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    Es wird ein Verfahren zum Identifizieren von Biopartikeln bereitgestellt mit den Schritten: Lokalisierung einzelner Partikel auf einem Substrat (2) durch Abbilden wenigstens eines Bereichs des Substrats durch Bestrahlung mittels Streiflicht und Messung des von den Partikeln reflektierten Lichts; Bestrahlung eines lokalisierten Partikels mit einem Laser und Erzeugen eines Raman-Spektrums; DOLLAR A Identifizieren des Partikels durch Vergleich des erzeugten Raman-Spektrums mit für eine Mehrzahl von verschiedenen Partikeln abgelegten Raman-Spektren. DOLLAR A Es ist ferner ein Schritt des Differenzierens zwischen biotischen und abiotischen Partikeln über Messung des Fluoreszenzlichts der Partikel bei dem oder nach dem Schritt des Lokalisierens vorgesehen.
    公开号:DE102004008762A1
    申请号:DE200410008762
    申请日:2004-02-23
    公开日:2005-09-08
    发明作者:Hans Prof. Dr. Burkhardt；Stefan Dr. Hofer；Markus Lankers；Klaus-Dieter Peschke；Renate Dr. Petry；Jürgen Prof. Dr. Popp；Olaf Dipl.-Phys. Ronneberger；Petra Dr. Rösch；Günther Schmauz；Andreas SCHÜLE
    申请人:ERWIN KAYSER-THREDE GmbH；Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV；Friedrich Schiller Universtaet Jena；Kayser Threde GmbH；rap ID Particle Systems GmbH；
    IPC主号:G01J3-44
    专利说明:
    [0001] DieErfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Detektionund zum Identifizieren von Biopartikeln.
    [0002] Inverschiedenen Branchen, wie z.B. der pharmazeutischen oder der Lebensmittelindustrie, findenProduktionen und Forschung unter Reinraumbedingungen statt, wobeihohe Reinheitserfordernisse einzuhalten sind. Es besteht daher Bedarfan Information überdie aktuell vorhandene Partikelbelastung im gesamten Produktionsbereich,um das Kontaminationspotential durch Mikroorganismen zu kontrollierenbzw. die Einhaltung der Reinheitsanforderungen quantitativ zu verifizieren.
    [0003] Bislangerfolgt die Überwachungder Biopartikelkontamination von Produktionsbereichen meist anhandvon konventionellen molekularbiologischen Methoden. Bei den konventionellenMethoden wird die Probe auf verschiedene Nährmedien aufgebracht, da verschiedeneMikroorganismen unterschiedlichen Nährmedien benötigen, diesebebrütet, dieMikroorganismen gezähltund anhand ihrer Morphologie sowie dem Wachstum unter variablenUmgebungsbedingungen identifiziert. Frühestens nach einem Zeitraumvon ca. 2 bis 5 Tagen lassen sich aus den Labor-Ergebnissen Rückschlüsse aufdie Art und Häufigkeitvorhandener Kontaminationen von einem weiter zurückliegenden Zeitpunkt ziehen.Im allgemeinen ist auch keine Einzelmethode, sondern nur die Kombinationmehrerer Methoden in der Lage, die Mikroorganismen eindeutig zuidentifizieren.
    [0004] Beieinem weiteren Verfahren werden einzelne Zellen mit Vitalfarbstoffengekennzeichnet und die angefärbtenZellen mit Hilfe eines Laserscanners detektiert. Problematisch erweistsich hier, dass die Vitalitätder Zellen nach der Anfärbungnicht mehr gegeben ist und der Anfärbeprozess manuell durchgeführt werdenmuss. Ein automatisiertes Umgebungsmonitoring ist so nicht möglich.
    [0005] Beieinem weiteren bekannten Verfahren wird eine Fluoreszenzanregungvon Partikeln, die angesaugt und durch einen speziellen Triggermechanismusim Flug angeregt werden. Das Verfahren beinhaltet keinerlei Probenvorbereitungund liefert unmittelbar Ergebnisse. Problematisch erweist sich hier derVerlust der untersuchten Partikel. Erkannte biotische Partikel können keinerweiterführendenIdentifizierung zugeführtwerden.
    [0006] Die DE 197 17 749 offenbartein Verfahren zur Größenbestimmungund Online-Differenzierung von luftgetragenen biotischen und abiotischenKontaminationen mit Hilfe von optischen Partikelzählern in Kombinationmit einer Veränderungseinheit.Eine genotypische Unterscheidung der Mikroorganismen kann mit diesemVerfahren nicht erzielt werden.
    [0007] DieWO 98/48243 offenbart ein Verfahren zur Detektion von Partikelnauf technischen Oberflächen über Streiflicht,wobei eine Unterscheidung bzw. Identifizierung der Biopartikel nichtgegeben ist.
    [0008] Die US 5,701,012 , WO 96/18205und WO 97/28439 offenbaren Fluoreszenzverfahren bei denen nach UV-Licht-Anregungvon Stoffwechselprodukten in biologischen Zellen das emittierteFluoreszenzlicht detektiert wird. Ein Echtzeit-Verfahren zur Bestimmungder Partikelgrößen kombiniertmit der Detektion von biologisch aktiven, vitalen Kontaminantenwird in der US 5,701,012 beschrieben.Die Partikelgröße wirdhierbei durch die unterschiedlichen Flugzeiten der Partikel aufgrundihrer Masse ermittelt (Aerodynamic Particle Sizing – APS).Anschließendwerden die Zellinhaltsstoffe wie NADH und Riboflavin per UV-Lichtangeregt und das Fluoreszenzlicht detektiert. Eine genotypischeBestimmung der biologischen Materialien ist mit diesem Verfahrennicht möglich.
    [0009] Esist ferner bekannt, mit schwingungs-spektroskopischen Methoden diechemische Zusammensetzung einer Biokontamination zu identifizieren.Das untersuchte Probenvolumen liegt im Bereich von 1 μm3, d. h. für die Identifizierung müssen Mikrokoloniengezüchtetwerden. Die Untersuchung von einzelnen Mikroorganismen mit konfokalerRaman-Spektroskopie auf Calciumfluoridsubstraten wurde berichtet.SERS bzw. SERRS wurde zur Spektroskopie von Einzelzellen sowie zurIdentifizierung von DNA-Fragmenten eingesetzt.
    [0010] Inder WO 03/060444 wird ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Identifizierungvon pathogenen Mikroorganismen auf einer Oberfläche beschrieben, das unteranderem Raman-Spektroskopie zur Identifizierung der Mikroorganismeneinsetzt. Mit diesem Verfahren wird ein integriertes Spektrum über einen Oberflächenbereicherzeugt und daraus die vorkommenden pathogenen Mikroorganismen bestimmt.Es ist jedoch mit diesem Verfahren nicht möglich, die Anzahl der Mikroorganismenzu bestimmen und gezielt einen einzelnen Mikroorganismus aus dervorhandenen Mehrzahl zu identifizieren.
    [0011] Ausder WO 02/097409 ist ein Verfahren zur automatisierten Erkennnung,spektroskopischen Analyse und Identifizierung von Partikeln bekannt.
    [0012] Esist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren und eine Vorrichtung bereitzustellenmit dem bzw. mit der zeitnahe Identifizierung von Biokontaminationen aufeinfache schnelle und zuverlässigeWeise möglichist.
    [0013] DieAufgabe wird gelöstdurch ein Verfahren nach Patentanspruch 1 bzw. durch eine Vorrichtung nachPatentanspruch 12. Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.
    [0014] DieErfindung weist den Vorteil auf, daß einzelne aus einer Mehrzahlzu untersuchender Biopartikel, wie z.B. einzelne Bakterien, in einemZeitraum von wenigen Minuten detektierbar und identifizierbar sind.Eine Unterscheidung zwischen biotischen und abiotischen Partikelnist möglich.Bei der Analyse könnenselektiv die interessierenden Partikel betrachtet werden, wodurchsich die Gesamtanalysezeit deutlich reduzieren läßt.
    [0015] DerEinsatz von höchstsensitiverRaman-Spektroskopie (Raman, Resonanz-Raman, UV-Resonanz-Raman) erlaubtden spezifischen Nachweis geringster Stoffmengen. Es ist keine Probenvorbereitungund kein Züchtenerforderlich. Ferner werden die Biopartikel bei der Detektion undder Identifizierung nicht zerstört.Die Identifizierung der einzelnen Mikroorganismen erfolgt an Handcharakteristischer Markermolekülewie z.B. DNA bzw. Proteinen. Durch die gezielte Analyse einzelnerPartikel ist es möglich,die Spektroskopieparameter optimal an die Streucharakteristikenindividueller Organismen anzupassen, wodurch die Analysezeit optimiertwird. Das Verfahren ist daher nahezu unabhängig von Wachstumsphasen bzw.Umwelteinflüssen.Der Zeitgewinn gegenüberkonventionellen Methoden ist somit außerordentlich hoch. Im Vergleichzu konventionellen mikrobiologischen Methoden erfolgt die Identifizierungetwa 1000 mal schneller. So werden konventionell z.B. etwa 3000Minuten benötigt,während etwa3 Minuten mit dem erfindungsgemäßen Verfahrenbenötigtwerden.
    [0016] Fallseine weiterführendeUntersuchung erforderlich ist, könneneinzelne Partikel abgenommen werden und entsprechend weiterverarbeitetwerden, z.B. mit SERS oder SERRS oder durch klassische mikrobiologischeVerfahren.
    [0017] DieErfindung eignet sich fürden automatisierten Betrieb in Produktionsbereichen wie z.B. der pharmazeutischenProduktion, der Lebensmittelherstellung, der Wasserversorgung und-aufbereitung. Durch die zeitnahe Analyse lassen sich die Kosten undRisiken, die durch Produktionsausfälle oder Produktverderb entstehen,minimieren.
    [0018] WeitereMerkmale und Zweckmäßigkeiten derErfindung ergeben sich aus der Beschreibung von Ausführungsbeispielenanhand der Figuren. Von den Figuren zeigen:
    [0019] 1 eineschematische Darstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtung;
    [0020] 2 eineschematische Darstellung der Beleuchtungseinrichtung der Vorrichtungnach 1;
    [0021] 3a)bis 3c) Abbildungen des Substrats mit Partikeln;
    [0022] 4 Raman-Spektreneinzelner Bakterien, die mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung aufgenommenwurden;
    [0023] 5 diedurchschnittliche Erkennungsrate von Bulk-Spektren eines dicken Bakterienausstrichs aufder Trägeroberfläche zumVergleich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren;
    [0024] 6 diedurchschnittliche Erkennungsrate von Spektren einzelner Bakteriengemäß dem Identifizierungsschrittdes erfindungsgemäßen Verfahrens.
    [0025] 7a)SERS-Spektren von zerstörtenE. coli in ansteigender (b-e) Konzentration der Zellsuspensionenim Silberkolloid;
    [0026] 7b SERS-Spektrenvon fünfverschiedenen Spezies; und
    [0027] 8 UV-Raman-Spektreneiner Auswahl an Mikroorganismen, die mit der erindungsgemäßen Vorrichtunggemessen wurden.
    [0028] Wieaus 1 ersichtlich ist, weist die Vorrichtung 100 ineiner Ausführungsformeinen Träger 1 miteinem darauf aufgebrachten Substrat 2 auf. Das Substrat 2 istvorzugsweise als eine Filtermembran z.B. aus polymerem Materialoder aus Metall ausgebildet, auf die die zu untersuchenden Partikelaufgebracht worden sind, z.B. durch Abscheidung aus der Luft. DiePartikel umfassen in der Regel biotische und abiotische Partikel.Ferner umfaßtdie Vorrichtung 100 eine Detektionseinheit 3 zumBestimmen der Position und der Formfaktoren von einzelnen Biopartikelnauf dem Substrat 2 und zur Differenzierung zwischen biotischenund abiotischen Partikeln. Es ist außerdem eine Identifizierungseinrichtung 4 vorgesehenzum Identifizieren des Partikels, bei biotischen Partikeln der Speziesbzw. des Stamms. Die Detektionseinheit 3 beinhaltet eineoptische Einheit 5 mit Vergrößerungsfunktion, eine Beleuchtungseinheit 6 undeine Bildaufnahmeeinrichtung 7.
    [0029] Wieaus 2 ersichtlich ist, ist die Beleuchtungseinheit 6,bestehend aus einer Lichtquelle 6a, Linsen 6b, Anregungsfiltern 6c undLichtleitern 6d derart ausgebildet, daß die Lichtleiter 6d ringförmig oberhalbdes Substrats 2 angeordnet sind und ein streifender Lichteinfalldes Beleuchtungslichts 8 unter einem vorgegebenen Einstrahlwinkel α auf die Oberfläche erfolgt.Der Einstrahlwinkel α istder Winkel zwischen der Haupteinstrahlrichtung und dem Träger 1.Er liegt bevorzugt zwischen etwa 20° bis etwa 30°. Als Lichtquelle 6a wirdz.B. eine UV-Lichtquelle mit hoher Lichtausbeute im UVA- Bereicheingesetzt.
    [0030] ZurErzeugung von wellenlängenspezifischemUV-Licht sind vor die UV-Lichtquelle 6a wahlweise schaltbareAnregungsfilter 6c vorgesehen.
    [0031] Dasvon den Partikeln auf dem Substrat 2 gestreute oder durchFluoreszenzanregung überdas Beleuchtungslicht 8 emittierte Licht 9 wird über die optischeEinheit 5 der Bildaufnahmeeinrichtung 7 zugeleitet.Die optische Einheit 5 beinhaltet eine Zwischenlinse 5a undein mehrfachvergrößerndesObjektiv 5b. Zur Selektion von Fluoreszenzlicht, das von denPartikeln ausgesandt wird, sind wahlweise in den Strahlengang schaltbareFluoreszenzfilter 5c vorgesehen.
    [0032] DieBildaufnahmeeinrichtung 7 ist vorzugsweise als hochauflösende CCD-Kamera,mit einer Auflösungvon z.B. 2k × 2kPixeln, ausgebildet und erzeugt ein vergrößertes Bild des Substrats.
    [0033] ZurAusgabe und Weiterverarbeitung des Bildes ist eine Datenverarbeitungseinrichtung 10 mit Bildschirmvorgesehen. Auf der Datenverarbeitungseinrichtung 10 istein Auswerteprogramm zur Bestimmung der Koordinaten, sowie zur Bestimmungder Abmessungen der detektierten Partikel auf dem Substrat 2 installiert.
    [0034] Dieoptische Einheit 5 die Detektionseinheit 3 undder Träger 1 sindrelativ zueinander übereine Positioniereinheit 11 positionierbar, z.B. in x-,y- und z-Richtung verfahrbar. Bevorzugt wird der Träger 1 in x-y-Richtungverfahren und die optische Einheit 5 in z-Richtung bewegt.
    [0035] DieIdentifizierungseinrichtung 4 umfaßt einen Laser 12,ein Spektrometer 13, einen Autofokusdetektor 14,eine elektronische Steuer- und Versorgungseinheit 15 für den Laserund den Autofokusdetektor, Spiegel 16, 17, 18 undeine mit dem Spektrometer gekoppelte Notch-Filtereinheit 19 sowieFaserkopplungen 20 zwischen der Notch-Filtereinheit 19 unddem Spektrometer 13. Der Laser 12 ist bevorzugtein im UV-Bereichemittierender Laser, aber auch frequenzverdoppelte NdYAG mit einerWellenlängevon 532 nm sind verwendbar. Andere Lasertypen sind je nach Anwendungein setzbar. Der Laserstrahl wird über die Spiegel 16, 17, 18 indie optische Einheit 5 eingekoppelt und über dieseauf das Substrat 2 fokussiert. Mithilfe der Positioniereinheit 11 ist dieoptische Einheit 5 so relativ zu dem Substrat 2 positionierbar,daß derLaserstrahl auf jede vorgegebene Stelle auf dem Substrat 2 fokussierbarist.
    [0036] Dermit der Steuereinheit 15 und der Positioniereinheit 11 verbundeneAutofokusdetektor 14 erhält über die dichroitischen Spiegel 17, 18 einenTeil des vom Partikel auf dem Substrat reflektierten Laserlichts.Die von dem Autofokusdetektor 14 gemessene Intensität hängt vomGrad der Fokussierung des Lasers auf das Partikel ab. Durch systematische vertikaleVerschiebung der Detektionseinheit 3 und durch Messungder jeweils erzielten Signalstärkeläßt sichdie optimale Fokusposition einstellen.
    [0037] Dasvon den Partikeln auf dem Substrat 2 aufgrund der Einstrahlungmit dem Laserstrahl erzeugte Raman-Streulicht wird über dendichroitischen Spiegel 19 aus dem zur Bildaufnahmeeinrichtung 7 führendenStrahlengang ausgekoppelt und überdie Notch-Filtereinheit 19 dem Spektrometer 13 zugeführt, mitdem ein Raman-Spektrum gemessen und an die Datenverarbeitungseinrichtung 10 weitergegebenwird.
    [0038] Inder Datenverarbeitungseinrichtung 10 ist ferner ein Programmvorgesehen, das jedem detektierten Partikel ein gemessenes Raman-Spektrum zuordnetund diese Information abspeichert und/oder weiterverarbeitet. Esist ferner in dieser Datenverarbeitungseinrichtung oder einer davongetrennten Datenverarbeitungseinrichtung eine Datenbank abgelegt,die bekannte Raman-Spektren füreine Vielzahl von Partikeln und Substanzen enthält.
    [0039] Daserfindungsgemäße Verfahrenund der Betrieb der Vorrichtung ist wie folgt.
    [0040] Ineinem ersten Schritt werden die auf dem Substrat 2 befindlichenPartikel überdie Detektion des elastisch gestreuten Lichts lokalisiert. 3c) zeigtdabei ein von der Bildaufnahmeeinrichtung 7 in Form derCCD-Kamera aufgenommenes Bild der Partikel auf dem Substrat, indiesem Fall einer Edelstahloberfläche, das mit der erfindungsgemäßen Streiflichtbeleuchtungerzeugt wurde. Im Vergleich dazu zeigen 3a) und 3b)Bilder, die mit den herkömmlichenVerfahren, wie Auflicht und Dunkelfeldbeleuchtung erzeugt wurden.Mittels der Streiflichtbeleuchtung lassen sich die Partikel alshelle Punkte deutlich von der Oberfläche unterscheiden. Die Oberfläche reflektiertaufgrund der flachen Beleuchtung kaum. So entsteht ein maximalerKontrast zwischen Oberflächeund Partikel, was die Lokalisierung aller Partikel erlaubt.
    [0041] Über dieDatenverarbeitungseinrichtung 10 werden die Koordinatenund falls erforderlich die Abmessungen der detektierten Partikelbestimmt. Eine Bestimmung der Anzahl der Partikel ist ebenso möglich.
    [0042] Ineinem zweiten Schritt wird eine Differenzierung der Partikel inbiotische und abiotische Partikel über Detektierung des Fluoreszenzlichtsvorgenommen. Fürdie Erfassung der biotischen Partikel wird z.B. die Fluoreszenzuniverseller Zellinhaltsstoffe verwendet. Dazu werden vor die UV-Lichtquelle geschalteteAnregungsfilter 6c in Form von Bandpassfiltern verwendet,mit denen die entsprechenden Anregungswellenlängen herausgefiltert werden.Das Fluoreszenzlicht wird dann durch Vorschaltung eines geeignetenFluoreszenzfilters Sc in der optischen Einheit 5 herausgefiltert.
    [0043] DieDifferenzierung in abiotische und biotische Partikel wird in einemAusführungsbeispielanhand der Fluoreszenzmessung von in den Zellen biotischer Partikeluniversell vorkommender Inhaltstoffe NAD(P)H und Riboflavin vorgenommen.Das Coenzym NAD(P)H hat sein Absorptionsmaximum bei ca. 334 nm,die Fluoreszenzwellenlängeliegt bei ca. 470 nm, was im elektromagnetischen Spektrum im sichtbarenblauen Bereich liegt. Riboflavin welches auch ein Coenzym der Zelleist, wird bei ihrem Absorptionsmaximum bei ca. 365 nm zu einer Fluoreszenzbei ca. 515 nm angeregt. Die Detektionseinheit 3 ermöglicht somitdie Erfassung und Differenzierung beider spezifischen Fluoreszenzender Coenzyme und die anschließendeDifferenzierung zwischen biotischen und abiotischen Partikeln.
    [0044] Indiesem Schritt wird der Laserstrahl auf ein einzelnes gewünschtesPartikel fokussiert. Die Positionierung des Strahlfokus erfolgtdabei überdie Positionierungseinrichtung 11 anhand der zuvor bestimmtenKoordinaten und gegebenenfalls den Abmessungen des Partikels. Über denAutofokusdetektor 14 wird eine genaue Fokussierung vorgenommen.
    [0045] DasRaman-Streulicht wird überdie optische Einheit 5 und die Spiegel 17, 18 unddas Filter 19 dem Spektrometer zugeführt und ein Raman-Spektrumfür daseinzelne Partikel aufgezeichnet, was dann in der Datenverarbeitungseinrichtung 10 abgelegtund/oder weiterverarbeitet wird.
    [0046] Anschließend wirdfür jedesgewünschte Partikelauf dem Substrat ein Raman-Spektrum wie zuvor beschrieben aufgenommen.
    [0047] Ineinem konkreten Beispiel wurden einzelne Mikroorganismen mit einerAnregungswellenlänge von532 nm gemessen. Wenn ein Spektrum eines Markerpigments detektiertwurde, z.B. Carotinoid, überdecktdas entsprechende Resonanzspektrum das partikelspezifische Raman-Spektrum.Das Pigment kann aber durch die eingestrahlte Energie bei dieserMessung zerstörtwerden. Durch erneutes Messen der Zelle mit zerstörtem Pigmentkann dann das partikelspezifische Spektrum aufgenommen werden. BeigroßenZellen wurden mehrere Messungen entlang der Hauptachse vorgenommen,da es sich hierbei hauptsächlichum eukaryotische Mikroorganismen (Hefen, Pilze) mit Kompartimentierungender Zelle handelt.
    [0048] 4 zeigtdie gemessenen Raman-Spektren einzelner Bakterien verschiedenerStämme.Die Integrationszeit, d.h. die Belichtungszeit mit der Laser betrug60s.
    [0049] Daserhaltene Spektrum wird mittels chemometrischer Verfahren mit bekanntenin einer Datenbank abgelegten Spektren verglichen und somit eine Identifizierungdes Partikels vorgenommen. Die Identifizierung von biotischen Partikelnerfolgt dabei anhand charakteristischer Markermoleküle, wiez.B. DNA bzw. Proteinen.
    [0050] 5 zeigtdie durchschnittliche Erkennungsrate von Bulk-Spektren von Bakterien, die durch Messungeines Bakterienausstrichs auf der Trägeroberfläche erzeugt sind.
    [0051] Abwandlungender grundlegenden Schritte der Erfindung und der zugehörigen Vorrichtungsind möglich.
    [0052] Ineiner Abwandlung erfolgt die Lokalisierung der Partikel auf demSubstrat unter Verwendung von sichtbarem Licht anstelle von UV-Licht.In einer weiteren Abwandlung wird die zur Lokalisierung und Differenzierungeingestrahlte Lichtleistung, insbesondere bei der Verwendung vonUV-Licht, so gewählt,daß dieVitalitätder biotischen Partikel erhalten bleibt.
    [0053] Ineiner weiteren Anwandlung ist der Träger 1 gekühlt, umeine Zerstörungder Partikel aufgrund von Erwärmungdurch die eingestrahlte Leistung zu verhindern.
    [0054] BeigroßenSubstraten erfolgt die Lokalisierung bereichsweise. Anschließend werdendie Bilder der Bereiche zu einem Gesamtbild zusammengesetzt. Somitlassen sich großeFlächenuntersuchen.
    [0055] Ineiner weiteren Abwandlung wird der Differenzierungsschritt weggelassen.Der Aufwand bei der Auswertung ist dann größer, weil Raman-Spektren vonabiotischen Partikeln mitaufgenommen werden und die Differenzierungzu biotischen Partikeln überdie Differenzierung der Raman-Spektren erfolgen muß.
    [0056] Ineiner weiteren Abwandlung wird eine oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie (Surface EnhancedRaman Spectroscopy SERS) oder eine oberflächenverstärkte Resonanz-Raman-Spektroskopie (SurfaceEnhanced Resonance Raman Spectroscopy.SERRS durchgeführt. Dabeiwird ein einzelner Mikroorganismus vom Substrat entfernt, z.B. mithilfeeines Mikromanipulators und einer Mikropumpe, und dieser anschließend zerstört, z.B.durch Schockgefrieren oder Ultraschall. Anschließend wird ein Edelmetallkolloid,vorzugsweise Gold oder Silber, zugegeben und der zerstörte Mikroorganismusim Kolloid mit einer geeigneten Anregungswellenlänge, z.B. 532, 633, 785 oder830 nm bestrahlt und das Raman-Spektrum aufgenommen.
    [0057] 7a)zeigt SERS-Spektren von zerstörten E.coli in ansteigender (b-e) Konzentration der Zellsuspensionen imSilberkolloid bei einer Integrationszeit von 120 s. a zeigt dasreine Kolloid. 7b) zeigt SERS-Spektren vonfünf verschiedenenSpezies.
    [0058] DieAufnahme eines SERS-Spektrums bzw. eines SERRS-Spektrums erfolgtzusätzlichinsbesondere dann, wenn die Aufnahme eines Raman-Spektrums auf demSubstrat in der Vorrichtung kein eindeutiges Spektrum liefert undeine weitere Identifizierung erforderlich ist.
    [0059] Esist auch möglicheinzelne Partikel nach der Lokalisierung und Identifizierung inder erfindungsgemäßen Vorrichtungzu entnehmen und für eineweiteregehende Untersuchung anzuzüchten.
    [0060] Ineiner weiteren Abwandlung wird eine UV-Raman-Spektroskopie durchgeführt. DieAnregungswellenlängensind in diesem Fall 264, 257, 244, 238 und 229 nm. Der Träger 1 istbevorzugt tiefgekühltauf eine Temperatur kleiner als -100°C. Der Abstand des Mikroskopobjektivsder optischen Einheit 5 vom Substrat 2 ist größer alsbei der normalen Raman-Spektroskopie.Das Abkühlenbei der UV-Raman-Spektroskopie hat den Vorteil, daß thermische Schäden am biotischenPartikel verhindert oder reduziert werden. Das Partikel kann nachder Messung für eineZüchtungverwendet werden.
    [0061] 8 zeigtdie UV-Raman-Spektren einer Auswahl an gemessenen Mikroorganismen.Die Anregungswellenlängebeträgtbeispielhaft, 244 nm, die Laserleistung auf dem Substrat ca. 5-8mW.
    [0062] Ineiner weiteren Abwandlung wird ein Bruchteil des Raman-Signals auf einehochsensitive Photodiode ausgekoppelt und das entsprechende Meßsignalals Referenz fürdie Einstellung der optimalen Meßzeit verwendet.
    权利要求:
    Claims (14)
    [1] Verfahren zum Identifizieren von Biopartikeln mitden Schritten: Lokalisierung einzelner Partikel auf einem Substrat (2)durch Abbilden wenigstens eines Bereichs des Substrats durch Bestrahlungmittels Licht und Messung des von den Partikeln reflektierten Lichts; Bestrahlungeines lokalisierten Partikels mit einem Laser und Erzeugen einesRaman-Spektrums; Identifizieren des Partikels durch Vergleichdes erzeugten Raman-Spektrums mit für eine Mehrzahl von verschiedenenPartikeln abgelegten Raman-Spektren.
    [2] Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einenSchritt des Differenzierens zwischen biotischen und abiotischenPartikeln überMessung des Fluoreszenzlichts der Partikel bei dem oder nach demSchritt des Lokalisierens.
    [3] Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,daß zumLokalisieren und/oder Differenzieren UV-Licht verwendet wird.
    [4] Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet,daß dieBestrahlung beim Schritt des Lokalisierens mit Streiflicht erfolgt.
    [5] Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet,daß dieDifferenzierung durch Messung der Fluoreszenzanregung von universellin biotischen Partikeln vorkommenden Stoffen, bevorzugt von NAD(P)Hund/oder Riboflavin, erfolgt.
    [6] Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, gekennzeichnetdurch einen Schritt des Bestimmens Formparameter des einzelnen lokalisiertenPartikels.
    [7] Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, gekennzeichnetdurch einen Schritt des Bestimmens der Gesamtzahl der lokalisiertenPartikel.
    [8] Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet,daß derSchritt des Bestrahlens einen Schritt des Fokussierens des Laserstrahlsauf die Position des einzelnen ausgewählten Partikels umfaßt.
    [9] Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet,daß einRaman-Spektrum, ein UV-Raman-Spektrum oder ein SERS- oder ein SERRS-Raman-Spektrumaufgenommen wird.
    [10] Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet,daß dieBestrahlungsdauer mit dem Laser auf der Grundlage eines Signalsgewähltwird, das durch Auskoppeln eines Bruchteils des Raman-Signals undMessen der Stärkedes ausgekoppelten Signals bestimmt wird.
    [11] Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet,daß dieStrahlungsleistung bei dem Schritt des Lokalisierens und/oder bei demSchritt des Bestrahlens mit dem Laser so gewählt wird, daß die Vitalität der Zellenerhalten bleibt.
    [12] Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einemder Ansprüche1 bis 11 mit einem Substrat (2); einer Detektionseinheit(3) zum Lokalisieren von einzelnen Partikeln auf dem Substrat;und einer Identifizierungseinrichtung (4) zum Identifiziereneines einzelnen Partikels überRaman-Spektroskopie.
    [13] Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet,daß dieDetektionseinheit (3) eine UV-Beleuchtungseinrichtung (6)umfaßtmit der das Substrat (2) unter Streiflichteinfall beleuchtetwird.
    [14] Vorrichtung nach Anspruch 13 dadurch gekennzeichnet,daß dieBeleuchtungseinrichtung (6) eine ringförmig über dem Substrat vorgesehene Strahlungsquelle(6d) umfaßt.
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    DE102004008762B4|2006-10-12|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    2005-09-08| OP8| Request for examination as to paragraph 44 patent law|
    2007-04-12| 8364| No opposition during term of opposition|
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