenz, die von einer fluoreszierenden Substanz ausgestrahltwird, mit einer Bildaufnahmeflächeeiner Bildaufnahmevorrichtung in dem TIRFM übereinstimmt; 16 Fig. 12 is a diagram showing a state in which an imaging position of fluorescence emitted from a fluorescent substance matches an imaging surface of an imaging device in the TIRFM;
[0048] 17A ist eine Darstellung,die die Arbeitsweise eines herkömmlichenTIRFM zeigt; 17A Fig. 12 is an illustration showing the operation of a conventional TIRFM;
[0049] 17B ist eine Darstellung,die die Arbeitsweise des herkömmlichenTIRFM zeigt; 17B Fig. 12 is an illustration showing the operation of the conventional TIRFM;
[0050] 17C ist eine Darstellung,die die Arbeitsweise des herkömmlichenTIRFM zeigt; 17C Fig. 12 is an illustration showing the operation of the conventional TIRFM;
[0051] 18 ist eine Darstellungdes Aufbaus des herkömmlichenTIRFM; und 18 Fig. 4 is an illustration of the construction of the conventional TIRFM; and
[0052] 19 ist eine Darstellungdes Aufbaus des herkömmlichenTIRFM. 19 is an illustration of the structure of the conventional TIRFM.
[0053] Eineerste Ausführungsformder vorliegenden Erfindung wird nachfolgend mit Bezug auf die Zeichnungenbeschrieben.Afirst embodimentThe present invention will hereinafter be described with reference to the drawingsdescribed.
[0054] 1 ist eine Darstellung desAufbaus eines Totalreflexionsfluoreszenzmikroskops (TIRFM) vom aufrechtstehendenTyp. Eine Bilderzeugungslinse 21, ein Emissionsfilter 22 sowieeine Bildaufnahmevorrichtung 23 sind auf einem optischenBeobachtungs weg Q einer Objektivlinse 20 angeordnet. DasEmissionsfilter 22 ist ein Bandpassfilter, das Licht lediglicheines bestimmten Wellenlängenbands λ_E1 durchlässt, welcheslänger alsdie Wellenlänge λ_L1 einesLaserstrahls ist, der von einer später beschriebenen Laseroszillatoreinheit 32 abgegebenwird. Die Bildaufnahmevorrichtung 23 ist am Ort des Fokusder Bilderzeugungslinse 21 angeordnet. 1 Fig. 3 is an illustration of the structure of an upright type total reflection fluorescence microscope (TIRFM). An imaging lens 21 , an emission filter 22 and an image pickup device 23 are on an optical observation path Q of an objective lens 20 arranged. The emission filter 22 is a band pass filter which only allows light of a certain wavelength band λ _{E1 to} pass, which is longer than the wavelength λ _{L1 of} a laser beam from a laser oscillator unit described later 32 is delivered. The imaging device 23 is at the focus of the imaging lens 21 arranged.
[0055] Unterder Objektivlinse 20 ist ein Beobachtungsschiebeglas 24 angeordnet.Auf das Schiebeglas 24 wird eine Probe 25 gesetzt.Die Probe 25 wird mit einem Deckglas 26 abgedeckt.Under the objective lens 20 is an observation sliding glass 24 arranged. On the sliding glass 24 becomes a rehearsal 25 set. The sample 25 comes with a coverslip 26 covered.
[0056] EinKondensor 27 ist an einer Stelle angeordnet, die der Objektivlinse 20 über dasSchiebeglas 24 hinweg gegenüberliegt. Der Kondensor 27 befindetsich auf einer Basis 28. Auf die Spitze des Kondensors 27 ist einImmersionsöl 29 getropftbzw. dort angebracht. Das Immersionsöl 29 wird demgemäß zwischendem Kondensor 27 und dem Schiebeglas 24 geladen.A condenser 27 is located at a location that the objective lens 20 over the sliding glass 24 opposite. The condenser 27 is on a base 28 , On top of the condenser 27 is an immersion oil 29 dripped or attached there. The immersion oil 29 is accordingly between the condenser 27 and the sliding glass 24 loaded.
[0057] Dienumerische Apertur (NA) des Kondensors 27 ist so ausgelegt,dass sie größer alsder Brechungsindex der Probe 25 ist. Unter der Annahme,dass der Brechungsindex des Immersionsöls 29 oder des Schiebeglases 24 n₁ ist und der Brechungsindex der Probe 25 n₂ ist, lässtsich dabei die folgende Beziehung aus den obigen Gleichungen (3)und (4) herleiten: NA= n₁·sinθmax > n₂ (5),wobei θmax einemmaximalen Einfallswinkel entspricht, bei dem ein Einfall von demKondensor 27 her durch das Immersionsöl 29 und das Schiebeglas 24 möglich ist.The numerical aperture (NA) of the condenser 27 is designed to be larger than the refractive index of the sample 25 is. Assuming that the refractive index of the immersion oil 29 or the sliding glass 24 n is ₁ and the refractive index of the sample 25 n is ₂ , the following relationship can be derived from equations (3) and (4) above: NA = n ₁ · Sinθmax> n ₂ (5) where θmax corresponds to a maximum angle of incidence at which an incidence from the condenser 27 forth through the immersion oil 29 and the sliding glass 24 is possible.
[0058] ImAllgemeinen beträgtder Brechungsindex einer lebenden Zelle etwa 1,37 bis 1,38. Dienumerische Apertur des Kondensors 27 weist demgemäß einenWert auf, der größer alsder Brechungsindex der lebenden Zelle von 1,37 bis 1,38 ist undbesitzt konkret einen Wert von etwa 1,65 bis 1,45.In general, the refractive index of a living cell is about 1.37 to 1.38. The numerical aperture of the condenser 27 accordingly has a value which is larger than the refractive index of the living cell from 1.37 to 1.38 and specifically has a value of approximately 1.65 to 1.45.
[0059] Aufeinem Durchlassbeleuchtungslichtweg T des Kondensors 27 sindeine Sammellinse 30 sowie eine Durchlassbeleuchtungslichtquelle 31 angeordnet.Die Sammellinse 30 leitet das von der Durchlassbeleuchtungslichtquelle 31 ausgestrahlteBeleuchtungslicht in den Kondensor 27.On a conduction illumination light path T of the condenser 27 are a converging lens 30 as well as a transmission illumination light source 31 arranged. The converging lens 30 directs that from the passage illumination light source 31 emitted illuminating light in the condenser 27 ,
[0060] Unterhalbder Basis 28 ist eine Lasereinleitungssektion L₁ angeordnet. Die LasereinleitungssektionL₁ umfasst die Laseroszillatoreinheit 32.Beispielsweise wird in der Laseroszillatoreinheit 32 eineLaserdiode verwendet. Die Oszillationswellenlänge der Laseroszillatoreinheit 32 enthält eineeinzige Wellenlänge λ_L1.Below the base 28 a laser introduction section L _{1 is} arranged. The laser initiation section L ₁ includes the laser oscillator unit 32 , For example, in the laser oscillator unit 32 used a laser diode. The oscillation wavelength of the laser oscillator unit 32 contains a single wavelength λ _L1 .
[0061] Eineoptische Faser 33 ist an das Laserabgabeende der Laseroszillatoreinheit 32 angeschlossen.Ein Ende der optischen Faser 33 ist vorzugsweise eine einmodigeFaser. Am anderen Ende der optischen Faser 33 befindetsich ein Faseremissionsende 34. Das Faseremissionsende 34 strahltden durch die optische Faser 33 geleiteten Laserstrahlals divergenten Strahl ab. Das Faseremissionsende 34 istbeispielsweise mit einem Ende einer Halterung 35 hohlerStruktur verbunden.An optical fiber 33 is to the laser output end of the laser oscillator unit 32 connected. One end of the optical fiber 33 is preferably a single-mode fiber. At the other end of the optical fiber 33 there is a fiber emission end 34 , The fiber emission end 34 shines through the optical fiber 33 derived laser beam as a divergent beam. The fiber emission end 34 is for example with a End of a bracket 35 hollow structure connected.
[0062] DieHalterung 35 ist beispielsweise an der Unterseite der Basis 28 befestigtbzw. an dieser gehalten. Eine Konzentrationslinse 36 wandeltden am Faseremissionsende 34 abgestrahlten divergentenStrahl in einen konvergenten Strahl um und konzentriert das Lichtin der Näheeiner vorderen fokalen Stelle des Kondensors 27.The bracket 35 is for example at the bottom of the base 28 attached or held on this. A concentration lens 36 converts that at the fiber emission end 34 radiated divergent beam into a convergent beam and concentrates the light near a front focal point of the condenser 27 ,
[0063] Einnach unten ragender Halterungsabschnitt 37 ist integralmit einem unteren Teil der Halterung 35 ausgebildet. Indem nach unten ragenden Halterungsabschnitt 37 sind einBewegungsloch 38 sowie ein Halterungsloch 39 vorgesehen.Das Bewegungsloch 38 und das Halterungsloch 39 sindin einer den Durchlassbeleuchtungslichtweg T im Wesentlichen rechtwinkligschneidenden Richtung vorgesehen.A bracket section projecting downward 37 is integral with a lower part of the bracket 35 educated. In the downward projecting bracket section 37 are a movement hole 38 as well as a mounting hole 39 intended. The movement hole 38 and the bracket hole 39 are provided in a direction substantially intersecting the passage illumination light path T.
[0064] Indem Bewegungsloch 38 ist ein Spiegelhalteteil 40 beweglichangeordnet. Fürden Spiegelhalteteil 40 sind ein Spiegeltragteil 41 sowieein Bewegungsführungsteil 42 integralausgebildet. Der Bewegungsführungsteil 42 istin das Bewegungsloch 38 eingesetzt und in dem Bewegungsloch 38 beweglich.Der Spiegeltragteil 41 ist in einer den Bewegungsführungsteil 42 imWesentlichen rechtwinklig schneidenden Richtung angeordnet.In the movement hole 38 is a mirror holder 40 arranged movably. For the mirror holding part 40 are a mirror support part 41 as well as a motion control part 42 integrally formed. The motion control part 42 is in the movement hole 38 inserted and in the movement hole 38 movable. The mirror support part 41 is in the movement guide part 42 arranged substantially at right angles to the direction.
[0065] Indem Halterungsloch 39 ist ein Mikrometer 43 angeordnet.Das Mikrometer 43 weist einen Mikrometerkopf 44 sowieeinen Mikrometerfunktionsteil 45 auf. Der Mikrometerkopf 44 liegtam unteren Teil des Spiegeltragteils 41 an. Der Mikrometerfunktionsteil 45 bewegtden Mikrometerkopf 44 unmittelbar durch Drehung. Die translatorischeRichtung des Mikrometerkopfs 44 stimmt mit der den DurchlassbeleuchtungslichtwegT im Wesentlichen rechtwinklig schneidenden Richtung überein.In the bracket hole 39 is a micrometer 43 arranged. The micrometer 43 has a micrometer head 44 as well as a micrometer functional part 45 on. The micrometer head 44 lies on the lower part of the mirror support part 41 on. The micrometer functional part 45 moves the micrometer head 44 immediately by rotation. The translational direction of the micrometer head 44 coincides with the direction substantially intersecting the transmission illumination light path T.
[0066] Zwischendem Spiegeltragteil 41 und dem nach unten ragenden Halterungsabschnitt 37 isteine Feder 46 vorgesehen. Die Feder 46 übt eineZugkraft aus, die den Spiegeltragteil 41 zur Seite desMikrometerkopfs 44 hin drängt. Dementsprechend liegtder Mikrometerkopf 44 an dem Spiegeltragteil 41 anund wird an diesem gehalten.Between the mirror support part 41 and the downward projecting bracket portion 37 is a feather 46 intended. The feather 46 exerts a pulling force on the mirror support part 41 to the side of the micrometer head 44 is pushing. The micrometer head is located accordingly 44 on the mirror support part 41 and is held on this.
[0067] Amoberen Ende des Spiegeltragteils 41 befindet sich ein Reflexionsspiegel 47.Wird der Mikrometerfunktionsteil 45 gedreht, bewegt sichder Mikrometerkopf 44 in translatorischer Weise in einerden Durchlassbeleuchtungslichtweg T im Wesentlichen rechtwinkligschneidenden Richtung. In Antwort auf diese Bewegung bewegt sichder Spiegeltragteil 41 in translatorischer Weise in derden Durchlassbeleuchtungslichtweg T im Wesentlichen rechtwinkligschneidenden Richtung. Als Folge bewegt sich der Reflexionsspiegel 47 intranslatorischer Weise in der den DurchlassbeleuchtungslichtwegT im Wesentlichen rechtwinklig schneidenden Richtung. Es ist zubeachten, dass der Spiegelhalteteil 40, das Mikrometer 43 unddie Feder 46 eine Spiegelbewegungseinheit bilden.At the upper end of the mirror support part 41 there is a reflection mirror 47 , Becomes the micrometer functional part 45 rotated, the micrometer head moves 44 in a translational manner in a direction substantially intersecting the passage illumination light path T. The mirror support part moves in response to this movement 41 in a translational manner in the direction substantially perpendicular to the passage illumination light path T. As a result, the reflection mirror moves 47 in a translational manner in the direction substantially perpendicular to the passage illumination light path T. It should be noted that the mirror holding part 40 , the micrometer 43 and the feather 46 form a mirror movement unit.
[0068] DerReflexionsspiegel 47 befindet sich in der Nähe der äußerstenSeite des Öffnungsdurchmessers desKondensors 27. Der Reflexionsspiegel 47 reflektiertden eingeleiteten Laserstrahl aus der den DurchlassbeleuchtungslichtwegT im Wesentlichen rechtwinklig schneidenden Richtung im Wesentlichenrechtwinklig nach oben.The reflection mirror 47 is near the outermost side of the condenser opening diameter 27 , The reflection mirror 47 reflects the introduced laser beam from the direction intersecting the transmission illumination light path T essentially at right angles, essentially at right angles.
[0069] Alsnächsteswird die Funktionsweise des wie vorstehend beschrieben ausgebildetenTIRFM beschrieben.Asnextis the functioning of the trained as described aboveTIRFM described.
[0070] DieLaseroszillatoreinheit 32 erzeugt einen Laserstrahl mitder Wellenlänge λ_L1.Der Laserstrahl mit der Wellenlänge λ_L1 wirdin die optische Faser 33 eingeleitet und am Faseremissionsende 34 alsdivergenter Strahl ausgestrahlt. Der als divergenter Strahl ausgestrahlteLaserstrahl wird durch die Konzentrationslinse 36 in einenkonvergenten Strahl umgewandelt und trifft auf den Reflexionsspiegel 47.The laser oscillator unit 32 generates a laser beam with the wavelength λ _L1 . The laser beam with the wavelength λ _L1 is in the optical fiber 33 initiated and at the fiber emission end 34 broadcast as a divergent beam. The laser beam emitted as a divergent beam is through the concentration lens 36 converted into a convergent beam and strikes the reflection mirror 47 ,
[0071] Derauf den Reflexionsspiegel 47 einfallende Laserstrahl wirdnahe der äußerstenSeite des Durchlassbeleuchtungslichtwegs T zur Seite des Kondensors 27 reflektiert.Der von dem Reflexionsspiegel 47 reflektierte Laserstrahlwird durch die Konzentrationslinse 36 einmal in der Nähe der vorderenfokalen Position des Kondensors 27 konzentriert. Der Laserstrahltrifft auf den Kondensor 27 und wird als paralleler Strahlausgegeben, der von dem Kondensor 27 in schräger Richtungläuft.Der von dem Kondensor 27 abgegebene Laserstrahl wird durchdas Immersionsöl 6 geleitetund fälltauf die Grenzflächezwischen dem Schiebeglas 24 und der Probe 25 ein.The one on the reflection mirror 47 incident laser beam becomes the condenser side near the outermost side of the transmission illumination light path T. 27 reflected. The one from the reflection mirror 47 reflected laser beam is through the concentration lens 36 once near the front focal position of the condenser 27 concentrated. The laser beam hits the condenser 27 and is output as a parallel beam from the condenser 27 runs in an oblique direction. The one from the condenser 27 The laser beam is emitted by the immersion oil 6 directed and falls on the interface between the sliding glass 24 and the sample 25 on.
[0072] Wennder Einfallswinkel θ_L1 des Laserstrahls auf die Grenzfläche zwischendem Schiebeglas 24 und der Probe 25 größer alsder kritische Winkel fürTotalreflexion ist, wird der Laserstrahl an der Grenzfläche reflektiert.Evaneszentes Licht dringt dann zur Seite der Probe 25 vor.When the angle of incidence θ _{L1 of} the laser beam on the interface between the sliding glass 24 and the sample 25 is larger than the critical angle for total reflection, the laser beam is reflected at the interface. Evanescent light then passes to the side of the sample 25 in front.
[0073] Diebesondere fluoreszierende Substanz, die in der Probe 25 vorhandenist, wird durch das evaneszente Licht mit der Wellenlänge λ_L1 angeregt.In Folge dieser Anregung strahlt die fluoreszierende Substanz Fluoreszenzab, und zwar solchermaßen,dass die maximale Luminanzwellenlänge der Fluoreszenz in einem Durchlasswellenlängenband λ_E1 desEmissionsfilters 22 liegt. Die Fluoreszenz fällt durchdas Deckglas 26 auf die Objektivlinse 20 ein.Die Fluoreszenz wird darüberhinaus durch das Emissionsfilter 22 hindurchgelassen undtrifft auf die Bildaufnahmevorrichtung 23. Die Bildaufnahmevorrichtung 23 nimmtein Fluoreszenzbild des Wellenlängenbands λ_E1 auf.The special fluorescent substance in the sample 25 is present, is excited by the evanescent light with the wavelength λ _L1 . As a result of this excitation, the fluorescent substance emits fluorescence in such a way that the maximum luminance wavelength of the fluorescence is in a transmission wavelength band λ _{E1 of} the emission filter 22 lies. The fluorescence falls through the cover slip 26 on the objective lens 20 on. The fluorescence is also through the emission filter 22 is let through and hits the image pickup device 23 , The imaging device 23 takes a fluorescence image of the wavelength band λ _E1 .
[0074] Wenndagegen der Mikrometerfunktionsteil 45 gedreht wird, bewegtsich der Reflexionsspiegel 47 in translatorischer Weisein der den Durchlassbeleuchtungslichtweg T rechtwinklig schneidendenRichtung. Wenn sich die Position des Reflexionsspiegels 47 inder den Durchlassbeleuchtungslichtweg T im Wesentlichen rechtwinkligschneidenden Richtung bewegt, verlagert sich die Einfallspositiondes Laserstrahls auf dem Kondensor 27. Dementsprechend ändert sichder Abstrahlwinkel des von dem Kondensor 27 abgegebenen Laserstrahls,d. h. der Einfallswinkel θ_L1 des Laserstrahls auf die Grenzfläche zwischendem Schiebeglas 24 und der Probe.If, on the other hand, the micrometer functional part 45 is rotated, the reflection mirror moves 47 in a translational manner in the direction intersecting the transmission illumination light path T at right angles. If the position of the reflection mirror 47 In the direction substantially perpendicular to the passage illumination light path T, the incident position of the laser beam on the condenser shifts 27 , The radiation angle of the condenser changes accordingly 27 emitted laser beam, ie the angle of incidence θ _{L1 of} the laser beam on the interface between the sliding glass 24 and the sample.
[0075] DieEindringtiefe des evaneszenten Lichts bei Totalreflexionsbeleuchtung ändert sichmit dem Einfallswinkel θ_L1 des Laserstrahls auf die Grenzfläche zwischendem Schiebeglas 24 und der Probe 25. Der Mikrometerfunktionsteil 45 wirddaher so gedreht, dass sich der Reflexionsspiegel 47 geringfügig in derden Durchlassbeleuchtungslichtweg T im Wesentlichen rechtwinkligschneidenden Richtung bewegt. Wenn der Reflexionsspiegel 47 dabeian den Durchlassbeleuchtungslichtweg T herangebracht oder von diesementfernt wird, kann die Eindringtiefe d_L1 desevaneszenten Lichts wahlweise geändertwerden.The penetration depth of the evanescent light with total reflection lighting changes with the angle of incidence θ _{L1 of} the laser beam on the interface between the sliding glass 24 and the sample 25 , The micrometer functional part 45 is therefore rotated so that the reflection mirror 47 moves slightly in the direction substantially intersecting the transmission illumination light path T. If the reflection mirror 47 the passage illumination light path T is brought up to or removed therefrom, the penetration depth d _{L1 of} the evanescent light can be optionally changed.
[0076] Esist zu beachten, dass bei Durchführungeiner Transmissionsbeleuchtungsbeobachtung mit Hilfe des von derDurchlassbeleuchtungslichtquelle 31 abgestrahlten Beleuchtungslichtsder Reflexionsspiegel 47 vollständig aus dem DurchlassbeleuchtungslichtwegT herausgenommen ist.It should be noted that when carrying out a transmission lighting observation with the help of the transmission illumination light source 31 emitted illuminating light of the reflection mirror 47 is completely taken out of the passage illumination light path T.
[0077] Wievorstehend beschrieben, ist gemäß der erstenAusführungsformder Kondensor 27 an einer der Objektivlinse 20 über dieProbe 25 hinweg gegenüberliegendenPosition angeordnet, der Reflexionsspiegel 47 ist beweglichin der Nähedes äußerstenTeils des Durchlassbeleuchtungslichtwegs T auf der Seite der Durchlassbeleuchtungslichtquelle 31 bezogenauf den Kondensor 27 angeordnet, und der von der Laseroszillatoreinheit 32 abgegebeneLaserstrahl wird von dem Reflexionsspiegel 47 zillatoreinheit 32 abgegebeneLaserstrahl wird von dem Reflexionsspiegel 47 reflektiertund trifft auf den Kondensor 27. Der Laserstrahl, der die durchdie Probe 25 gefärbtefluoreszierende Substanz anregt, geht dabei nicht durch die Objektivlinse 20 hindurch,sondern geht durch den Kondensor 27 hindurch, die so angeordnetist, dass sie der Objektivlinse 20 zugewandt ist.As described above, according to the first embodiment, the condenser is 27 on one of the objective lens 20 about the sample 25 arranged opposite position, the reflection mirror 47 is movable near the outermost part of the transmission illumination light path T on the transmission illumination light source side 31 related to the condenser 27 arranged, and that of the laser oscillator unit 32 The laser beam is emitted by the reflection mirror 47 zillatoreinheit 32 The laser beam is emitted by the reflection mirror 47 reflects and hits the condenser 27 , The laser beam that passes through the sample 25 stimulates colored fluorescent substance does not go through the objective lens 20 through, but goes through the condenser 27 through, which is arranged so that it is the objective lens 20 is facing.
[0078] Dementsprechendhängt dermaximale Einfallswinkel θmaxdes auf die Grenzflächezwischen dem Schiebeglas 24 und der Probe 25 treffendenLaserstrahls nur von der durch obige Gleichung (5) repräsentiertenNA des Kondensors 27 ab. Eine Fluoreszenzbeobachtung mitTotalreflexionsbeleuchtung ist daher ungeachtet der NA oder derVergrößerung derObjektivlinse 20 möglich.Accordingly, the maximum angle of incidence θmax depends on the interface between the sliding glass 24 and the sample 25 only from the NA of the condenser represented by equation (5) above 27 from. Fluorescence observation with total reflection lighting is therefore irrespective of the NA or the magnification of the objective lens 20 possible.
[0079] DieLasereinleitungssektion L₁ ist getrenntvon der Probe 25 und dem Kondensor 27 angeordnet.Demgemäß gibt eskeine in der Näheder Probe 25 befindlichen Strukturen, und der Raum in derNähe derProbe 25 ist nicht eingeschränkt.The laser initiation section L ₁ is separate from the sample 25 and the condenser 27 arranged. Accordingly, there is none near the sample 25 structures, and the space near the sample 25 is not restricted.
[0080] DieLasereinleitungssektion L₁ umfasst eineKonstruktion, bei der der Reflexionsspiegel 47 mittelsdes Mikrometers 43 bewegt wird. Die LasereinleitungssektionL₁ besitzt einen einfachen Aufbau und hatauch einen schmalen Arbeitsbereich. Wegen der LasereinleitungssektionL₁ kann das TIRFM daher selbst kompakt seinund es kann das TIRFM bessere Arbeitseigenschaften haben.The laser introduction section L ₁ includes a construction in which the reflection mirror 47 by means of the micrometer 43 is moved. The laser introduction section L ₁ has a simple structure and also has a narrow working area. Because of the laser initiation section L ₁ , the TIRFM can therefore itself be compact and the TIRFM can have better working properties.
[0081] Dieerste Ausführungsformkann auch wie folgt abgewandelt werden.Thefirst embodimentcan also be modified as follows.
[0082] Für das Schiebeglas 24 kannauch ein gläsernerUnterteller verwendet werden. Das Deckglas 26 kann entsprechendauch weggelassen werden. Wenn in diesem Fall die Arbeitsentfernungder Objektivlinse 20 kurz ist, kann eine Immersionsobjektivlinsefür dieObjektivlinse 20 verwendet werden.For the sliding glass 24 a glass saucer can also be used. The coverslip 26 can also be omitted accordingly. If in this case the working distance of the objective lens 20 is short, an immersion objective lens can be used for the objective lens 20 be used.
[0083] Beispielsweisekann bei dem Mikrometer 43 auch ein elektromotorischerAntrieb, ein Piezoaktuator oder dergleichen zur Bewegung des Reflexionsspiegels 47 verwendetwerden.For example, the micrometer 43 also an electric motor drive, a piezo actuator or the like for moving the reflection mirror 47 be used.
[0084] DerReflexionsspiegel wird festgelegt. Das Faseremissionsende 34 unddie Konzentrationslinse 36 werden gemeinsam in Richtungparallel zum Durchlassbeleuchtungslichtweg T bewegt. Auch bei dieserAusbildung wird eine ähnlicheFunktionsweise wie bei der ersten Ausführungsform erhalten. Das Faseremissionsende 34 unddie Konzentrationslinse 36 werden in diesem Fall beispielsweisemittels eines Mikromotors, eines Elektromotorantriebs, eines Piezo-Aktuators oder dergleichenbewegt.The reflection level is determined. The fiber emission end 34 and the concentration lens 36 are moved together in the direction parallel to the passage lighting light path T. In this configuration, too, a similar mode of operation is obtained as in the first embodiment. The fiber emission end 34 and the concentration lens 36 are moved in this case for example by means of a micromotor, an electric motor drive, a piezo actuator or the like.
[0085] Dieerste Ausführungsformist nicht nur bei einem Mikroskop des aufrechtstehenden Typs anwendbar, sondernauch bei einem umgekehrten.Thefirst embodimentis not only applicable to an upright type microscope, buteven with a reverse.
[0086] Dasoptische Beobachtungssystem ist nicht auf eine Ausbildung mit derBilderzeugungslinse 21, dem Emissionsfilter 22 undder Bildaufnahmevorrichtung 23 beschränkt. Es kann nach Bedart ausgestaltetwerden, solange die Fluoreszenzwellenlänge im Hinblick auf die angeregteWellenlängeder Lasereinleitungssektion L₁ gewählt wirdund das Bild aufgenommen werden kann.The observation optical system is not on training with the imaging lens 21 , the emission filter 22 and the image pickup device 23 limited. It can be configured according to requirements, as long as the fluorescence wavelength is selected with regard to the excited wavelength of the laser introduction section L ₁ and the image can be recorded.
[0087] Beider ersten Ausführungsformwird der vom Faseremissionsende 34 abgestrahlte Laserstrahldurch die einzelne Konzentrationslinse 36 in einen konvergentenStrahl umgewandelt und der konvergente Strahl von dem Reflexionsspiegel 47 reflektiertund in der Näheder vorderen fokalen Position des Kondensors 27 konzentriert.Die vorliegende Erfindung ist nicht hierauf beschränkt. Beispielsweisewird der von dem Faseremissionsende 34 abgestrahlte Laserstrahlmittels einer Einzellinse oder einer Mehrzahl von Linsen in einenparallelen Lichtfluss umgewandelt, wobei die Konzentrationslinsean einer optischen Position auf dem optischen Weg angeordnet ist,wenn der parallele Lichtfluss von dem Reflexionsspiegel 47 reflektiertwird und in der Näheder vorderen fokalen Position des Kondensors 27 einfällt, unddas Licht durch die Konzentrationslinse konzentriert werden kann.In the first embodiment, that from the fiber emission end 34 radiated laser beam through the single concentration lens 36 converted into a convergent beam and the convergent beam from the reflection mirror 47 reflected and near the front focal position of the condenser 27 concentrated. The present invention is not limited to this. For example, that of the fiber emission end 34 emitted laser beam is converted into a parallel light flow by means of a single lens or a plurality of lenses, the concentration lens being arranged at an optical position on the optical path when the parallel light flow from the reflection mirror 47 is reflected and near the front focal position of the condenser 27 occurs, and the light can be concentrated through the concentration lens.
[0088] Einezweite Ausführungsformder vorliegenden Erfindung wird mit Bezug auf die Zeichnungen beschrieben.Es ist zu beachten, dass gleiche Teile wie in 1 mit dem gleichen Bezugszeichen bezeichnet sind;auf ihre detaillierte Beschreibung wird verzichtet.A second embodiment of the present invention will be described with reference to the drawings. It should be noted that the same parts as in 1 are designated by the same reference number; their detailed description is omitted.
[0089] 2 ist eine Darstellung,die den Aufbau eines Totalreflexionsfluoreszenzmikroskops (TIRFM)vom aufrechtstehenden Typ zeigt. Eine Konversionslinseneinheit 50 istzwischen dem Faseremissionsende 34 und der Konzentrationslinse 36 angeordnet.Die Konversionslinseneinheit 50 ist integral entfernbareingesetzt, bezogen auf einen optischen Lasereinleitungsweg zwischendem Faseremissionsende 34 und der Kondensierungslinse 36. 2 Fig. 11 is a diagram showing the structure of an upright type total reflection fluorescence microscope (TIRFM). A conversion lens unit 50 is between the fiber emission end 34 and the concentration lens 36 arranged. The conversion lens unit 50 is inserted integrally removable, based on an optical laser introduction path between the fiber emission end 34 and the condensing lens 36 ,
[0090] Die 3 und 4 sind vergrößerte Draufsichten von obenauf die Konversionslinseneinheit 50. In einer Seitenfläche derHalterung 35 mit der hohlen Struktur ist ein Schutzraumteil 51 vorgesehen.Die Konversionslinseneinheit 50 ist mit einem Knopf 52 ausgeführt. DerKnopf 52 ragt aus dem Schutzraumteil 51 durchdie Wand des Schutzraumteils 51 heraus. Die Konversionslinseneinheit 51 istdurch Betätigungdes Knopfs 52 entfernbar zwischen den optischen Lasereinleitungswegin der Halterung 35 und das Innere des Schutzraumteils 51 eingesetzt.Wenn beispielsweise der Knopf 52 herausgezogen wird, wiein 3 gezeigt, gelangtdie Konversionslinseneinheit 50 aus dem optischen Lasereinleitungswegheraus. Wenn der Knopf 52 hineingedrückt wird, wie in 4 gezeigt, wird die Konversionslinseneinheit 50 inden optischen Lasereinleitungsweg hineingeführt.The 3 and 4 are enlarged top plan views of the conversion lens unit 50 , In one side of the bracket 35 with the hollow structure is a shelter part 51 intended. The conversion lens unit 50 is with a button 52 executed. The button 52 protrudes from the shelter part 51 through the wall of the shelter part 51 out. The conversion lens unit 51 is by pressing the button 52 removable between the optical laser path in the holder 35 and the inside of the shelter part 51 used. For example, if the button 52 is pulled out as in 3 shown, the conversion lens unit arrives 50 out of the optical laser introduction path. If the button 52 is pushed in as in 4 shown is the conversion lens unit 50 led into the optical laser introduction path.
[0091] DieKonversionslinseneinheit 50 besitzt beispielsweise einehohle Struktur. In der Konversionslinseneinheit 50 sindeine konvexe Linse 53 und eine konkave Linse 54 angeordnet.Die konvexe Linse 53 wandelt die NA des vom Faseremissionsende 34 abgestrahltendivergenten Laserstrahls.The conversion lens unit 50 has, for example, a hollow structure. In the conversion lens unit 50 are a convex lens 53 and a concave lens 54 arranged. The convex lens 53 converts the NA from the fiber emission end 34 radiated divergent laser beam.
[0092] Diekonkave Linse 54 ist in Richtung der optischen Achse desoptischen Lasereinleitungswegs zwischen der konvexen Linse 53 undder Konzentrationslinse 36 beweg bar angeordnet. Die konkaveLinse 54 macht den von der konvexen Linse 53 NA-gewandelten Laserstrahldivergent. Wenn dementsprechend die konkave Linse 54 inRichtung der optischen Achse des optischen Lasereinleitungswegsbewegt wird, kann der Laserstrahl in der Nähe der vorderen fokalen Positiondes Kondensors 27 durch die Konzentrationslinse 36 konzentriertwerden. Der fokale Abstand der Konzentrationslinse 36 istdaher durch die konkave Linse 54 einstellbar.The concave lens 54 is in the direction of the optical axis of the laser introduction path between the convex lens 53 and the concentration lens 36 arranged movable bar. The concave lens 54 does that of the convex lens 53 NA-converted laser beam divergent. If so, the concave lens 54 is moved in the direction of the optical axis of the laser optical introduction path, the laser beam can be near the front focal position of the condenser 27 through the concentration lens 36 be concentrated. The focal distance of the concentration lens 36 is therefore through the concave lens 54 adjustable.
[0093] Alsnächsteswird die Funktionsweise des wie vorstehend beschrieben ausgestaltetenTIRFM beschrieben.Next, the operation of the TIRFM configured as described above will be wrote.
[0094] Wennder Knopf 52 hineingedrücktwird, wie in 4 gezeigt,wird die Konversionslinseneinheit 50 in den optischen Lasereinleitungsweghineingeführt.Die NA des divergenten Laserstrahls vom Faseremissionsende 34 wirddabei durch die konvexe Linse 53 gewandelt.If the button 52 is pushed in as in 4 shown is the conversion lens unit 50 led into the optical laser introduction path. The NA of the divergent laser beam from the fiber emission end 34 is through the convex lens 53 changed.
[0095] Danachwird der Laserstrahl in der Näheder vorderen fokalen Position des Kondensors 27 durch die konkaveLinse 54 und die Konzentrationslinse 36 konzentriert.Die Einfalls-NA des Laserstrahls auf dem Kondensor 27 wirddabei verglichen mit dem Fall verringert, dass die konvexe Linse 53 unddie konkave Linse 54 von dem optischen Lasereinleitungswegabweichen. Demgemässwird der Laserstrahl in der Näheder vorderen fokalen Position des Kondensors 27 mit kleinerEinfalls-NA konzentriert.After that, the laser beam is near the front focal position of the condenser 27 through the concave lens 54 and the concentration lens 36 concentrated. The incident NA of the laser beam on the condenser 27 is reduced compared to the case where the convex lens 53 and the concave lens 54 deviate from the optical laser introduction path. Accordingly, the laser beam is near the front focal position of the condenser 27 concentrated with small incident NA.
[0096] AlsFolge wird der Strahlenflussdurchmesser des nach Durchgang durchden Kondensor 27 in schräger Richtung laufenden parallelenStrahls, d. h. der Einstrahlungsbereich des Laserstrahls in dieProbe 25, komprimiert. Die Energiedichte des Laserstrahlswird somit größer.As a result, the beam flow diameter becomes the after passing through the condenser 27 parallel beam running in an oblique direction, ie the irradiation area of the laser beam into the sample 25 , compressed. The energy density of the laser beam is therefore greater.
[0097] Wievorstehend beschrieben, ist gemäß der zweitenAusführungsformdie Konversionslinseneinheit 50 mit der konvexen Linse 53 undder konkaven Linse 54 entfernbar am optischen Lasereinleitungswegangebracht. Dementsprechend kann der Einstrahlungsbereich des Laserstrahlsan der Probe 25 komprimiert werden. Die Energiedich te desLaserstrahls, mit dem die Probe 25 bestrahlt wird, kanndabei gewandelt werden, so dass sie beispielsweise hoch ist.As described above, according to the second embodiment, the conversion lens unit 50 with the convex lens 53 and the concave lens 54 removably attached to the optical laser introduction path. Accordingly, the irradiation area of the laser beam on the sample 25 be compressed. The energy density of the laser beam with which the sample 25 irradiated can be converted so that it is high, for example.
[0098] Wenndaher eine schwache Fluoreszenz mit starker Leistung beobachtetwerden soll, wird die Konversionslinseneinheit 50 in denoptischen Lasereinleitungsweg eingebracht. Bei einer Fluoreszenzbeobachtungeines breiten Bereichs wird die Konversionslinseneinheit 50 ausdem optischen Lasereinleitungsweg entfernt. Die Probe 25 wirdwahlweise nach Maßgabeder Anwendung der Beobachtung in dieser Weise verwendet.Therefore, if weak fluorescence with strong performance is to be observed, the conversion lens unit 50 introduced into the optical laser introduction path. When observing fluorescence over a wide area, the conversion lens unit 50 removed from the optical laser path. The sample 25 is used in this way, depending on the application of the observation.
[0099] Diezweite Ausführungsformkann auch wie folgt modifiziert werden.Thesecond embodimentcan also be modified as follows.
[0100] DieMittel zum Einbringen/Entfernen der Konversionslinseneinheit 50 sindnicht auf den Knopf beschränktund könnenbeispielsweise auch ein Elektromotorantrieb sein und sie können freiausgestaltet werden.The means for inserting / removing the conversion lens unit 50 are not limited to the button and can also be an electric motor drive, for example, and they can be freely configured.
[0101] DieKonversionslinseneinheit 50 ist nicht auf die Kombinationder konvexen Linse 53 und der konkaven Linse 54 beschränkt; siekann auch eine Kombination von konvexen und konkaven Linsen sein,mit denen die gleiche Funktion erhalten wird.The conversion lens unit 50 is not on the combination of the convex lens 53 and the concave lens 54 limited; it can also be a combination of convex and concave lenses with which the same function is obtained.
[0102] Wasdie Konversionslinseneinheit 50 anbelangt, so ist ein Typvon Einheit so ausgebildet, dass er entfernbar zwischen das Faseremissionsende 34 unddie Konzentrationslinse 36 eingesetzt ist; die vorliegende Erfindungist jedoch nicht hierauf beschränkt.Beispielsweise wird die Konversionslinseneinheit 50 aufeine andere Einfalls-NA umgestellt und ist selektiv entfernbar zwischendas Faseremissionsende 34 und die Konzentrationslinse 36 eingesetzt.Mit dieser Ausgestaltung kann die Probe 25 mit Laserstrahlendreier oder mehr verschiedener Einfalls-NA bestrahlt werden. Dementsprechendkönnender Einstrahlungsbereich des Laserstrahls und außerdem die Energiedichte feinereingestellt werden.As for the conversion lens unit 50 Regarding this, one type of unit is designed to be removable between the fiber emission end 34 and the concentration lens 36 is inserted; however, the present invention is not limited to this. For example, the conversion lens unit 50 switched to another incidence NA and is selectively removable between the fiber emission end 34 and the concentration lens 36 used. With this configuration, the sample 25 be irradiated with laser beams from three or more different incident NAs. Accordingly, the irradiation area of the laser beam and also the energy density can be set more finely.
[0103] Einedritte Ausführungsformder vorliegenden Erfindung wird mit Bezug auf die Zeichnung beschrieben.Es ist zu beachten, dass gleiche Teile wie in 2 mit gleichen Bezugszeichen versehensind; auf ihre detaillierte Beschreibung wird verzichtet.A third embodiment of the present invention will be described with reference to the drawing. It should be noted that the same parts as in 2 are provided with the same reference numerals; their detailed description is omitted.
[0104] 5 ist eine Darstellung derAusbildung eines Totalreflexionsfluoreszenzmikroskops (TIRFM) vom aufrechtstehendenTyp. An einem Objektivlinsenwechsler 60 sind eine Objektivlinse 61 zurBeobachtung mit starker Vergrößerung sowieeine Objektivlinse 62 zur Beobachtung mit geringer Vergrößerung angebracht. 5 Fig. 4 is an illustration of the formation of an upright type total reflection fluorescence microscope (TIRFM). On an objective lens changer 60 are an objective lens 61 for observation with high magnification and an objective lens 62 attached for observation with low magnification.
[0105] 6 ist eine Darstellung,die einen Wechselmechanismus fürdie Objektivlinsen 61, 62 zeigt. An einer Seitenfläche desObjektivlinsenwechslers 60 ist ein Umstellglied 63,etwa eine Zahnstange, vorgesehen. Das Umstellglied 63 ist über einRitzel oder dergleichen mit einem Vergrößerungswechselantreibsteil 64 verbunden.Wenn der Vergrößerungswechselantriebsteil 64 rotiert/angetriebenwird, wird dieser rotierende Antrieb auf das Umstellglied 63 übertragenund in eine translatorische Bewegung in Richtung eines Pfeils Aumgesetzt. Dementsprechend bewegt sich der Objektivlinsenwechsler 60 inRichtung des Pfeils A, und es wird die Objektivlinse 61 zurBeobachtung mit starker Vergrößerung oderdie Objektivlinse 62 zur Beobachtung mit geringer Vergrößerung aufdem optischen Beobachtungsweg Q angeordnet. 6 is an illustration showing a mechanism for changing the objective lenses 61 . 62 shows. On one side of the objective lens changer 60 is a changeover element 63 , such as a rack. The changeover link 63 is via a pinion or the like with a magnification changing driving part 64 connected. If the magnification changing drive part 64 is rotated / driven, this rotating drive is on the changeover element 63 transferred and converted into a translatory movement in the direction of an arrow A. The objective lens changer moves accordingly 60 in the direction of arrow A and it becomes the obj tivlinse 61 for observation with high magnification or the objective lens 62 arranged for observation with low magnification on the optical observation path Q.
[0106] Aneiner Seitenflächeder Konversionslinseneinheit 50 ist auf der Einfallsseiteein Einführ-/Entfernungselement 65 vorgesehen,etwa eine Zahnstange. Das Einführ-/Entfernungselement 65 ist über einRitzel oder dergleichen mit einem Einführ-/Entfernungsantriebsteil 66 verbunden,etwa einem Elektromotorantrieb. Wenn der Einführ-/Entfernungsantriebsteil 66 inDrehung versetzt bzw. angetrieben wird, wird die Drehung bzw. derAntrieb auf das Einführ-/Entfernungselement 65 übertragenund in eine translatorische Bewegung in Richtung eines Pfeils Bumgesetzt. Dementsprechend bewegt sich die Konversionslinseneinheit 50 inRichtung des Pfeils B und ist entfernbar in den optischen Lasereinleitungswegeingesetzt.On a side surface of the conversion lens unit 50 is an insertion / removal element on the entrance side 65 provided, such as a rack. The insertion / removal element 65 is via a pinion or the like with an insertion / removal drive part 66 connected, such as an electric motor drive. When the insertion / removal drive part 66 is rotated or driven, the rotation or the drive on the insertion / removal element 65 transferred and converted into a translatory movement in the direction of an arrow B. The conversion lens unit moves accordingly 50 in the direction of arrow B and is removably inserted into the optical laser path.
[0107] Ineinem Zustand, in dem die Konversionslinseneinheit 50 inden optischen Lasereinleitungsweg eingeführt ist, ist der Einstrahlungsbereichdes Laserstrahls so eingestellt, dass er im wesentlichen mit demBeobachtungsbereich der Objektivlinse 61 zur Beobachtungmit hoher Vergrößerung übereinstimmt.In einem Zustand, in dem die Konversionslinseneinheit 50 ausdem optischen Lasereinleitungsweg entfernt ist, ist der Einstrahlungsbereichdes Laserstrahls so eingestellt, dass er im wesentlichen mit demBeobachtungsbereich der Objektivlinse 62 zur Beobachtungmit geringer Vergrößerung übereinstimmt.In a state in which the conversion lens unit 50 is introduced into the optical laser introduction path, the irradiation area of the laser beam is set so that it essentially corresponds to the observation area of the objective lens 61 for observation with high magnification. In a state in which the conversion lens unit 50 is removed from the optical laser introduction path, the irradiation area of the laser beam is set so that it essentially corresponds to the observation area of the objective lens 62 for observation with low magnification.
[0108] DerVergrößerungswechselantriebsteil 64 undder Einführ-/Entfernungsantriebsteil 66 sind über einen Treiber 67 miteiner Steuersektion 68 verbunden. Der Treiber 67 erhält einenvon der Steuersektion 68 gelieferten Antriebsbefehl zurAnsteuerung des Vergrößerungswechselantriebsteils 64 unddes Einführ-/Entfernungsantriebsteils 66.The enlargement change drive part 64 and the insertion / removal drive part 66 are about a driver 67 with a tax section 68 connected. The driver 67 receives one from the tax section 68 supplied drive command to control the magnification change drive part 64 and the insertion / removal drive part 66 ,
[0109] DieSteuersektion 68 umfasst einen Personalcomputer und dergleichen.Wird die Objektivlinse 61 zur Beobachtung mit hoher Vergrößerung aufdem optischen Beobachtungsweg Q angeordnet, führt die Steuersektion 68 einUmstellprogramm aus und liefert einen Ansteuerbefehl an den Treiber 67,um die Konversionslinseneinheit 50 in den optischen Lasereinleitungswegeinzuführen.Wird die Objektivlinse 62 zur Beobachtung mit geringerVergrößerung aufdem optischen Beobachtungsweg Q angeordnet, führt die Steuersektion 68 das Umstellprogrammaus und liefert einen Ansteuerbefehl an den Treiber 67,um die Konversionslinseneinheit 50 aus dem optischen Lasereinleitungswegzu entfernen.The tax section 68 includes a personal computer and the like. Becomes the objective lens 61 arranged for observation with high magnification on the optical observation path Q, leads the control section 68 a changeover program and delivers a control command to the driver 67 to the conversion lens unit 50 to introduce into the optical laser introduction path. Becomes the objective lens 62 Arranged for observation with low magnification on the optical observation path Q, the control section leads 68 the changeover program and delivers a control command to the driver 67 to the conversion lens unit 50 remove from the optical laser path.
[0110] Alsnächsteswird die Funktionsweise des wie vorstehend beschrieben ausgestaltetenTIRFM erläutert.Asnextthe functioning of the as described above is designedTIRFM explained.
[0111] Wenndie Objektivlinse 61 zur Beobachtung mit hoher Vergrößerung aufdem optischen Beobachtungsweg Q angeordnet wird, wird die Konversionslinseneinheit 50 inden optischen Lasereinleitungsweg eingeführt. Dementsprechend stimmtder Einstrahlungsbereich des Laserstrahls gegenüber der Probe 25 imwesentlichen mit dem Beobachtungsbereich der Objektivlinse 61 zurBeobachtung mit hoher Vergrößerung überein.If the objective lens 61 is arranged for observation with high magnification on the optical observation path Q, the conversion lens unit 50 introduced into the optical laser introduction path. Accordingly, the irradiation area of the laser beam is correct compared to the sample 25 essentially with the observation area of the objective lens 61 for observation with high magnification.
[0112] Wenndie Objektivlinse 62 zur Beobachtung mit geringer Vergrößerung inden optischen Beobachtungsweg Q eingebracht wird, wird die Konversionslinseneinheit 50 ausdem optischen Lasereinleitungsweg herausgenommen. Dementsprechendstimmt der Einstrahlungsbereich des Laserstrahls gegenüber derProbe 25 im wesentlichen mit dem Beobachtungsbereich derObjektivlinse 62 zur Beobachtung mit geringer Vergrößerung überein.If the objective lens 62 is introduced into the optical observation path Q for observation with low magnification, the conversion lens unit 50 removed from the optical laser introduction path. Accordingly, the irradiation area of the laser beam is correct compared to the sample 25 essentially with the observation area of the objective lens 62 for observation with low magnification.
[0113] Gemäß der drittenAusführungsformkann daher mit einem Wechsel zwischen der Objektivlinse 61 zur Beobachtungmit hoher Vergrößerung undder Objektivlinse 62 zur Beobachtung mit geringer Vergrößerung zwecksWechsels der Beobachtungsvergrößerung auchder Einstrahlungsbereich des Laserstrahls umgestellt werden, sodasser im wesentlichen mit der Größe des Sehfeldsfür dieBeobachtung der Probe 25 übereinstimmt.According to the third embodiment, therefore, a change between the objective lens 61 for observation with high magnification and the objective lens 62 for observation with low magnification in order to change the observation magnification, the irradiation area of the laser beam can also be changed so that it essentially corresponds to the size of the field of view for observing the sample 25 matches.
[0114] Zubeachten ist, dass auch die dritte Ausführungsform wie folgt abgewandeltwerden kann.Tonote that the third embodiment is also modified as followscan be.
[0115] Eskönnenauch drei oder mehr Objektivlinsen mit unterschiedlicher Vergrößerung verwendetwerden. In diesem Fall ist eine Mehrzahl von Konversionslinseneinheitenmit unterschiedlichem Reduktionsverhältnis des Laserstrahleinstrahlungsbereichsin Entsprechung zu den mehreren Objektivlinsen vorgesehen. Die Steuersektion 68 führt dieentsprechende Konversionslinseneinheit in den optischen Lasereinleitungswegin Zusammenwirkung mit dem Umstellen auf die jeweilige Objektivlinseein.Three or more objective lenses with different magnifications can also be used. In this case, a plurality of conversion lens units with a different reduction ratio of the laser beam irradiation area are provided in correspondence with the plurality of objective lenses. The tax section 68 introduces the corresponding conversion lens unit into the optical laser introduction path in cooperation with the changeover to the respective objective lens.
[0116] Wennkeine Zusammenwirkung des Objektivlinsenwechsels mit dem Einführen/Entfernender Konversionslinseneinheit relativ zu dem optischen Lasereinleitungswegerforderlich ist, könnender Objektivlinsenwechsel und das Einführen/Entfernen der Konversionslinseneinheitunabhängiggeschaltet werden. In diesem Fall können der Objektivlinsenwechselund das Einführen/Entfernender Konversionslinseneinheit auch manuell durchgeführt werden.Ifno interaction of the objective lens change with the insertion / removalthe conversion lens unit relative to the optical laser introduction pathcanchanging the objective lens and inserting / removing the conversion lens unitindependentlybe switched. In this case you can change the objective lensand insertion / removalthe conversion lens unit can also be performed manually.
[0117] Einevierte Ausführungsformder vorliegenden Erfindung wird mit Bezug auf die Zeichnungen beschrieben.Afourth embodimentthe present invention will be described with reference to the drawings.
[0118] Die 7A und 7B sind Darstellungen, die den Aufbaueiner Zoomlinseneinheit 69 in einem Totalreflexionsfluoreszenzmikroskop(TIRFM) zeigen. In der Zoomlinseneinheit 69 sind eine konvexeLinse 70 und eine konkave Linse 71 vorgesehen.Die konvexe Linse 70 ist in Richtung der optischen Achsedes optischen Lasereinleitungswegs zwischen dem Faseremissionsende 34 undder Konzentrationslinse 36 bewegbar angeordnet. Die konvexeLinse 70 wandelt die NA des vom Faseremissionsende 34 abgestrahltendivergenten Laserstrahls.The 7A and 7B are illustrations showing the construction of a zoom lens unit 69 show in a total reflection fluorescence microscope (TIRFM). In the zoom lens unit 69 are a convex lens 70 and a concave lens 71 intended. The convex lens 70 is in the direction of the optical axis of the optical laser introduction path between the fiber emission end 34 and the concentration lens 36 arranged movably. The convex lens 70 converts the NA from the fiber emission end 34 radiated divergent laser beam.
[0119] Diekonkave Linse 71 ist in Richtung der optischen Achse desoptischen Lasereinleitungswegs bewegbar zwischen der konvexen Linse 70 undder Konzentrationslinse 36 angeordnet. Die konkave Linse 71 macht denLaserstrahl, dessen NA durch die konvexe Linse 70 gewandeltwurde, divergent. Wenn dementsprechend die konkave Linse 71 inRichtung der optischen Achse des optischen Lasereinleitungswegsbewegt wird, kann der Laserstrahl in der Nähe der vorderen fokalen Positiondes Kondensors 27 durch die Konzentrationslinse 36 konzentriertwerden. Mittels der konkaven Linse 71 ist deswegen derfokale Abstand der Konzentrationslinse 36 einstellbar.The concave lens 71 is movable between the convex lens in the direction of the optical axis of the optical laser introduction path 70 and the concentration lens 36 arranged. The concave lens 71 makes the laser beam, its NA through the convex lens 70 was changed, divergent. If so, the concave lens 71 is moved in the direction of the optical axis of the laser optical introduction path, the laser beam can be near the front focal position of the condenser 27 through the concentration lens 36 be concentrated. By means of the concave lens 71 is therefore the focal distance of the concentration lens 36 adjustable.
[0120] Diekonvexe Linse 70 ist mit einer Bewegungseinheit 72 ausgeführt. DieBewegungseinheit 72 bewegt die konvexe Linse 70 inRichtung der optischen Achse (Richtung eines Pfeils B) des optischenLasereinleitungswegs. Die Bewegungseinheit 72 umfasst beispielsweiseeinen Elektromotor und dergleichen.The convex lens 70 is with one movement unit 72 executed. The movement unit 72 moves the convex lens 70 in the direction of the optical axis (direction of arrow B) of the optical laser introduction path. The movement unit 72 includes, for example, an electric motor and the like.
[0121] Diekonkave Linse 71 ist mit einer Bewegungseinheit 73 ausgeführt. DieBewegungseinheit 72 bewegt die konkave Linse 71 inRichtung der optischen Achse (Richtung eines Pfeils C) des optischenLasereinleitungswegs. Die Bewegungseinheit 73 umfasst beispielsweiseeinen Elektromotor und dergleichen.The concave lens 71 is with one movement unit 73 executed. The movement unit 72 moves the concave lens 71 in the direction of the optical axis (direction of an arrow C) of the optical laser introduction path. The movement unit 73 includes, for example, an electric motor and the like.
[0122] DieBewegungseinheiten 72, 73 sind über einenTreiber 74 mit einer Steuersektion 75 verbunden.Der Treiber 74 erhältvon der Steuersektion 75 einen Ansteuerbefehl zur Ansteuerungder jeweiligen Bewegungseinheit 72, 73.The movement units 72 . 73 are about a driver 74 with a tax section 75 connected. The driver 74 receives from the tax section 75 a control command to control the respective movement unit 72 . 73 ,
[0123] DieSteuersektion 75 umfasst einen Personalcomputer und dergleichen.Die Steuersektion 75 führtein Antriebsprogramm aus, um in Abhängigkeit von der positionsmäßigen Bewegungder konvexen Linse 70 eine Bewegungsposition der konkavenLinse 71 zur Einstellung der Konzentrationsposition desLaserstrahls in der Näheder vorderen fokalen Position des Kondensors 27 zu bestimmen.Die Steuersektion 75 steuert die Stärke der Bewegung bzw. des Antriebsder Bewegungseinheiten 72, 73 auf Grundlage derInformationen überdie ermittelte Bewegungsposition der konkaven Linse 71.The tax section 75 includes a personal computer and the like. The tax section 75 executes a drive program in order depending on the positional movement of the convex lens 70 a moving position of the concave lens 71 to adjust the concentration position of the laser beam near the front focal position of the condenser 27 to determine. The tax section 75 controls the strength of the movement or the drive of the movement units 72 . 73 based on the information about the determined movement position of the concave lens 71 ,
[0124] Alsnächsteswird die Funktionsweise des wie vorstehend beschrieben ausgestaltetenTIRFM erläutert.Asnextthe functioning of the as described above is designedTIRFM explained.
[0125] DieSteuersektion 75 führtdas Antriebsprogramm aus, um einen Ansteuerbefehl an den Treiber 74 auszugeben.Der Treiber 74 erhältden von der Steuersektion 75 ausgegebenen Ansteuerbefehl,um die jeweilige Bewegungseinheit 72, 73 anzusteuern.Dementsprechend bewegt die Bewegungseinheit 72 die konvexe Linse 70 inRichtung der optischen Achse (Richtung des Pfeils B) des optischenLasereinleitungswegs, wie in den 7A und 7B gezeigt. Die Bewegungseinheit 73 bewegtdie konkave Linse 71 in Richtung der optischen Achse (inRichtung des Pfeils C) des optischen Lasereinleitungswegs, wie inden 7A und 7B gezeigt.The tax section 75 executes the drive program to a control command to the driver 74 issue. The driver 74 receives that from the tax section 75 issued control command to the respective movement unit 72 . 73 head for. The movement unit moves accordingly 72 the convex lens 70 in the direction of the optical axis (direction of arrow B) of the optical laser introduction path, as in FIGS 7A and 7B shown. The movement unit 73 moves the concave lens 71 in the direction of the optical axis (in the direction of arrow C) of the optical laser introduction path, as in FIGS 7A and 7B shown.
[0126] DieSteuersektion 75 ermittelt dabei die Bewegungspositionder konkaven Linse 71 zur Einstellung der Konzentrationspositiondes Laserstrahls in der Näheder vorderen fokalen Position des Kondensors 27 nach Maßgabe derpositionsmäßigen Bewegung derkonvexen Linse 70 und steuert die Bewegungs-/Ansteuerbeträge der Bewegungseinheiten 72, 73 aufGrundlage der Informationen überdie ermittelte Bewegungsposition der konkaven Linse 71.The tax section 75 determines the movement position of the concave lens 71 to adjust the concentration position of the laser beam near the front focal position of the condenser 27 according to the positional movement of the convex lens 70 and controls the movement / control amounts of the movement units 72 . 73 based on the information about the determined movement position of the concave lens 71 ,
[0127] DieNA des am Faseremissionsende 34 abgestrahlten divergentenLaserstrahls wird somit durch die konvexe Linse 70 gewandelt,deren Position verstellt wird. Der fokale Abstand des Laserstrahls,dessen NA gewandelt wurde, wird durch Durchgang durch die konkaveLinse 71 und die Konzentrationslinse 36 justiert. AlsFolge wird der Laserstrahl in der Nähe der vorderen fokalen Positiondes Kondensors 27 konzentriert.The NA of the at the fiber emission end 34 radiated divergent laser beam is thus by the convex lens 70 changed, whose position is adjusted. The focal distance of the laser beam whose NA has been converted is determined by the passage through the concave lens 71 and the concentration lens 36 adjusted. As a result, the laser beam is near the front focal position of the condenser 27 concentrated.
[0128] Eskann daher allein die Einfalls-NA ohne Änderung der Konzentrationspositiondes Laserstrahls kontinuierlich gewandelt werden. Als Folge wirdder Strahlenflussdurchmesser des nach Durchgang durch den Kondensor 27 inschrägerRichtung laufenden parallelen Strahls, das heißt die Größe des Einstrahlungsbereichsdes Laserstrahls in die Probe 25, kontinuierlich gewandelt.Die Energiedichte des Laserstrahls wird entsprechend der Änderungdes Laserstrahleinstrahlungsbereichs kontinuierlich gewandelt.Therefore, the incident NA alone can be continuously changed without changing the concentration position of the laser beam. As a result, the beam flow diameter becomes the after passing through the condenser 27 parallel beam running in an oblique direction, ie the size of the irradiation area of the laser beam into the sample 25 , continuously changed. The energy density of the laser beam is continuously changed in accordance with the change in the laser beam irradiation area.
[0129] Wievorstehend beschrieben, sind bei der vierten Ausführungsformdie konvexe Linse 70 und die konkave Linse 71 inder Zoomlinseneinheit 69 in Richtung der optischen Achsedes optischen Lasereinleitungswegs bewegbar angeordnet. Folglichkann der Einstrahlungsbereich des Laserstrahls in die Probe 25,also die Energiedichte des Laserstrahls, kontinuierlich gewandeltwerden. Wenn eine schwache Fluoreszenz mit starker Leistung erfasstwerden soll, wird der Einstrahlungsbereich des Laserstrahls konzentriert.Bei einer Fluoreszenzbeobachtung in einem breiten Bereich wird derEinstrahlungsbereich des Laserstrahls größer. Auf diese Weise ist esmöglich,die Probe 25 entsprechend den Anwendungen, wie etwa demBeobachtungszweck, selektiv zu nutzen.As described above, in the fourth embodiment, the convex lens 70 and the concave lens 71 in the zoom lens unit 69 arranged movably in the direction of the optical axis of the optical laser introduction path. Consequently, the area of irradiation of the laser beam into the sample 25 , i.e. the energy density of the laser beam, are continuously changed. When weak fluorescence with high power is to be detected, the irradiation area of the laser beam is concentrated. With fluorescence observation over a wide range, the irradiation range of the laser beam becomes larger. In this way it is possible to sample 25 selectively use according to the applications, such as the observation purpose.
[0130] Esist zu beachten, dass auch die vierte Ausführungsform wie folgt modifiziertwerden kann.ItNote that the fourth embodiment also modifies as followscan be.
[0131] 8 ist eine Darstellung desAufbaus einer Modifikation. Es ist zu beachten, dass gleiche Teilewie in den 7A bzw. 7B mit gleichen Bezugszeichenversehen sind; auf eine detaillierte Beschreibung wird verzichtet.Ein Objektivlinsenrevolver (Objektivlinsenwechseleinheit) 76 istmit einer Mehrzahl von Objektivlinsen 77 bis 82 mitunterschiedlicher Beobachtungsvergrößerung ausgestattet. Der Objektivlinsenrevolver 76 dreht sichum eine Rotationsachse 83, wobei von den Objektivlinsen 77 bis 82 einebeliebige ausgewähltund auf dem optischen Beobachtungsweg Q angeordnet wird. 8th is an illustration of the structure of a modification. It should be noted that the same parts as in the 7A respectively. 7B are provided with the same reference numerals; a detailed description is omitted. An objective lens turret (objective lens changing unit) 76 is with a plurality of objective lenses 77 to 82 equipped with different observation magnifications. The objective lens turret 76 rotates around an axis of rotation 83 , being from the objective lenses 77 to 82 any one is selected and placed on the optical observation path Q.
[0132] EineBeobachtungsvergrößerungswechseleinheit 84 drehtden Objektivlinsenrevolver 76 und wählt eine der Objektivlinsen 77 bis 82,um die Objektivlinse auf den optischen Beobachtungsweg Q zu setzen.Die Beobachtungsvergrößerungswechseleinheit 84 umfasstbeispielsweise einen Elektromotor und dergleichen.An observation magnification exchange unit 84 turns the objective lens turret 76 and choose one of the objective lenses 77 to 82 to put the objective lens on the optical observation path Q. The observation magnification exchange unit 84 includes, for example, an electric motor and the like.
[0133] DieBeobachtungsvergrößerungswechseleinheit 84 ist über einenTreiber 85 mit der Steuersektion 75 verbunden.Der Treiber 74 erhälteinen von der Steuersektion 75 ausgegebenen Ansteuerbefehl,um die Beobachtungsvergrößerungswechseleinheit 84 anzusteuern.The observation magnification exchange unit 84 is about a driver 85 with the tax section 75 connected. The driver 74 receives one from the tax section 75 issued drive command to the observation magnification changing unit 84 head for.
[0134] DieSteuersektion 75 führtein Ansteuerprogramm aus, um den Ansteuerbefehl an die Beobachtungsvergrößerungswechseleinheit 84 zurAuswahl der Beobachtungsvergrößerung derObjektivlinsen 77 bis 82 auszugeben. Darüber hinausermittelt die Steuersektion 75 die Positionen der konvexenLinse 70 und der konkaven Linse 71, um so einenLaserstrahleinstrahlungsbereich zu erhalten, der im wesentlichenmit dem Beobachtungsbereich bei den Beobachtungsvergrößerungender Objektivlinsen 77 bis 82 übereinstimmt, und gibt denAnsteuerbefehl an die Beobachtungsvergrößerungswechseleinheit 84 basierendauf den ermittelten Positionsinformationen aus.The tax section 75 executes a drive program to send the drive command to the observation magnification changing unit 84 for the selection of the observation magnification of the objective lenses 77 to 82 issue. In addition, the tax section determines 75 the positions of the convex lens 70 and the concave lens 71 so as to obtain a laser beam irradiation area substantially equal to the observation area at the observation magnifications of the objective lenses 77 to 82 matches, and gives the drive command to the observation magnification changing unit 84 based on the determined position information.
[0135] Wennbei dieser Ausbildung die Objektivlinsen 77 bis 82 mitoptionaler Beobachtungsvergrößerung ausgewählt werden,kann ein mit dem Beobachtungsbereich ei ner Objektivlinse im wesentlichen übereinstimmenderLaserstrahleinstrahlungsbereich in Zusammenwirkung mit der ausgewählten Objektivlinseeingestellt/festgelegt werden.If in this training the objective lenses 77 to 82 can be selected with optional observation magnification, a laser beam irradiation region which essentially corresponds to the observation region of an objective lens can be set / defined in cooperation with the selected objective lens.
[0136] DieZoomlinseneinheit 69 ist nicht auf die Kombination derkonvexen Linse 70 und der konkaven Linse 71 beschränkt; siekann eine Kombination von konvexen und konkaven Linsen sein, mitdenen die gleiche Funktion erhalten wird.The zoom lens unit 69 is not on the combination of the convex lens 70 and the concave lens 71 limited; it can be a combination of convex and concave lenses with which the same function is obtained.
[0137] MitBezug auf die Zeichnungen wird eine fünfte Ausführungsform der vorliegendenErfindung beschrieben. Zu beachten ist, dass gleiche Teile wie in 1 mit gleichen Bezugsziffernversehen sind; auf ihre detaillierte Beschreibung wird verzichtet.A fifth embodiment of the present invention will be described with reference to the drawings. It should be noted that the same parts as in 1 are provided with the same reference numbers; their detailed description is omitted.
[0138] 9 ist eine Darstellung desAufbaus eines Totalreflexionsfluoreszenzmikroskops (TIRFM) vom aufrechtstehendenTyp. In einem unteren Teil der Basis 28 sind beispielsweisevier Lasereinleitungssektionen (nachfolgend erste bis vierte Lasereinleitungssektiongenannt) L₁, L₂,L₃, L₄ im unterenTeil der Basis 28 angeordnet. Die erste bis vierte LasereinleitungssektionL₁, L₂, L₃, L₄ sind in gleichenWinkelabständenum den Durchlassbeleuchtungslichtweg T angeordnet. Die erste bisvierte Lasereinleitungssektion L₁, L₂, L₃, L₄ sind dabeiradial angeordnet in einer den Durchlassbeleuchtungslichtweg T imwesentlichen rechtwinklig schneidenden Richtung. Die erste und zweiteLasereinleitungssektion L₁, L₂ sindso angeordnet, dass sie sich über denDurchlassbeleuchtungslichtweg T hinweg einander gegenüberliegen.Die dritte und vierte Lasereinleitungssektion L₃,L₄ sind so angeordnet, dass sie sich über denDurchlassbeleuchtungslichtweg T hinweg gegenüberliegen. Da die zweite bisvierte Lasereinleitungssektion L₂, L₃, L₄ die gleicheAusgestaltung wie die erste Lasereinleitungssektion L₁ haben,wird auf eine detaillierte Beschreibung der Ausgestaltung verzichtet. 9 Fig. 3 is an illustration of the structure of an upright type total reflection fluorescence microscope (TIRFM). In a lower part of the base 28 are, for example, four laser initiation sections (hereinafter referred to as first to fourth laser initiation sections) L ₁ , L ₂ , L ₃ , L ₄ in the lower part of the base 28 is assigns. The first to fourth laser introduction sections L ₁ , L ₂ , L ₃ , L ₄ are arranged at equal angular intervals around the transmission illumination light path T. The first to fourth laser introduction sections L ₁ , L ₂ , L ₃ , L ₄ are arranged radially in a direction that intersects the passage illumination light path T essentially at right angles. The first and second laser introduction sections L ₁ , L ₂ are arranged so that they face each other across the transmission illumination light path T. The third and fourth laser introduction sections L ₃ , L ₄ are arranged so that they face each other across the transmission illumination light path T. Since the second to fourth laser introduction sections L ₂ , L ₃ , L _{4 have} the same configuration as the first laser introduction section L ₁ , a detailed description of the configuration is omitted.
[0139] DieWellenlängender von der ersten bis vierten Lasereinleitungssektion L₁, L₂, L₃,L₄ abgestrahlten Laserstrahlen unterscheidensich zudem voneinander. Die erste Lasereinleitungssektion L₁ gibt einen Laserstrahl mit einer einzigenWellenlänge λ_L1 ab.Die zweite Lasereinleitungssektion gibt einen Laserstrahl mit einereinzigen Wellenlänge λ_L2 ab.Die dritte Lasereinleitungssektion L₃ gibteinen Laserstrahl mit einer einzigen Wellenlänge λ_L3 ab.Die vierte Lasereinleitungssektion L₄ gibteinen Laserstrahl mit einer einzigen Wellenlänge λ_L4 ab.The wavelengths of the laser beams emitted by the first to fourth laser introduction sections L ₁ , L ₂ , L ₃ , L ₄ also differ from one another. The first laser introduction section L ₁ emits a laser beam with a single wavelength λ _L1 . The second laser introduction section emits a laser beam with a single wavelength λ _L2 . The third laser introduction section L ₃ emits a laser beam with a single wavelength λ _L3 . The fourth laser introduction section L ₄ emits a laser beam with a single wavelength λ _L4 .
[0140] Alsnächsteswird die Ausbildung auf der Seite des optischen BeobachtungswegesQ erläutert.Auf dem optischen Beobachtungsweg Q ist ein erster dichroitischerSpiegel 93 angeordnet. Der erste dichroitische Spiegel 93 hatdie Eigenschaft, dass der Spiegel Licht kürzerer Wellenlänge alseine Standardwellenlänge λ₁ reflektiertund Licht einer längerenWellenlängeals die Wellenlänge λ₁ durchlässt.Next, the formation on the optical observation path Q side will be explained. A first dichroic mirror is on the optical observation path Q. 93 arranged. The first dichroic mirror 93 has the feature that the mirror light of shorter wavelength than a standard wavelength λ ₁ and reflects light of a longer wavelength than the wavelength λ ₁ transmits.
[0141] Aufeinem optischen Reflexionsweg des ersten dichroitischen Spiegels 93 sinddie Bilderzeugungslinse 21 sowie ein zweiter dichroitischerSpiegel 94 angeordnet. Der zweite dichroitische Spiegel 94 besitzteine Wellenlänge λ₂,die eine kürzereStandardwellenlängeals die Wellenlänge λ₁ ist,und hat die Eigenschaft, dass der Spiegel Licht kürzerer Wellenlängen alsdie Wellenlänge λ₂ reflektiertund Licht auf der Seite längererWellenlängendurchlässt.On an optical reflection path of the first dichroic mirror 93 are the imaging lens 21 and a second dichroic mirror 94 arranged. The second dichroic mirror 94 has a wavelength λ ₂ , which is a shorter standard wavelength than the wavelength λ ₁ , and has the property that the mirror reflects light of shorter wavelengths than the wavelength λ ₂ and transmits light on the side of longer wavelengths.
[0142] Daserste Emissionsfilter 22 und die erste Bildaufnahmevorrichtung 25 sindauf einem optischen Reflexionsweg des zweiten dichroitischen Spiegels 94 angeordnet.Das erste Emissionsfilter 22 ist ein Bandpassfilter, dasnur Licht mit einem bestimmten Wellenlängenband λ_E1 durchlässt, daskleiner als die Wellenlänge λ₂ ist.Die erste Bildaufnahmevorrichtung 25 ist an der fokalenPosition der ersten Bilderzeugungslinse 21 angeordnet.The first emission filter 22 and the first image pickup device 25 are on an optical reflection path of the second dichroic mirror 94 arranged. The first emission filter 22 is a bandpass filter that only lets light with a certain wavelength band λ _E1 that is smaller than the wavelength λ ₂ . The first imaging device 25 is at the focal position of the first imaging lens 21 arranged.
[0143] Aufeinem optischen Durchlassweg des zweiten dichroitischen Spiegels 94 sindein zweites Emissionsfilter 95 und eine zweite Bildaufnahmevorrichtung 96 angeordnet.Das zweite Emissionsfilter 95 ist ein Bandpassfilter, dasLicht lediglich eines bestimmten Wellenlängenbands λ_E2 zwischenden Wellenlängen λ_L2 und λ_L1 durchlässt. Diezweite Bildaufnahmevorrichtung 96 ist an der fokalen Positionder ersten Bilderzeugungslinse 21 angeordnet.On an optical transmission path of the second dichroic mirror 94 are a second emission filter 95 and a second image pickup device 96 arranged. The second emission filter 95 is a bandpass filter that only allows light of a certain wavelength band λ _{E2 to} pass between the wavelengths λ _L2 and λ _L1 . The second imaging device 96 is at the focal position of the first imaging lens 21 arranged.
[0144] Dagegensind eine zweite Bilderzeugungslinse 97 sowie ein Totalreflexionsprisma 98 aufeinem optischen Durchlassweg des ersten dichroitischen Spiegels 93 angeordnet.Auf einem optischen Reflexionsweg des Totalreflexionsprismas 98 istein dritter dichroitischer Spiegel 99 angeordnet.In contrast are a second imaging lens 97 as well as a total reflection prism 98 on an optical transmission path of the first dichroic mirror 93 arranged. On an optical reflection path of the total reflection prism 98 is a third dichroic mirror 99 arranged.
[0145] Derdritte dichroitische Spiegel 99 weist eine Wellenlänge λ₃ auf,die eine Standardwellenlängeist, welche kürzerals die Wellenlänge λ₁ ist,und besitzt die Eigenschaft, dass der Spiegel Licht kürzerer Wellenlängen alsdie Wellenlänge λ₃ reflektiertund Licht auf der Seite längererWellenlängendurchlässt.Ein drittes Emissionsfilter 100 und eine dritte Bildaufnahmevorrichtung 101 sindauf einem optischen Reflexionsweg des dritten dichroitischen Spiegels 99 angeordnet.Das dritte Emissionsfilter 100 ist ein Bandpassfilter,das Licht lediglich eines bestimmten Wellenlängenbands λ_E3 zwischenden Wellenlängen λ₁ und λ₃ durchlässt. Diedritte Bildaufnahmevorrichtung 101 ist an der fokalen Positionder zweiten Bilderzeugungslinse 97 angeordnet.The third dichroic mirror 99 has a wavelength λ ₃ , which is a standard wavelength which is shorter than the wavelength λ ₁ , and has the property that the mirror reflects light of shorter wavelengths than the wavelength λ ₃ and transmits light on the longer wavelength side. A third emission filter 100 and a third image pickup device 101 are on an optical reflection path of the third dichroic mirror 99 arranged. The third emission filter 100 is a bandpass filter that only allows light of a certain wavelength band λ _{E3 to} pass between the wavelengths λ ₁ and λ ₃ . The third imaging device 101 is at the focal position of the second imaging lens 97 arranged.
[0146] Aufeinem optischen Durchlassweg des dritten dichroitischen Spiegels 99 sindein viertes Emissionsfilter 102 sowie eine vierte Bildaufnahmevorrichtung 103 angeordnet.Das vierte Emissionsfilter 102 ist ein Bandpassfilter,das Licht lediglich eines bestimmten Wellenlängenbands λ_E4 durchlässt, daslängerals die Wellenlänge λ_L3 ist.Die vierte Bildaufnahmevorrichtung 103 ist an der fokalenPosition der zweiten Bilderzeugungslinse 97 angeordnet.On an optical transmission path of the third dichroic mirror 99 are a fourth emission filter 102 and a fourth image pickup device 103 arranged. The fourth emission filter 102 is a bandpass filter that only allows light of a certain wavelength band λ _{E4 to} pass, which is longer than the wavelength λ _L3 . The fourth imaging device 103 is at the focal position of the second imaging lens 97 arranged.
[0147] 11 ist eine Darstellung,die den Zusammenhang zwischen den durch den ersten bis dritten dichroitischenSpiegel 93, 94, 99 und das erste bisvierte Emissionsfilter 22, 95, 100, 102 separiertenWellenlängen zeigt.Die bestimmten Wellenlängenbänder λ_E1 bis λ_E4 genügen derBeziehung λ_E1 < λ_E2 < λ_E3 < λ_E4. 11 is a diagram showing the relationship between those through the first to third dichroic mirrors 93 . 94 . 99 and the first to fourth emission filters 22 . 95 . 100 . 102 shows separated wavelengths. The determined wavelength bands λ _E1 to λ _E4 satisfy the relationship λ _E1 <λ _E2 <λ _E3 <λ _E4 .
[0148] Alsnächsteswird die Arbeitsweise des wie vorstehend beschrieben ausgestaltetenTIRFM erläutert.Asnextis the operation of the designed as described aboveTIRFM explained.
[0149] DieLaseroszillatoreinheit 32 in der ersten LasereinleitungssektionL₁ erzeugt einen Laserstrahl mit der Wellenlänge λ_L1.Der Laserstrahl mit der Wellenlänge λ_L1 wirdin die optische Faser 33 eingeleitet und vom Faseremissionsende 34 alsdivergenter Strahl abgestrahlt. Der als divergenter Strahl abgestrahlteLaserstrahl wird durch die Konzentrationslinse 36 in einenkonvergenten Strahl umgewandelt und trifft auf den Reflexionsspiegel 47.The laser oscillator unit 32 in the first laser introduction section L ₁ generates a laser beam with the wavelength λ _L1 . The laser beam with the wavelength λ _L1 is in the optical fiber 33 initiated and from the fiber emission end 34 radiated as a divergent beam. The laser beam emitted as a divergent beam is transmitted through the concentration lens 36 converted into a convergent beam and strikes the reflection mirror 47 ,
[0150] Derauf den Reflexionsspiegel 47 einfallende Laserstrahl wirdauf der Seite des Kondensors 27 in der Nähe der äußerstenSeite des Durchlassbeleuchtungslichtwegs T reflektiert. Der vondem Reflexionsspiegel 47 reflektierte Laserstrahl wirdeinmal in der Näheder vorderen fokalen Position des Kondensors 27 durch die Konzentrationslinse 36 konzentriert.Darüberhinaus fälltder Laserstrahl auf den Kondensor 27 ein und wird von demKondensor 27 als in schräger Richtung laufender parallelerStrahl abgegeben. Der von dem Kondensor 27 abgegebene Laserstrahlwird durch das Immersionsöl 6 übertragenund trifft auf die Grenzflächezwischen dem Schiebeglas 24 und der Probe 25.The one on the reflection mirror 47 incident laser beam is on the side of the condenser 27 is reflected in the vicinity of the outermost side of the transmission illumination light path T. The one from the reflection mirror 47 reflected laser beam is once near the front focal position of the condenser 27 through the concentration lens 36 concentrated. In addition, the laser beam hits the condenser 27 one and is from the condenser 27 emitted as a parallel beam running in an oblique direction. The one from the condenser 27 The laser beam is emitted by the immersion oil 6 transmitted and hits the interface between the sliding glass 24 and the sample 25 ,
[0151] Wennder Einfallswinkel θ_L1 des Laserstrahls auf die Grenzfläche zwischendem Schiebeglas 24 und der Probe 25 größer alsder kritische Winkel der Totalreflexion ist, wird der Laserstrahlan der Grenzflächetotal reflektiert. Evaneszentes Licht dringt dementsprechend indie Probe 25 ein.When the angle of incidence θ _{L1 of} the laser beam on the interface between the sliding glass 24 and the sample 25 is larger than the critical angle of total reflection, the laser beam is totally reflected at the interface. Accordingly, evanescent light penetrates the sample 25 on.
[0152] Diein der Probe 25 vorhandene spezielle fluoreszierende Substanzwird durch das evaneszente Licht mit der Wellenlänge λ_L1 angeregt.Infolge der Anregung emittiert die fluoreszierende Substanz Fluoreszenz derart,dass die maximale Luminanzwellenlänge der Fluoreszenz im Durchlasswellenlängenband λ_E1 des Emissionsfilters 22 liegt.Die Fluoreszenz fälltdurch das Deckglas 26 auf die Objektivlinse 20 ein.Außerdem gelangtdie Fluoreszenz durch die Bilderzeugungslinse 21 und dasEmissionsfilter 22 und fällt auf die erste Bildaufnahmevorrichtung 23 ein.Die erste Bildaufnahmevorrichtung 23 nimmt das Fluoreszenzbilddes Wellenlängenbands λ_E1 auf.The one in the sample 25 Existing special fluorescent substance is excited by the evanescent light with the wavelength λ _L1 . As a result of the excitation, the fluorescent substance emits fluorescence such that the maximum luminance wavelength of the fluorescence in the transmission wavelength band λ _{E1 of} the emission filter 22 lies. The fluorescence falls through the cover slip 26 on the objective lens 20 on. In addition, the fluorescence passes through the imaging lens 21 and the emission filter 22 and falls on the first image pickup device 23 on. The first imaging device 23 takes the fluorescence image of the wavelength band λ _E1 .
[0153] Wenndagegen der Mikrometerfunktionsteil 45 in der ersten LasereinleitungssektionL₁ gedreht wird, wird der Reflexionsspiegel 47 intranslatorischer Weise in der den DurchlassbeleuchtungslichtwegT im wesentlichen rechtwinklig schneidenden Richtung bewegt. Wennsich die Position des Reflexionsspiegels 47 in der denDurchlassbeleuchtungslichtweg T im wesentlichen rechtwinklig schneidendenRichtung bewegt, verlagert sich die Einfallsposition des Laserstrahlsauf dem Kondensor 27. Dementsprechend ändert sich der Abstrahlwinkeldes von dem Kondensor 27 abgestrahlten Laserstrahls, alsoder Einfallswinkel θ_L1 des Laserstrahls auf die Grenzfläche zwischendem Schiebeglas 24 und der Probe 25.If, on the other hand, the micrometer functional part 45 is rotated in the first laser introduction section L ₁ , the reflection mirror 47 in a translational manner in the direction substantially intersecting the transmission illumination light path T. If the position of the reflection mirror 47 In the direction substantially perpendicular to the passage illumination light path T, the incident position of the laser beam on the condenser shifts 27 , The radiation angle of the condenser changes accordingly 27 radiated laser beam, i.e. the angle of incidence θ _{L1 of} the laser beam on the interface between the sliding glass 24 and the sample 25 ,
[0154] DieEindringtiefe des evaneszenten Lichts bei Totalreflexionsbeleuchtung ändert sichmit dem Einfallswinkel θ_L1 des Laserstrahls auf die Grenzfläche zwischendem Schiebeglas 24 und der Probe 25. Der Mikrometerfunktionsteil 45 wirddaher so gedreht, dass sich der Reflexionsspiegel 47 geringfügig in derden Durchlassbeleuchtungslichtweg T im wesentlichen rechtwinkligschneidenden Richtung bewegt. Wenn dabei der Reflexionsspiegel 47 anden Durchlassbeleuchtungslichtweg T herangebracht wird oder vondiesem entfernt wird, kann die Eindringtief d_L1 desevaneszenten Lichts optional geändertwerden.The penetration depth of the evanescent light with total reflection lighting changes with the angle of incidence θ _{L1 of} the laser beam on the interface between the sliding glass 24 and the sample 25 , The micrometer functional part 45 is therefore rotated so that the reflection mirror 47 moved slightly in the direction substantially intersecting the transmission illumination light path T. If doing so, the reflection mirror 47 is brought into or removed from the passage illumination light path T, the penetration depth d _{L1 of} the evanescent light can optionally be changed.
[0155] Esist zu beachten, dass bei Durchführungeiner Transmissionsbeleuchtungsbeobachtung mit Hilfe des von derDurchlassbeleuchtungslichtquelle 31 ausgegebenen Beleuchtungslichtsder Reflexionsspiegel 47 vollständig aus dem DurchlassbeleuchtungslichtwegT herausgenommen ist.It should be noted that when carrying out a transmission lighting observation with the help of the transmission illumination light source 31 output illumination light of the reflection mirror 47 is completely taken out of the passage illumination light path T.
[0156] Diezweite Lasereinleitungssektion L₂ ist ähnlich derersten Lasereinleitungssektion L₁. Wennder Mikrometerfunktionsteil 45 in der zweiten LasereinleitungssektionL₂ gedreht wird, ändert sich der Einfallswinkel θ_L1 des Laserstrahls der Wellenlänge λ_L2,der auf die Grenzflächezwischen dem Schiebeglas 24 und der Probe 25 einfällt. Dementsprechendkann die Eindringtiefe d_L2 des evaneszentenLichts optional geändertwerden.The second laser initiation section L ₂ is similar to the first laser initiation section L ₁ . If the micrometer functional part 45 is rotated in the second laser introduction section L ₂ , the angle of incidence θ _{L1 of} the laser beam of the wavelength λ _{L2 changes} , which is on the interface between the sliding glass 24 and the sample 25 incident. Accordingly, the depth of penetration d _{L2 of} the evanescent light can optionally be changed.
[0157] Diein der Probe 25 vorhandene fluoreszierende Substanz wirddurch das evaneszente Licht mit der Wellenlänge λ_L2 angeregt.Infolge der Anregung strahlt die spezielle fluoreszierende Substanz,die in der Probe 25 vorhanden ist, die Fluoreszenz derartab, dass die maximale Luminanzwellenlänge der Fluoreszenz im Durchlasswellenlängenband λ_E2 deszweiten Emissionsfilters 95 liegt. Die Fluoreszenz desWellenlängenbands λ_E2 fällt durchdas Deckglas 26 auf die Objektivlinse 20 ein.The one in the sample 25 Existing fluorescent substance is excited by the evanescent light with the wavelength λ _L2 . As a result of the excitation, the special fluorescent substance emits in the sample 25 is present, the fluorescence decreases such that the maximum luminance wavelength of the fluorescence in the transmission wavelength band λ _{E2 of} the second emission filter 95 lies. The fluorescence of the wavelength band λ _E2 falls through the cover slip 26 on the objective lens 20 on.
[0158] Diedurch die Objektivlinse 20 hindurchgehende Fluoreszenzdes Wellenlängenbands λ_E2 wirdvon dem ersten dichroitischen Spiegel 93 im optischen BeobachtungswegQ reflektiert und trifft überdie Bilderzeugungslinse 21 auf den zweiten dichroitischenSpiegel 94. Die Fluoreszenz des Wellenlängenbands λ_E2 wirdvon dem zweiten dichroitischen Spiegel 94 reflektiert,durch das zweite Emissionsfilter 95 hindurchgelassen und fällt aufdie zweite Bildaufnahmevorrichtung 96 ein. Die zweite Bildaufnahmevorrichtung 96 nimmtdas Fluoreszenzbild des Wellenlängenbands λ_E2 auf.That through the objective lens 20 fluorescence of the wavelength band λ _E2 passing through is obtained from the first dichroic mirror 93 reflected in the optical observation path Q and strikes the images supply lens 21 on the second dichroic mirror 94 , The fluorescence of the wavelength band λ _E2 is from the second dichroic mirror 94 reflected by the second emission filter 95 is let through and falls onto the second image pickup device 96 on. The second imaging device 96 takes the fluorescence image of the wavelength band λ _E2 .
[0159] Auchdie dritte und vierte Lasereinleitungssektion L₃,L₄ sind ähnlichder ersten Lasereinleitungssektion L₁. Wennder Mikrometerfunktionsteil 45 in der dritten LasereinleitungssektionL₃ gedreht wird, ändert sich der Einfallswinkel θ_L3 des auf die Grenzfläche zwischen dem Schiebeglas 24 undder Probe 25 einfallenden Laserstrahls der Wellenlänge λ_L3.Dementsprechend kann die Eindringtiefe d_L3 desevaneszenten Lichts mit der Wellenlänge λ_L3 optionalgeändertwerden.The third and fourth laser introduction sections L ₃ , L ₄ are also similar to the first laser introduction section L ₁ . If the micrometer functional part 45 is rotated in the third laser introduction section L ₃ , the angle of incidence θ _L3 changes to the interface between the sliding glass 24 and the sample 25 incident laser beam of wavelength λ _L3 . Accordingly, the penetration depth d _{L3 of} the evanescent light with the wavelength λ _L3 can optionally be changed.
[0160] DieFluoreszenz mit dem Wellenlängenband λ_E3 gehtdurch den ersten dichroitischen Spiegel 93 hindurch undtrifft überdie zweite Bilderzeugungslinse 97 und das Totalreflexionsprisma 98 aufden dritten dichroitischen Spiegel 99. Die Fluoreszenzdes Wellenlängenbands λ_E3 wirdvon dem dritten dichroitischen Spiegel 99 reflektiert,geht durch das dritte Emissionsfilter 100 hindurch undtrifft auf die dritte Bildaufnahmevorrichtung 101. Diedritte Bildaufnahmevorrichtung 101 nimmt das Fluoreszenzbilddes Wellenlängenbands λ_E3 auf.The fluorescence with the wavelength band λ _E3 passes through the first dichroic mirror 93 and hits over the second imaging lens 97 and the total reflection prism 98 on the third dichroic mirror 99 , The fluorescence of the wavelength band λ _E3 is from the third dichroic mirror 99 reflected, goes through the third emission filter 100 and hits the third image pickup device 101 , The third imaging device 101 takes the fluorescence image of the wavelength band λ _E3 .
[0161] Wennder Mikrometerfunktionsteil 45 in der vierten LasereinleitungssektionL₄ gedreht wird, ändert sich der Einfallswinkel θ_L4 des auf die Grenzfläche zwischen dem Schiebeglas 24 undder Probe 25 einfallenden Laserstrahls der Wellenlänge λ_L4.Dementsprechend kann die Eindringtiefe d_L4 desevaneszenten Lichts der Wellenlänge λ_L4 optionalgeändertwerden.If the micrometer functional part 45 is rotated in the fourth laser introduction section L ₄ , the angle of incidence θ _L4 changes to the interface between the sliding glass 24 and the sample 25 incident laser beam of wavelength λ _L4 . Accordingly, the depth of penetration d _{L4 of} the evanescent light of the wavelength λ _L4 can optionally be changed.
[0162] DieFluoreszenz des Wellenlängenbands λ_E4 gehtdurch den ersten dichroitischen Spiegel 93 hindurch, gelangtdurch die zweite Bilderzeugungslinse 97 und das Totalreflexionsprisma 98 undtrifft auf den dritten dichroitischen Spiegel 99. Die Fluoreszenzdes Wellenlängenbands λ_E4 gehtdurch den dritten dichroitischen Spiegel 99 hindurch, wirddurch das vierte Emissionsfilter 102 durchgelassen undtrifft auf die vierte Bildaufnahmevorrichtung 103. Dievierte Bildaufnahmevorrichtung 103 nimmt ein Fluoreszenzbilddes Wellenlängenbands λ_E4 auf.The fluorescence of the wavelength band λ _E4 passes through the first dichroic mirror 93 passes through the second imaging lens 97 and the total reflection prism 98 and hits the third dichroic mirror 99 , The fluorescence of the wavelength band λ _E4 passes through the third dichroic mirror 99 through, is through the fourth emission filter 102 passed and strikes the fourth image pickup device 103 , The fourth imaging device 103 takes a fluorescence image of the wavelength band λ _E4 .
[0163] Wievorstehend beschrieben, hängtgemäß der fünften Ausführungsformder jeweilige maximale Einfallswinkel θmax der Laserstrahlen mit denWellenlängen λ_L1 bis λ_L4,die auf die Grenzflächezwischen dem Schiebeglas 24 und der Probe 25 einfallen,lediglich von der NA des Kondensors 27 in gleicher Weisewie bei der ersten Ausführungsformab. Daher ist eine Fluoreszenzbeobachtung mittels Totalreflexionsbeleuchtung ungeachtetder NA oder der Vergrößerung derObjektivlinse 20 möglich.As described above, according to the fifth embodiment, the respective maximum angle of incidence θmax of the laser beams with the wavelengths λ _L1 to λ _L4 depends on the interface between the sliding glass 24 and the sample 25 occur only from the NA of the condenser 27 in the same way as in the first embodiment. Therefore, fluorescence observation using total reflection lighting is irrespective of the NA or the magnification of the objective lens 20 possible.
[0164] Dieerste bis vierte Lasereinleitungssektion L₁,L₂, L₃, L₄ sind entfernt von der Probe 25 unddem Kondensor 27 angeordnet. Demgemäss befinden sich keine Strukturenin der Näheder Probe 25 und der Raum in der Nähe der Probe 25 istnicht eingeschränkt.Die erste bis vierte Lasereinleitungssektion L₁,L₂, L₃, L₄ könnenradial an der Basis angeordnet werden.The first to fourth laser initiation sections L ₁ , L ₂ , L ₃ , L ₄ are removed from the sample 25 and the condenser 27 arranged. Accordingly, there are no structures near the sample 25 and the space near the sample 25 is not restricted. The first to fourth laser introduction sections L ₁ , L ₂ , L ₃ , L ₄ can be arranged radially at the base.
[0165] Dieerste bis vierte Lasereinleitungssektion L₁,L₂, L₃, L₄ umfassen eine Konstruktion, bei der derReflexionsspiegel 47 durch das Mikrometer 43 bewegtwird. Die erste bis vierte Lasereinleitungssektion L₁,L₂, L₃, L₄ haben einen einfachen Aufbau und weisenauch einen schmalen Arbeitsbereich auf. Wegen der ersten bis viertenLasereinlei tungssektion L₁, L₂,L₃, L₄ kann daherdas TIRFM selbst kompakt sein und das TIRFM kann bessere Arbeitseigenschaftenaufweisen.The first to fourth laser introduction sections L ₁ , L ₂ , L ₃ , L ₄ include a construction in which the reflection mirror 47 through the micrometer 43 is moved. The first to fourth laser introduction sections L ₁ , L ₂ , L ₃ , L ₄ have a simple structure and also have a narrow working area. Because of the first to fourth laser introduction sections L ₁ , L ₂ , L ₃ , L ₄ , the TIRFM itself can therefore be compact and the TIRFM can have better working properties.
[0166] Für die erstebis vierte Lasereinleitungssektion L₁, L₂, L₃, L₄ können dieWellenlängen λ_L1 bis λ_L4 und dieEindringtiefen d_L1 bis d_L4 desevaneszenten Lichts jeweils individuell eingestellt werden.For the first to fourth laser introduction sections L ₁ , L ₂ , L ₃ , L ₄ , the wavelengths λ _L1 to λ _L4 and the penetration depths d _L1 to d _{L4 of} the evanescent light can be set individually.
[0167] JederTeil in der Probe 25, der ein Beobachtungsobjekt ist, wirddeswegen manchmal mit mehreren Arten von fluoreszierenden Substanzenmarkiert, wie etwa CFP, GFP, YFP, RFP. In diesem Fall ist es möglich, dieEindringtiefe des evaneszenten Lichts mit einer Anregungswellenlänge optimalim Hinblick auf die Tiefe einzustellen, in der der jeweils zu markierendeTeil liegt.Every part in the sample 25 , which is an observation object, is therefore sometimes labeled with several types of fluorescent substances, such as CFP, GFP, YFP, RFP. In this case it is possible to optimally set the penetration depth of the evanescent light with an excitation wavelength with regard to the depth in which the part to be marked lies.
[0168] Dieerste bis vierte Lasereinleitungssektion L₁,L₂, L₃, L₄ sind vollständig unabhängig voneinander ausgebildet.Dementsprechend könnendie optischen Eigenschaften nach Maßgabe der benutzerseitigenApplikation unabhängigeingestellt werden. Zusätzlichzu der ersten bis vierten Lasereinleitungssektion L₁,L₂, L₃, L₄ ist es möglich, die erforderliche Anzahlvon Lasereinleitungssektionen anzuordnen, hinzuzufügen oderzu entfernen. Das heißt,Lasereinleitungssektionen könnenferner zu einem Extraraum, falls vorhanden, hinzugefügt werden.The first to fourth laser introduction sections L ₁ , L ₂ , L ₃ , L ₄ are completely independent of one another. Accordingly, the optical properties can be set independently in accordance with the user application. In addition to the first to fourth laser initiation sections L ₁ , L ₂ , L ₃ , L ₄ , it is possible to arrange, add or remove the required number of laser initiation sections. That is, laser initiation sections can also be added to an extra room, if any.
[0169] DieBeleuchtungsseite (Seite des Kondensors 27) ist von derBeobachtungsseite (Seite der Objektivlinse 20) getrennt.Dementsprechend ist kein dichroitischer Multiband-Spiegel erforderlichund die Handhabung vereinfacht.The lighting side (side of the condenser 27 ) is from the observation side (side of the objective lens 20 ) Cut. Accordingly, a dichroic multiband mirror is not required and handling is simplified.
[0170] Gemäß der fünften Ausführungsformkann daher ein Totalreflexionsfluoreszenzmikroskop mit den folgendenbesseren Systemeigenschaften bereitgestellt werden. Das Mikroskopist kompakt und leicht handhabbar. Mehrere Lasereinleitungssektionenkönnenleicht hinzugefügtwerden. Die Eindringtiefen des evaneszenten Lichts können mitHilfe von Laserstrahlen mehrerer Wellenlängen unabhängig eingestellt wer den. Esist möglich,die Probe 25 gleichzeitig mit Laserstrahlen mehrerer Wellenlängen zubestrahlen.According to the fifth embodiment, therefore, a total reflection fluorescence microscope with the following better system properties can be provided. The microscope is compact and easy to use. Multiple laser initiation sections can be easily added. The penetration depths of evanescent light can be set independently with the help of laser beams of several wavelengths. It is possible to take the sample 25 to be irradiated simultaneously with laser beams of several wavelengths.
[0171] Zubeachten ist, dass auch die fünfteAusführungsformwie folgt abgewandelt werden kann.Tonote that also the fifthembodimentcan be modified as follows.
[0172] Eskann statt des Schiebeglases 24 auch ein Glasuntertellerverwendet werden. Entsprechend kann das Deckglas 26 weggelassenwerden. Wenn in diesem Fall der Arbeitsabstand der Objektivlinse 20 kurzist, kann eine Immersionsobjektivlinse verwendet werden.It can be used instead of the sliding glass 24 a glass saucer can also be used. Accordingly, the cover slip 26 be omitted. If in this case the working distance of the objective lens 20 is short, an immersion objective lens can be used.
[0173] Eskann der Reflexionsspiegel 47 beispielsweise auch mit Hilfeeines Elektoomotors, eines Piezoaktuators oder dergleichen zusätzlich zudem Mikrometer bewegt werden.It can be the reflection mirror 47 for example, can also be moved in addition to the micrometer with the aid of an electric motor, a piezo actuator or the like.
[0174] DerReflexionsspiegel 47 wird festgelegt. Das Faseremissionsende 34 unddie Konzentrationslinse 36 können gemeinsam in Richtungparallel zur optischen Achse des DurchlassbeleuchtungslichtwegsT bewegt werden. Das Faseremissionsende 34 und die Konzentrationslinse 36 sindbeispielsweise mittels eines Mikromotors, eines Elektromotors, einesPiezoaktuators oder dergleichen bewegbar.The reflection mirror 47 is set. The fiber emission end 34 and the concentration lens 36 can be moved together in the direction parallel to the optical axis of the transmission illumination light path T. The fiber emission end 34 and the concentration lens 36 can be moved, for example, by means of a micromotor, an electric motor, a piezo actuator or the like.
[0175] DieAusführungsformist nicht nur bei einem Mikroskop vom aufrechtstehenden Typ anwendbar,sondern auch bei einem umgekehrten Mikroskop.Theembodimentis not only applicable to an upright type microscope,but also with an inverted microscope.
[0176] Eskann auch die Ausbildung auf dem optischen Beobachtungsweg Q optionalsein, solange die Fluoreszenzwellenlänge im Hinblick auf die jeweiligeAnwendungswellenlängeso gewähltwird, dass ein Bild aufgenommen wird.Ittraining on the optical observation path Q can also be optionalbe as long as the fluorescence wavelength with respect to the particularApplication wavelengthso chosenis that a picture is taken.
[0177] Wiein 12 gezeigt, können inder ersten bis vierten Lasereinleitungssektion L₁,L₂, L₃, L₄ auch Verschlüsse bzw. Vorhänge 110 bis 113 vorgesehensein. Die Verschlüsse 110 bis 113 wählen jeweilsdie Einleitung und Blockierung des Laserstrahls in der betreffendenersten bis vierten Lasereinleitungssektion L₁,L₂, L₃, L₄. Eine Ver schlusssteuereinheit 114 steuertdas Öffnen/Schließen jedesder Verschlüsse 110 bis 113 individuell.Dementsprechend kann der in die Probe 25 einzuleitendeLaserstrahl gewähltwerden.As in 12 shown, closures or curtains can also be used in the first to fourth laser introduction sections L ₁ , L ₂ , L ₃ , L ₄ 110 to 113 be provided. The closures 110 to 113 select the introduction and blocking of the laser beam in the respective first to fourth laser introduction sections L ₁ , L ₂ , L ₃ , L ₄ . A locking control unit 114 controls the opening / closing of each of the shutters 110 to 113 individually. Accordingly, the in the sample 25 laser beam to be introduced can be selected.
[0178] DieWellenlängejedes von mehreren Lasereinleitungssektionen, beispielsweise mindestenszwei Lasereinleitungssektionen aus der ersten bis vierten LasereinleitungssektionL₁, L₂, L₃, L₄, eingeleitetenLaserstrahls wird gleich eingestellt. Darüber hinaus werden die Laserstrahlendurch Öffnen/Schließen derbetreffenden Verschlüsse,beispielsweise der Verschlüsse 110, 111,abwechselnd in die Probe 25 eingeleitet. Die Eindringtiefedes durch Anregung mittels eines jeweiligen Laserstrahls erzeugtenevaneszenten Lichts wird dementsprechend geändert. Wenn folglich die beobachtetenBilder anhand der Differenz der Eindringtiefe der Fluoreszenz dergleichen fluoreszierenden Substanz verglichen werden, ist es möglich, dieTiefe einer Erzeugungsquelle der Fluoreszenz zu bestimmen.The wavelength of each of a plurality of laser initiation sections, for example at least two laser initiation sections from the first to fourth laser initiation sections L ₁ , L ₂ , L ₃ , L ₄ , is set the same. In addition, the laser beams are opened / closed by the relevant closures, for example the closures 110 . 111 , alternately in the sample 25 initiated. The penetration depth of the evanescent light generated by excitation with a respective laser beam is changed accordingly. Accordingly, when the observed images are compared based on the difference in the penetration depth of the fluorescence of the same fluorescent substance, it is possible to determine the depth of a generation source of the fluorescence.
[0179] DieLaseroszillatoreinheiten, etwa Laserdioden, zur Verwendung in derersten bis vierten Lasereinleitungssektion L₁,L₂, L₃, L₄ erzeugen die Laserstrahlen mit einer einzigenWellenlänge.Die vorliegende Erfindung ist nicht hierauf beschränkt; eineLaseroszillatoreinheit kann auch einen Laserstrahl mit mehrerenWellenlängenerzeugen.The laser oscillator units, such as laser diodes, for use in the first to fourth laser introduction sections L ₁ , L ₂ , L ₃ , L ₄ generate the laser beams with a single wavelength. The present invention is not limited to this; a laser oscillator unit can also generate a multi-wavelength laser beam.
[0180] Beispielsweisekann auch ein in 13 gezeigterLaserkombinierer 120 verwendet werden. Der Laserkombinierer 120 umfasstLaseroszillatoreinheiten 121 bis 124, welche Laserstrahlenmit unterschiedlicher Wellenlängeerzeugen. Auf den optischen Wegen der von den Laseroszillatoreinheiten 121, 122 abgegebenen Laserstrahlensind dichroitische Spiegel 124, 125 angeordnet.Ein Spiegel 126 ist auf dem optischen Weg des von der Laseroszillatoreinheit 123 abgegebenenLaserstrahls angeordnet. Die dichroitischen Spiegel 124, 125 undeine Konzentrationslinse 127 sind auf einem optischen Reflexionswegdes Spiegels 126 angeordnet.For example, an in 13 shown laser combiner 120 be used. The laser combiner 120 includes laser oscillator units 121 to 124 which generate laser beams with different wavelengths. On the optical paths of the laser oscillator units 121 . 122 emitted laser beams are dichroic mirrors 124 . 125 arranged. A mirror 126 is on the optical path of the laser oscillator unit 123 emitted laser beam arranged. The dichroic mirrors 124 . 125 and a concentration lens 127 are on an optical path of reflection of the mirror 126 arranged.
[0181] Beidieser Ausbildung wird der von der Laseroszillatoreinheit 123 ausgestrahlteLaserstrahl von dem Spiegel 126 reflektiert. Die von denLaseroszillatoreinheiten 121, 122 emittiertenLaserstrahlen werden von dem dichroitischen Spiegel 124 bzw. 125 reflektiert.In this configuration, the laser oscillator unit 123 emitted laser beam from the mirror 126 reflected. The one from the laser oscillator units 121 . 122 emitted laser beams are from the dichroic mirror 124 respectively. 125 reflected.
[0182] Dievon den Laseroszillatoreinheiten 121, 122 emittiertenLaserstrahlen werden danach mit dem von der Laseroszillatoreinheit 123 ausgesandtenLaserstrahl zusammengefasst. Die zusammengefassten Laserstrahlenwerden durch die Objektivlinse 74 auf die optische Faser 33 konzentriert.Als Ergebnis wird ein zusammengefasster Laserstrahl, der jede Wellenlänge aufweist,durch die optische Faser 33 übertragen und zu der Konversionslinseneinheit 50 gesendet.The one from the laser oscillator units 121 . 122 Laser beams are then emitted with that from the laser oscillator unit 123 emitted laser beam summarized. The combined laser beams are through the objective lens 74 on the optical fiber 33 concentrated. As a result, a condensed laser beam, which has any wavelength, is passed through the optical fiber 33 transferred and to the conversion lens unit 50 Posted.
[0183] MitHilfe eines Laserstrahls mit Multiwellenlänge können mehrere fluoreszierendeSubstanzen mit unterschiedlichen Anregungswellenlängenbereichenin einer Lasereinleitungssektion angeregt werden.WithWith the help of a laser beam with multi wavelength, several fluorescentSubstances with different excitation wavelength rangesbe excited in a laser initiation section.
[0184] Beijeder der Lasereinleitungssektionen L₁,L₂, L₃, L₄ kann die Konversionslinseneinheit 50 auchentfernbar zwischen dem Faseremissionsende 34 der optischenFaser 33 und der Konzentrationslinse 36 angebrachtsein, wie in den 3 und 4 gezeigt.In each of the laser introduction sections L ₁ , L ₂ , L ₃ , L ₄ , the conversion lens unit can 50 also removable between the fiber emission end 34 the optical fiber 33 and the concentration lens 36 be appropriate, as in the 3 and 4 shown.
[0185] Dievorliegende Erfindung ist auch bei einem Mikroskop anwendbar, dasmehrere Objektivlinsen mit unterschiedlicher Beobachtungsvergrößerung aufweist,beispielsweise die Objektivlinse 61 zur Beobachtung mithoher Vergrößerung unddie Objektivlinse 62 zur Beobachtung mit geringer Vergrößerung,die in 5 gezeigt sind.Bei Anwendung bei dem Mikroskop wird die Konversionslinseneinheit 50 inden optischen Lasereinleitungsweg jeder der LasereinleitungssektionenL₁, L₂, L₃, L₄ eingeführt, wenndie Objektivlinse 61 zur Beobachtung mit hoher Vergrößerung aufdem optischen Beobachtungsweg Q angeordnet wird. Wird die Objektivlinse 62 zurBeobachtung mit geringer Vergrößerung inden optischen Beobachtungsweg Q einge fügt, wird die Konversionslinseneinheit 50 ausdem optischen Lasereinleitungsweg jeder der LasereinleitungssektionenL₁, L₂, L₃, L₄ entfernt.The present invention is also applicable to a microscope which has a plurality of objective lenses with different observation magnifications, for example the objective lens 61 for observation with high magnification and the objective lens 62 for observation with low magnification, which in 5 are shown. When used with the microscope, the conversion lens unit 50 into the laser optical introduction path of each of the laser introduction sections L ₁ , L ₂ , L ₃ , L ₄ when the objective lens 61 is arranged for observation with high magnification on the optical observation path Q. Becomes the objective lens 62 inserted into the optical observation path Q for observation with low magnification, the conversion lens unit 50 removed from the laser introduction path of each of the laser introduction sections L ₁ , L ₂ , L ₃ , L ₄ .
[0186] Beijeder Lasereinleitungssektion L₁, L₂, L₃, L₄ istdie in den 7A und 7B gezeigte Zoomlinseneinheit 69 anwendbar.In each laser initiation section L ₁ , L ₂ , L ₃ , L ₄ is in the 7A and 7B shown zoom lens unit 69 applicable.
[0187] MitBezug auf die Zeichnungen wird eine sechste Ausführungsform der vorliegendenErfindung beschrieben. Zu beachten ist, dass gleiche Teile wie inden 9 und 10 mit gleichen Bezugszeichenversehen sind; auf ihre detaillierte Beschreibung wird verzichtet.A sixth embodiment of the present invention will be described with reference to the drawings. It should be noted that the same parts as in the 9 and 10 are provided with the same reference numerals; their detailed description is omitted.
[0188] 14 ist eine Darstellungdes Aufbaus eines Totalreflexionsfluoreszenzmikroskops (TIRFM) desaufrechtstehenden Typs. Auf dem optischen Weg zwischen dem zweitendichroitischen Spiegel 94 und dem zweiten Emissionsfilter 95 isteine optische Weglängeneinstelleinheit 130 angeordnet.Die optische Weglängeneinstelleinheit 130 umfassteine feststehende Prismengruppe 131, ein bewegliches Prisma 132 sowieeine Prismenbewegungssektion 133. 14 Fig. 4 is an illustration of the structure of an upright type total reflection fluorescence microscope (TIRFM). On the optical path between the second dichroic mirror 94 and the second emission filter 95 is an optical path length adjustment unit 130 arranged. The optical path length adjustment unit 130 includes a fixed group of prisms 131 , a movable prism 132 as well as a prism movement section 133 ,
[0189] Dasbewegliche Prisma 132 ist in einer Richtung (Richtung einesPfeils D) vertikal zum optischen Weg zwischen dem zweiten dichroitischenSpiegel 94 und dem zweiten Emissionsfilter 95 bewegbar.Dabei ist das bewegliche Prisma 132 in einer Entfernungsrichtungund einer Annäherungsrichtunggegenüberder feststehenden Prismengruppe 131 bewegbar.The movable prism 132 is in a direction (direction of an arrow D) vertical to the optical path between the second dichroic mirror 94 and the second emission filter 95 movable. Here is the movable prism 132 in a distance direction and an approach direction with respect to the fixed prism group 131 movable.
[0190] DiePrismenbewegungssektion 133 treibt das bewegliche Prisma 132 inder Entfernungsrichtung und der Annäherungsrichtung gegenüber derfeststehenden Prismengruppe 132 an. Die Prismenbewegungssektion 133 verwendetbeispielsweise einen Elektromotor, einen Piezoaktuator oder dergleichen,um das beweglich Prisma 132 in translatorischer Weise zubewegen.The prism movement section 133 drives the movable prism 132 in the distance direction and the approach direction to the fixed prism group 132 on. The prism movement section 133 uses, for example, an electric motor, a piezo actuator, or the like, around the movable prism 132 to move in a translational way.
[0191] Dieoptische Weglängeneinstelleinheit 130 treibtdaher das bewegliche Prisma 132 in Entfernungrichtung undAnnäherungsrichtunggegenüberder feststehenden Prismengruppe 131 linear an, um die Bilderzeugungspositionder von der fluoreszierenden Substanz der Probe 25 abgestrahltenFluoreszenz zu verlängern. DieBilderzeugungsposition der ersten Bilderzeugungslinse 121 isteine Referenzposition fürdie Verlängerung derBilderzeugungsposition der Fluoreszenz.The optical path length adjustment unit 130 therefore drives the movable prism 132 in the direction of distance and approach to the fixed prism group 131 linear to the imaging position of the sample from the fluorescent substance 25 to prolong emitted fluorescence. The imaging position of the first imaging lens 121 is a reference position for extending the imaging position of fluorescence.
[0192] DiePrismenbewegungssektion 133 ist über einen Treiber 134 miteiner Steuersektion 135 verbunden. Der Treiber 134 erhält ein vonder Steuersektion 135 ausgegebenes Ansteuersignal zur Ansteuerungder Prismenbewegungssektion 133.The prism movement section 133 is about a driver 134 with a tax section 135 connected. The driver 134 receives one from the tax section 135 Output control signal for controlling the prism movement section 133 ,
[0193] DieSteuersektion 135 umfasst einen Personalcomputer und dergleichen.Die Steuersektion 135 liefert den Ansteuerbefehl an denTreiber 134, um das bewegliche Prisma 132 in Entfernungsrichtungoder Annäherungsrichtunggegenüberder feststehenden Prismengruppe 131 in translatorischerWeise anzutreiben. Die Steuersektion 135 verarbeitet Bildsignale,die von der ersten bis vierten Bildaufnahmevorrichtung 23, 96, 101, 103 ausgegebenwerden, zu Bildern.The tax section 135 includes a personal computer and the like. The tax section 135 delivers the control command to the driver 134 to the movable prism 132 in the direction of distance or near direction compared to the fixed prism group 131 to drive in a translational manner. The tax section 135 processes image signals from the first to fourth image pickup devices 23 . 96 . 101 . 103 are spent on images.
[0194] 15 ist eine vergrößerte Ansichtdes Innenlebens der Probe und des optischen Beobachtungswegs. Eineerste fluoreszierende Substanz F₁ wird durchdie Wellenlänge λ_L1 desvon der Lasereinleitungssektion L₁ eingeleitetenLaserstrahls angeregt und emittiert Fluoreszenz. Die maximale Luminanzwellenlänge der Fluoreszenzliegt im Durchlasswellenlängenband λ_E1 desersten Emissionsfilter 22. 15 Fig. 3 is an enlarged view of the inside of the sample and the optical observation path. A first fluorescent substance F ₁ is excited by the wavelength λ _L1 of the laser beam introduced by the laser introduction section L ₁ and emits fluorescence. The maximum luminance wavelength of the fluorescence lies in the transmission wavelength band λ _{E1 of} the first emission filter 22 ,
[0195] Einezweite fluoreszierende Substanz F₂ wirddurch die Wellenlänge λ_L2 desvon der Lasereinleitungssektion L₂ eingeleitetenLaserstrahls zur Emission von Fluoreszenz angeregt. Die maximaleLuminanzwellenlängeder Fluoreszenz liegt im Durchlasswellenlängenband λ_E2 deszweiten Emissionsfilters 95.A second fluorescent substance F ₂ is excited by the wavelength λ _L2 of the laser beam introduced by the laser introduction section L ₂ to emit fluorescence. The maximum luminance wavelength of the fluorescence lies in the transmission wavelength band λ _{E2 of} the second emission filter 95 ,
[0196] Dieerste und zweite fluoreszierende Substanz F₁,F₂ werden in eine Zelle in der Probe 25 soeingebracht, dass sie sich in bestimmten kleinen Organen besondersausbil den. Die erste fluoreszierende Substanz F₁ bildetsich in einem kleinen Organ in der Nähe der Zellhülle aus.Die zweite fluoreszierende Subtanz F₂ bildet sichin einem kleinen Organ, das etwas entfernt von der Zellhülle angeordnetist, aus.The first and second fluorescent substances F ₁ , F ₂ are in a cell in the sample 25 introduced in such a way that they form especially in certain small organs. The first fluorescent substance F ₁ forms in a small organ near the cell envelope. The second fluorescent substance F ₂ forms in a small organ, which is located somewhat away from the cell envelope.
[0197] DieEindringtiefe d_L1 des evaneszenten Lichtszur Anregung der fluoreszierenden Subtanz F₁ wirdgering eingestellt. Dagegen wird die Eindringtiefe d_L2 desevaneszenten Lichts zur Anregung der fluoreszierenden Substanz F₂ größer alsdie Eindringtiefe d_L1 eingestellt.The depth of penetration d _{L1 of} the evanescent light to excite the fluorescent substance F ₁ is set to be small. On the other hand, the penetration depth d _{L2 of} the evanescent light for exciting the fluorescent substance F _{2 is set} greater than the penetration depth d _L1 .
[0198] DerFokus der Objektivlinse 20 wird auf dasjenige kleine Organeingestellt, bei dem sich die erste fluoreszierende Substanz F₁ ausbildet.The focus of the objective lens 20 is adjusted to the small organ in which the first fluorescent substance F _{1 is} formed.
[0199] DiePosition des kleinen Organs, in dem sich die zweite fluoreszierendeSubstanz F₂ ausbildet, liegt daher in derNähe derSeite der Objektivlinse 20 statt der Fokalposition derObjektivlinse 20.The position of the small organ in which the second fluorescent substance F _{2 is} formed is therefore close to the side of the objective lens 20 instead of the focal position of the objective lens 20 ,
[0200] Alsnächsteswird die Funktionsweise des wie vorstehend beschrieben ausgestaltetenTIRFM erläutert.Asnextthe functioning of the as described above is designedTIRFM explained.
[0201] Wennder Mikrometerfunktionsteil 45 der LasereinleitungssektionL₁ gedreht wird, wird die Tiefe eingestellt,die das evaneszente Licht mit der Wellenlänge λ_L1 inder ersten fluoreszierenden Substanz F₁ erreicht. Wennin ähnlicherWeise der Mikrometerfunktionsteil 45 der LasereinleitungssektionL₂ gedreht wird, wird die Tiefe eingestellt,die das evaneszente Licht mit der Wellenlänge λ_L2 inder zweiten fluoreszierenden Substanz F₂ erreicht.If the micrometer functional part 45 the laser introduction section L _{1 is} rotated, the depth that the evanescent light with the wavelength λ _{L1 reaches} in the first fluorescent substance F _{1 is set} . If in a similar way the micrometer functional part 45 the laser introduction section L _{2 is} rotated, the depth that the evanescent light with the wavelength λ _{L2 reaches} in the second fluorescent substance F _{2 is set} .
[0202] Dieerste fluoreszierende Substanz F₁ liegtam Fokus der Objektivlinse 20. Die von der ersten fluoreszierendenSubtanz F₁ ausgesandt Fluoreszenz wird durchdie Objektivlinse 20 zu einem parallelen Strahl, wird vondem ersten dichroitischen Spiegel 93 reflektiert, bildetdurch die erste Bilderzeugungslinse 21 einen konvergentenStrahl, gelangt durch den zweiten dichroitischen Spiegel 94 unddas erste Emissionsfilter 22 und wird auf der Bildaufnahmefläche derersten Bildaufnahmevorrichtung 23 zu einem Bild geformt.The first fluorescent substance F ₁ lies at the focus of the objective lens 20 , The fluorescence emitted by the first fluorescent substance F ₁ is through the objective lens 20 into a parallel beam, from the first dichroic mirror 93 reflected, formed by the first imaging lens 21 a convergent beam passes through the second dichroic mirror 94 and the first emission filter 22 and is on the image pickup surface of the first image pickup device 23 shaped into a picture.
[0203] Diezweite fluoreszierende Substanz F₂ befindetsich dagegen an einer Stelle, die auf der Seite der Objektivlinse 20 vomFokus der Objektivlinse 20 abweicht. Die von der zweitenfluoreszierenden Subtanz F₂ ausgesandteFluoreszenz geht durch die Objektivlinse 20 hindurch, umeinen etwas divergierenden Strahl zu bilden, wie in 15 anhand einer gestrichelten Linie gezeigt.Die Fluoreszenz wird von dem ersten dichroitischen Spiegel 93 reflektiertund gelangt durch die Bilderzeugungslinse 21, um einenkonvergenten Strahl zu bilden.The second fluorescent substance F ₂ , however, is located at a location on the side of the objective lens 20 from the focus of the objective lens 20 differs. The fluorescence emitted by the second fluorescent substance F ₂ passes through the objective lens 20 through to form a somewhat divergent beam, as in 15 shown by a dashed line. The fluorescence is from the first dichroic mirror 93 reflects and passes through the imaging lens 21 to form a convergent beam.
[0204] DieBilderzeugungsposition nach dem zweiten dichroitischen Spiegel 94,der optischen WeglängeneinstelleinheitC1 und dem zweiten Emissionsfilter 95 entspricht dabeider Position nach der Bildaufnahmefläche der zweiten Bildaufnahmevorrichtung 96 ineinem Zustand, in dem sich das bewegliche Prisma 132 ineiner Normalstellung befindet. Das von der zweiten Bilderaufnahmevorrichtung 96 aufgenommeneFluoreszenzbild der zweiten fluoreszierenden Substanz F₂ bildetsomit ein Bild, das außerhalbdes Fokus liegt.The imaging position after the second dichroic mirror 94 , the optical path length setting unit C1 and the second emission filter 95 corresponds to the position after the image recording surface of the second image recording device 96 in a state in which the movable prism 132 is in a normal position. That from the second imaging device 96 recorded fluorescence image of the second fluorescent substance F ₂ thus forms an image that is out of focus.
[0205] DieSteuersektion 135 gibt einen Ansteuerbefehl an den Treiber 134 aus.Entsprechend bewegt die Prismenbewegungssektion 133 dasbewegliche Prisma 132 in translatorischer Weise in Richtungweg von der feststehenden Prismengruppe 131. Infolge dertranslatorischen Bewegung wird die optische Weglänge bis zur zweiten Bildaufnahmevorrichtung 96 verlängert. DieBilderzeugungsposition der von der zweiten fluoreszierenden SubtanzF₂ ausgesandten Fluoreszenz ist nahe beider Bildaufnahmeflächeder zweiten Bildaufnahmevorrichtung 96.The tax section 135 gives a control command to the driver 134 out. The prism movement section moves accordingly 133 the movable prism 132 in a translational manner in the direction away from the fixed prism group 131 , As a result of the translational movement, the optical path length up to the second image recording device 96 extended. The imaging position fluoresce from that of the second The fluorescence emitted by the substance F ₂ is close to the image recording area of the second image recording device 96 ,
[0206] 16 zeigt einen Zustand,in dem die Bilderzeugungsposition der von der zweiten fluoreszierenden SubtanzF₂ ausgesandten Fluoreszenz mit der Bildaufnahmefläche derzweiten Bildaufnahmevorrichtung 96 übereinstimmt. Die Fluoreszenz,die von der zweiten fluoreszierenden Substanz F₂ ander auf der Seite der Objektivlinse 20 von der Fokalpositionder Objektivlinse 20 abweichenden Stelle ausgesandt wird,wird auf der Bildaufnahmeflächeder zweiten Bildaufnahmevorrichtung 96 zu einem Bild geformt. 16 shows a state in which the image formation position of the fluorescence emitted from the second fluorescent substance F ₂ with the image pickup surface of the second image pickup device 96 matches. The fluorescence emitted by the second fluorescent substance F ₂ on the side of the objective lens 20 from the focal position of the objective lens 20 deviating point is sent out on the image recording surface of the second image recording device 96 shaped into a picture.
[0207] DieSteuersektion 135 berechnet dabei die positionsmäßige Abweichungder zweiten fluoreszierenden Substanz F₂ gegenüber derFokalposition der Objektivlinse 20 auf Grundlage der Bewegungdes beweglichen Prismas 132 aus der Referenzposition. Darüber hinausberechnet die Steuersektion 135 eine Abweichung der Vergrößerung aufder Bildaufnahmeflächeder zweiten Bildaufnahmevorrichtung 96. Ferner führt dieSteuersektion 135 eine Bildverarbeitung durch, um die Vergrößerung desaufgenommenen Bilds zu korrigieren.The tax section 135 calculates the positional deviation of the second fluorescent substance F ₂ from the focal position of the objective lens 20 based on the movement of the movable prism 132 from the reference position. It also calculates the tax section 135 a deviation of the magnification on the image pickup surface of the second image pickup device 96 , The tax section also leads 135 performs image processing to correct the magnification of the captured image.
[0208] Wievorstehend beschrieben, ist gemäß der sechstenAusführungsformdie Objektivlinse 20 feststehend, wobei Flächen inunterschiedlicher Tiefe der Probe 25 einer Totalreflexionsbeleuchtungausgesetzt werden und gleichzeitig mit hohem Kontrast beobachtetwerden können.Beispielsweise werden kleine Organe an unterschiedlich tiefen Stellenin der Probe 25, etwa dasjenige kleine Organ, in dem sichdie erste fluoreszierende Substanz F₁ ausbildet,und das kleine Organ, in dem sich die zweite fluoreszierende SubstanzF₂ ausbildet, einer Totalreflexionsbeleuchtungausgesetzt und könnengleichzeitig mit hohem Kontrast beobachtet werden.As described above, according to the sixth embodiment, the objective lens 20 fixed, with areas at different depths of the sample 25 be exposed to total reflection lighting and at the same time can be observed with high contrast. For example, small organs are located at different depths in the sample 25 , such as the small organ in which the first fluorescent substance F _{1 is} formed and the small organ in which the second fluorescent substance F _{2 is} formed are exposed to total reflection illumination and can be observed at the same time with high contrast.
[0209] Auchdie sechste Ausführungsformkann wie folgt modifiziert werden.Alsothe sixth embodimentcan be modified as follows.
[0210] Eskann auch eine optische Weglängeneinstelleinheit,die in der gleichen Weise wie die optische Weglängeneinstelleinheit 130 ausgebildetist, auf jedem der unterteilten optischen Beobachtungswege angeordnet sein,die zu anderen Bildaufnahmevorrichtungen als der zweiten Bildaufnahmevorrichtung 96 verlaufen,etwa der ersten, dritten und vierten Bildaufnahmevorrichtung 23, 101, 103.In diesem Fall enthältder Treiber 134 mehrere Kanäle zur Ansteuerung mehrereroptischer Weglängeneinstelleinheiten.Die jeweiligen Kanälewerden durch Ansteuerbefehle von der Steuersektion 135 unabhängig gesteuert.It can also be an optical path length setting unit that works in the same way as the optical path length setting unit 130 is configured to be arranged on each of the divided optical observation paths leading to image recording devices other than the second image recording device 96 run, such as the first, third and fourth imaging device 23 . 101 . 103 , In this case, the driver contains 134 Multiple channels for controlling multiple optical path length setting units. The respective channels are activated by control commands from the control section 135 controlled independently.
[0211] Ein ähnlicherEffekt wird beispielsweise erhalten, wenn die zweite Bildaufnahmevorrichtung 96 selbst linearin Richtung parallel zum optischen Weg bewegt wird, anstatt dieoptische Weglängenanstelleinheit 130 vorzusehen.Der ähnlicheEffekt wird erhalten, wenn beispielsweise die erste, dritte undvierte Bildaufnahmevorrichtung 23, 101, 103 inRichtung parallel zum optischen Weg translatorisch bewegt werden.A similar effect is obtained, for example, when the second image pickup device 96 itself is moved linearly in the direction parallel to the optical path instead of the optical path length adjusting unit 130 provided. The similar effect is obtained when, for example, the first, third and fourth image pickup devices 23 . 101 . 103 can be moved translationally in the direction parallel to the optical path.
[0212] Auchdie Verschlüsse 110 bis 113 können injeder der ersten bis vierten Lasereinleitungssektion L₁,L₂, L₃, L₄ in der gleichen Weise wie in 12 vorgesehen sein. Derin die Probe 25 einzuleitende Laserstrahl kann gewählt werden,wenn das Öffnen/Schließen derVerschlüsse 110 bis 113 durchdie Verschlusssteuereinheit gesteuert wird.Even the closures 110 to 113 in each of the first to fourth laser introduction sections L ₁ , L ₂ , L ₃ , L ₄ in the same manner as in 12 be provided. The one in the rehearsal 25 Laser beam to be introduced can be selected when opening / closing the shutters 110 to 113 is controlled by the shutter control unit.
[0213] DieWellenlängender von mehreren Lasereinleitungssektionen, beispielsweise wenigstenszwei Lasereinleitungssektionen aus der ersten bis vierten LasereinleitungssektionL₁, L₂, L₃, L₄, eingeleitetenLaserstrahlen werden gleich festgelegt. Außerdem werden die Laserstrahlenabwechselnd in die Probe 25 eingeleitet, beispielsweisedurch Öffnen/Schließen derVerschlüsse 110, 111.Dementsprechend ändertsich die Eindringtiefe des durch die Anregung mit dem jeweiligenLaserstrahl erzeugten evaneszenten Lichts. Wenn die beobachtetenBilder anhand der Differenz der Eindringtiefe der Fluoreszenz dergleichen fluoreszierenden Substanz verglichen werden, ist es alsFolge möglich,die Tiefe der Erzeugungsquelle der Fluoreszenz zu bestimmen.The wavelengths of the laser beams introduced by a plurality of laser introduction sections, for example at least two laser introduction sections from the first to fourth laser introduction sections L ₁ , L ₂ , L ₃ , L ₄ , are defined in the same way. In addition, the laser beams are alternately in the sample 25 initiated, for example by opening / closing the closures 110 . 111 , The depth of penetration of the evanescent light generated by the excitation with the respective laser beam changes accordingly. As a result, when the observed images are compared by the difference in the penetration depth of the fluorescence of the same fluorescent substance, it is possible to determine the depth of the generation source of the fluorescence.

权利要求:
Claims (26)
[1]
Totalreflexionsfluoreszensmikroskop, dadurchgekennzeichnet, dass es umfasst: mindestens eine Objektivlinse(20), welche Licht von einer Probe (25) erhält; mindestenseine Bildaufnahmevorrichtung (23), welche ein Bild desvon der Objektivlinse (20) erhaltenen Lichts aufnimmt; einenoptischen Beobachtungsweg (Q), überden das von der Objektivlinse (20) erhaltene Licht aufdie Bildaufnahmevorrichtung konzentriert wird; einen Kondensor(27), welcher an einer der Objektivlinse (20) über dieProbe (25) hinweg gegenüberliegenden Positionangeordnet ist und eine numerische Apertur besitzt, die eine Totalreflexionsbeleuchtungmöglich macht,und Durchlassbeleuchtungslicht in die Probe (25) leitet;sowie mindestens eine Lasereinleitungssektion (33),welche den Einfall eines Laserstrahls in einer den optischen Wegdes Durchlassbeleuchtungslichts rechtwinklig schneidenden Richtunggestattet und den einfallenden Laserstrahl auf der Seite des Kondensors(27) in der Näheeines äußerstenTeils des Durchlassbeleuchtungslichtwegs einleitet.Total reflection fluorescence microscope, characterized in that it comprises: at least one objective lens ( 20 ) which light from a sample ( 25 ) receives; at least one image recording device ( 23 ), which is an image of the objective lens ( 20 ) receives received light; an optical observation path (Q), through which the objective lens ( 20 ) obtained light is concentrated on the image pickup device; a condenser ( 27 ), which on one of the objective lens ( 20 ) about the sample ( 25 ) opposite Is arranged and has a numerical aperture, which makes total reflection illumination possible, and passage illumination light into the sample ( 25 ) leads; and at least one laser initiation section ( 33 ) which allows the incidence of a laser beam in a direction perpendicular to the optical path of the transmission illumination light and the incident laser beam on the side of the condenser ( 27 ) near an outermost part of the passage illumination light path.
[2]
Totalreflexionsfluoreszenzmikroskop nach Anspruch1, dadurch gekennzeichnet, dass es ferner umfasst: ein optischesTeilersystem (93, 94, 99), das auf demoptischen Beobachtungsweg (Q) angeordnet ist und das Licht von derProbe (25) auf dem optischen Beobachtungsweg (Q) auf mehrereBildaufnahmevorrichtungen (23) abhängig von optischen Eigenschaftenaufteilt.Total reflection fluorescence microscope according to claim 1, characterized in that it further comprises: an optical splitter system ( 93 . 94 . 99 ), which is arranged on the optical observation path (Q) and the light from the sample ( 25 ) on the optical observation path (Q) on several image recording devices ( 23 ) depending on optical properties.
[3]
Totalreflexionsfluoreszensmikroskop nach Anspruch1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Lasereinleitungssektion(33) umfasst: einen Reflexionsspiegel (47),welcher in der Näheeines äußerstenTeils des Durchlassbeleuchtungslichtwegs auf der Einfallsseite desDurchlassbeleuch tungslichts in den Kondensor (27) beweglichangeordnet ist und den Laserstrahl reflektiert, um den Laserstrahlzur Seite des Kondensors (27) zu leiten; und eineSpiegelbewegungseinheit (40, 43, 46),welche den Reflexionsspiegel (47) in einer Richtung parallelzu einer Einleitungsrichtung des Laserstrahls bewegt.Total reflection fluorescence microscope according to claim 1 or 2, characterized in that the laser introduction section ( 33 ) includes: a reflection mirror ( 47 ), which is in the vicinity of an outermost part of the passage illumination light path on the incidence side of the passage illumination light into the condenser ( 27 ) is movably arranged and reflects the laser beam to the laser beam to the side of the condenser ( 27 ) to lead; and a mirror moving unit ( 40 . 43 . 46 ), which the reflection mirror ( 47 ) moved in a direction parallel to an introduction direction of the laser beam.
[4]
Totalreflexionsfluoreszensmikroskop nach Anspruch1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Lasereinleitungssektion(33) umfasst: eine Laseroszillatoreinheit (32),welche den Laserstrahl ausgibt; eine optische Faser (33),welche den von der Laseroszillatoreinheit (32) ausgegebenenLaserstrahl weiterleitetet; und eine Konzentrationslinse (36),welche den von einem Emissionsende der optischen Faser (33)abgestrahlten divergenten Laserstrahl in konvergentes Licht umwandelt,um das Licht in der Näheeiner vorderen fokalen Position des Kondensors (27) zukonzentrieren.Total reflection fluorescence microscope according to claim 1 or 2, characterized in that the laser introduction section ( 33 ) includes: a laser oscillator unit ( 32 ) which emits the laser beam; an optical fiber ( 33 ) which corresponds to that of the laser oscillator unit ( 32 ) transmits output laser beam; and a concentration lens ( 36 ) which is the one from an emission end of the optical fiber ( 33 ) radiated divergent laser beam converts to convergent light to the light near a front focal position of the condenser ( 27 ) to concentrate.
[5]
Totalreflexionsfluoreszensmikroskop nach Anspruch4, dadurch gekennzeichnet, dass die Lasereinleitungssektion (33)eine Konversionslinseneinheit (50) umfasst, welche dienumerische Appertur des auf eine Konzentrationsposition einfallendenLaserstrahls ohne Änderungder Konzentrationsposition des Laserstrahls mittels der Konzentrationslinse(36) wandelt.Total reflection fluorescence microscope according to claim 4, characterized in that the laser introduction section ( 33 ) a conversion lens unit ( 50 ) which comprises the numerical aperture of the laser beam incident on a concentration position without changing the concentration position of the laser beam by means of the concentration lens ( 36 ) changes.
[6]
Totalreflexionsfluoreszensmikroskop nach Anspruch5, dadurch gekennzeichnet, dass die Konversionslinseneinheit (50)entfernbar zwischen das Emissionsende (34) der optischenFaser und die Konzentrationslinse (36) eingesetzt ist.Total reflection fluorescence microscope according to claim 5, characterized in that the conversion lens unit ( 50 ) removable between the emission end ( 34 ) of the optical fiber and the concentration lens ( 36 ) is used.
[7]
Totalreflexionsfluoreszensmikroskop nach Anspruch5, dadurch gekennzeichnet, dass die Konversionslinseneinheit (50)eine Linsengruppe (53, 54) umfasst, welche dienumerische Apertur des auf die Konzentrationsposition einfallendenLaserstrahls wandelt.Total reflection fluorescence microscope according to claim 5, characterized in that the conversion lens unit ( 50 ) a lens group ( 53 . 54 ) which converts the numerical aperture of the laser beam incident on the concentration position.
[8]
Totalreflexionsfluoreszensmikroskop nach Anspruch5, dadurch gekennzeichnet, dass die Konversionslinseneinheit (50)umfasst: eine konvexe Linse (53), welche die numerischeApertur des vom Emissionsende (34) der optischen Faserabgestrahlten divergenten Laserstrahls wandelt; sowie einekonkave Linse (54), welche den Laserstrahl mit der durchdie konvexe Linse (53) gewandelten numerischen Aperturdivergent macht.Total reflection fluorescence microscope according to claim 5, characterized in that the conversion lens unit ( 50 ) includes: a convex lens ( 53 ), which is the numerical aperture of the emission end ( 34 ) converts the divergent laser beam emitted from the optical fiber; as well as a concave lens ( 54 ), which the laser beam with the through the convex lens ( 53 ) makes the converted numerical aperture divergent.
[9]
Totalreflexionsfluoreszensmikroskop nach Anspruch8, dadurch gekennzeichnet, dass die konkave Linse (54)in Richtung eines optischen Wegs des Laserstrahls zwischen der konvexenLinse (53) und der Konzentrationslinse (36) bewegbarist.Total reflection fluorescence microscope according to claim 8, characterized in that the concave lens ( 54 ) in the direction of an optical path of the laser beam between the convex lens ( 53 ) and the concentration lens ( 36 ) is movable.
[10]
Totalreflexionsfluoreszensmikroskop nach Anspruch6, dadurch gekennzeichnet, dass es ferner umfasst: eine Mehrzahlvon Objektivlinsen (61, 62) mit unterschiedlicherBeobachtungsvergrößerung; einenObjektivlinsenwechsler (60), welcher wahlweise eine dermehreren Objektivlinsen (61, 62) auf dem optischenBeobachtungsweg anordnet; sowie eine Steuersektion (68),welche das Einfügen/Entfernender Konversionslinseneinheit (50) zwischen dem Emissionsende(34) der optischen Faser und der Konzentrationslinse (36)abhängigvon der Beobachtungsvergrößerung derauf dem optischen Beobachtungsweg angeordneten Objektivlinse (61, 62)steuert.Total reflection fluorescence microscope according to claim 6, characterized in that it further comprises: a plurality of objective lenses ( 61 . 62 ) with different observation magnification; an objective lens changer ( 60 ), which optionally one of the several objective lenses ( 61 . 62 ) arranges on the optical observation path; as well as a tax section ( 68 ), which the insertion / removal of the conversion lens unit ( 50 ) between the Emission end ( 34 ) the optical fiber and the concentration lens ( 36 ) depending on the observation magnification of the objective lens arranged on the optical observation path ( 61 . 62 ) controls.
[11]
Totalreflexionsfluoreszensmikroskop nach Anspruch10, dadurch gekennzeichnet, dass die mehreren Objektivlinsen umfassen: Objektivlinsenzur Beobachtung mit hoher Vergrößerung undzur Beobachtung mit niedriger Vergrößerung und dass die Steuersektiondie Konversionslinseneinheit (50) zwischen das Emissionsende(34) der optischen Faser und die Konzentrationslinse (36)in einem Fall einführt,wo die Objektivlinse (61) zur Beobachtung mit hoher Vergrößerung aufdem optischen Beobachtungsweg (Q) angeordnet wird, und die Konversionslinseneinheit (50)zwischen dem Emissionsende der optischen Faser und der Konzentrationslinsein einem Fall entfernt, wo die Objektivlinse (62) zur Beobachtungmit geringer Vergrößerung aufdem optischen Beobachtungsweg (Q) angeordnet wird.Total reflection fluorescence microscope according to claim 10, characterized in that the plurality of objective lenses comprise: objective lenses for observation with high magnification and for observation with low magnification and that the control section the conversion lens unit ( 50 ) between the emission end ( 34 ) of the optical fiber and the concentration lens ( 36 ) in a case where the objective lens ( 61 ) is arranged for observation with high magnification on the optical observation path (Q), and the conversion lens unit ( 50 ) between the emission end of the optical fiber and the concentration lens in a case where the objective lens ( 62 ) is arranged for observation with low magnification on the optical observation path (Q).
[12]
Totalreflexionsfluoreszensmikroskop nach Anspruch11, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Fall, dass die Konversionslinseneinheit(50) zwischen das Emissionsende (34) der optischenFaser und die Konzentrationslinse (36) eingeführt ist,der Einstrahlungsbereich des Laserstrahls auf die Probe (25)mit dem Beobachtungsbereich der Objektivlinse (61) zurBeobachtung mit hoher Vergrößerung übereinstimmtund in dem Fall, dass die Konversionslinseneinheit zwischen demEmissionsende (34) der optischen Faser und der Konzentrationslinse(36) entfernt ist, der Einstrahlungsbereich des Laserstrahlsauf die Probe (25) mit dem Beobachtungsbereich der Objektivlinse(62) zur Beobachtung mit geringer Vergrößerung übereinstimmt.Total reflection fluorescence microscope according to claim 11, characterized in that in the event that the conversion lens unit ( 50 ) between the emission end ( 34 ) of the optical fiber and the concentration lens ( 36 ) is introduced, the irradiation area of the laser beam onto the sample ( 25 ) with the observation area of the objective lens ( 61 ) for observation with high magnification and in the case that the conversion lens unit between the emission end ( 34 ) the optical fiber and the concentration lens ( 36 ) is removed, the irradiation area of the laser beam onto the sample ( 25 ) with the observation area of the objective lens ( 62 ) for observation with a low magnification.
[13]
Totalreflexionsfluoreszensmikroskop nach Anspruch1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Lasereinleitungssektion(33) eine Zoomlinseneinheit (69) umfasst, welchedie Konzentrationsposition des Laserstrahls in die Nähe einervorderen fokalen Position des Kondensors (27) einstellt.Total reflection fluorescence microscope according to claim 1 or 2, characterized in that the laser introduction section ( 33 ) a zoom lens unit ( 69 ) comprising the concentration position of the laser beam in the vicinity of a front focal position of the condenser ( 27 ) sets.
[14]
Totalreflexionsfluoreszensmikroskop nach Anspruch13, dadurch gekennzeichnet, dass die Zoomlinseneinheit (69)umfasst: eine Linsengruppe, welche die Konzentrationspositiondes Laserstrahls in die Näheder vorderen fokalen Position des Kondensors (27) einstellt.Total reflection fluorescence microscope according to claim 13, characterized in that the zoom lens unit ( 69 ) includes: a lens group that shows the concentration position of the laser beam near the front focal position of the condenser ( 27 ) sets.
[15]
Totalreflexionsfluoreszensmikroskop nach Anspruch13, dadurch gekennzeichnet, dass die Zoomlinseneinheit (69)umfasst: eine konvexe Linse (70), welche die numerischeApertur des vom Faseremissionsende der optischen Faser abgestrahltendivergenten Laserstrahls wandelt; sowie eine konkave Linse(71), welche den Laserstrahl mit der durch die konvexeLinse (70) gewandelten numerischen Apertur divergent macht.Total reflection fluorescence microscope according to claim 13, characterized in that the zoom lens unit ( 69 ) includes: a convex lens ( 70 ) which converts the numerical aperture of the divergent laser beam emitted from the fiber emission end of the optical fiber; as well as a concave lens ( 71 ), which the laser beam with the through the convex lens ( 70 ) makes the converted numerical aperture divergent.
[16]
Totalreflexionsfluoreszensmikroskop nach Anspruch15, dadurch gekennzeichnet, dass die konvexe Linse (70)in Richtung eines optischen Wegs des Laserstrahls zwischen dem Faseremissionsende(34) und der Konzentrationslinse (36) beweglichist.Total reflection fluorescence microscope according to claim 15, characterized in that the convex lens ( 70 ) towards an optical path of the laser beam between the fiber emission end ( 34 ) and the concentration lens ( 36 ) is mobile.
[17]
Totalreflexionsfluoreszensmikroskop nach Anspruch15, dadurch gekennzeichnet, dass die konkave Linse (71)in Richtung eines optischen Wegs des Laserstrahls zwischen der konvexenLinse (70) und der Konzentrationslinse (36) beweglichist.Total reflection fluorescence microscope according to claim 15, characterized in that the concave lens ( 71 ) in the direction of an optical path of the laser beam between the convex lens ( 70 ) and the concentration lens ( 36 ) is mobile.
[18]
Totalreflexionsfluoreszensmikroskop nach Anspruch15, dadurch gekennzeichnet, dass es ferner umfasst: eine Steuersektion(75), welche eine Bewegungsposition der konkaven Linse(71) zur Einstellung der Konzentrationsposition des Laserstrahlsin die Näheder vorderen fokalen Position des Kondensors (27) abhängig von derpositionsmäßigen Bewegungder konvexen Linse (70) ermittelt und die Bewegung derkonvexen Linse (70) und der konkaven Linse (71)auf Grundlage der Informationen überdie ermittelte Bewegungsposition der konkaven Linse (71)steuert.A total reflection fluorescence microscope according to claim 15, characterized in that it further comprises: a control section ( 75 ), which is a movement position of the concave lens ( 71 ) to adjust the concentration position of the laser beam close to the front focal position of the condenser ( 27 ) depending on the positional movement of the convex lens ( 70 ) determined and the movement of the convex lens ( 70 ) and the concave lens ( 71 ) based on the information about the determined movement position of the concave lens ( 71 ) controls.
[19]
Totalreflexionsfluoreszensmikroskop nach Anspruch14, dadurch gekennzeichnet, dass es ferner umfasst: eine Mehrzahlvon Objektivlinsen (61, 62) mit unterschiedlicherBeobachtungsvergrößerung; einenObjektivlinsenwechsler (84), welcher wahlweise eine dermehreren Objektivlinsen (61, 62) auf dem optischenBeobachtungsweg anordnet; sowie eine Steuersektion (75),welche einen relativen Positionszusammenhang der in der Zoomlinseneinheit(69) vorgesehenen Linsengruppe in jeder optischen Achsrichtungabhängigvon der Beobachtungsvergrößerung derauf dem optischen Beobachtungsweg angeordneten Objektivlinse (61, 62)ermittelt.Total reflection fluorescence microscope according to claim 14, characterized in that it further comprises: a plurality of objective lenses ( 61 . 62 ) with different observation magnification; an objective lens changer ( 84 ), which optionally one of the several objective lenses ( 61 . 62 ) arranges on the optical observation path; as well as a tax section ( 75 ), which shows a relative positional relationship of the in the zoom lens unit ( 69 ) provided lens group in each optical axis direction depending on the observation magnification the objective lens arranged on the optical observation path ( 61 . 62 ) determined.
[20]
Totalreflexionsfluoreszensmikroskop nach Anspruch19, dadurch gekennzeichnet, dass die Zoomlinseneinheit (69)umfasst: eine konvexe Linse (70), welche die numerischeApertur des vom Faseremissionsende der optischen Faser abgestrahltendivergenten Laserstahls wandelt; und eine konkave Linse (71),welche den Laserstrahl mit der durch die konvexe Linse gewandeltennumerischen Apertur divergent macht, und dass die Steuersektion(75) eine Bewegungsposition der konkaven Linse zur Einstellungder Konzentrationsposition des Laserstrahls in die Nähe der vorderenfokalen Position des Kondensors (27) in Abhängigkeitvon der positionsmäßigen Bewegungder konvexen Linse ermittelt und die Bewegung der konvexen Linse(70) und der konkaven Linse (71) auf Grundlageder Informationen überdie ermittelte Bewegungsposition der konkaven Linse steuert.Total reflection fluorescence microscope according to claim 19, characterized in that the zoom lens unit ( 69 ) includes: a convex lens ( 70 ) which converts the numerical aperture of the divergent laser steel emitted from the fiber emission end of the optical fiber; and a concave lens ( 71 ), which makes the laser beam divergent with the numerical aperture converted by the convex lens, and that the control section ( 75 ) a moving position of the concave lens to adjust the concentration position of the laser beam near the front focal position of the condenser ( 27 ) depending on the positional movement of the convex lens and the movement of the convex lens ( 70 ) and the concave lens ( 71 ) based on the information about the determined movement position of the concave lens.
[21]
Totalreflexionsfluoreszensmikroskop nach Anspruch1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: eine Mehrzahlvon Lasereinleitungssektionen (33, 90, 91, 92),welche radial um den Durchlassbeleuchtungslichtweg in einer denDurchlassbeleuchtungslichtweg rechtwinklig schneidenden Richtungangeordnet sind.Total reflection fluorescence microscope according to claim 1 or 2, characterized in that it comprises: a plurality of laser introduction sections ( 33 . 90 . 91 . 92 ), which are arranged radially around the transmission illumination light path in a direction perpendicular to the transmission illumination light path.
[22]
Totalreflexionsfluoreszensmikroskop nach Anspruch1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es ferner umfasst: wenigstenseine optische Weglängeneinstelleinheit(130), welche auf wenigstens einem geteilten optischen Beobachtungswegunter den mehreren geteil ten optischen Beobachtungswegen angeordnetist, die durch das optische Teilersystem geteilt werden, und dieoptische Weglängeverlängert/verkürzt.Total reflection fluorescence microscope according to claim 1 or 2, characterized in that it further comprises: at least one optical path length setting unit ( 130 ) which is arranged on at least one divided optical observation path among the plurality of divided optical observation paths which are divided by the optical dividing system, and lengthens / shortens the optical path length.
[23]
Totalreflexionsfluoreszensmikroskop nach Anspruch22, dadurch gekennzeichnet, dass die optische Weglängeneinstelleinheit(130) umfasst: eine feste Prismengruppe (131),welche auf dem geteilten optischen Beobachtungsweg festgelegt/angeordnet ist;sowie ein bewegliches Prisma (132), welches in einerEntfernungsrichtung und einer Annäherungsrichtung relativ zu derfeststehenden Prismengruppe beweglich ist.Total reflection fluorescence microscope according to claim 22, characterized in that the optical path length setting unit ( 130 ) includes: a fixed group of prisms ( 131 ) which is fixed / arranged on the shared optical observation path; as well as a movable prism ( 132 ), which is movable in a distance direction and an approach direction relative to the fixed prism group.
[24]
Totalreflexionsfluoreszensmikroskop nach Anspruch22, dadurch gekennzeichnet, dass es ferner umfasst: eine Steuersektion(135), welche die Verlängerung/Verkürzung deroptischen Längedurch die optische Weglängeneinstelleinheit(130) berechnet/verarbeitet.A total reflection fluorescence microscope according to claim 22, characterized in that it further comprises: a control section ( 135 ), which the lengthening / shortening of the optical length by the optical path length setting unit ( 130 ) calculated / processed.
[25]
Totalreflexionsfluoreszensmikroskop nach Anspruch1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es ferner umfasst: eineMehrzahl von Verschlüssen(110, 111, 112, 113), welchein den mehreren Lasereinleitungssektionen angeordnet sind; und eineSteuersektion, welche das Öffnen/Schließen dermehreren Verschlüsse(110, 111, 112, 113) steuert,um die Einleitung oder Blockierung des Laserstrahls zu steuern.Total reflection fluorescence microscope according to claim 1 or 2, characterized in that it further comprises: a plurality of shutters ( 110 . 111 . 112 . 113 ) which are arranged in the plurality of laser introduction sections; and a control section which enables the opening / closing of the plurality of shutters ( 110 . 111 . 112 . 113 ) controls to control the introduction or blocking of the laser beam.
[26]
Totalreflexionsfluoreszensmikroskop nach Anspruch1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die mehreren Lasereinleitungssektionen(33, 90, 91, 92) umfassen: mindestenszwei Lasereinleitungssektionen, welche Laserstrahlen gleicher Wellenlänge abgeben.Total reflection fluorescence microscope according to claim 1 or 2, characterized in that the plurality of laser introduction sections ( 33 . 90 . 91 . 92 ) include: at least two laser introduction sections which emit laser beams of the same wavelength.

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US7385758B2|2008-06-10|

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US20040196457A1|2004-10-07|

引用文献:

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公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题

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法律状态:
2011-05-05| 8110| Request for examination paragraph 44|

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2011-05-05| R012| Request for examination validly filed|Effective date: 20110215 |

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2015-07-30| R016| Response to examination communication|

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2020-10-01| R119| Application deemed withdrawn, or ip right lapsed, due to non-payment of renewal fee|

优先权:

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申请号 | 申请日 | 专利标题

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