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    • 专利摘要:
    Ein Methylophilus-Bakterium, worin ein Gen mit einer Nukleotidsequenz, die mit einer DNA identisch ist, die für ein Protein der folgenden Definition (A) oder (B) codiert, oder ein Gen mit einer solchen Homologie zu der DNA, daß eine homologe Rekombination mit der DNA auftritt, zerstört ist, wodurch die Expression des Gens unterdrückt ist und die intrazelluläre Lysindecarboxylaseaktivität verringert oder ausgeschaltet ist, wird in einem Medium, enthaltend Methanol als Hauptkohlenstoffquelle, zur Herstellung und Anhäufung von L-Lysin in der Kultur gezüchtet, und das L-Lysin wird aus der Kultur gewonnen: DOLLAR A (A) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 4; DOLLAR A (B) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 4, DOLLAR A einschließlich Substitution, Deletion, Insertion oder Addition eines oder mehrerer Aminosäurereste, und mit Lysindecarboxylaseaktivität.
    公开号:DE102004006526A1
    申请号:DE102004006526
    申请日:2004-02-10
    公开日:2004-09-02
    发明作者:Seiko Kawasaki Hirano；Hisashi Kawasaki Yasueda
    申请人:Ajinomoto Co Inc；
    IPC主号:C12N15-09
    专利说明:
    [0001] Die vorliegende Erfindung betrifftein neues Lysindecarboxylase-Gen aus Methylophilus-Bakterium, dasam Abbau von L-Lysin beteiligt ist. Die vorliegende Erfindung betrifftauch kein Methylophilus-Bakterium, worin die Expression des vorstehendgenannten Gens unterdrücktist, und ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin unter Einsatzdieses Bakteriums.
    [0002] Lysindecarboxylase ist ein Enzym,das die Reaktion zur Bildung von Cadaverin durch Decarboxylierungvon L-Lysin katalysiert. Beispielsweise gibt es in Escherichia coli(E. coli) zwei Enzyme, die als CadA und Ldc bezeichnet werden (WO96/17930).Außerdemwurde aufgrund von Gensequenzinformationen aus Genomen oder experimentellenErgebnissen vorgeschlagen, daß Lysindecarboxylasein verschiedenen Bakterien, einschließlich Bacillus halodulans,Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Salmonella typhimurium, Selenomonasruminantium, Nicotiana glutinosa und dergleichen, vorhanden ist(KEGG Database (Release 25.0), Januar 2003), Y. Takatsuka, et al.,Journal of Bacteriology, Vol. 182, S. 6732–6741 (2000), Y.-S. Lee undY.-D. Cho, The Biochemical Journal, Vol. 360, S. 657–665 (2001)).Die Existenz des Enzyms ist in Methanol-verwertenden Bakterien jedochbislang ungewiß.
    [0003] Inzwischen ist ein Verfahren zurHerstellung von L-Lysin unter Einsatz eines Methylophilus-Bakteriums bekanntund umfaßtdas Kultivieren eines Mutantenstammes, der gegen ein Lysinanalogon,wie AEC (S-(2-Aminoethyl)-L-cystein), resistent ist, oder einesrekombinanten Stammes, der einen Vektor mit DNA enthält, diedie genetische Information trägt,die an der Biosynthese von L-Lysin beteiligt ist (WO 00/61723).Ein Gen, welches Lysindecarboxylase, abgeleitet aus einem MethylophilusBakterium, codiert, ist bislang jedoch nicht bekannt, und es gibtbislang keine Berichte überL-Lysin-Produktion unter Verwendung eines Methylophilus-Bakteriums,worin die Expression eines solchen Gens unterdrückt oder ausgeschaltet ist.
    [0004] Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindungist es, ein Lysindecarboxylase-Gen aus Methylophilus methylotrophuszu erhalten, welches ein Methanol-verwertendes Bakterium ist, undein solches Gen zur Herstellung eines L-Lysin-produzierenden Bakteriumsder Gattung Methylophilus, worin die Expression des Lysindecarboxylase-Gensin der Zelle unterdrücktist, zu verwenden. Eine weitere Aufgabe ist es, ein Verfahren zur Herstellungvon L-Lysin durch Kultivieren eines solchen Methylophilus-Bakteriumsbereitzustellen.
    [0005] Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindungist es, ein Protein aus der folgenden Gruppe bereitzustellen: (A) ein Protein mit der Aminosäuresequenzder SEQ ID NO: 4; (B) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 4,einschließlichSubstitution, Deletion, Insertion oder Addition eines oder mehrererAminosäurereste,und mit Lysindecarboxylase-Aktivität.
    [0006] Eine weitere Aufgabe der vorliegendenErfindung ist es, eine DNA bereitzustellen, welche das vorstehendbeschriebene Protein codiert.
    [0007] Eine weitere Aufgabe der vorliegendenErfindung ist es, die vorstehend beschriebene DNA bereitzustellen,wobei die DNA aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: (a)eine DNA mit der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern 684 bis 2930in der SEQ ID NO: 3; (b) eine DNA, die mit einer DNA mit der Nukleotidsequenz derNukleotidnummern 684 bis 2930 in der SEQ ID NO: 3 unter stringentenBedingungen hybridisierbar ist und für ein Protein mit Lysindecarboxylase-Aktivität codiert.
    [0008] Eine weitere Aufgabe der vorliegendenErfindung ist es, die vorstehend beschriebene DNA bereitzustellen,die von einem Chromosom eines Methylophilus-Bakteriums abgeleitetist.
    [0009] Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegendenErfindung, ein Methylophilus-Bakterium bereitzustellen, das dieFähigkeitzur Produktion von L-Lysin hat und so modifiziert ist, daß die intrazelluläre Lysindecarboxylase-Aktivität vermindertoder ausgeschaltet ist.
    [0010] Es ist eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe,das vorstehend beschriebene Methylophilus-Bakterium bereitzustellen,worin ein Gen auf einem Chromosom mit einer Nukleotidsequenz, dieder Sequenz der vorstehend beschriebenen DNA identisch ist, zerstört ist,oder ein Gen auf einem Chromosom mit einer Homologie zu der vorstehendbeschriebenen DNA in einem solchen Ausmaß, daß eine homologe Rekombinationmit der DNA auftritt, zerstörtist, wodurch die Expression des Gens unterdrückt ist und die intrazelluläre Lysindecarboxylase-Aktivität vermindertoder eliminiert ist.
    [0011] Es ist eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe,ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin bereitzustellen, welchesdas Kultivieren des vorstehend beschriebenen Methylophilus-Bakteriumsin einem Medium, das Methanol als Hauptkohlenstoffquelle enthält, zurProduktion und Akkumulation von L-Lysin in der Kultur und das Gewinnendes L-Lysins aus der Kultur umfaßt.
    [0012] Mit der vorliegenden Erfindung wirdes möglich,eine neue Lysindecarboxylase und ein für dieses Enzym codierendesGen bereitzustellen. Außerdemkann durch Kultivieren eines Methylophilus-Bakteriums, das die Fähigkeitzur Produktion von L-Lysinhat und worin die Expression des Gens unterdrückt ist, L-Lysin effizienthergestellt werden.
    [0013] Die Erfinder der vorliegenden Erfindunghaben Forschungen durchgeführt,um zu bestimmen, ob Lysindecarboxylase in Methylophilus-Bakteriumvorkommt, und sie haben einen offenen Leserahmen (im folgenden als "orf" abgekürzt) miteiner Homologie zu einem bekannten Lysindecarboxylase-Gen, abgeleitetvon einer DNA-Sequenz auf dem Genom von Methylophilus methylotrophus,gefunden. Die Homologie der durch dieses Gen codierten Aminosäuresequenz(Anteil identischer Aminosäuren)war 38,18 zu dem cadA-Produkt von Escherichia coli (E. coli K12,NCBI: AAC77092) und 37,85% zu dem ldcC-Produkt desselben Bakteriums (E.coli K12, NCBI: AAC73297). Überdieshatte die durch diesen orf codierte Aminosäuresequenz etwa 38,11 Homologiezu Arginindecarboxylase, welches das Genprodukt von adiA von Escherichiacoli ist (E. coli K12, NCBI: AAC77078), und somit war das newldc-Genidentifiziert.
    [0014] Deshalb haben die Erfinder der vorliegendenErfindung versucht, den vorstehend beschriebenen orf von Methylophilusme thylotrophus zu zerstören,um dessen Funktion zu untersuchen. Der im Ergebnis erhaltene Stammwuchs in einem SEII-Medium nicht mehr, worin ein Wildtypstamm vonMethylophilus methylotrophus normalerweise wachsen kann. Dies warein unerwartetes Ergebnis, weil Escherichia coli und dergleichen keinebesondere Auxotrophie zeigen, selbst wenn cadA und ldcC deletiertsind.
    [0015] Da davon ausgegangen wurde, daß ein Nährstofffür Methylophilusmethylotrophus aufgrund des Defekts des orf essentiell wurde undnicht in den Komponenten des SEII-Mediums vorhanden war, wurde Cadaverin,ein Abbauprodukt von L-Lysin, oder Agmatin, ein Abbauprodukt vonL-Arginin, in einer geeigneten Menge zu dem Medium gegeben. Es zeigtesich, daß derStamm mit dem Defekt in dem orf in dem Medium wachsen konnte.
    [0016] Deshalb wurde gefunden, daß in Methylophilusmethylotrophus das durch diesen orf codierte Protein für das Wachstumin einem typischen Minimalmedium essentiell ist und daß Cadaverinoder Agmatin fürdas Wachstum eines Stammes mit einem Defekt im orf notwendig ist.
    [0017] Ausgehend davon wurde das Gen, dasdiesen orf enthielt, ldc-Gengenannt.
    [0018] Wenn die Expression des ldc-Gensin einem L-Lysin-produzierendem Stamm, der von Methylophilus methylotrophusgezüchtetwurde, unterdrücktwurde, wurde die L-Lysin-Produktion verbessert, und somit wurdedie vorliegende Erfindung gemacht.
    [0019] Im folgenden wird die vorliegendeErfindung eingehend beschrieben.
    [0020] Die erfindungsgemäße Lysindecarboxylase und diedafür codierendeDNA
    [0021] Die erfindungsgemäße Lysindecarboxylase ist einProtein, das im folgenden in (A) oder (B) definiert ist:
    [0022] Die erfindungsgemäße DNA codiert für ein vorstehendin (A) oder (B) definiertes Protein.
    [0023] Die erfindungsgemäße DNA (im folgenden auch als "ldc-Gen" bezeichnet) kannaus einer chromosomalen DNA eines Methylophilus-Bakteriums, wieMethylophilus methylotrophus, isoliert und erhalten werden. EinWildtypstamm von Methylophilus methylotrophus, Stamm AS1 (NCIMBNr. 10515), ist bei den National Collections of Industrial and MarineBacteria (Adresse: NCIMB Lts., Torry Research Station, 135, AbbeyRoad, Aberdeen AB9 8DG, Großbritannien)erhältlich,Obwohl ein typisches Kultivierungsverfahren für diesen Stamm im Katalog vonNCIMB beschrieben ist, kann er auch in dem SEII-Medium, das in denBeispielen beschrieben ist, gezüchtetwerden.
    [0024] Die genomische DNA des Stammes AS1kann durch ein bekanntes Verfahren hergestellt werden, und es kannein käuflicherwerbbarer Kit fürdie Herstellung des Genoms eingesetzt werden.
    [0025] Die erfindungsgemäße DNA kann durch Synthetisierenvon Primern auf der Grundlage der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern684 bis 2930 in der SEQ ID NO: 3 und anschließendes Amplifizieren der DNA durchPCR (Polymerasekettenreaktion) unter Einsatz einer chromosomalenDNA eines Bakteriums, wie Methylophilus-Bakterium, als Matrize erhaltenwerden. Außerdemkann die erfindungsgemäße DNA auchdurch Koloniehybridisierung unter Einsatz einer Sonde, hergestelltauf der Grundlage der vorstehend genannten Nukleotidsequenz odereines Teilfragments, wobei die Sonde durch PCR amplifiziert wurde,erhalten werden.
    [0026] Herstellungstechniken für die genomischeDNA-Bibliothek, die Hybridisierung, PCR, Herstellung von Plasmid-DNA,Verdauung und Ligation von DNA, Transformation und dergleichen,die fürdas Klonieren der erfindungsgemäßen DNAeingesetzt werden, sind in Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis,T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ThirdEdition (2001) beschrieben.
    [0027] Beispiele für in der vorstehend genanntenPCR eingesetzten Primer umfassen, wobei sie jedoch nicht daraufbeschränktsind, Oligonukleotide der SEQ ID NO: 1 und 2.
    [0028] Die Nukleotidsequenz des ldc-Gens,isoliert aus dem Genom von Methylophilus methylotrophus, das wievorstehend beschrieben erhalten wurde, ist in SEQ ID NO: 3 gezeigt.Außerdemist die Aminosäuresequenzder davon codierten Lysindecarboxylase als SEQ ID NO: 4 gezeigt.
    [0029] Fürdie vorstehend genannte Aminosäuresequenzwurde eine bekannte Datenbank auf homologe Aminosäuresequenzendurchsucht. Es wurden dadurch zwei Arten von Lysindecarboxylasen(codiert von cadA und ldcC) und Arginindecarboxylase (codiert vonadiA) aus Escherichia coli mit Homologien von 38,18%, 37,85% beziehungsweise38,11% zu der vorstehend genannten Aminosäuresequenz gefunden. Die Homologienwurden als Anteile identischer Aminosäuren zur Gesamtanzahl der Aminosäureresteder fürden Vergleich verwendeten Regionen berechnet.
    [0030] Die erfindungsgemäße DNA kann für eine Aminosäuresequenz,einschließlichSubstitution, Deletion, Insertion oder Addition eines oder mehrererAminosäurerestean einer oder mehreren Positionen codieren, solange die Aktivität der codiertenLysin decarboxylase nicht wesentlich beeinträchtigt ist. Der Ausdruck "mehrere", der hier verwendetwird, variiert in Abhängigkeitvon den Positionen der Aminosäurerestein der dreidimensionalen Struktur des Proteins und der Aminosäureart.Die Aminosäuresequenzkann jedoch eine Sequenz mit 70% oder mehr, vorzugsweise 80% odermehr, stärkerbevorzugt 90% oder mehr Homologie zur Gesamtaminosäuresequenzder Lysindecarboxylase mit der Aktivität von Lysindecarboxylase sein.
    [0031] Genauer gesagt sind "mehrere" vorzugsweise zwischen2 und 20, stärkerbevorzugt zwischen 2 bis 10. Die vorstehend genannte Aktivität von Lysindecarboxylasebedeutet eine Aktivitätzur Katalyse der Reaktion zur Herstellung von Cadaverin durch Decarboxylierungvon L-Lysin.
    [0032] Eine DNA, die für ein Protein codiert, dasim wesentlichen mit der vorstehend genannten Lysindecarboxylaseidentisch ist, kann durch Modifizieren der in SEQ ID NO: 3 gezeigtenNukleotidsequenz erhalten werden. Beispielsweise kann ortsspezifischeMutagenese eingesetzt werden, so daß Substitution, Deletion, Insertionoder Addition eines oder mehrerer Aminosäurereste an einer spezifischenStelle auftritt. Außerdemkann eine wie vorstehend beschrieben modifizierte DNA auch durchherkömmlichbekannte Mutationsbehandlungen erhalten werden. Beispiele solcherMutationsbehandlungen umfassen ein Verfahren zur Behandlung des ldc-Gensin vitro mit Hydroxylamin oder dergleichen, ein Verfahren zur Behandlungeines Mikroorganismus, wie ein Escherichia-Bakterium, enthaltendein ldc-Gen, mit UV-Bestrahlung oder einem Mutagenisierungsmittel,das üblicherweisebei Mutationsbehandlungen eingesetzt wird, wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) oderEMS.
    [0033] Die Substitution, Deletion, Insertion,Addition, Inversion und dergleichen von Nukleotiden, wie vorstehendbeschrieben, kann auch eine natürlichauftretende Mutation auf der Basis von beispielsweise einem individuellenUnterschied oder einem Unterschied in der Art der Mikroorganismen,welche das ldc-Gen enthalten, sein.
    [0034] Eine DNA, die im wesentlichen für dasselbeProtein wie Lysindecarboxylase codiert, kann durch Exprimieren einersolchen DNA mit einer vorstehend beschriebenen Mutation in einergeeigneten Zelle und Untersuchen der Aktivität der exprimierten Lysindecarboxylaseerhalten werden. Eine DNA, die im wesentlichen für dasselbe Protein wie Lysindecarboxylasecodiert, kann auch durch Isolieren einer DNA, die mit einer DNA mitder Nukleotidsequenz, die den Nukleotidnummern 684 bis 2930 derNukleotidsequenz in SEQ ID NO: 3 entspricht, oder mit einer Sonde,die aus der Nukleotidsequenz unter stringenten Bedingungen hergestelltwerden kann, hybridisierbar ist und für ein Protein mit Lysindecarboxylase-Aktivität codiert,aus einer Zelle, welche das ldc-Gen mit einer Mutation enthält, erhaltenwerden.
    [0035] Die "stringenten Bedingungen" umfassen Bedingungen,unter denen ein sogenanntes spezifisches Hybrid gebildet wird undein nicht-spezifisches Hybrid nicht gebildet wird. Es ist schwierig,diese Bedingung durch Zahlenangaben genau auszudrücken. Beispielsweiseumfassen stringente Bedingungen jedoch eine Bedingung, bei der DNAsmit hoher Homologie, wie DNAs mit einer Homologie von 70% oder höher, vorzugsweise80% oder höher,stärkerbevorzugt 90% oder höher,noch stärkerbevorzugt 95% oder höher,miteinander hybridisieren, und DNAs mit einer Homologie, die niedrigerals vorstehend genannt ist, nicht miteinander hybridisieren. Alternativdazu umfassen stringente Bedingungen eine Bedingung, bei der DNAsmiteinander bei einer Salzkonzentration hybridisieren, die typischenWaschbedingungen bei der Southern Hybridisierung entsprechen, nämlich 1 × SSC, 0,1%SDS, vorzugsweise 0,1 × SSC,0,1% SDS, bei 60°C.
    [0036] Eine Teilsequenz des ldc-Gens kannauch als Sonde eingesetzt werden. Eine solche Sonde kann durch PCRunter Einsatz von Oligonukleotiden, hergestellt auf der Grundlageder Nukleotidsequenz des Gens, als Primer und einem DNA-Fragment,welches das Gen enthält,als Matrize durch dem Fachmann bekannte Verfahren hergestellt werden.Wenn ein DNA-Fragment mit einer Länge von etwa 300 bp als Sondeeingesetzt wird, kann die Waschbedingung für die Hybridisierung beispielsweise50°C, 2 × SSC und0,1% SDS sein.
    [0037] Die Aktivität der Lysindecarboxylase kanndurch das Verfahren gemessen werden, das in Y.-S. Lee und Y.-D.Cho, The Biochemical Journal, Bd. 360, S. 657–665 (2001) beschrieben ist.
    [0038] Das erfindungsgemäße ldc-Gen kann zusätzlich zurKonstruktion eines späterbeschriebenen Stammes mit zerstörtemldc-Gen beispielsweise fürdie Produktion der erfindungsgemäßen Lysindecarboxylase eingesetztwerden. Das heißt,die Lysindecarboxylase kann durch Einführen des ldc-Gens in einengeeigneten Wirtsmikroorganismus zur Expression des Gens produziertwerden. Dies kann auf dieselbe Weise durchgeführt werden wie ein üblichesVerfahren zur Produktion eines nützlichenProteins unter Verwendung von Genrekombinationstechniken. Das heißt, eineDNA, die fürLysindecarboxylase codiert, kann in einen Vektor eingebaut werden,der einen geeigneten Promotor enthält, ein Wirt, wie Escherichiacoli, kann mit dem erhaltenen rekombinanten Vektor transformiertwerden, und die Transformante kann zur Expression des vorstehendgenannten Gens kultiviert werden. Beispiele des Wirts umfassen,sie sind jedoch nicht darauf beschränkt, Escherichia coli, Bacillussubtilis, Hefe und dergleichen. Der Promotor kann jeder beliebigePromotor sein, der in dem eingesetzten Wirt funktioniert, und Beispieleumfassen lac, trp, tac, trc, recA, T7 (Lecture of Biochemical Experiments,New Edition, Vol. 1, Protein, VI Synthesis and Expression, herausgegebenvon Japanese Biochemical Society, S. 166, Yasueda, Matsui, 1992,veröffentlichtvon Tokyo Kagaku Dojin), PGK, ADH1, GPD, MFa1, SUC2, PHO5, GAL1,GAL4 (Lecture of Biochemical Experiments, New Edition, Vol. 1, Protein,VI Synthesis and Expression, herausgegeben von Japanese BiochemicalSociety, S. 215, Sakai et al., 1992, veröffentlicht von Tokyo KagakuDojin) und dergleichen.
    [0039] Die Lysindecarboxylase kann aus einemWirtsmikroorganismus auf dieselbe Weise wie für die Produktion eines üblichenrekombinanten Proteins gewonnen werden.
    [0040] Das erfindungsgemäße Bakterium ist ein Methylophilus-Bakteriummit der Fähigkeitzur Produktion von L-Lysin und ist so modifiziert, daß die intrazelluläre Lysindecarboxylase-Aktivität vermindertoder ausgeschaltet ist.
    [0041] Ein Beispiel des Methylophilus-BakteriumsumfaßtMethylophilus methylotrophus. Die "Fähigkeitzur Produktion von L-Lysin",auf die in der vorliegenden Erfindung Bezug genommen wird, bedeutetdie Fähigkeit deserfindungsgemäßen Bakteriums,die Anhäufungeiner signifikanten Menge von L-Lysin in einem Medium zu bewirken,wenn das Bakterium in dem Medium kultiviert wird.
    [0042] Die Verringerung oder Ausschaltungder intrazellulärenLysindecarboxylase-Aktivitätwird beispielsweise durch Unterdrücken der Expression des ldc-Genserreicht. Die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Lysindecarboxylase-Aktivität kann auchdurch Modifizieren der Struktur des Lysindecarboxylase-Enzyms, dasdurch dieses Gen codiert wird, zur Verringerung oder Ausschaltungder spezifischen Aktivität derLysindecarboxylase erreicht werden. Beispiele für ein Verfahren zur Herstellungeines solchen Methylophilus-Bakteriums, worin die intrazelluläre Lysindecarboxylase-Aktivität verringertoder ausgeschaltet ist, umfassen ein Verfahren zur Behandlung eines Methylophilus-Bakteriumsmit UV-Strahlung oder einem Mutagenisierungsmittel, das in üblichenMutagenisierungsbehandlungen eingesetzt wird, wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin(NTG) oder EMS, und das Selektieren eines Mutantenstammes, welcherdie verringerte Aktivitätvon Lysindecarboxylase zeigt.
    [0043] Eine bevorzugte Ausführungsformdes erfindungsgemäßen Bakteriumsist ein Methylophilus-Bakterium, worin das ldc-Gen auf einem Chromosomzerstörtist, wodurch die Expression des Gens unterdrückt wird und die intrazelluläre Lysindecarboxylase-Aktivität verringertoder ausgeschaltet ist. Das in dieser Ausführungsform beschriebene ldc-Genumfaßtein Gen, das fürLysindecarboxylase mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 4codiert, und ein Gen mit einer Homologie zu diesem Gen in einemAusmaß,daß homologeRekombination mit dem Gen mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 4auftritt. Die vorstehend erwähnteHomologie in einem Ausmaß,daß homologeRekombination auftritt, ist vorzugsweise 90% oder mehr, stärker bevorzugt95% oder mehr, insbesondere bevorzugt 99% oder mehr Homologie.
    [0044] Das ldc-Gen auf einem Chromosom kanndurch ein Verfahren auf der Grundlage von Gensubstitution unterEinsatz homologer Rekombination zerstört werden (Experiments in MolecularGenetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1972); Matsuyama,S. & Mizushima,S. J. Bacteriol., 162, 1196 (1985), wie in den Beispielen beschrieben.Die Fähigkeit,homologe Rekombination zu bewirken, ist eine allgemein in Bakterienvorhandene Eigenschaft, und die Erfinder der vorliegenden Erfindunghaben gefunden, daß Gensubstitutionunter Einsatz homologer Rekombination auch in Methylophilus-Bakterienmöglichist. Genauer gesagt wird ein Methylophilus-Bakterium mit einer DNA,die das ldc-Gen enthält,das so modifiziert ist, daß keineLysindecarboxylase produziert wird, die normal funktioniert (ldc-Genvom Deletionstyp), transformiert, und die Rekombination wird zwischendem ldc-Gen vom Deletionstyp und dem ldc-Gen auf einem Chromosombewirkt. Danach wird, wenn die Rekombination erneut an einer Stelleauf dem Chromosom, in die das Plasmid einverleibt wurde, auftritt,das Plasmid aus dem Chromosom eliminiert. Zu diesem Zeitpunkt kann,in Abhängigkeitvon der Rekombinationsstelle, das Gen vom Deletionstyp auf dem Chromosomfixiert sein, und das native Gen kann zusammen mit dem Plasmid ausdem Chromosom eliminiert worden sein, oder das native Gen kann aufdem Chromosom fixiert sein, und das Gen vom Deletionstyp kann zusammenmit dem Plasmid aus dem Chromosom entfernt worden sein, Durch Selektiereneines solchen Stammes, in dem das Erstgenannte aufgetreten ist,kann ein Stamm, worin das Gen vom Deletionstyp gegen das nativeGen auf dem Chromosom ausgetauscht worden ist, erhalten werden.
    [0045] Außerdem haben die Erfinder dervorliegenden Erfindung gefunden, daß in Methylophilus methylotrophusdas Einführeneines zu einem gewünschtenGen homologen Gens in ein Chromosom in der Form eines linearen DNA-Fragmentsdie homologe Rekombination zwischen dem gewünschten Gen auf dem Chromosom unddem homologen Gen auf dem eingeführtenlinearen DNA-Fragment in der Zelle bewirkte, wodurch eine Gensubstitutionerzielt werden konnte, so daß einsolches Verfahren ebenfalls eingesetzt werden kann. Ein Beispielder Gensubstitution, durchgeführtunter Einsatz dieses Verfahrens, wird in den Beispielen beschrieben.
    [0046] Beispiele des vorstehend beschriebenenldc-Gens vom Deletionstyp umfassen Gene, worin Substitution, Deletion,Insertion, Addition oder Inversion eines oder mehrerer Nukleotidein der Nukleotidsequenz der codierenden Region bewirkt wird unddadurch die spezifische Aktivitätdes codierten Proteins verringert oder ausgeschaltet wird, sowieGene, deren innerer Bereich oder Endbereich der codierenden Regiondeletiert ist, Gene, in deren codierende Region eine andere Se quenzeingefügtworden ist, und dergleichen. Beispiele anderer Sequenzen umfassenMarkergene, wie das Kanamycinresistenzgen.
    [0047] Die Expression des ldc-Gens auf einemChromosom kann auch durch Einführenvon Substitutionen, Deletionen, Insertionen, Additionen oder Inversioneneines oder mehrerer Nukleotide in einer Promotorsequenz des Genszur Verringerung der Promotoraktivität und damit zur Unterdrückung derExpression des Gens auf Transkriptionsebene verringert oder ausgeschaltetwerden (vergleiche Rosenberg, M. & Court,D., Ann. Rev. Genetics, 13, S. 319 (1979); Youderian, P., Bouvier,S. & Susskind,M., Cell, 30, S. 843–853(1982)).
    [0048] Außerdem kann die Expressiondes ldc-Gens auch auf Translationsebene durch Einführen einerSubstitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion einesoder mehrerer Nukleotide in eine Region zwischen der SD-Sequenzund dem Initiationscodon des Gens unterdrückt werden (vergleiche Dunn,J. J., Buzash-Pollert, E. & Studier,F. W., Proc., Natl. Acad. Sci. USA, 75, S. 2743 (1978)).
    [0049] Die Modifikation eines Promotorsoder einer Region zwischen der SD-Sequenz und dem Initiationscodon,wie vorstehend beschrieben, kann auf dieselbe Weise wie für die vorstehendbeschriebene Gensubstitution durchgeführt werden. OrtsspezifischeMutagenese (Kramer, W. & Frits,H. J: Methods in Enzymology, 154, 350 (1987)) und der Einsatz einerBehandlung mit einem chemischen Mittel, wie Natriumhyposulfit oderHydroxylamin (Shortle, D. und Nathans, D., Proc., Natl. Acad. Sci.USA, 75, 270 (1978)) kann spezifisch eingesetzt werden, um Substitution,Deletion, Insertion, Addition oder Inversion von Nukleotiden ineinem Gen zu bewirken.
    [0050] Ortsspezifische Mutagenese ist einVerfahren unter Einsatz synthetischer Oligonukleotide, welche einewillkürlicheSubstitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion in spezifischeBasenpaare einführen kann.Um dieses Verfahren einzusetzen, wird ein Plasmid, welches ein gewünschtesGen enthält,das cloniert ist und eine bekannte DNA-Nukleotidsequenz enthält, zunächst denaturiert,um einen Einzelstrang zu erhalten. Dann wird ein synthetisches Oligonukleotid,das zu einer Region, worin eine Mutation eingeführt werden soll, komplementär ist, synthetisiert.Bei dieser Synthese wird die Sequenz des synthetischen Oligonukleotidsnicht als vollständigkomplementäreSequenz hergestellt, sondern so hergestellt, daß Substitution, Deletion, Insertion,Addition oder Inversion eines oder mehrerer willkürlicherNukleotide umfaßtsind. Danach wird die einzelsträngigeDNA und das synthetische Oligonukleotid, welches Substitution, Deletion,Insertion, Addition oder Inversion eines oder mehrerer willkürlicherNukleotide umfaßt,hybridisiert, und ein vollständigdoppelsträngigesPlasmid wird unter Einsatz eines Klenow-Fragments der DNA-Polymerase I undT4-Ligase synthetisiert und in kompetente Zellen von Escherichiacoli eingeführt.Einige der wie vorstehend beschrieben erhaltenen Transformantentragen ein Plasmid, welches das Gen enthält, worin Substitution, Deletion,Insertion, Addition oder Inversion eines oder mehrerer Nukleotidefestgelegt ist. Ein ähnlichesVerfahren, welches die Einführung einerMutation in ein gewünschtesGen ermöglichtund dadurch die Modifikation oder Zerstörung des Gens ermöglicht,umfaßtdas rekombinante PCR-Verfahren (PCR Technology, Stockton Press (1989)).
    [0051] Durch Ersetzen des nativen Gens aufeinem Chromosom eines Methylophilus-Bakteriums durch das Gen, indas eine Mutation eingeführtworden ist und das dadurch wie vorstehend beschrieben modifiziertoder zerstörtwurde, kann die Expression des ldc-Gens in der Zelle unterdrückt werden.
    [0052] Das Methylophilus-Bakterium mit verringerteroder ausgeschalteter Lysindecarboxylase-Aktivität ist ein Methylophilus- Bakterium mit einerFähigkeitzur Produktion von L-Lysin. Ein Methylophilus-Bakterium mit derFähigkeitzur Produktion von L-Lysin, wie ein Stamm von Methylophilus methylotrophus,kann durch Mutagenesebehandlung eines solchen Stammes, der die Fähigkeitzur Produktion von L-Lysin nicht hat oder eine geringe Fähigkeitzur Produktion von L-Lysin hat, unter Verleihung einer Resistenzgegen ein L-Lysin-Analogon, wie S-(2-Aminoethyl)-L-cystein (im folgendenals "AEC" abgekürzt) erhaltenwerden. Beispiele des Verfahrens zur Mutagenesebehandlung umfassen,wobei sie jedoch nicht darauf beschränkt sind, Verfahren zur Behandlungvon Zellen von Escherichia coli mit einem chemischen Mutagenisierungsmittel,wie NTG oder EMS, oder mit UV-Strahlung oder dergleichen. SpezifischeBeispiele eines solchen Stammes umfassen Methylophilus methylotrophusAJ13608. Dieser Stamm wurde durch Übertragung der AEC-Resistenzauf den Stamm Methylophilus methylotrophus AS1 gezüchtet. Methylophilusmethylotrophus AJ13608 wurde am 10. Juni 1999 beim National Instituteof Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Scienceand Technology (derzeit das unabhängige Verwaltungsinstitut NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology, InternationalPatent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome,Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) hinterlegt und erhieltdie Hinterlegungsnummer FERM P-17416. Dann wurde die Hinterlegungam 31. März2000 in eine internationale Hinterlegung gemäß den Regelungen des BudapesterVertrages umgewandelt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM BP-7112.
    [0053] Ein Methylophilus methylotrophusmit der Fähigkeitzur Produktion von L-Lysin kann auch durch Einführen einer DNA, die genetischeInformation trägt,die an der Biosynthese von L-Lysin beteiligt ist, oder durch Verstärken derExpression der DNA mit einer genetischen Rekombinationstechnik gezüchtet werden.Das oder die einzuführendenGene codieren fürein Enzym des Biosyntheseweges von L-Lysin, wie Dihydrodipicolinatsynthase undSuccinyldiaminopimelattransaminase. Im Fall eines Gens für ein Enzym,das einer Rückkopplungshemmungdurch L-Lysin unterliegt, wie Dihydrodipicolinatsynthase, ist esbevorzugt, ein mutiertes Gen einzusetzen, das für ein Enzym codiert, das freivon Rückkopplungshemmungist.
    [0054] Außerdem kann die Fähigkeitzur Produktion von L-Lysin auch durch Verstärken der Aktivität eines Proteins,das an der Sekretion von L-Lysin beteiligt ist, verbessert werden.Beispielsweise ist als ein Protein, das an der Sekretion von L-Lysin beteiligt ist,das LysE-Protein, das durch das lysE-Gen codiert wird, bekannt (M.Vrljic, H. Sahm and L. Eggeling, Molecular Microbiology 22, S. 815–826 (1996);Internationale PatentveröffentlichungWO 97/23597). Die Erfinder der vorliegenden Erfindung bestätigten,daß obwohlein Wildtyp-lysE, abgeleitet aus Brevibacterium Bakterien, in Methylophilus-Bakterien überhauptnicht funktionierte, dieses Gen modifiziert werden konnte, so daß es inMethylophilus-Bakterien funktionierte. Beispiele solcher Varianten desLysE-Proteins umfassen LysE24, das in den Beispielen beschriebenist (vergleiche US-2003-0124687-A1).
    [0055] Das LysE-Protein, das durch das lysE-Gencodiert wird, hat 6 hydrophobe Helixregionen. Einige dieser hydrophobenRegionen sind vermutlich Transmembrandomänen. Es wird auch vermutet,daß eineRegion zwischen der dritten und der vierten Region, bezogen aufden N-Terminus, hydrophil ist und eine Schleifenstruktur aufweist.Die Nukleotidsequenz des Wildtyp-lysE und die Aminosäuresequenzdes LysE-Proteins von Brevibacterium lactofermentum sind in derSEQ ID NO: 21 und der SEQ ID NO: 22 gezeigt. In dieser Aminosäuresequenzkorrespondieren die hydrophoben Helixregionen mit den Aminosäurenummern5-20, 37-58, 67-93, 146-168, 181-203 und 211-232. Die Schleifenregionentspricht den Aminosäurenummern94 bis 145.
    [0056] Die Erfinder der vorliegenden Erfindungfanden, daß daslysE-Gen in Methylophilus-Bakterienletal war, jedoch auch, daß eineDNA, die füreine Variante des LysE-Proteins codiert, welche die Schleifenregion nichthatte oder im wesentlichen nur aus den hydrophoben Helices bestand,die Sekretion von L-Lysin aus der Zelle eines Methanol-verwertendenBakteriums heraus erhöhte(US-2003-0124687-A1). Das lysE24 codiert für ein solches mutiertes LysE-Protein,dem die vorstehend beschriebene Schleifenregion, die in einem Wildtyp-LysE-Proteinvorhanden ist, fehlt oder im wesentlichen nur aus den hydrophobenHelices besteht.
    [0057] Das vorstehend beschriebene mutierteLysE ist nicht besonders eingeschränkt, solange es eine oder mehrerehydrophobe Helices hat und, wenn es in einem Methanol-verwertendenBakterium exprimiert wird, zu einer erhöhten Sekretion von L-Lysinführt.Genauer gesagt ist eine DNA, die für ein mutiertes LysE codiert, dasalle, nämlichdie erste bis sechste hydrophobe Helix, bezogen auf den N-Terminus,codiert, mit umfaßt. Genauergesagt ist eine DNA, die fürein Peptid codiert, das die erste bis dritte hydrophobe Helix, bezogenauf den N-Terminus, enthält,und eine DNA, die fürein Peptid codiert, das die vierte bis sechste hydrophobe Helix, bezogenauf den N-Terminus,codiert, mit umfaßt.Das vorstehend genannte lysE24 ist ein Beispiel eines mutiertenlysE, das fürein Peptid, das die erste bis dritte hydrophobe Helix enthält, undfür einPeptid codiert, das die vierte bis sechste hydrophobe Helix enthält. DaslysE24-Gen wird durch eine Mutation im Stoppcodon stromabwärts derRegion, die fürdie dritte hydrophobe Helix codiert, eingeführt. Die Erfinder der vorliegenden Erfindunghaben bestätigt,daß wenneine Region stromabwärtsvon diesen Stoppcodon deletiert wird, das mutierte lysE24-Gen dieAkkumulation von L-Lysin in dem Medium nicht bewirkte, wenn es indem Methylophilus methylotrophus Stamm AS1 exprimiert wurde. Deshalbwird angenommen, daß einPeptid, das die erste bis dritte hydrophobe Helix enthält, undein Peptid, das die vierte bis sechste hydrophobe Helix enthält, getrennt voneinandertranslatiert werden und in Methylophilus-Bakterium funktionieren.Die Ergebnisse zeigen, daß die Einführung deslysE24-Gens in ein Methylophilus-Bakterium zu einer Verbesserungder Produktion von L-Lysin führt.
    [0058] Jeder Mikroorganismus kann eingesetztwerden, um eine DNA zu erzeugen, die für ein Protein codiert, dasan der Sekretion von L-Lysin aus der Zelle heraus beteiligt ist,d. h. das lysE-Gen oder sein homologes Gen, solange es eine Variantedes Gens hat, welches die L-Lysin-sekretorische Aktivität in einemMethanol-verwertenden Bakterium exprimieren kann.
    [0059] Genauer gesagt umfassen Beispielesolcher Mikroorganismen, wobei sie jedoch nicht darauf beschränkt sind,coryneforme Bakterien, wie Corynebacterium glutamicum und Brevibacteriumlactofermentum, Escherichia-Bakterien, wie Escherichia coli, Pseudomonas-Bakterien,wie Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium-Bakterien, wie Mycobacteriumtuberculosis und dergleichen.
    [0060] Um die Expression des Gens zur Lysinsekretionin einem Methanol-verwertenden Bakterium zu verstärken, wirdein Genfragment an einen Vektor ligiert, der in einem Methylophilus-Bakteriumfunktionieren kann, vorzugsweise ein Mehrkopienvektor, um rekombinanteDNA herzustellen, die dann eingesetzt wird, um den Wirt, nämlich dasMethanol-verwertende Bakterium, zu transformieren. Alternativ dazukann das Gen in ein Transposon eingebaut und in ein Chromosom eingeführt werden.Außerdemkann ein Promotor, der eine leistungsfähige Transkription in einemMethanol-verwertenden Bakterium induziert, stromaufwärts vondem Gen ligiert werden.
    [0061] Um ein gewünschtes Gen, wie ein L-Lysin-Biosynthesegenoder Gen fürdie L-Lysin-Sekretion, in Methylophilus-Bakterien ein zuführen unddessen Expression zu verstärken,kann das Gen an einen Vektor ligiert werden, der in einer Zellevon Methylophilus-Bakterien autonom replizierbar ist, wobei rekombinanteDNA hergestellt wird, die dann eingesetzt wird, um Methylophilusmethylotrophus beispielsweise durch Elektroporation zu transformieren.Zusätzlichist es auch möglich,ein gewünschtesGen in ein Wirtschromosom durch ein Verfahren unter Einsatz vonTransduktion, Transposon (D. E. Berg und C. M. Berg, Bio/Technol.,1 S. 417 (1983)), Mu phage (Offengelegtes Japanisches Patent (Kokai)Nr. 2-109985) oder homologe Rekombination (Experiments in MolecularGenetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)) einzuführen.
    [0062] Die Vektoren, die in Methylophilus-Bakterienautonom replizierbar sind, umfassen, wobei sie jedoch nicht daraufbeschränktsind, RSF1010, ein Vektor mit breitem Wirtsbereich, und Derivatedavon, wie pAYC32 (Chistorerdov, A. Y., Tsygankov, Y. D., Plasmid16, S. 161–167(1986)) und pMFY42 (Gene, 44, S. 53 (1990)), pBBR1 und solche, dievon Derivaten davon abgeleitet sind (Kovach, M. E., et al., Gene,166, S. 175–176 (1995)),pRK310 und solche, die von Derivaten davon abgeleitet sind (Hrsg.Murrell, J. C., und Dalton, H., Methane and methanol utilizers,Plenum Press., S. 183–206(1992)) und dergleichen.
    [0063] Ein Methylophilus-Bakterium, dasdie Fähigkeitzur Produktion von L-Lysin hat und worin die Lysindecarboxylase-Aktivität verringertoder ausgeschaltet ist, kann durch Übertragen der Fähigkeitzur Produktion von L-Lysin auf ein Methylophilus-Bakterium, worin die Lysindecarboxylase-Aktivität verringertoder ausgeschaltet ist, erhalten werden. Außerdem kann ein solches vorstehenderwähntesBakterium auch durch Modifizieren eines Methylophilus-Bakteriumsmit der Fähigkeitzur Produktion von L-Lysin, so daß die Lysindecarboxylase-Aktivität verringertoder ausgeschaltet ist, erhalten werden.
    [0064] Die Kultivierung des Methylophilus-Bakteriums,worin die Lysindecarboxylase-Aktivität verringert oder eliminiertist und das wie vorstehend beschrieben erhalten wurde, in einemMedium, das Methanol als Hauptkohlenstoffquelle enthält, führt zurProduktion einer erheblichen Menge von L-Lysin und zur Akkumulationdes produzierten L-Lysins in dem Medium. Somit ist der Einsatz deserfindungsgemäßen Methylophilus-Bakteriumsmit der Fähigkeitzur Produktion von L-Lysin, worin die Lysindecarboxylase-Aktivität verringertoder ausgeschaltet ist, fürdie Verbesserung der Akkumulierung von L-Lysin wirksam.
    [0065] Das für die Produktion von L-Lysineingesetzte Medium ist ein typisches Medium, das eine Kohlenstoffquelle,Stickstoffquelle, anorganische Ionen und andere organische Spurennährstoffe,falls erforderlich, enthält.Die Hauptkohlenstoffquelle ist Methanol. Zucker, wie Glucose, Lactose,Galactose, Fructose und Stärkehydrolysat,Alkohole, wie Glycerin und Sorbitol, und organische Säuren, wieFumarsäure,Citronensäure, Bernsteinsäure undBrenztraubensäure,könnenzusammen eingesetzt werden. Der Ausdruck "Methanol wird als Hauptkohlenstoffquelleeingesetzt" bedeutet,daß derMethanolanteil in der Gesamtkohlenstoffquelle 50% (Gew./Gew.) oderhöher,vorzugsweise 80% (Gew./Gew.) oder höher der Gesamtkohlenstoffquelleist. Wenn Methanol als Kohlenstoffquelle eingesetzt wird, ist derenKonzentration üblicherweisezwischen 0,001 bis 4% (Gew./Vol.), vorzugsweise0,1% bis 2% (Gew./Vol.). Außerdemist, wenn Glucose und dergleichen zugegeben werden, deren Konzentration üblicherweisezwischen 0,1% bis 3% (Gew./Gew.), vorzugsweise zwischen 0,1% bis1% (Gew./Vol.).
    [0066] Als Stickstoffquelle können anorganischeAmmoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid und Ammoniumphosphat,organi sche Stickstoffquellen, wie Sojabohnenhydrolysat, Ammoniakgas,wäßriges Ammoniakund dergleichen, eingesetzt werden.
    [0067] Als anorganische Ionen (oder Quellendavon) werden kleine Mengen Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisenionen,Manganionen und dergleichen zu dem Medium gegeben. Als organischeSpurennährstoffe werdenVitamin B1, Hefeextrakt und dergleichenin geeigneten Mengen zu dem Medium gegeben.
    [0068] Die Kultivierung wird vorzugsweisewährendetwa 16 bis 72 Stunden unter aeroben Bedingungen durchgeführt. DieKultivierungstemperatur wird zwischen 25°C bis 45°C kontrolliert, und der pH-Wertwird währendder Kultivierung zwischen 5 bis 8 kontrolliert. Anorganische oderorganische saure oder alkalische Substanzen, Ammoniakgas und dergleichenkönnenzur Einstellung des pH-Werts zugegeben werden.
    [0069] Nach dem vollständigen Ablauf der Kultivierungkann L-Lysin aus einer Fermentationsbrühe beispielsweise durch typischeVerfahren unter Einsatz von Ionenaustauschharzen, durch Ausfällungsverfahrenund dergleichen in Kombination gewonnen werden.
    [0070] Im folgenden wird die vorliegendeErfindung anhand der folgenden, nicht-einschränkenden Beispiele eingehenderbeschrieben.
    [0071] Um eine chromosomale DNA aus Methylophilusmethylotrophus AS1 Wildtypstamm zu erhalten, wurde der Stamm AS1in 50 ml des SEII-Mediums (Zusammensetzung: 5,0 g/l (NH4)2SO4, 1,9 g/l KH2PO4, 1,56 g/l NaH2PO4·2H2O, 200 mg/l MgSO4·7H2O, 72 mg/l CaCl2·6H2O, 5 ug/l CuSO4·5H20, 25 ug/l MnSO4·5H2O; 23 μg/l ZnSO4·7H2O, 9,7 mg/l FeCl3·6H2O, 0,5% (Vol./Vol.) Methanol) eingeimpftund überNacht bei 37°Cunter Schüttelnkultiviert. Dann wurde die Kulturbrühe zur Gewinnung der Zellenzentrifugiert. Eine chromosomale DNA wurde aus den erhaltenen Zellenunter Einsatz eines käuflicherwerbbaren Kits (Genomic DNA Purification Kit (hergestellt vonEdge Biosystems)) gemäß der dortbeigefügtenGebrauchsanweisung hergestellt.
    [0072] Die chromosomale DNA wurde als Matrizezusammen mit den DNA-Primernder SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 eingesetzt, um eine PCR durchzuführen (einZyklus, der aus der Denaturierung bei 98°C während 10 Sekunden, dem Annealingbei 55°Cwährend30 Sekunden und der Verlängerungbei 72°Cwährend 3Minuten bestand, wurde 25-mal wiederholt). Es wurde Pyorbestpolymerase(Takara Shuzo) eingesetzt. Im Ergebnis wurde ein DNA-Fragment miteiner Größe von etwa3,0 Kilobasenpaaren (im folgenden als "kbp" abgekürzt) erhalten.
    [0073] Dann wurde das erhaltene Fragmentdurch das in Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Third Edition (2001) beschriebeneVerfahren sequenziert. Es zeigt sich, daß die Region von der Restriktionsenzym-EcoRV-Schnittstellebis zur Schnittstelle des Restriktionsenzyms DdeI auf dem DNA-Fragmentdie Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 3 hatte. In dieser DNA-Sequenzwar ein offener Leserahmen (im folgenden als "orf" abgekürzt), welcherdie Aminosäuresequenzder SEQ ID NO: 4 codiert, enthalten. Dieser orf wurde als orf#3098bezeichnet. Das Gen, das fürdie Aminosäuresequenzder SEQ ID NO: 4 codiert, wurde ldc-Gen genannt.
    [0074] Die in Beispiel 1 erhaltene chromosomaleDNA wurde als Matrize zusammen mit den DNA-Primern der SEQ ID NO:5 und 6 eingesetzt, um eine PCR durchzuführen (Reaktionsbedingungen:TaKaRa Ex Taq wurde eingesetzt, ein Zyklus, der aus der Denaturierungbei 94°Cwährend30 Sekunden, dem Annealing bei 60°C während 30Sekunden und der DNA-Strangverlängerungsreaktionbei 72°Cwährend2 Minuten bestand, wurde 25-mal wiederholt), wodurch ein Fragmentvon etwa 1,3 kb erhalten wurde. Die PCR wurde auch unter Verwendungder in der SEQ ID NO: 7 und 8 gezeigten Primer unter denselben Bedingungendurchgeführt,wobei ein DNA-Fragment mit einer Größe von etwa 2,0 kb erhaltenwurde.
    [0075] Eine PCR wurde auch unter Einsatzdes Plasmids pKD4 (GenBank Accession Nr. AY048743, Datsenko, K.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 (12), 6640–6645 (2000))als Matrize und den in SEQ ID NO: 9 und 10 gezeigten Primern unterdenselben Bedingungen wie vorstehend erwähnt durchgeführt, wobeiein DNA-Fragment,das ein Kanamycinresistenzgen (Km®) enthielt,erhalten wurde (etwa 1,5 kb).
    [0076] Die drei Arten der vorstehend beschriebenenDNA-Fragmente wurden gemischt und als Matrize zusammen mit den inder SEQ ID NO: 11 und SEQ ID NO: 12 gezeigten Primern eingesetzt,um eine PCR durchzuführen(Reaktionsbedingungen: Es wurde TaKaRa Ex Taq eingesetzt; ein Zyklus,der aus der Denaturierung bei 94°Cwährend30 Sekunden, dem Annealing bei 60°Cwährend30 Sekunden und der DNA-Strangverlängerungsreaktion bei 72°C während 4Minuten und 30 Sekunden bestand, wurde 25-mal wiederholt), wodurch einFragment von etwa 4,7 kb erhalten wurde. Dieses Fragment enthieltdas ldc-Gen, das mit dem Kanamycinresistenzgenunterbrochen war. Dieses Fragment wurde unter Einsatz eines käuflich erwerbbarenKits (Wizard PCR Preps DNA Purification System, hergestellt vonPromega) gereinigt und anschließendeiner Ethanolpräzipitationunterworfen, und die Präzipitatewurden in TE-Lösung(10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA- Lösung)gelöst.Diese DNA-Lösungwurde im folgenden Verfahren als Fragment für die Genzerstörung eingesetzt.
    [0077] Dann wurde das Genfragment für die vorstehendbeschriebene Genzerstörungin den Methylophilus methylotrophus-Stamm AS1 eingeführt. DasElektroporationsverfahren (Canadian Journal of Microbiology, 43, 197(1997)) wurde fürdie Transformation eingesetzt. Das genaue Vorgehen ist wie folgt.
    [0078] Der Methylophilus methylotrophus-StammAS1 wurde in einem SEII flüssigenMedium (Methanolkonzentration: 0,5% (Vol./Vol.)) bei 37°C während 16Stunden unter Rührenkultiviert, und 20 ml der Kulturbrühe wurden 10 Minuten bei 10.000UpM zentrifugiert, um die Zellen zu gewinnen. Die Zellen wurdenmit 1 mM HEPES-Puffer(pH 7,2, 20 ml) versetzt, darin suspendiert und zentrifugiert, unddieser Vorgang wurde zweimal wiederholt. Schließlich wurde 1 ml desselbenPuffers zu den Zellen gegeben, um eine Zellsuspension herzustellen,wobei die Elektrozellen fürdie Elektroporation verwendet wurden. Dann wurde etwa 1 μg des vorstehenderwähntenDNA-Fragments, enthaltend das mit dem Kanamycinresistenzgen zerstörte ldc-Gen (ldc::Km®),zu 100 μlder Elektrozellen gegeben, und elektrische Pulse wurden unter denBedingungen von 18,5 kV/cm, 25 μFund 200 Ω ausgeübt, um dieElektroporation durchzuführenund dadurch die DNA-Fragmente in die Zellen einzuführen. DasSEII flüssigeMedium wurde unmittelbar zu dieser Zellsuspension gegeben, und dieZellen wurden bei 37°Cwährend3 Stunden kultiviert.
    [0079] Dann wurde diese Kulturbrühe auf dasSEII-Agarmedium, enthaltend 20 μg/mlKanamycin, aufgetragen und bei 37°Cinkubiert. Nach der Kultivierung während 48 Stunden zeigten sichmehrere zehn Kolonien auf der Platte. Unter diesen wurden 20 Stämme willkürlich ausgewählt, unddie Zerstörungdes Zielgens in diesen Stämmenwurde durch ein Nachweisverfahren auf der Grundlage der PCR bestätigt. Dasheißt,die vorstehend genannten auftretenden Kolonien wurden jeweils in20 μl sterilisiertemWasser suspendiert, mit 5 μl einer1 mg/ml Proteinase K und mit 25 μlP-Lösung(Lösung,die 40 mM Tris, 0,5% Tween 20, 1% Nonidet P-40, 1 mM EDTA (mit HClauf pH 8,0 eingestellt)) versetzt, gerührt und bei 60°C während 20Minuten und bei 95°C während 5Minuten inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde als Matrize zusammenmit den in der SEQ ID NO: 11 und SEQ ID NO: 12 gezeigten Primerneingesetzt, um eine PCR durchzuführen(Reaktionsbedingungen: Es wurde TaKaRa Ex Taq eingesetzt; ein Zyklus,der aus der Denaturierung bei 94°Cwährend30 Sekunden, dem Annealing bei 60°Cwährend30 Sekunden und der DNA-Strangverlängerungsreaktionbei 72°Cwährend 4Minuten und 30 Sekunden bestand, wurde 25-mal wiederholt), wodurchdie Zerstörungdes Zielgens bestätigtwurde. Es wurde gefunden, daß zehnStämmedie gewünschtenStämmemit zerstörtemGen waren. Deshalb wurde ein Stamm unter diesen als DLC10-Stamm(MLDC-Stamm) bezeichnetund in den folgenden Experimenten eingesetzt.
    [0080] Der Stamm DLC10, der wie vorstehendin (2) hergestellt wurde, war ein Stamm, der als Stamm ausgewählt wurde,der auf dem Kanamycin enthaltenden SEII-Agarmedium wachsen konnte.Es wurde jedoch gefunden, daß ernicht weiter wachsen konnte, wenn er auf demselben Agarmedium subkultiviertwurde. Deshalb wurde untersucht, ob die Wachstumshemmung durch dieZugabe von Cadaverin (CAD) und Agmatin (AGM), die Reaktionsprodukteder Lysindecarboxylase (LDC) und Arginindecarboxylase (ADC) sind,zu dem Medium komplementiert werden konnte.
    [0081] Ein Medium, das aus 4 ml flüssigem SEII-Medium,enthaltend 20 μg/mlKanamycin, bestand und mit Cadaverin oder Agmatin bei einer Konzentrationvon 1 g/l versetzt war, wurde hergestellt. Dann wurde der vorstehendgenannte Stamm DLC10 in das Medium eingeimpft und bei 37°C unter Rühren bei116 UpM kultiviert, und das Wachstum wurde untersucht. Es wurdegefunden, daß derStamm DLC10 auf dem Medium, das kein Cadaverin oder Agmatin enthielt,nicht wachsen konnte, währendder Stamm auf dem Medium, das diese Substanzen enthielt, wachsenkonnte. Überdieszeigte die Zugabe von Cadaverin eine bessere Wirkung auf die Wiederherstellungder Wachstumsfähigkeitals die Zugabe von Agmatin.
    [0082] Es wurde untersucht, ob die Cadaverinauxotrophiefür dasWachstum des vorstehend beschriebenen Stammes mit einem Defekt imldc-Gen durch die Einführungdes in Beispiel 1 erhaltenen orf#3098 komplementiert werden konnte.Zunächstwurde ein Plasmid fürdie Einführungvon DNA, die nur orf#3098 enthielt, in den Stamm mit dem Defektim ldc-Gen hergestellt. Die in Beispiel 1 beschriebene chromosomaleDNA wurde als Matrize zusammen mit DNA-Primern der SEQ ID NO: 13und 14 (Sse83871-Schnittstellewurde an das 5'-Endeligiert) eingesetzt, um eine PCR durchzuführen (Amplifikationsreaktionsbedingungen:Es wurde Pyrobest DNA-Polymerase, hergestellt von Takara Shuzo,eingesetzt; ein Zyklus, der aus der Denaturierung bei 98°C während 10Sekunden, dem Annealing bei 55°Cwährend30 Sekunden und der DNA-Strangverlängerungsreaktion bei 72°C während 3Minuten bestand, wurde 25-mal wiederholt). Das erhaltene DNA-Fragment mit einer Größe von etwa3 kb wurde mit dem Restriktionsenzym Sse8387I (Takara Shuzo) verdaut.Das DNA-Fragment wurde mit dem Vektor pRStac, der auf ähnlicheWeise mit Sse8387I verdaut war, ligiert und anschließend einer Dephosphorylierungsbehandlungunterworfen (Ligation Kit Ver. 2, hergestellt von Takara Shuzo).Das Plasmid, das orf#3098 (bezüg (bezüglich demtac-Promotor in Sinnrichtung) enthielt und wie vorstehend beschriebenerhalten wurde, wurde pRS-orf#3098 bezeichnet.
    [0083] Das Plasmid pRStac wurde durch Einführen destac-Promotors in ein bekanntes Plasmid pRS konstruiert (vergleicheInternationale Patentveröffentlichungin Japanisch (Kohyo) Nr. 3-501682).Das Plasmid pRS hat ein Vektorsegment des Plasmids pVIC40 (InternationalePatentveröffentlichungWO 90/04636, veröffentlichteInternationale Patentanmeldung in Japanisch Nr. 3-501682) und wurdeaus pVIC40 durch Deletion einer DNA-Region, welche für das Threoninoperon codiert,das auf dem Plasmid vorhanden ist, erhalten. Das Plasmid pVIC40ist von dem Vektor pAYC32 mit breitem Wirtsbereich (Chistorerdov,A. Y., Tsygankov, Y. D., Plasmid, 1986, 16, 161–167), welches ein Derivatvon RSF1010 ist, abgeleitet.
    [0084] Zunächst wurde das Plasmid pRStacmit dem tac-Promotor von dem Plasmid pRS konstruiert. Der pRS-Vektorwurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und PstI verdaut und zueiner Phenol/Chloroformlösunggegeben und zum Abbruch der Reaktion gemischt. Nachdem das Reaktionsgemischzentrifugiert worden war, wurde die obere Schicht gewonnen, unddie DNAs wurden durch Ethanolausfällung gewonnen und auf einem0,8% Agarosegel aufgetrennt. Ein DNA-Fragment von 8 Kilobasenpaarenwurde durch Einsatz von EASY TRAP Ver. 2 (DNA collection kit, TakaraShuzo) gewonnen. Andererseits wurde die tac-Promotorregion durchPCR unter Einsatz des Plasmids pKK223-3 (Expressionsvektor, Pharmacia)als Matrize und den in der SEQ ID NO: 17 und SEQ ID NO: 18 gezeigtenPrimern amplifiziert (ein Zyklus, der aus Denaturierung bei 94°C während 20Sekunden, Annealing bei 55°Cwährend30 Sekunden und einer Verlängerungsreaktionbei 72°C während 60Sekunden bestand, wurde 30-mal wiederholt). Für die PCR wurde die Pyrobest-DNA-Polymerase (TakaraShuzo) verwendet. Das DNA-Fragment, welches den amplifizierten tac-Promotor enthielt,wurde unter Einsatz von PCR prep (Promega) gereinigt und dann anden Restriktionsenzymschnittstellen, die vorher in den Primern konstruiertworden waren, d. h. an der EcoRI- und der EcoT22I-Schnittstelle,verdaut. Dann wurde das Reaktionsgemisch zu einer Phenol/Chloroformlösung gegebenund zum Abbruch der Reaktion gemischt. Nachdem das Reaktionsgemischzentrifugiert worden war, wurde die obere Schicht gewonnen, unddie DNAs wurden durch Ethanolausfällung gewonnen und auf einem0,8% Agarosegel aufgetrennt. Ein DNA-Fragment von etwa 0,15 kbpwurde unter Einsatz von EASY TRAP Ver. 2 gewonnen.
    [0085] Das Verdauungsprodukt des pRS-Vektors,der wie vorstehend beschrieben hergestellt wurde, und das tac-Promotor-Regionfragmentwurden unter Einsatz eines DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo)ligiert. Die Ligationsreaktionslösungwurde zur Transformierung von Escherichia coli (E. coli JM109 kompetenteZellen, Takara Shuzo) eingesetzt. Die Zellen wurden auf ein LB-Agarmedium,enthaltend 20 mg/l Streptomycin, ausplattiert und über Nachtbei 37°Cinkubiert. Die auf dem Agarmedium auftretenden Kolonien wurden inein LB-Flüssigmedium,enthaltend 20 mg/l Streptomycin, eingeimpft und 8 Stunden bei 37°C unter Schütteln kultiviert.Die Plasmid-DNA wurde aus dieser Kulturbrühe durch das Alkali-SDS-Verfahrenextrahiert, und die Struktur jedes Plasmids wurde durch Verdauungmit Restriktionsenzymen bestätigt,wobei pRStac erhalten wurde. Ein Plasmid, worin die Transkriptionsrichtungendes Streptomycinresistenzgens auf dem pRS-Vektor und des tac-Promotorsidentisch waren, wurde als pRStac ausgewählt.
    [0086] Unter Verwendung des Plasmids pRS-orf#3098,hergestellt wie vorstehend beschrieben, oder pRStac als Kontrollplasmidwurde der Stamm DLC10 durch Elektroporation transformiert und aufdem SEII-Agarmedium (enthaltend 20 μg/ml Kanamycin, 50 μg/ml Streptomycinund 1 g/l Cadaverin) selektiert.
    [0087] Wenn der ausgewählte Stamm DLC10/pRS-orf#3098in das SEII-Agarmedium,das Cadaverin nicht enthält(enthaltend 20 ug/ml Kanamycin und 50 μg/ml Streptomycin), eingeimpftwurde, war das Wachstum des Stammes mit dem eingeführten PlasmidpRStacorf#3098 möglich,währendder Stamm DLC10/pRStac als Kontrollstamm nicht wachsen konnte. Außerdem wurdenPlasmide aus dem Stamm DLC10/pRS-orf#3098 unter Einsatz von WizardMinipreps, hergestellt von Promega, extrahiert und durch Elektrophoresebestätigt.Es wurde bestätigt,daß derStamm das gewünschtePlasmid enthielt, und daher wurde gefunden, daß das Protein, das auf demPlasmid von orf#3098 codiert wird, in trans wirkt, so daß Komplementierungerzielt wurde. Es wird angenommen, daß die vorstehenden Ergebnissezeigen, daß dasFehlen von orf#3098 die Cadaverinauxotrophie für das Wachstum des Stammesverursachte.
    [0088] Um zu untersuchen, ob ein von E.coli abgeleitetes ldcC-Gen die Cadaverinauxotrophie des Stammes DLC10für dasWachstum komplementiert, wurde zunächst ein Plasmid hergestellt,das das von E. coli abgeleitete ldcC trägt. Der E.-coli-Stamm W3110wurde überNacht bei 37°Cin dem LB-Medium (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l NaCl)kultiviert, und eine chromosomale DNA wurde von den erhaltenen Zellenunter Einsatz eines Genomic DNA Purif. Kit, hergestellt von EdgeBio Systems, hergestellt. Diese chromosomale DNA wurde als Matrizezusammen mit DNA-Primern (eine PstI-Schnittstelle wurde an das 5'-Ende ligiert) mit denin der SEQ ID NO: 15 und SEQ ID NO: 16 gezeigten Sequenzen (J. Bacteriol.,179 (14), 4486–4492 (1997))eingesetzt, um eine PCR durchzuführen(Amplifikationsreaktionsbedingungen: Es wurde die Pyrobest DNA-Polymerase,hergestellt von Takara Shuzo, eingesetzt; ein Zyklus, der aus derDenaturierung bei 98°C während 10Sekunden, dem Annealing bei 60°Cwährend30 Sekunden und der DNA-Strangverlängerungsreaktion bei 72°C während 2Minuten bestand, wurde 25-mal wiederholt). Das erhaltene DNA-Fragmentmit einer Größe von etwa2,3 kb wurde mit dem Restriktionsenzym PstI (Takara Shuzo) verdaut.Getrennt davon wurde der Vektor pRStac mit Sse8387I verdaut, danneiner Dephosphorylierungsbehandlung unterzogen und mit dem vorstehenderwähntenPCR-Fragment ligiert (es wurde ein Ligation Kit Ver. 2, hergestelltvon Takara Shuzo, eingesetzt). Das Plasmid, welches das ldcC ausE. coli trägtund wie vorstehend beschrieben hergestellt wurde, wurde als pRS-ldcC-F (welches ldcCin Vorwärtsrichtungin Bezug auf den tac-Promotorträgt)oder pRS-ldcC-R (welches ldcC in Umkehrrichtung in Bezug auf dentac-Promotor trägt)bezeichnet.
    [0089] Der Stamm DLC10 wurde mit jeweilseinem der wie vorstehend beschrieben hergestellten Plasmide durchElektroporation transformiert, und die Transformanten wurden aufdem SEII-Agarmedium (enthaltend 20 μg/ml Kanamycin, 50 μg/ml Streptomycinund 1 g/l Cadaverin) selektiert. Es konnte keine Transformante mit pRStac-ldcC-Ferhalten werden, und eine Transformante konnte nur mit pRStac-ldcC-Rerhalten werden.
    [0090] Der Stamm DLC10/pRStac-ldcC-R wurdeauf das SEII-Agarmedium aufgetragen, das Cadaverin nicht enthielt(enthaltend 20 μg/mlKanamycin und 50 μg/mlStreptomycin), und es wurde bestätigt,daß derStamm DLC10/pRStac-ldcC-R wachsen konnte, während der Stamm DLC10/pRS-tacals Kontrollstamm nicht wachsen konnte. Die Ergebnisse zeigen, daß LDC (Lysindecarboxylase)aus E. co li die Cadaverinauxotrophie von Methylophilus methylotrophusmit dem Defekt in orf#3098 komplementieren konnte.
    [0091] Um ein lysE-Gen, welches für ein Proteinmit der Aktivitätcodiert, Lysin in Corynebacterium glutamicum auszuscheiden, in einMethylophilus-Bakterium einzuführen,wurde ein Plasmid pRSlysE24 fürdie Expression von lysE unter Einsatz des vorstehend beschriebenenpRStac konstruiert.
    [0092] Das Plasmid pRStac, hergestellt inBeispiel 2, (4) wurde mit Sse8387I (Takara Shuzo) und SapI (New EnglandBiolabs) verdaut und zu einer Phenol/Chloroformlösung gegeben und zum Abbruchder Reaktion gemischt. Nachdem das Reaktionsgemisch zentrifugiertworden war, wurde die obere Schicht gewonnen, und DNAs wurden durchEthanolausfällunggewonnen und auf einem 0,8% Agarosegel aufgetrennt, wobei ein DNA-Fragmentvon etwa 9,0 kbp erhalten wurde.
    [0093] Das lysE-Genfragment wurde auch durchPCR unter Einsatz eines Chromosoms, extrahiert aus dem Stamm Brevibacteriumlactofermentum 2256 (ATCC 13869), als Matrize und den in SEQ IDNO: 19 und 20 gezeigten Primern amplifiziert (Denaturierung bei94°C während 20Sekunden, Annealing bei 55°Cwährend 30Sekunden und Strangverlängerungsreaktionbei 72°Cwährend90 Sekunden). Fürdie PCR wurde Pyrobest-DNA-Polymerase (Takara Shuzo) verwendet.Das erhaltene Fragment wurde unter Verwendung von PCR prep (Promega)gereinigt und mit den Restriktionsenzymen Sse8387I und SapI verdaut.Das Reaktionsgemisch wurde zu einer Phenol/Chloroformlösung gegebenund unter Abbruch der Reaktion gemischt. Nachdem das Reaktionsgemischzentrifugiert worden war, wurde die obere Schicht gewonnen, undDNAs wurden durch Ethanolausfällunggewonnen, auf 0,8% Agarosegel gereinigt und gewonnen.
    [0094] Das Verdauungsprodukt des pRStac-Vektorsund des lysE-Genregionfragments,hergestellt wie vorstehend beschrieben, wurden unter Verwendungeines DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo) ligiert. Diese Ligationsreaktionslösung wurdeeingesetzt, um Escherichia coli (E. coli JM109 kompetente Zellen,Takara Shuzo) zu transformieren. Die Zellen wurden auf LB-Agarmedium, enthaltend20 mg/l Streptomycin, plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.Die auf dem Agarmedium auftretenden Kolonien wurden jeweils in LB-Flüssigmedium,enthaltend 20 mg/l Streptomycin, eingeimpft und 8 Stunden bei 37°C unter Rühren kultiviert.Eine Plasmid-DNA wurde aus dieser Kulturbrühe durch das Alkali-SDS-Verfahrenextrahiert, und die Struktur des Plasmids wurde durch Verdauungmit Restriktionsenzymen und Bestimmen der Nukleotidsequenz bestätigt, wobeipRSlysE erhalten wurde. In pRSlysE ist das lysE-Gen so angeordnet,daß dieTranskriptionsrichtung dieselbe wie diejenige des tac-Promotorsist.
    [0095] Das wie vorstehend beschrieben hergestelltepRSlysE wurde in den Stamm Methylophilus methylotrophus AS1 (NCIMB10515)durch Elektroporation eingeführt(Canadian Journal of Microbiology, 43, 197 (1997)). Es zeigte sich,daß kaumeine Transformante erhalten werden konnte. Außerdem wurde, wenn Nukleotidsequenzenvon Plasmiden, die aus mehreren Kolonie-bildenden Stämmen extrahiertwurden, untersucht wurden, eine Mutation in das lysE-Gen eingeführt. Undwenn die Kolonien kultiviert wurden, häufte sich L-Lysin in den Kulturüberständen nichtan. Wenn jedoch viele Kolonien weiter untersucht wurden, konnteein mutiertes lysE-Gen, das die Fähigkeit zur Bildung von L-Lysinauf Methylophilus-Bakterien übertragenkonnte, d. h. funktio nieren konnte, durch Analyse von pRSlysE, worineine Mutation eingeführtwar, erhalten werden.
    [0096] Dieses mutierte lysE-Gen wurde alslysE24-Gen bezeichnet. Die Nukleotidsequenz des lysE24-Gens wurdeanalysiert, und es wurde gefunden, daß die Mutation nicht zu einerAminosäuresubstitution,sondern zu einer Unsinnmutation führt, welche ein Stoppcodonin der Nähedes Zentrums der Translationsregion von lysE einführt. DieNukleotidsequenz des Wildtyp-lysE-Gens und die Aminosäuresequenz,die davon codiert wird, sind in der SEQ ID NO: 21 und SEQ ID NO:22 gezeigt. In lysE24 wurde T (Thymin) nach G (Guanin) an der Position355 des Wildtyp-lysE-Gens,gezeigt in SEQ ID NO: 21, eingeführt.Die Nukleotidsequenz von lysE24 und die Aminosäuresequenz, die davon codiertwird, sind in der SEQ ID NO: 23 und SEQ ID NO: 24 gezeigt. Das Plasmid,welches lysE24 trägt,wurde pRSlysE24 genannt.
    [0097] Ein Plasmid mit einem Gen, das für Dihydrodipicolinatsynthasecodiert, das frei von Rückkopplungshemmungdurch L-Lysin (dapA*) ist, wurde als L-Lysin-Biosynthesesystem-Enzymgenhergestellt.
    [0098] Das in Beispiel 2, (4) hergestelltepRStac wurde mit Sse8387I und XbaI verdaut, zu einer Phenol/Chloroformlösung gegebenund zum Abbruch der Reaktion gemischt. Nachdem das Reaktionsgemischzentrifugiert worden war, wurde die obere Schicht gewonnen, undDNAs wurden durch Ethanolausfällunggewonnen und auf einem 0,8% Agarosegel aufgetrennt, um ein DNA-Fragmentvon etwa 9 kbp zu erhalten.
    [0099] Das bekannte Plasmid RSFD80 (WO 90/16042),welches dieses Gen enthält,wurde als Matrize eingesetzt, um dapA* durch PCR unter Einsatz derin SEQ ID NO: 25 und 26 gezeigten Primer zu amplifizieren (Denaturierungbei 94°Cwährend20 Sekunden, An nealing bei 55°Cwährend30 Sekunden und Verlängerungsreaktionbei 72°Cwährend60 Sekunden). Fürdie PCR wurde Pyrobest-DNA-Polymerase(Takara Shuzo) eingesetzt. Das erhaltene dapA*-Fragment wurde unter Einsatz von PCRprep (Promega) gereinigt und dann mit Restriktionsenzymen Sse8387Iund XbaI verdaut. Das Reaktionsgemisch wurde zu einer Phenol/Chloroformlösung gegebenund zum Abbruch der Reaktion gemischt. Nachdem das Reaktionsgemisch zentrifugiertworden war, wurde die obere Schicht gewonnen, und DNAs wurden durchEthanolausfällunggewonnen und auf einem 0,8% Agarosegel aufgetrennt, wobei ein DNA-Fragmentvon etwa 0,1 kbp erhalten wurde.
    [0100] Das Verdauungsprodukt des pRStac-Vektorsund des dapA*-Genregionfragments,hergestellt wie vorstehend beschrieben, wurde unter Einsatz einesDNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo) ligiert. Diese Ligationsreaktionslösung wurdezur Transformierung von Escherichia coli (E. coli JM109 kompetenteZellen, Takara Shuzo) eingesetzt. Die Zellen wurden auf ein LB-Agarmedium, enthaltend20 mg/l Streptomycin, plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.Die auf dem Agarmedium auftretenden Kolonien wurden jeweils in LB-Flüssigmedium,enthaltend 20 mg/l Streptomycin, eingeimpft und 8 Stunden bei 37°C unter Schütteln gerührt. Plasmid-DNAwurde aus der Kulturbrühedurch das Alkali-SDS-Verfahren extrahiert, und die Struktur desPlasmids wurde durch Verdauung mit Restriktionsenzymen und Bestimmender Nukleotidsequenz bestätigt,wobei das Plasmid pRSdapR erhalten wurde. In dem Plasmid pRSdapAist das dapA*-Genso angeordnet, daß dieTranskriptionsrichtung dieselbe ist wie diejenige des tac-Promotors.
    [0101] Ein Plasmid, das aus pRSlysE24 bestandund worin das dapA*-Gen eingeführtwar, wurde konstruiert, um die kombinierte Wirkung von lysE24 unddapA* zu untersuchen.
    [0102] Das im Beispiel 4(1) hergestelltepRSlysE24 wurde mit einem Restriktionsenzym SapI verdaut und unterEinsatz eines DNA 8lunting Kit (Takara Shuzo) mit glatten Endenversehen. Außerdemwurde das in Beispiel 4(2) hergestellte Plasmid pRSdapA mit RestriktionsenzymenEcoRI und SapI verdaut, und ein Fragment von etwa 1 kbp, welchesden tac-Promotor und die dapA*-Regionenthält,wurde auf einem 0,8% Agarosegel abgetrennt. Das Fragment wurde unterEinsatz von ERSY TRAP Ver. 2 (Takara Shuzo) gewonnen. Das Fragmentwurde wie vorstehend beschrieben mit glatten Enden versehen undan das vorstehend genannte Verdauungsprodukt von pRSlysE24 unterEinsatz eines DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo) ligiert.
    [0103] Die vorstehend genannte Ligationsreaktionslösung wurdezur Transformation von Escherichia coli (E. coli JM109 kompetenteZellen, Takara Shuzo) eingesetzt. Die Zellen wurden auf ein LB-Agarmedium,enthaltend 20 mg/l Streptomycin, plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.Die auf dem Agarmedium auftretenden Kolonien wurden jeweils in LB-Flüssigmedium,enthaltend 20 mg/l Streptomycin, eingeimpft und 8 Stunden bei 37°C unter Schütteln kultiviert.Plasmid-DNA wurde aus dieser Kulturbrühe durch das Alkali-SDS-Verfahren extrahiert,und die Struktur des Plasmids wurde durch Verdauung mit Restriktionsenzymenund Bestimmung der Nukleotidsequenz bestätigt, wobei ein Plasmid pRSlysEdapAerhalten wurde. In dem Plasmid sind das lysE24-Gen und das dapA*-Genso angeordnet, daß derenTranskriptionsrichtung dieselbe ist.
    [0104] Der E.-coli-Stamm JM109, transformiertmit dem pRSlysEdapA-Plasmid,wurde als AJ13832 bezeichnet, und dieser Stamm wurde am 4. Juni2001 bei der unabhängigenVerwaltungsorganisation National Institute of Advanced IndustrialScience and Technology, International Patent Organism Depositary,hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM P-18371. Dannwurde die Hinterlegung gemäß den Vorgabendes Budapester Übereinkommensam 13. Mai 2002 in eine internationale Hinterlegung mit der Hinterlegungsnummer FERMBP-8042 umgewandelt.
    [0105] Der Einfluß des Defekts in dem ldc-Genauf die L-Lysin-Produktionvon Methylophilus methylotrophus wurde untersucht. Zunächst wurde,da der in Beispiel 2 hergestellte Stamm DLC10 aus einem Wildtypstamm hergestelltworden war, die L-Lysin-Produktionsfähigkeitnicht modifiziert. Deshalb wurde, um den Einfluß des Defekts in ldc auf dieL-Lysin-Produktion effektiv zu untersuchen, ein Stamm mit zerstörtem ldcaus dem Stamm Methylophilus methylotrophus AS1, enthaltend pRSlysEdapA,auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2(2) hergestellt. Der erhalteneStamm wurde als Stamm DLC12/pRSlysEdapA bezeichnet.
    [0106] Der Stamm AS1/pRSlysEdapA als Kontrollstammund der Stamm DLC12/pRSlysEdapA wurden auf das SEII-Agarmedium,enthaltend 50 μg/mlStreptomycin, beziehungsweise auf das SEII-Agarmedium, enthaltend50 μg/mlStreptomycin und 1 g/l Cadaverin, aufgetragen und über Nachtbei 37°Ckultiviert. Dann wurden die Zellen auf etwa 3 cm2 (Quadratzentimeter)von jeder Mediumoberflächeabgeschabt, in 20 ml SEII-Produktionsmedium, enthaltend 1 g/l Cadaverin(enthaltend 50 μg/mlStreptomycin), eingeimpft und 67 Stunden bei 37°C unter Schütteln kultiviert. Nach demvollständigenAblauf der Kultivierung wurden die Zellen durch Zentrifugation entfernt,und die L-Lysinkonzentrationin dem Kulturüberstandwurde unter Einsatz eines Aminosäure-Analysiergeräts (NihinBunko, HPLC) bestimmt.
    [0107] Es zeigte sich, daß der StammAS1/pRSlysEdapA 1,26 g/l L-Lysin in dem Medium akkumulierte, und daß der StammDLC12/pRSlysEdapA 1,79 g/l L-Lysin in dem Medium akkumulierte. Somitkonnte bestätigt werden,daß derDefekt in ldc die Produktion von L-Lysin verbesserte.
    [0108] Währenddie vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf bevorzugte Ausführungsformeneingehend beschrieben wurde, ist für den Fachmann klar, daß verschiedeneAbwandlungen gemacht werden könnenund Äquivalenteeingesetzt werden können,ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen. Jedes der vorstehendgenannten Dokumente, einschließlichdes ausländischenPrioritätsdokuments, JP 200347185 , wird in dievorliegende Anmeldung durch Bezugnahme vollständig aufgenommen.
    SEQUENZLISTE










    权利要求:
    Claims (9)
    [1] Aus der folgenden Gruppe ausgewähltes Protein: (A)ein Protein mit der Aminosäuresequenzder SEQ ID NO: 4; (B) ein Protein mit der Aminosäuresequenzder SEQ ID NO: 4, einschließlichSubstitution, Deletion, Insertion oder Addition eines oder mehrererAminosäurereste,und mit Lysindecarboxylase-Aktivität.
    [2] Aus der folgenden Gruppe ausgewähltes Protein: (A) einProtein mit der Aminosäuresequenzder SEQ ID NO: 4; (B) ein Protein mit der Aminosäuresequenzder SEQ ID NO: 4, einschließlichSubstitution, Deletion, Insertion oder Addition eines oder mehrererAminosäurereste,wobei das Protein Lysindecarboxylase-Aktivität hat und mindestens 90% Homologiezu SEQ ID NO: 4 aufweist.
    [3] DNA, die fürein aus der folgenden Gruppe ausgewähltes Protein codiert: (A)ein Protein mit der Aminosäuresequenzder SEQ ID NO: 4; (B) ein Protein mit der Aminosäuresequenzder SEQ ID NO: 4, einschließlichSubstitution, Deletion, Insertion oder Addition eines oder mehrererAminosäurereste,und mit Lysindecarboxylase-Aktivität.
    [4] DNA, die fürein aus der folgenden Gruppe ausgewähltes Protein codiert: (A)ein Protein mit der Aminosäuresequenzder SEQ ID NO: 4; (B) ein Protein mit der Aminosäuresequenzder SEQ ID NO: 4, einschließlichSubstitution, Deletion, Insertion oder Addition eines oder mehrererAminosäurereste,wobei das Protein Lysindecarboxylase-Aktivität hat und mindestens 90% Homologiezu SEQ ID NO: 4 aufweist.
    [5] DNA nach Anspruch 3, ausgewählt aus der folgenden Gruppe: (a)eine DNA mit der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern 684 bis 2930in der SEQ ID NO: 3; (b) eine DNA, die mit einer DNA mit derNukleotidsequenz der Nukleotidnummern 684 bis 2930 in der SEQ ID NO:3 unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist und für ein Proteinmit Lysindecarboxylase-Aktivitätcodiert.
    [6] DNA nach Anspruch 3, die von einem Chromosom ausMethylophilus-Bakterium abgeleitet ist.
    [7] Methylophilus-Bakterium, welches L-Lysin produziertund so modifiziert ist, daß dieintrazelluläreLysindecarboxylase-Aktivität vermindertoder ausgeschaltet ist.
    [8] Methylophilus-Bakterium, welches L-Lysin produziert,wobei ein Gen auf einem Chromosom mit einer Nukleotidsequenz, diezu der DNA nach Anspruch 3 identisch ist, zerstört ist oder ein Gen auf einemChromosom mit einer solchen Homologie zu der DNA des Anspruchs 3,daß einehomologe Rekombination mit der DNA auftritt, zerstört ist,wodurch die Expression des Gens unterdrückt ist und die intrazelluläre Lysindecarboxylase-Aktivität vermindertoder ausgeschaltet ist.
    [9] Verfahren zur Herstellung von L-Lysin, welches dasKultivieren des Methylophilus-Bakteriums nach Anspruch 8 in einemMedium, das Methanol als Hauptkohlenstoffquelle enthält, dasAnhäufenvon L-Lysin in der Kultur und das Gewinnen des L-Lysins aus der Kultur umfaßt.
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    FR2851575A1|2004-08-27|
    US20040229311A1|2004-11-18|
    JP2004254544A|2004-09-16|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    2008-12-24| 8139| Disposal/non-payment of the annual fee|
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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